JP4995610B2 - 内在化機能を有する抗体の高処理スクリーニングの方法 - Google Patents
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Description
ある実施態様において本発明は、細胞内に内在化されるリガンドを特定する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む。i)リガンドに非共有結合させたエフェクター(例えばレポーター)と、前記細胞とを接触させる工程;ii)前記リガンドから前記レポーターを分離し、さらに分離したレポーターを前記細胞の表面から取り除く工程;iii)レポーターが細胞内に存在する場合は、前記細胞内の前記レポーターを検出する工程。ここで細胞内のレポーターの存在は、リガンドが内在化機能を有するレセプターと結合し、内在化されたことを示す。ある実施態様では、前記接触工程は、エピトープタグを含むリガンドと細胞を接触させる工程、及び前記エピトープタグと結合する成分部分を含むレポーターと前記細胞を接触させる工程を含む。好ましい実施態様では、前記リガンドは、細胞表面レセプターと結合するリガンドである。好ましいリガンドには、ペプチド(例えばscFv、Fv、Fab、モノクローナル抗体、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子など)、核酸、炭水化物、糖類などが含まれるが、これらに限定されない。特に好ましいペプチドリガンドは、コンビネーション化学合成(combinatorial chemical synthesis)またはファージディスプレーライブラリーを用いて(例えば繊維状ファージを用いて)組換えによって生成される。
前記方法はさらに、前記細胞内に内在化されたリガンドを単離する工程を含む。ある実施態様では、前記“単離”工程は、細胞によって内在化されたリガンドのアミノ酸配列を決定する工程か、または前記リガンドをコードする核酸配列を決定する工程を含みうる。
ある種の実施態様では、前記方法はさらに、前記細胞内に内在化されるリガンドを単離する工程を含む。前記リガンドの配列を決定するか、または前記リガンドをコードする核酸の配列を決定することができる。前記方法はさらに、再度内在化機能を有するレセプターに付せんを付ける(tag)ために、またはこれを単離するために細胞を標識リガンドと接触させることを含む。
さらに別の実施態様では、本発明は、本発明の方法(例えば内在化レセプターについて細胞をスクリーニングする方法)で使用される構築物を提供する。好ましい構築物は、エフェクター(例えばレポーター)とエピトープタグを介して非共有結合したリガンドを含む。好ましい構築物では、前記リガンドには、ペプチド(例えばscFv、Fv、Fab、モノクローナル抗体、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子など)、核酸、炭水化物、糖類などが含まれるが、これらに限定されない。特に好ましいペプチドリガンドは、コンビネーション化学合成によってまたはファージディスプレーライブラリーを用いて(例えば繊維状ファージを用いて)組換えによって生成される。
さらにまた別の実施態様では、本発明は、細胞によるリガンドの結合および内在化を検出する方法を提供する。前記方法は下記工程を含む:i)リガンドに非共有結合させたエフェクター(例えばレポーター)と、細胞とを接触させる工程;ii)細胞と結合しないエフェクター部分を取り除く工程;iii)細胞表面と結合し前記細胞によって内在化されたリガンドの総量を示す第一の読みを得るために、細胞と結合したレポーターを検出する工程;iv)前記レポーターをリガンドから分離し、分離したレポーターを細胞表面から除去する工程;v)内在化されたリガンド量を示す第二の読みを得るために、細胞に残存するレポーターを検出する工程;及びvi)細胞表面に結合しているリガンド量を示す差を得るために、第二の読みを第一の読みから差し引く工程。いくつかの事例では、前記接触工程の後で、例えば細胞の温度を低下させる(典型的には4℃)ことによって、または細胞を有効量の代謝阻害剤(例えばアンヒドログルコースまたはアジ化ナトリウム)で処理することによって、内在化プロセスの進行を停止させることが有利である。
本発明はまた、ステロールを含み、エピトープタグ(好ましくはヘキサヒスチジンタグ)と金属キレート結合を形成することができる金属キレート脂質を提供する。より好ましくは、コレステロール共役NTA金属錯体を含む金属キレート脂質が提供される。
“ポリペプチド”、“オリゴペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は、本明細書では互換的に用いられアミノ酸残基ポリマーを指す。前記用語は、1つまたは2つ以上のアミノ酸残基が天然に存在するアミノ酸の対応する人工的類似体であるアミノ酸ポリマーにも、天然に存在するアミノ酸ポリマーと同様に適用される。前記用語はまた、ポリペプチドを構成するアミノ酸を連結する従来のペプチド結合に関する変種も含む。タンパク質にはまた糖タンパク質(例えばヒスチジン富裕糖タンパク質(HRG)、ルイスY抗原(LeY)など)も含まれる。
本明細書で用いられるように、“抗体”という用語は、実質的に免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントによってコードされた1つまたは2つ以上のポリペプチドから成る。認定されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子が、多数の免疫グロブリンの可変領域遺伝子とともに含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダのどちらかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、前記は順次IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE免疫グロブリンクラスをそれぞれ規定する。
典型的な免疫グロブリン(抗体)の構造ユニットは四量体を含むことが判明している。各四量体は同一な2対のポリペプチド鎖で構成され、各対は1つの“軽”鎖(約25kD)および1つの“重”鎖(約50−70kD)を有する。各鎖のN−末端は、約100から110またはそれ以上のアミノ酸であって主として抗原認識に必要な可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ前記の軽鎖および重鎖を指す。
グメントも含む。好ましい抗体には、単鎖抗体(単一のポリペプチド鎖として存在する抗体)、より好ましくは単鎖Fv抗体(sFvまたはscFv)が含まれる。後者では、可変重鎖および可変軽鎖が一緒に(直接またはペプチドリンカーを介して)結合され連続したポリペプチドが生成されている。前記単鎖Fv抗体は共有結合によって連結されたVH−VL異種二量体であり、VHおよびVLコード配列(直接連結されてあるか、またはペプチドコードリンカーによって連結されてある)を含む核酸から発現させることができる(Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883)。VHおよびVLは単鎖ポリペプチドとして互いに連結されているが、VHドメインおよびVLドメインは非共有結合によって結合されてある。繊維状ファージの表面で発現された最初の機能性抗体分子は単鎖Fv(scFv)であったが、また別の発現手法も成功した。例えば、Fab分子は、鎖の一方(重鎖または軽鎖)がg3キャプシドタンパク質と融合され、相補鎖が可溶性分子としてペリプラズムに搬出される場合、ファージ上でディスプレーさせることができる。前記2つの鎖は同じレプリコンでコードされても、または異なるレプリコンでコードされてもよいが、重要な点は、各Fab分子内の前記2つの抗体鎖は翻訳後に合体し、二量体は、前記鎖の一方と例えばg3pとの結合を介してファージ粒子内に取り込まれるということである(例えば米国特許第5,733,743号を参照されたい)。前記scFv抗体および他の多くの構造物が当業者に知られているが、後者は、天然の状態では凝集しているが、化学的に分離させた抗体のV領域由来軽鎖および重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造と実質的に同様な三次元構造に折り畳まれた分子に変換されてある(例えば米国特許第5,091,513号、第5,132,405号および第4,956,778号を参照されたい)。特に好ましい抗体には、ファージ上でディスプレーされた全てが含まれるべきである(例えば、scFv、Fabおよびジスルフィド結合により連結されたFvである(Reiter et al.(1995) Protein Eng. 8:1323-1331))。
“リガンド”という用語は、別の分子と特異的に結合および/または搬送されるか、または可能な分子を指す。好ましいリガンドには、ペプチド、核酸、炭水化物、糖、ホルモンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。リガンドとリガンドが結合する分子とは結合対を形成し、前記結合対において各構成要素は他方の構成要素に対してリガンドとみなされる。結合対の明白な例には、抗体/抗原、抗体/ハプテン、酵素/基質、酵素/インヒビター、酵素/補助因子、結合タンパク質/基質、担体タンパク質/基質、トランスポータータンパク質/基質、レクチン/炭水化物、レセプター/ホルモン、レセプター/調節物質、ポリヌクレオチドの相補鎖、タンパク質/核酸リプレッサー(インダクター)、レセプター/ウイルスなどが含まれる。
“レポーター”とは、検出可能なシグナルを提供するエフェクターである(例えば検出可能な標識である)。ある種の実施態様では、前記レポーターは、それ自体は検出可能なシグナルを提供する必要はないが、その後すぐに検出可能な標識と結合することができる成分部分を単に提供するだけでよい。
“調節する”という用語は、リガンドの内在化の調節に関して用いられるときは、内在化されるリガンドの総量、および/または内在化速度のアッピレギュレーションまたはダウンレギュレーションを指す。ある種の実施態様では、特にリガンドの流出がアッセイされないか、または制御されない場合には、調節はリガンドの流出速度を変化させることによって発生し、細胞によるリガンド取込みの正味速度または正味量に影響を与えることができる。
“有機小分子”という用語は、一般的に製薬で用いられる有機分子に匹敵するサイズを有する分子を指す。前記用語では生物学的巨大分子(例えばタンパク質、核酸など)は除外される。好ましい有機小分子のサイズは約5000Daまで、より好ましくは2000Daまで、もっとも好ましくは約1000Daまでの範囲である。
“キレート結合”という用語は、エフェクターと電子対ドナーとの間の結合であって、前記電子対ドナーと金属イオンとの間で誘引力を生じる、前記電子対ドナーと前記金属イオンの配位部位との間の相互作用を伴うものを指す。
“リポソーム”という用語は、両親媒性脂質で構成された自己封入層(self-enclosed layer)を含むナノ粒子を指す。典型的には、前記の層は、疎水性部分および親水性部分を含む分子によって形成された二重層で、疎水性部分は水性媒体中で結合して前記層の内側部分を形成し、一方、親水性部分は媒体と接触状態にある。前記層は内部を取囲んでこれを封入し、前記内部は、全体的にまたは部分的に水相、固体、ゲル、気相または非水性液を含むことができる。エフェクター、例えばレポーターはリポソームの前記内部、脂質層内に含まれているか、または前記脂質層の外側表面に結合されてあってもよい。
さらに別の実施態様では、本発明の方法を用いて、リガンドを内在化させる細胞の能力を調節する薬剤をスクリーニングすることができる。好ましい実施態様では、前記方法は、本明細書に記載するようにリガンドの内在化についてスクリーニングすることを必要とする。この場合、細胞をエフェクター/リガンド構築物と接触させる前に、または接触させている間に、それら細胞をスクリーニングされるべき薬剤と接触させる。例えばテスト薬剤を低濃度で含むか、またはテスト薬剤を含まない陰性コントロールと比較したとき、テスト薬剤と接触させた細胞によるリガンド内在化の差異は、前記テスト薬剤が問題のリガンドの内在化を調節する(例えば増加または減少させる)ことを示す。
好ましい実施態様では、本発明の方法は、リガンドに非共有結合させた(典型的には“ナノ粒子”と複合体を形成させるか、またはナノ粒子内に局在化させる)エフェクターを利用する。ある種の実施態様では、エフェクターは切断可能な共有結合によってリガンドと結合させることができる。
エフェクターと共役させるためのリガンド
実質的にいずれのリガンドも本発明の方法で使用するために適している。特に好ましい実施態様では、本発明の方法はペプチドを利用するが、一方、核酸、糖、種々の炭水化物、脂質および任意の有機分子をリガンドとして用いることが可能である。
コンビネーションペプチドライブラリーを製造する方法は当業者には周知である。前記ペプチドライブラリーは化学的に合成するか、または核酸発現ライブラリーによって製造することができる。コンビナトリアルライブラリーの構築における最初の研究は化学的なペプチド合成を中心とした(Furka et al.(1991) Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493; Houghton et al.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135; Geysen et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Fodor et al.(1991) Science 251:767)。
ファージディスプレー法はペプチドライブラリーの唯一の作製方法ではない。ファージ以外のベクターを用いて大きなペプチドライブラリーを作製することが可能である。
本発明の方法で使用されるリガンドはペプチドリガンドに限定されない。エフェクター/レポーターと非共有結合することができるかぎり、実質的にはいずれのリガンドも用いることができる。さらにまた、リガンドが特定のエフェクター/レポーターと非共有結合により結合することができるように、例えば特定のペプチドエピトープ用いてリガンドを誘導することができる。適切な非ペプチドリガンドには、核酸(RNAもしくはDNAまたはその類似体)、糖、炭水化物、脂質、小型の有機分子などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
化学的および/または生物学的合成方法(多数の化学的に作られた“ビルディングブロック”を組み合わせることによる)によって、極めて複雑で多様性を有するライブラリーを作製することができる。例えば、ある研究者は、100個の互換性を有するビルディングブロックを系統的に組み合わせて混合することによって、理論的には1億個の四量体化合物または100億個の五量体化合物が合成されることを観察した(Gallop et al.(1994) 37(9):1233-1250)。
液相化学合成のために周知の多数の自動システムもまた開発されている。 前記システムには以下のような自動化ワークステーションが含まれる(ただしこれらに限定されない):武田薬品工業(株)(大阪)が開発した自動合成装置およびロボットアームを用いる自動システム(ザイメート(Zymate)II(Zymark Corporation; Hopkinton, Mass).;オルカ(Orca)(ヒューレットパッカード;Palo Alto, CA)、前記は研究者による手動合成操作に類似するものである)およびベンチャーTMプラットフォーム(初めから終わりまで576から9600の同時反応を進行させることができる超高速処理合成装置(Advanced ChemTech, Inc.; Louisville, KY))。上記の装置のいずれも本発明での使用に適している。本明細書で述べたように前記装置を操作することができるように、(必要な場合には)前記装置に加えるべき改変の特性およびその実施は当業者には明白であろう。さらに、コンビナトリアルライブラリー自体も多数市販されている(ComGenex; Princeton, N.J.;Asinex; Moscow, Ru;Tripos, Inc.; St. Louis, MO;ChemStar, Ltd; Moscow, Ru;3D Pharmaceuticals; Exton, PA;Martek Biosciences; Columbia, MDなど)。
好ましい実施態様では、リガンドはエフェクターに非共有結合されている。前記結合は直接的結合であっても、エフェクターを“搬送する”担体(例えばナノ粒子)との結合であってもよい。本明細書で用いられるように、エフェクターとは、その活性を細胞内に内在化させることが所望される任意の分子または分子の組合せを指す。エフェクターには、例えば標識、サイトカイン、酵素、成長因子、転写因子、核酸、薬などの分子が含まれるが、ただしこれらに限定されない。エフェクターとして特に適切な薬は、細胞毒性抗癌剤である。細胞毒性抗癌剤の例は、アンタサイクリン(例えばドキソルビシン)、ツルニチニチソウのアルカロイド(例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン)、ホレート類似体(例えばメトトレキセート、エダトレキセート)、ヌクレオチド類似体(例えばアラビノシルシチジン、アザチミジン)、白金錯体(例えばシスプラチン、カルボプラチン)、およびアルキル化剤(例えばニトロソウレア、メルファラン、シクロホスファミド)である。
スピン標識は、不対電子対をもつレポーター分子によって提供され、前記は電子スピン共鳴(ESR)分光法によって検出することができる。典型的なスピン標識には、遊離有機ラジカル、遷移金属錯体(特にバナジウム、銅、鉄およびマンガン)などが含まれる。典型的なスピン標識にはニトロオキシド遊離ラジカルが含まれる。
他の好ましい標識には放射性標識が含まれる。放射性標識をナノ粒子に導入し、続いて前記ナノ粒子をエフェクターに非共有結合させる。例えば、同位元素125I、131I、99mTc、67Ga、111In、14C、3H、35Sおよび14Pが放射性標識として一般的に用いられる。例えば67Ga、111Inのような放射性金属イオンを、IDA、NTAなどとの混合キレート型としてエピトープタグに非共有結合させることができる。放射性標識の検出方法は当技術分野では周知である。
ある種の実施態様では、エフェクター(例えばレポーター/エフェクター)はリガンドに非共有結合により直接連結され、一方、他の実施態様では、前記エフェクターはナノ粒子内に含まれるか、および/またはナノ粒子と複合体を形成し、前記ナノ粒子がリガンドと非共有結合で連結される。本明細書で用いられるように、ナノ粒子とは、エフェクターと複合体を形成するか、またはエフェクターを含有することができ、さらにリガンドに非共有結合を提供することができる任意の“担体”である。
好ましい実施態様では、リガンドはエフェクターおよび/またはエフェクターを含むナノ粒子に非共有結合される。前記非共有結合は、イオン性相互作用、配位結合(例えばキレート結合)および/または水素結合および/または疎水性相互作用などの手段による。特に好ましい実施態様では、前記非共有結合はエピトープタグの手段による。
本明細書で用いられるようにエピトープタグとは、抗体または他の結合パートナーによって特異的に認識される分子または分子の領域を指す。したがって、例えばエピトープ/抗体相互作用で認識されるエピトープの他に、エピトープタグはまた、他の結合分子によって認識される“エピトープ”(例えばレセプターと結合するリガンド)、他のリガンドと結合してヘテロダイマーまたはホモダイマーを形成するリガンド、2から8個のヒスチジン残基を有するオリゴヒスチジン配列(例えばNi−NTAと結合したHis6)などを含む。
エフェクター/ナノ粒子の重要な事例の1つはリポソームである。リポソームは数百または数千のエフェクター分子(例えばレポーター)を含むことができる。前記によって本発明の方法の感度を高めることができる。リポソームの作製方法および種々の物質(例えばエフェクター、特にレポーター)をロードする方法は、当分野では公知で、種々の文献に記載されている(例えば以下を参照されたい:Liposome Technology, Ed. G. Gregoriadis, vol.I-III, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1993; D. Lasic (1993) Liposomes: From Physics to Applications. Elsvier, Amsterdam, 575pp)。リガンドが結合したリポソームはある種の細胞と結合および/または内在化されることが判明している(Park et al.(1997) Adv. Pharmacology, 40:399-435)。本発明のエフェクター/リガンド構築物を生成するために、例えばNTA−およびIDA−共役脂質を含むリポソームを用いることができる。
好ましい実施態様では、1つまたは2つ以上の“テスト”細胞(例えばリガンドを内在化させる能力についてスクリーニングされるべき細胞)を、リガンドと非共有結合させたエフェクター(例えばレポーター)と接触させる。1つの細胞がしばしば多数の異なるリガンド/エフェクターの組合せと接触させられるであろう。接触は、典型的には、前記細胞がリガンドを内在化させることができる条件下で、すなわち内在化機能を有するレセプターが機能を発揮できる条件下で実施される。哺乳類細胞の場合には、わずかに高い温度で(30から40℃)生理的に均衡させた塩および細胞栄養物を含む水溶液中で接触させることが好ましい。典型的には、細胞を培養状態でリガンド/エフェクター構築物と接触(インキュベート)させるが、前記のような接触は急性/新鮮調製物に由来する細胞の場合である。
特に好ましい実施態様では、リガンドおよびエフェクターはエピトープタグを介して結合される。前記のような実施態様では、(リガンドとエフェクター間の)非共有結合の形成および細胞とリガンド/エフェクター構築物との接触は、容易に単一の工程にまとめることができる。例示すれば、実施例1では、NTA−リポソーム(すなわち表面結合Ni−NTA基を有するリポソーム)(0.5から1mMの総リン脂質)の接触は、(His)6含有リガンド(約20μg/mL)とともに細胞を100μLの組織培養液(10%FCS補充)中で37℃で4時間インキュベートすることによって実施された。前記のような条件下では、リガンドはエフェクターと非共有結合を形成し細胞内に内在化された。
好ましい方法では、リガンドを内在化させるために十分な時間、リガンド/エフェクター構築物を細胞と接触させた後、非共有結合を解離させることによって前記エフェクターをリガンドから分離させる。前記は、当業者に周知の多数の任意の方法によって実施される。前記のような非共有結合を破壊する方法には、解離因子および/または解離剤、例えば熱、酸、カオトロピズム誘発薬剤、高塩、キレート剤などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。特に好ましいものは細胞保全的方法で、この場合、細胞の完全性が保存され、分離後、内在化されたリガンドおよび/またはエフェクターは本質的に細胞内に残留する。エフェクターおよびリガンドが、(例えばNi−NTA基とHis6−エピトープタグ間の)金属キレート結合によって連結されている場合、前記解離剤は、好ましくは二価遷移金属イオンと結合する試薬、例えばEDTA(典型的には0.2から5mMの低濃度)、弱い金属錯体形成試薬、例えばイミダゾール(高濃度、典型的には100から300mM)、またはジチオール化合物、例えば2,3−ジメルカプトスクシネート(典型的には0.2から10mM)で、中性生理学的緩衝食塩水中で実施される。金属イオン(例えばNi2+)の結合に対してリガンド−リポソームキレート結合と競合することによって、前記解離剤は金属イオンの結合を奪い、前記結合の崩壊をもたらす。ある好ましい実施態様では、実施例1に示したように細胞表面結合リポソーム/リガンド複合体を分離し、分離したリポソームは細胞を3から4回解離緩衝液で洗浄することによって除去した。解離緩衝液は、前記の場合は生理学的リン酸緩衝食塩水(2mMのMgCl2、2mMのCaCl2、および1mMのEDTAを含む)または250mMのリン酸緩衝イミダゾール(pH7.4)である。内在化リポソーム/リガンド複合体は解離緩衝液がアクセスすることができないので、内在化リポソームは細胞内に残留し、その存在および内在化されたリガンド/リポソーム構築物の量を示す検出可能なシグナルを提供する。
内在化されたリガンドは、当業者に周知の方法に従って検出される。リガンドは直接(例えば種々の精製技術により)検出することができるが、好ましい実施態様では、リガンドはリガンドに結合した(または付随した)エフェクター分子を検出することによって検出される。エフェクターがレポーター(検出可能な標識)である場合は、エフェクターは同種の標識を検出するために典型的に用いられる方法によって検出される。したがって、エフェクターが放射性核種である場合は、検出は、例えばシンチログラフィーまたはオートラジオグラフィーの手段による。エフェクターが比色タグである場合には検出は光学手段による。エフェクターが蛍光タグである場合は、検出は、例えば蛍光測定法、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡による。エフェクターが磁性粒子のときは、検出は磁力測定による。
エフェクターがサイトトキシンであるときは、内在化の検出は細胞死亡率の測定を必要とする。逆に、エフェクターが増殖因子またはマイトジェンの場合は、検出は細胞の増殖または分裂の検出を必要とする。
上記に述べたアッセイはまた、(例えば以前には知られていなかった)内在化機能を有するレセプターを特定するためにも用いることができる。好ましい実施態様では、そのような方法は、内在化されたリガンドを上述の方法にしたがって特定することを伴う。内在化されたリガンドは細胞から回収されおよび/または特定される。続いて、回収および/または特定されたリガンドを用いて、前記リガンドを内在化させたレセプターを特定することができる。
内在化されたリガンドを回収する方法は当業者には周知である。前記方法は、細胞を溶解し標準的な精製方法を実施して、標識された(エフェクター結合)リガンドを単離することを含む。細胞に由来する分子の精製方法は当業者には周知である。典型的な精製方法には、ゲル電気泳動、陰イオン交換クロマトグラフィー[例えばモノ−Qカラム(Pharmacia-LKB, Piscataway, New Jersey, USA)]、または逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)が含まれるが、ただしこれらに限定されない。標準的な技術に関する概論については以下を参照されたい:
Methods in Enzymology, vol.182: Guide to Protein Purification, M. Deutscher, ed. (1990), p619-626。
エフェクター(例えばレポーターまたはナノ粒子)をリガンドから分離させる工程の後で、本発明の方法を用いてリガンドを内在化させる細胞を検出するとき、細胞内のリガンドの存在は当業者に公知の任意の手段によって検出できる(上記の“内在化されたリガンドの検出”の項を参照されたい)。ある種の好ましい実施態様では、前記検出方法は、個々の細胞の検査を必要とする。そのような方法の例には以下が含まれる:蛍光性レポーターの場合はフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡法、放射性核種のレポーターの場合はオートラジオグラフィーなど。
本方法の特に好ましいある実施態様は、患者から得た身体組織または液体サンプル中の悪性細胞の検出を含む。この場合には、悪性細胞に選択的に内在化されるリガンドが用いられる。本明細書および同時係属中の米国特許第09/249,529号に記載されているように、例えば抗体(例えばscFv)を悪性細胞または他の病理学的細胞への特異的内在化のために選択し、本発明にしたがって患者の身体組織または液体サンプル中の病理学的細胞の検出および/または選別のために用いることができる。
本発明の方法はまた、細胞によるリガンドの表面結合および内在化の両方の検出に用いることができる。好ましい実施態様では、本方法は、細胞をリガンド/エフェクター(例えばリガンド/レポーター)構築物と接触させ、細胞と結合しなかった前記構築物部分(すなわち表面に結合せず細胞によって内在化もされなかった構築物)を除去し、さらに細胞と結合しているレポーターを検出し、細胞表面に結合したリガンドおよび細胞内に内在化されたリガンドの総量を示す第一の読みを得ることを含む。レポーターの細胞非結合部分の除去は、好ましくは、非解離条件下で細胞を除去することによって達成されるリガンド/レポーター構築物の除去による。前記非解離条件は、例えばリン酸緩衝食塩水、緩衝塩溶液(リンゲル、ハンクス溶液)、細胞培養液、または解離剤を含まない他の生理学的媒体を用いることによる。したがって、前記解離剤の非存在下では、細胞表面結合リガンド/エフェクター構築物は細胞上に完全なままで残留し、細胞に付随する全リガンドの第一の測定値を提供するエフェクターから検出されるシグナルに寄与するであろう。
本発明の方法はまた、リガンドの内在化を調節する薬剤のスクリーニングに用いることができる。好ましい実施態様では、前記方法は本明細書で述べたようにリガンドの内在化についてスクリーニングすることを含み、この場合、細胞をエフェクター/リガンド構築物と接触させる前、および/またはその間、および/またはその後で前記細胞をスクリーニングされるべきテスト薬剤と接触させる。例えば濃度の低いテスト薬剤を含むかまたはテスト薬剤を含まない陰性コントロールと比較したとき、テスト薬剤と接触した細胞によるリガンドの内在化における差異は、前記テスト薬剤が対象のリガンドの内在化を調節する(例えば増加または低下させる)ことを示す。内在化されるリガンドの増加は、テスト薬剤が内在化をアップレギュレートすることを示し、一方、内在化されるリガンドの減少は、テスト薬剤が内在化をダウンレギュレートすることを示す。
調節物質の活性のアッセイは典型的には陽性のスコアとして記される。この場合、テスト薬剤が存在する場合に観察される活性とコントロール(通常は陰性コントロール)との間に差異が存在し、この場合、好ましくは前記差異は統計的に有意である(例えば80%を越える、好ましくは約90%を越える、より好ましくは約98%を越える、もっとも好ましくは約99%を越える信頼度レベルである)。もっとも好ましい“陽性”アッセイは、陰性コントロール(テスト薬剤が存在しないか、またはより低い濃度で存在するもの)とは少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも1.5倍、より好ましくは少なくとも2倍、もっとも好ましくは少なくとも4倍、または10倍すら相違する。
本発明の方法は高処理スクリーニングに極めて適切である。特にエピトープタグを用いてリガンドがエフェクターに連結される場合は、前記アッセイは本質的に、リガンドおよび/またはエフェクターの複雑な精製を必要としない“単工程”様式で実施される。実施例1に示すように、対象細胞をリガンドおよびエフェクターと適切な“インキュベーション”条件下で一緒にするだけで十分である。リガンドはエフェクターと結合し、細胞が対応する内在化機能を有するレセプターを有する場合は、前記リガンドは結合されているエフェクター(例えば標識)とともに細胞内に内在化される。
本発明の方法で用いられる細胞を、リガンドおよび/またはただ1つのテスト薬剤と一度に接触させる必要は無い。反対に、高処理スクリーニングを促進するために、ただ1つの細胞を少なくとも2つ、好ましくは少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも10、もっとも好ましくは少なくとも20、少なくとも50、または少なくとも100個のリガンドまたはテスト薬剤と接触させることができる。細胞が陽性スコアを示したら、活性を有するテスト薬剤、または内在化リガンドが特定されるまで、続いてサブセットの前記リガンドまたはテスト薬剤を用いてテストすることができる。
高処理スクリーニングは、当業者に公知の多数の様式で実施することができる。好ましい実施態様では、高処理スクリーニングはマイクロタイタープレート様式を利用する(例えば96ウェル様式、480ウェル様式、960ウェル様式など)
ある種の実施態様では、本発明は、エフェクターを細胞内に配送する組成物を提供する。前記組成物は以下の(i)および(ii)を含む:(i)疎水性脂質部分、前記脂質部分と結合した親水性ポリマー、および前記親水性ポリマーと結合したキレート基(ここで前記キレート基は金属イオンと錯体を形成しエピトープタグと結合する)を含む金属キレート脂質、および(ii)前記エピトープタグを含むリガンド(ここで前記エピトープタグは少なくとも2つの隣り合うヒスチジン残基(ヒスチジンタグ)を含む)。さらに、前記組成物ではエフェクターは前記金属キレート脂質と結合している。前記タグは、好ましくは6つの隣接するヒスチジン残基を含む(ヘキサヒスチジンタグ)。好ましい組成物は、金属キレート脂質とエフェクターがリポソーム内に含まれるものである。本明細書に記載したいずれのエフェクターおよび/またはリガンドも適切である。前記エフェクターは、例えばレポーター、サイトトキシン、薬または核酸である。前記リガンドは典型的にはタンパク質、炭水化物、核酸、または小有機分子である。リガンドは天然でも合成でもよい。好ましいタンパク質リガンドは、抗体(例えば免疫グロブリンおよびそのフラグメント)の抗原結合配列を含むもので、天然または組換えによって生成されたもので単鎖フラグメントを含む。前記リポソームはさらに脂質−ポリマー共役物、特に脂質−ポリ(エチレングリコール)共役物を含むことができる。前記リポソームでは、金属キレート脂質は典型的には0.1モル%から50モル%、好ましくは0.2モル%から10モル%を構成する。場合によって、前記脂質ポリマー共役物(金属キレート基を含まない)はリポソーム脂質の20モル%まで含まれてあってもよい。
ある種の実施態様では、本発明の方法はさらに特定された内在化機能を有するレセプターを内在化レセプター特定データベースに収めること、および/またはそのようなデータベースにリガンド内在化の調節物質を収めることを含む。データベースという用語は情報を記録しさらに情報を取り出す手段を指す。好ましい実施態様では、前記データベースはまた、保存された情報の分類および/または検索のための手段を提供する。前記データベースは以下を含む(ただしこれらに限定されない)任意の都合のよい媒体を含むことができる:ペーパーシステム、カードシステム、機械システム、電子システム、光学システム、磁気システム、またはその組合せ。好ましいデータベースには電子(例えばコンピュータ支援)データベースが含まれる。データベースの保存および操作で使用されるコンピュータシステムは当業者には周知で、“パーソナルコンピュータシステム”、メーンフレームシステム、ネット間またはネット内連絡拠点(distributed nodes on an inter- or intra-net)、特殊化ハードウェアに保存されたデータまたはデータベースなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
別の実施態様では、本発明は、本明細書に記載した方法を実施するための材料を含むキットを提供する。ある好ましい実施態様では、前記キットは、エフェクター(例えばレポーター)とエピトープタグを介して非共有結合されたリガンドを収納する容器を含む。前記キットは、1つのタイプのリガンドを含む“単一”構築物、または多数の異なるリガンドを提供する構築物ライブラリーを含むことができる。また別には、エフェクター(例えばレポーターまたはナノ粒子)は、(別々の容器の)1つまたは2つ以上のリガンドと一緒に提供することができる。それによって提供された指示および特定の用途に合わせて、前記エフェクターおよびリガンドを使用者が混合したとき、エフェクター/リガンド構築物が生成されるであろう。
さらに、キットは、本発明の方法のための一般的な指示および/または固有のプロトコルを提供する指示物を含むことができる。前記指示物は典型的にはタイプまたは印刷されたものを含むが、ただしそのようなものに限定されない。前記の指示を保存し、さらに前記指示を最終使用者に伝達することができるいずれの媒体も本発明に包含される。前記媒体には、電子保存媒体(例えば磁性ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えばCDROM)などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記媒体には、前記の指示物を提供するインターネットのサイトのアドレスを含むことができる。
実施例1
金属キレートリポソームを用いる抗体の内在化をモニターする新規なアッセイ
序
抗体および抗体フラグメントは、多様な薬剤(例えば薬、遺伝子、毒素または放射性核種)を抗原発現細胞に配送することができる。細胞内部への前記抗体フラグメントのエンドサイトーシスは多くの場合、前記治療薬の治療効果を高めることができる。薬のデリバリールートとしてのレセプター仲介エンドサイトーシスの主要な利点は、治療薬剤がレセプターを過剰発現している標的細胞に特異的に配送され、それによって効能が高められ、一方、全身的毒性は減少させることができるということである。例えば、抗ErbB2抗体を用いて、ドキソルビシン含有リポソーム(Park et al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:1327-1331)、またはシュードモナス外毒素(イムノトキシン)(King et al.(1996) Semin Cancer Biol 7:79-86)が腫瘍細胞の内部に誘導された。
リポソームの調製:リポソームは、1−パルミトイル−2−オレオイル−ホスファチジルコリン(POPC)およびコレステロール(6:4モル比)並びに種々の量のNTA−DOGS(Avanti Lipids)(0.5から5モル%のPOPC)から、35mMの8−ヒドロキシピレン−1,3,5−トリスルホン酸ナトリウム塩(HPTS)(Molecular Probes Inc., Oregon, USA)を含む溶液(pH7.0)(NaClで浸透圧を280nmol/kgに調整)中で脂質フィルムの水和によって調製される。いくつかの事例では、前記リポソームは、1,2−ジステアロイル−ホスファチジルコリン(DSPC)をPOPCの代わりに用いて作製し、親油性蛍光標識DiIC18(3)−DSおよびDiIC8(5)−DS(リポソームリン脂質の0.1−1モル%)をHPTSの代わりに用い、同じ結果を得た。前記の事例では、水和は、5から20mMの4−(N−2−ヒドロキシエチル−ピペラジノ)エチルスルホン酸ナトリウム塩(HEPES)でpH7.2から7.4に緩衝させた140mMのNaCl水溶液中で55から60℃で実施される。水和後、文献(Kirpotin et al.(1997) Biochemistry 36:66-75)の記載にしたがって2つの0.1μmのポリカーボネートメンブレン(Corning)から膜押出しによってリポソームを形成する。続いて非被包化HPTSを架橋デキストランビーズ(セファデックスG−25)(Pharmacia Amersham, New Jersey, USA)上でのゲルろ過によって分子した。
リポソーム製剤:リポソームは0、0.5、2および5モル%のNTA−脂質を用いて製剤化し、C−末端(His)6タグを含むように組換え操作を施した抗ErbB2scFv抗体(F5)を用いSKBR3腫瘍細胞への内在化についてテストした。4時間の内在化反応の後、細胞をPBS中の1mMEDTAで洗浄し、さらに前記細胞を塩基中で溶解し、マイクロフルオリメーターで蛍光の読みを得た。シグナル強度は、調べた範囲では高NTA−脂質組成物で劇的に増加した(図1)。内在化は、scFvがhis−タグを含まないとき、またはリポソームをNTA含有脂質無しで製剤化したときには生じなかった(図2)。前記アッセイの有用性を完全長のモノクローナル抗体にまで広げるために、二価性試薬スルホ−MBSを用いてプロテインAをペプチドCGGGHHHHHH(配列番号:2)と共役させた(前記試薬は前記ペプチド内のチオール基をプロテインAの第一アミンと架橋させる)。SDS−PAGE分析で約10kDaの分子量の明瞭なシフトが示されたことによって明らかなように、プロテインA1分子につき多数のペプチドが共役できることが確認された(データは示されていない)。SKBR3細胞をプロテインA−(His)6および抗ErbB2モノクローナル抗体ヘルセプチンと一緒にインキュベートしたとき、NTA−リポソームは特異的にエンドサイトーシスにより内在化された(図2)。プロテインA−(His)6またはヘルセプチン単独ではNTA−リポソームの取込みは増加せず、内在化はヘルセプチン/プロテインA−(His)6複合体によって仲介されることを示した(図2)。
アッセイの感度:アッセイの感度は、SKBR3細胞で異なるエピトープに対する種々の濃度の抗体を用いてテストした(図4)。F5scFv抗体(抗ErB2抗体)のみが複合体の内在化をもたらした。興味深いことには、無関係の抗体(4G7)および非内在化抗ErbB2抗体(C6.5)は、NTA−リポソームの内在化を仲介しなかった(図5)。この結果は、F5およびC6.5の内在化について共焦点顕微鏡分析によって我々が得た以前の結果と一致する。SKBR3細胞でF5scFvを用いたアッセイの検出レベルは精製抗体1μg/mL以下であった。
リポソームとリガンドのエピトープ仲介非共有結合共役のための
脂質−NTA共役物
6−(1,2−ジパルミトイルグリセロール−3−スクシニル)アミド−2−(N,N−ジカルボキシメチルアミノ)−ヘキサン酸ニッケル塩(DPGS−NTA−Ni)
6−アミノ−2−(N,N−ビス−カルボキシメチルアミノ)ヘキサン酸(I)をN(イプシロン)−CBZ−リジンおよびブロム酢酸から文献(Schmitt et al.(1994) J. Amer. Chem. Soc. 116:8485-8491)にしたがって合成した。ただし、カルボベンゾキシ保護基の除去は4MのHBr/氷酢酸混合物中で一晩実施し、ヒドロブロミドとして(I)を回収した。
1,2−ジパルミトイル−3−スクシニル−rac−グリセロール(II)は、1,2−ジパルミトイル−グリセロール、無水コハク酸、および4−ピロリジノピリジンから文献(Silvius & Leventis (1987) Biochemistry 26:3297)にしたがって調製した。
化合物(III)について記載した方法と同じ方法で、244mgのコレステリルヘミスクシネート(Sigma Chemical Co., USA)をN−ヒドロキシスクシンイミドおよびDCCと反応させ、さらに化合物(I)のヒドロブロミドと反応させた。硫酸第一ニッケルの添加に際して、緑色のペーストが生成された。前記ペーストを数回クロロホルム−メタノール混合物(容積で5:1)で抽出した。前記抽出物を硫安無水物上で乾燥させ、GF/Cガラス繊維フィルターでろ過し、真空中で乾燥させた。119.5mg(理論的収量30%)の緑色の固形物が得られ、前記はクロロホルムに容易に溶解して青緑色の溶液を生じる。TLC:Rf0.12(シリカ;CHCl3−MeOH−H2O=65:25:4)。意図した構造であることはPMRによって確認された。
分子量が3400のポリ(エチレングリコール)から調製した198mg(0.0445mmol)のジステアロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ポリ(エチレングリコール)−プロピオン酸N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(NHS−PEG−DSPE;Shearwater Polymers, Alabama, USA)を、1mLのエタノール無水物および0.5mLのクロロホルム無水物の混合物に溶解し、さらに0.5mLのエタノール無水物および0.15mL(1.08mmol)のトリエチルアミンの混合物中の(I)のヒドロブロミド40.8mg(0.120mmol)の溶液と混合し、60℃で2時間攪拌した。前記反応混合物を乾燥させ、0.14MのNaCl水溶液の3mLに溶解した。前記混合物を15500×gで5分遠心分離して清澄にし、さらに透明な上清を真空中で乾燥させた。残留物を2.5mLの0.144MのNaClに溶解し、pHを1NのNaOHで6.8に調節し、0.12mLの1MのNiSO4を添加した。架橋デキストランビーズ(セファデックスG−75;Pharmacia Amersham, USA)の13mLのカラムで0.144MのNaClを溶離液として用いて前記溶液でクロマトグラフィーを実施した。ボイド容積(合計4mL)で出現する分画を集め、一晩凍結乾燥して乾燥させた。前記凍結乾燥固形物を2mLのエタノール無水物および0.2mLのクロロホルムの混合物で抽出し、不溶物質を遠心分離で除去し、透明な溶液を真空中で乾燥させた。残留物を0.1mLのクロロホルムを含む2mLのエタノールに再度溶解し、前記溶液を遠心分離(15.5×g、5分)によって清澄にし、さらに真空中で乾燥させた。青色の固形物をクロロホルム−メタノール混合物(容積で60:40)に溶解した。水に溶解した場合淡青色の溶液を生じた。意図した構造であることはPMRで確認した。
Ni−NTA−PEG−DSPEおよびHis付せん付きscFv抗体を
用いた細胞毒性リポソームの細胞内デリバリー
DSPC、コレステロール、メトキシポリ(エチレングリコール)−DSPE誘導体(PEG(2000)−DSPE、PEG分子量2000;Avanti Polar Lipids, Alabama, USA)および化合物V(Ni−NTA−PEG−DSPE)(モル比=3:2:0.05:0.06)の脂質組成を有するリポソームを、脂質フィルム水和法(lipid film hydration)およびポリカーボネートトラックエッチング処理膜(polycarbonate track-etched membrane)(0.1μm、10回)押出し法を0.25Mの硫安水溶液中で55℃で実施して調製した。架橋デキストランビーズ(セファデックスG−75;Pharmacia, New Jersey, USA)を用いてゲルクロマトグラフィーを実施して、未被包化硫安を除去し、5%デキストロース、5mMモルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝液(pH5.5、NaOHで調節)に移した後、リポソームを10mg/mLの二酒石酸ビノレルビン溶液USP(Glaxo Wellcome, USA)と混合してモル比5:1の薬剤/脂質とし、55℃で30分インキュベートした。非被包化ビノレルビンを上記のようにゲル−クロマトグラフィーで除去した。典型的には>80%の薬剤が、前記のようにして得られたNi−NTA−PEG−DSPE含有リポソームに被包化されたままであった。コントロールリポソームは、Ni−NTA−PEG−DSPEの代わりにPEG−DSPEを用いて調製した。共有結合4G7含有リポソームは、ビノレルビン付加コントロールリポソームを両親媒性リンカーと共役させた4G7共役物、マレイミド−PEG−DSPEとともにインキュベートして調製した(米国特許第6,210,707号(Papahadjopoulos et al.))。血管内皮増殖因子(VEGF)レセプターを発現しているウシの内皮細胞(BEND−3)を、遊離(すなわち非被包化)ビノレルビン0.03から90μg/mLまたは、ヘキサヒスチジンタグおよび末端システイン基を有する内在化(機能を有する)抗VEGFRscFv抗体0.02mg/mLを含む、もしくは含まないNi−NTA−PEG−DSPEリポソームに被包化したビノレルビンを含有する増殖培養液中でインキュベートした。前記細胞を前記薬剤を含まない増殖培養液でさらに72時間ポストインキュベートし、細胞の生存度を通常のテトラソリウム(MTT)アッセイで決定した。細胞毒性中央値用量(IC50)(すなわち、未処理コントロールの50%まで細胞生存度を減少させる用量)は以下のとおりであった:遊離ビノレルビン、0.67μg/mL;4G7scFvを含まないNi−NTA−PEG−DSPEリポソーム中のビノレルビン、>100μg/mL(IC50に達せず);コントロールリポソーム+4G7scFv、<100μg/mL(IC50に達せず);共有結合4G7を含むリポソーム中のビノレルビン、2.5μg/mL;Ni−NTA−PEG−DSPEリポソーム+4G7scFv、1.4μg/mL。したがって、レセプター特異的scFvがヘキサヒスチジンタグを介して結合したNi−NTA−PEG−DSPE含有リポソームによって、血管上皮細胞にビノレルビンが特異的に配送されることが観察された。
Ni−NTA−PEG−DSPEリポソームおよびヘキサヒスチジン
付せん付き抗体による癌細胞へのメトトレキセートの誘導配送
文献(Szoka and Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4134-4178)に記載された逆相蒸発法によって、DSPC、コレステロールおよびPEG(2000)−DSPE(モル比、3:2:0.025)並びにN−4−ヒドロキシエチル−ピペラジノ−エチルスルホン酸(HEPES)ナトリウム塩(pH7.2)の10mM緩衝溶液中のメトトレキセートナトリウム溶液(100mg/mL)からメトトレキセート含有リポソームを調製した。溶離液として20mMのHEPES、144mM塩化ナトリウム(HBS緩衝液)を用いてゲル−クロマトグラフィーによって非被包化メトトレキセートを分離した。リポソームのリン脂質1mmol当たり150±7mgのメトトレキセートを含む生成されたリポソームを、HBS緩衝液に溶解したNi−NTA−PEG−DSPEとともにリポソームのリン脂質の2モル%の量でインキュベートした(55℃、30分)。リポソームから薬剤の漏出は前記インキュベーション中には検出されなかった。4G7scFv含有、非含有の前記リポソームおよび遊離メトトレキセートの毒性中央値用量(IC50)は、実施例3に記載したようにBEND3細胞培養で決定し、以下のとおりであった:遊離メトトレキセート、>90μg/mL(IC50に達せず);抗体を含まないNi−NTA−PEG−DSPEリポソーム中のメトトレキセート、>90μg/mL(IC50に達せず);ヘキサヒスチジン付せん付き4G7scFv存在下でのNi−NTA−PEG−DSPEリポソーム中のメトトレキセート、9μg/mL。したがって予め生成したメトトレキセートリポソームへのNi−NTA−PEG−DSPEの取込みによって、ヒスチジン付せん付き抗体を含む内在化され得る構築物を形成するメトトレキセート含有リポソームが得られた。
種々のNi−NTA脂質を含むリポソームへの細胞毒性薬剤の付加
リポソーム中のNi−NTA脂質の性質は、トランスメンブレングラディエント法によるサイトトキシンノ被包化効率に予期せぬ影響を示した。0.25Mの硫安を捕捉したリポソームを以下の組成を有する脂質マトリックスを用いて調製した:DSPC、コレステロール(Chol)およびPEG−DSPE(モル比、3:2:0.03)、調製物A;DSPC、Chol、PEG−DSPEおよびNi−NTA−DOGS(モル比、3:2:0.03:0.06)、調製物B;およびDSPC、Chol、およびNi−NTA−PEG−DSPE(化合物V)(モル比、3:2:0.03:0.06)、調製物C。リポソームを5%デキストロース、5mMのMES−N緩衝液(pH5.5)(MES−デキストロース)に入れた後、ビノレルビン(VNR)またはドキソルビシン(DOX)を、リポソームのリン脂質1mmol当たり150mgの薬剤のインプット薬剤/脂質比で前記リポソームとインキュベートした(55℃、30分)。リポソームを氷上で冷却し、さらに、MES−デキストロース緩衝液を用いてゲル−クロマトグラフィーで非被包化薬剤を分離した。リポソームのリン脂質の濃度は、リポソームの酸性消化後にモリブデート−アスコルビン酸法によって分光光度法で決定した。リポソームの薬剤の濃度は、80%メタノール水溶液(ビノレルビン、370nmでの吸収)または70%イソプロパノール−0.1M塩酸水溶液(ドキソルビシン、485nmでの吸収)中にリポソームを溶解した後、標準曲線との比較によって分光光度法で決定した。ローディング効率はローディングのために添加した全薬剤に対する被包化薬剤の百分率として算出した。結果を表1に示す。
本明細書に示した実施例および実施態様は単なる例示であって、種々の改変および変更が当業者によって提唱されるであろうが、それらは本発明の範囲内に包含されることは理解されよう。本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は参照により本明細書に含まれる。
本出願は、USSN60/241279(2000年10月18日出願)(前記文献は参照により本明細書に含まれる)の優先権を主張する。
連邦政府の研究開発補助により達成された発明の権利に関する記載
本研究は、米国国防省乳癌研究プログラム(Department of Defense Breast Cancer Research Program)グラント番号DAMD17-94-J-4433およびDAMD17-98-1-8189によって部分的に補助された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
Claims (29)
- 脂質、前記脂質と結合した親水性ポリマー、および前記親水性ポリマーと結合した金属キレート基を含む金属キレート脂質組成物であって、前記金属キレート基はオリゴヒスチジンタグと金属キレート結合を形成しており、前記金属キレート基は、前記金属キレート基に結合した金属イオンよりも配位部位が少ない、金属キレート脂質組成物。
- 前記親水性ポリマーが4つ以上のモノマーユニットを含む、請求項1の金属キレート脂質組成物。
- 前記金属キレート基がニトリロ三酢酸(NTA)である、請求項1または請求項2の金属キレート脂質組成物。
- 前記金属キレート基がイミノ二酢酸(IDA)である、請求項1または請求項2の金属キレート脂質組成物。
- 前記親水性ポリマーがポリ(エチレングリコール)を含む、請求項1〜4のいずれか1項の金属キレート脂質組成物。
- 前記脂質がジステアロイル−グリセロホスホリル−エタノールアミン(DSPE)を含む、請求項1〜5のいずれか1項の金属キレート脂質組成物。
- 前記金属キレート基に、Ni、Co、CuまたはZnの二価イオンが結合している、請求項1〜6のいずれか1項に記載の金属キレート脂質組成物。
- 前記オリゴヒスチジンタグがHis6タグである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の金属キレート脂質組成物。
- 6−(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロホスホリル−エタノールアミノカルボニル)ポリ(オキシエチレン)−(オキシカルボニル)アミノ−2−(N,N−ビス−カルボキシメチルアミノ)−ヘキサン酸(DSPE−PEG−NTA)を含む金属キレート脂質組成物であって、前記NTA基はオリゴヒスチジンタグと金属キレート結合を形成しており、前記NTA基は、前記NTA基に結合した金属イオンよりも配位部位が少ない、金属キレート脂質組成物。
- 前記NTA基に、Ni、Co、CuまたはZnの二価イオンが結合している、請求項9に記載の金属キレート脂質組成物。
- ステロール、前記ステロールと結合した親水性ポリマー、および前記親水性ポリマーと結合した金属キレート基を含む金属キレート脂質組成物であって、前記金属キレート基はオリゴヒスチジンタグと金属キレート結合を形成しており、前記金属キレート基は、前記金属キレート基に結合した金属イオンよりも配位部位が少ない、金属キレート脂質組成物。
- 前記親水性ポリマーが4つ以上のモノマーユニットを含む、請求項11の金属キレート脂質組成物。
- 前記ステロールがコレステロールであり、前記金属キレート基がニトリロ三酢酸(NTA)である請求項11または12の金属キレート脂質組成物。
- 前記金属キレート基に、Ni、Co、CuまたはZnの二価イオンが結合している、請求項11〜13のいずれか1項に記載の金属キレート脂質組成物。
- 請求項1〜14のいずれか1項の金属キレート脂質組成物;
細胞と結合し、さらに場合によって該細胞によって内在化されることを特徴とする、前記オリゴヒスチジンタグを含むリガンド;及び
前記金属キレート脂質組成物に結合しているエフェクター
を含むことを特徴とする組成物。 - 前記脂質がリポソームを含むこと;及び、
前記リポソームが、前記エフェクターを含有するか、または前記エフェクターと複合体を形成すること
を特徴とする請求項15の組成物。 - 前記親水性ポリマーがポリ(エチレングリコール)を含む、請求項15または16の組成物。
- 前記脂質がDSPEを含む、請求項15〜17のいずれか1項の組成物。
- オリゴヒスチジンタグを介してエフェクターと非共有結合されたリガンドを含有することを特徴とする、内在化レセプターについて細胞をスクリーニングするための構築物であって、
前記エフェクターは、請求項1〜14のいずれか1項の金属キレート脂質組成物に結合しており、前記リガンドは前記オリゴヒスチジンタグを含み、前記金属キレート脂質組成物の金属キレート基は前記オリゴヒスチジンタグと金属キレート結合を形成している、内在化レセプターについて細胞をスクリーニングするための構築物。 - 前記リガンドがペプチドである請求項19の構築物。
- 前記リガンドが、scFv、Fv、Fab、モノクローナル抗体、サイトカイン、酵素、ホルモンおよび増殖因子から成る群から選択される請求項19または20の構築物。
- 前記リガンドがファージディスプレーライブラリーで生成されるリガンドである請求項19〜21のいずれか1項の構築物。
- 前記ファージディスプレーライブラリーが繊維状ファージを用いる請求項22の構築物。
- 前記エフェクターが、酵素、比色標識、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、ナノ粒子およびリポソームから成る群から選択される請求項19〜23のいずれか1項の構築物。
- 前記オリゴヒスチジンタグがヘキサヒスチジン(His6)タグであり、前記レポーターがニトリロ三酢酸(NTA)脂質またはイミノ二酢酸(IDA)脂質を含有するリポソームである請求項19〜24のいずれか1項の構築物。
- 前記リガンドが抗体であり、前記オリゴヒスチジンタグが、プロテインAまたはプロテインGとの共有結合を介して前記抗体と結合される請求項19〜25のいずれか1項の構築物。
- 前記構築物が前記リガンドに対して多価である請求項19〜26のいずれか1項の構築物。
- 内在化機能を有する細胞を特定するか、または細胞によって内在化されたリガンドをスクリーニングするためのキットであって、請求項19〜27のいずれか1項に記載の構築物のライブラリーを収納する容器を含むことを特徴とする、前記特定またはスクリーニング用キット。
- リガンドを内在化させる細胞を特定する用途、または細胞によって内在化されたリガンドを特定する用途で前記ライブラリーを使用することについて説明する指示物をさらに含む請求項28のキット。
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