JP5028125B2 - アミノ酸分析法およびアミノ酸分析システム - Google Patents

Description

本発明は、アミノ酸分析法およびアミノ酸分析システムに関する。

アミノ酸一斉分析の対象となるアミノ酸およびアミノ酸類縁物質は大別して、約２０種のたん白質加水分解物アミノ酸と４０種以上の生体液アミノ酸およびアミノ酸類縁物質に分類できる。

これらの多種のアミノ酸を一斉分析する手法として、複数の緩衝液を混合し、混合した緩衝液に試料を添加し、分離カラムを通過させて検出する分析法が一般的に用いられている。この手法において、分離カラムに充填する樹脂の種類，緩衝液組成，流速等を工夫することにより、分離の向上、かつ分析時間の短縮を目標に分析法が開発されてきた。この例として特許文献１および特許文献２がある。

特開平８−２１８３０号公報 特開平９−８００３７号公報

アミノ酸分析計による多成分一斉分析においては、ピーク面積値を基に定量を行うため、定量値の正確性を得るためには、近接ピークの分離を向上させる必要がある。また、分析時間を短縮し、検体処理能力を向上させるために分析の高速化が求められている。

アミノ酸分析において、分離に寄与するファクターとしてカラム充填剤の化学的特性が挙げられる。カラム充填剤には、その化学的特性により、容易に分離できる成分と分離困難な成分があり、この分離困難な成分は充填剤により異なる。

例えば、充填剤αを用いたカラムαはＡとＢという成分の分離に優れているがＣとＤという成分は分離できない、充填剤βを用いたカラムβはＣとＤという成分の分離に優れているがＡとＢという成分は分離できないとする。ここで、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄの混合試料について一斉分析を行う場合、カラムαを用いてもカラムβを用いても全ての成分を分離できない。このように、多成分一斉分析において単一充填剤を用いたカラムを用いると、全成分について、定量に支障のない十分な分離を得ることができない可能性がある。

この充填剤の特性に起因する分離困難な成分については、グラジエントプログラム，移動相組成，カラム形状といった、アミノ酸分析において一般的に分離向上を目的に変更される各種パラメータを変更しても、一定以上の分離を得ることが出来ない可能性がある。

一部成分については、流量を変更し分析時間を延長することにより分離向上が可能であるが、その方法では高速化という要求を満足できない可能性がある。

本発明の一つの目的はカラムを用いたアミノ酸分析において、カラム充填剤の特性に起因する分離困難な成分について、分離を向上させることにより、アミノ酸成分の分離性能向上、さらに高速分析を可能にすることである。

本発明の一つの特徴は、化学的特性の異なる充填剤を用いたカラムを複数本直列につなぐことにある。ここで化学的特性の例として、カラムサイズ，分析に最適な溶離液およびグラジエントプログラム，平均粒子径，粒子分布幅，イオン交換容量，架橋度，疎水性，比表面積，機械的強度，スルホン酸基導入量等の化学パラメータ等がある。

本発明によれば、アミノ酸一斉分析においてアミノ酸およびアミノ酸類縁物質各成分について、分離性能の向上、さらに分析の高速化を図れる。

以下、図，表を用いて実施例を説明する。

以下の説明において、分析対象となるアミノ酸の名称および略号は表１の表記に従った。

本発明の実施形態の例として、複数の成分を含む複数種類の溶離液に試料を導入し、分離カラムを通過させて分析を行うアミノ酸分析法において、Ａｓｐ／ＰｒｏとＮｌｅ／
Ｔｙｒの成分についての分離能に差異のある２種の充填剤をそれぞれ用いたカラムを２本直列に配置することを特徴とするアミノ酸分析法および分析システムが挙げられる。

更に本実施例は、液体クロマトグラフィにより複数種類の溶離液を用いて、試料中のアミノ酸を溶出して分析クロマトグラムを作成し、該クロマトグラムを表示装置に表示して、該クロマトグラムを解析して所定のアミノ酸分析を行う方法であって、該表示装置に
Ｎｌｅ，Ｔｙｒ，Ｇｌｕ，Ｐｒｏを含むアミノ酸クロマトグラムを表示することを特徴とするアミノ酸分析装置に関する。本発明の実施形態によれば、Ａｓｐ／Ｐｒｏ，Ｎｌｅ／Ｔｙｒのアミノ酸が、相互に完全に分離されているためアミノ酸分析、例えば各成分の含有比が容易に計算できる。

図１は、本実施例のアミノ酸分析計の装置構成及び流路説明図である。符号１〜符号４はそれぞれ第１〜第４緩衝液、符号５はカラム再生液である。この中から電磁弁シリーズ６によって何れかの緩衝液が選ばれ、緩衝液ポンプ７によってアンモニアフィルタカラム８，オートサンプラ９によって導入されたアミノ酸試料は分離カラム１０で分離される。ここで分離したアミノ酸は、ニンヒドリンポンプ１２によって送られてきたニンヒドリン試薬１１とミキサ１３で混合し、加熱された反応カラム１４で反応する。反応によって発色したアミノ酸は検出器１５で連続的に検知され、データ処理装置１６と図示しないディスプレイ，プリンタ，ストレージ等によってクロマトグラム及びデータとして出力され、表示，記録，保存される。

データ処理装置１６は緩衝液容器の電磁弁６Ａ〜６Ｄ，カラム再生液容器の電磁弁６Ｅ、並びにニンヒドリンポンプ１２，オートサンプラ９，緩衝液容器などの温度を制御する手段（図示せず）を制御する。この制御は主として制御装置の記憶装置（図示せず）に格納されたプログラムによって実行される。

緩衝液１〜緩衝液４および再生液５としては、表２に示すクエン酸ナトリウム緩衝液を用いた。ニンヒドリン試薬１１は市販のニンヒドリン試薬Ｌ−８９００セット（和光純薬工業（株）製）を用いた。表２に示すクエン酸ナトリウム緩衝液は、一般的なたんぱく質加水分解物アミノ酸の分析の溶離液として使用されるものであり、本実施例に特有のものではない。本実施例は、従来のアミノ酸分析法においてカラムを変更することにより高分離化を図るものである。

本発明の実施形態の例として、図１の分離カラム１０に、充填剤ａを５.４mmＩＤ×
２５mmサイズのカラムに充填した分離カラムＡ、および、充填剤ａとは化学的特性の異なる充填剤ｂを５.４mmＩＤ×２５mm サイズのカラムに充填した分離カラムＢの二種類のカラムを１本ずつ直列に配置して分析を行う。ここで、５.４mmＩＤ×２５mm サイズのカラムの体積は５７２.２７mm³であり、ガードカラムではない。以下、図２に示すように、２本の分離カラム（分離カラムα１７と分離カラムβ１９）を溶離液の流れる方向に対し直列に配置し、２本のカラムをコネクタ１８で接続したものをツインカラムと呼ぶ。ここで、本発明の実施形態として分離カラムＡと分離カラムＢを２本直列に配置したものを示す。この複合カラムをツインカラムＡ＋Ｂと呼ぶ。また、本実施例の比較例として分離カラムＡを２本直列に配置したものと、分離カラムＢを２本直列に配置したものを示す。これらの複合カラムをツインカラムＡ＋Ａ，ツインカラムＢ＋Ｂと呼ぶ。これら同一種の充填剤を用いた複合カラムは従来アミノ酸分析に使われているものである。

この３種のツインカラムについて分離能の比較を表３に示す。ツインカラムの分離能の指標として以下の式（数１）および（数２）で算出されるα１およびα２を用いた。また、本実施例における各ツインカラムのクロマトグラムは図３，図４に示す。図３は分離指標α１の、３種ツインカラムにおける分離能比較に相当するＡｓｐ〜Ｐｒｏ部分のクロマトグラムであり、図４は分離指標α２の、３種ツインカラムにおける分離能比較に相当するＩｌｅ〜Ｔｙｒ部分のクロマトグラムである。

（註：＊分離指標α２については実測値よりシミュレーションで求めた。）

上記、分離指標α１と同様の分離指標として、式(１)におけるＡｓｐ／ＰｒｏをＡｓｐ／Ｔｈｒ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ｓｅｒ／Ｇｌｕ，Ｇｌｕ／Ｐｒｏとしても同様の結果を得られる。また、分離指標α２と同様の分離指標として式（２）におけるＮｌｅ／Ｔｙｒを
Ｌｅｕ／Ｎｌｅ，Ｌｅｕ／Ｔｙｒとしても同様の結果を得られる。

以上の結果より充填剤ａはＡｓｐ／Ｐｒｏの分離能が高く、充填剤ｂはＮｌｅ／Ｔｙｒの分離能が高いという化学的特性を持つことが分かる。これらの充填剤を単一種用いたツインカラムＡ＋Ａ，ツインカラムＢ＋Ｂは一部成分について高い分離能を持っているが、多成分一斉分析において、全成分良好な分離を得ることができず、全成分についての含有比を精度良く求めることが出来ない。

これに対し、本発明の実施例ではＡｓｐ／ＰｒｏとＮｌｅ／Ｔｙｒの成分についての分離能という化学的特性に差異のある充填剤ａとｂを用いたツインカラムＡ＋Ｂを提供する。ツインカラムＡ＋Ｂを用いた分析においては、表３に示すとおり、ツインカラムＡ＋ＡとツインカラムＢ＋Ｂの中間の分離能を得られる。このように本発明による化学的特性の異なる充填剤を用いたツインカラムを用いることにより、アミノ酸多成分一斉分析において、単一充填剤を用いたカラムを用いた場合に比較し、全成分について偏りなく良好な分離を得ることができる。

実施例２では、実施例１の変形例として、図１に示したアミノ酸分析装置を用い、溶離液として、表２に示したクエン酸ナトリウム緩衝液の代わりに、表４に示すクエン酸リチウム緩衝液を用いた例を示す。表４に示すクエン酸リチウム緩衝液は、一般的な生体液アミノ酸の分析の溶離液として使用されるものであり、本実施例に特有のものではない。ここで、本実施例においては分離能の指標として（数３）に示す分離度Ｒｓを用いる。また、本実施例における各ツインカラムのクロマトグラムは図５，図６に示す。図５は分離指標α１の、３種ツインカラムにおける分離能比較に相当するＡｓｐ〜Ｐｒｏ部分のクロマトグラムであり、図６は分離指標α２の、３種ツインカラムにおける分離能比較に相当するＩｌｅ〜Ｔｙｒ部分のクロマトグラムである。

各ツインカラムにおけるＴｈｒ／ＳｅｒおよびＮｌｅ／ＴｙｒのＲｓを表５に示す。本実施例においても実施例１と同様に、ツインカラムＡ＋ＡはＴｈｒ／Ｓｅｒの分離能が高く、ツインカラムＢ＋ＢはＮｌｅ／Ｔｙｒの分離能が高い。また、ツインカラムＡ＋Ｂを用いると、実施例１と同様に、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ｎｌｅ／Ｔｙｒについて、ツインカラムＡ＋ＡとツインカラムＢ＋Ｂの中間の分離能を得られる。同様に１Ｍｅｈｉｓ／ＨｉｓおよびＨｉｓ／３−ＭｅｈｉｓでもツインカラムＡ＋Ｂを用いると、実施例１と同様に、ツインカラムＡ＋ＡとツインカラムＢ＋Ｂの中間の分離度を得られると期待される。

また、本発明の他の実施形態として、表３，表４に示したクエン酸緩衝液に替えて、酢酸緩衝液を溶離液として用いたアミノ酸分析法およびアミノ酸分析装置が挙げられる。酢酸緩衝液を溶離液として用いた場合には、実施例１および実施例２のクロマトグラムと比較し、各アミノ酸成分溶出順の前後関係が逆転することがある。本実施例でも化学的特性の異なる２種の充填剤を用いた各カラムを直列に配置したツインカラムにおいて、これら２種の充填剤のどちらかに特徴的な成分の分離能について、実施例１および実施例２と同様に、任意の隣接する２つのピークについて、単一充填剤を用いたツインカラムの中間の性能が得られることが期待される。

更に、本発明の他の実施形態として、下記の性質についていずれかが異なる２種の充填剤を用い、図１に示したアミノ酸分析装置を用いたアミノ酸分析法および分析装置がある。カラム１，２などに選択可能な好適な設定パラメータとして、以下のものが挙げられる。平均粒子径（５μｍ以下），粒子分布幅（平均粒子径±２０％），イオン交換容量（１〜１０ｍＥｑ／ｇ），架橋度（５〜１５％），疎水性，比表面積，機械的強度，スルホン酸基導入量等。

本実施例でも化学的特性の異なる２種の充填剤を用いた各カラムを直列に配置したツインカラムにおいて、これら２種の充填剤のどちらかに特徴的な成分の分離能について、実施例１および実施例２と同様に、任意の隣接する２つのピークについて、単一充填剤を用いたツインカラムの中間の性能が得られることが期待される。

更に、本発明の他の実施形態として、実施例４に示すような化学的性質の異なる充填剤を用い、カラムの形状（長さ，中心径）を任意に変更したツインカラムを用いたアミノ酸分析法およびアミノ酸分析装置がある。カラム形状を変えることで、例えばツインカラムＡ＋Ｂにおいて、分離カラムＡに用いた充填剤ａの能力をより強く発揮させたい場合には、カラムＢに対してカラムＡの長さまたは中心径を大きくすることにより、カラム体積を増加し、充填剤ａの特徴が強く発揮されるツインカラムを設計することができる。このようにカラム形状を任意に変更することにより充填剤の量を調節し、分析対象にあわせた特性を発揮するツインカラムを設計することができ、目的成分の分離向上を可能にすると考えられる。

更に、本発明の他の実施形態として、実施例４に示すような化学的性質の異なる充填剤を用いたカラムを少なくとも３本直列に配置し、コネクタで各カラムを繋いだ複合カラムがある。充填剤ａを用いたカラムＡ、充填剤ｂを用いたカラムＢ、充填剤ｃを用いたカラムＣの３種のカラムを３本直列に配置し、コネクタで各カラムを繋いだ複合カラムを、複合カラムＡ＋Ｂ＋Ｃとする。この複合カラムＡ＋Ｂ＋Ｃにおいても実施例１と同様に、各カラムの特性が複合カラムＡ＋Ｂ＋Ｃの特性に対して平均的に反映されると考えられる。すなわち複合カラムＡ＋Ｂ＋Ｃ全体では、各カラムの特性を１／３ずつ発揮すると考えられる。

また、この複合カラムも実施例５と同様にカラム形状を任意に変更することにより、各充填剤の特性が、複合カラム全体の特性へ及ぼす影響の割合を調節することができる。すなわち複合カラムＡ＋Ｂ＋ＣにおいてカラムＡの体積を７０、カラムＢの体積を２０、カラムＣの体積を１０とする。このとき複合カラムＡ＋Ｂ＋Ｃ全体の特性は、Ａの特性を
７０％、カラムＢの特性を２０％、カラムＣの特性を１０％反映する。複合カラムにおいては各カラムの特性がカラム体積に比例して反映されることが考えられる。このように３本以上のカラムを用いた複合カラムではカラム形状の組み合わせにより、各種充填剤の特性の発現を任意に調節した複合カラムを設計することが可能であると期待される。

本明細書では、分離カラムとは、分離を目的とし各種充填剤を用いたカラムで、体積が７０mm³ 以上であり、分離に用いるカラムの劣化を防ぐために使用されるガードカラムでないものとして定義する。

また、分離用カラムは、ガードカラムと目的が異なり、分離することが目的であるため数千段以上の理論段数を有する必要がある。このため、例えば平均粒子径が５μｍ程度の充填剤の場合、１５mm以上の分離カラムの長さが必要となる。必要なカラム長さは平均粒子径に比例するため、平均粒子径が３μｍ程度の充填剤の場合、９mm以上のカラム長さが、平均粒子径が２μｍ程度の充填剤の場合、６mm以上のカラム長さが必要である。一方、一般にガードカラムは高々５mm程度の長さである。

本明細書の開示の一例を列挙すると次の通りである。（１）充填剤を有する分離カラムを用いるアミノ酸分析法において、少なくとも第１の分離カラムに試料を導入した後、前記第１のカラムと直列に配置され、前記第１のカラムに用いる充填剤と化学的特性の異なる充填剤を用いた第２の分離カラムに試料を導入することを特徴とするアミノ酸分析法。（２）前記（１）において、前記充填剤はイオン交換樹脂を含むことを特徴とするアミノ酸分析法。（３）前記（１）において、前記第１の分離カラムおよび前記第２の分離カラムのうち、少なくとも１つが、ポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とするアミノ酸分析法。（４）前記（１）において、前記第１の分離カラムおよび前記第２の分離カラムのうち、少なくとも１つが、スルホン酸基を導入したポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とするアミノ酸分析法。（５）前記（１）において、前記試料は溶離液と共にカラムに導入し、前記溶離液としてはクエン酸緩衝液および酢酸緩衝液を用いることを特徴としたアミノ酸分析法。（６）それぞれ化学的特性の異なるイオン交換樹脂を含む充填剤を用い、直列に配置された複数本の分離カラムと、前記複数本の分離カラムのうち少なくとも第１の分離カラムに試料を導入した後、第２の分離カラムに試料を導入することのできる導入手段とを有することを特徴としたアミノ酸分析システム。（７）前記（６）において、前記第１の分離カラムおよび前記第２の分離カラムのうち、少なくとも１つが、ポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とするアミノ酸分析システム。（８）前記（６）において、前記第１の分離カラムおよび前記第２の分離カラムのうち、少なくとも１つが、スルホン酸基を導入したポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とするアミノ酸分析法システム。（９）前記（６）において、前記試料は溶離液と共にカラムに導入し、溶離液としてクエン酸緩衝液および酢酸緩衝液を用いることを特徴としたアミノ酸システム。（１０）イオン交換樹脂を充填剤とする第１の分離カラムと、第１のカラムと直列に配置され、第１のカラムに用いる充填剤と化学的特性の異なる充填剤を用いる第２の分離カラムとを少なくとも有し、試料が、第１のカラム，第２の分離カラムの順に導入されることを特徴とする分離用複合カラム。（１１）前記（１０）において、前記第１の分離カラムおよび、前記第２の分離カラムは、ポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とする分離用複合カラム。

以上のように、アミノ酸多成分一斉分析において、カラム充填剤の化学的特性に起因する分離困難を解消し、高分離かつ高速分析を可能にすることが開示され、アミノ酸多成分一斉分析において化学的特性の異なる充填剤を用いたカラムを複数本直列に配置して分析を行うことにより、各充填剤の特性による高分離部分を活かした分離が可能になり、分離性能向上および分析の高速化を図れることが開示される。

本発明で使用するアミノ酸分析計の流路図である。 本発明で使用するツインカラムの模式図である。 ツインカラム各種の実施例１におけるＡｓｐ〜Ｐｒｏのクロマトグラムである。 ツインカラム各種の実施例１におけるＩｌｅ〜Ｔｙｒのクロマトグラムである。 ツインカラム各種の実施例２におけるＡｓｐ〜Ｇｌｕのクロマトグラムである。 ツインカラム各種の実施例２におけるＭｅｔ〜Ｔｙｒのクロマトグラムである。

符号の説明

１〜４ 緩衝液
５ 再生液
６ 電磁弁シリーズ
７ 緩衝液ポンプ
８ アンモニアフィルタカラム
９ オートサンプラ
１０ 分離カラム
１１ ニンヒドリン試薬
１２ ニンヒドリンポンプ
１３ ミキサ
１４ 反応カラム
１５ 検出器
１６ データ処理装置
１７ 分離カラムα
１８ コネクタ
１９ 分離カラムβ

Claims (11)

1. 充填剤を有する分離カラムを用いるアミノ酸分析法において、少なくとも第１の分離カラムに試料を導入した後、前記第１のカラムと直列に配置された第２の分離カラムに試料を導入するアミノ酸分析法であり、
   所定の第１成分群の分離では、前記第１のカラムの方が前記第２のカラムよりも分離性能が高く、前記第１の成分群とは異なる所定の第２成分群の分離では、前記第２のカラムの方が前記第１のカラムよりも分離性能が高くなるように、第１のカラムと第２のカラムで異なる充填剤を用い、
   前記第１の分離カラムと前記第２の分離カラムで同じ溶離液を用い、
   前記第１の分離カラムと前記第２の分離カラムの間に分岐を有しておらず、かつ、前記第１の分離カラムから溶出したものは、全て前記第２の分離カラムに導入される、ことを特徴とするアミノ酸分析法。
2. 請求項１において、前記充填剤はイオン交換樹脂を含むことを特徴とするアミノ酸分析法。
3. 請求項１において、前記第１の分離カラムおよび前記第２の分離カラムのうち、少なくとも１つが、ポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とするアミノ酸分析法。
4. 請求項１において、前記第１の分離カラムおよび前記第２の分離カラムのうち、少なくとも１つが、スルホン酸基を導入したポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とするアミノ酸分析法。
5. 請求項１において、前記試料は溶離液と共にカラムに導入し、前記溶離液としてはクエン酸緩衝液および酢酸緩衝液を用いることを特徴としたアミノ酸分析法。
6. 充填剤を有する分離カラムを用いるアミノ酸分析システムにおいて、少なくとも第１の分離カラムに試料を導入した後、前記第１のカラムと直列に配置された第２の分離カラムに試料を導入するアミノ酸分析システムであり、
   所定の第１成分群の分離では、前記第１のカラムの方が前記第２のカラムよりも分離性能が高く、前記第１の成分群とは異なる所定の第２成分群の分離では、前記第２のカラムの方が前記第１のカラムよりも分離性能が高くなるように、第１のカラムと第２のカラムで異なる充填剤を用い、
   前記第１の分離カラムと前記第２の分離カラムで同じ溶離液を用い、
   前記第１の分離カラムと前記第２の分離カラムの間に分岐を有しておらず、かつ、前記第１の分離カラムから溶出したものは、全て前記第２の分離カラムに導入される、ことを特徴とするアミノ酸分析システム。
7. 請求項６において、前記第１の分離カラムおよび前記第２の分離カラムのうち、少なくとも１つが、ポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とするアミノ酸分析システム。
8. 請求項６において、前記第１の分離カラムおよび前記第２の分離カラムのうち、少なくとも１つが、スルホン酸基を導入したポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とするアミノ酸分析法システム。
9. 請求項６において、前記試料は溶離液と共にカラムに導入し、溶離液としてクエン酸緩衝液および酢酸緩衝液を用いることを特徴としたアミノ酸システム。
10. 充填剤を有する、第１のカラムと第２のカラムを備えた分離用複合カラムであり、
    第２のカラムは第１のカラムの下流側に配置されており、
    第１のカラムと第２のカラムは互いに直列に配置されており、
    所定の第１成分群の分離では、前記第１のカラムの方が前記第２のカラムよりも分離性能が高く、前記第１の成分群とは異なる所定の第２成分群の分離では、前記第２のカラムの方が前記第１のカラムよりも分離性能が高くなるように、第１のカラムと第２のカラムで異なる充填剤を用い、
    前記第１の分離カラムと前記第２の分離カラムの間に分岐を有しておらず、かつ、前記第１の分離カラムから溶出したものは、全て前記第２の分離カラムに導入される、ことを特徴とする分離用複合カラム。
11. 請求項１０において、前記第１の分離カラムおよび、前記第２の分離カラムは、ポリスチレン樹脂を母剤に用いたイオン交換樹脂を充填剤とすることを特徴とする分離用複合カラム。

Images