JP4987970B2 - Zap−70相互作用分子の同定およびzap−70の精製のための方法 - Google Patents
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Description
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物を提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、
(c) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体を所与の化合物とともにインキュベーションする段階、および
(d) 化合物が固定化アミノピリド-ピリミジンリガンド24からリン酸化ZAP-70を分離できるかどうかを判定する段階。
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物を提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、所与の化合物および固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、ならびに
(c) 段階(b)において形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体を検出する段階。
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物の二つのアリコートを提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24と一方のアリコートを接触させる段階、
(c) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、所与の化合物および固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24ともう一方のアリコートを接触させる段階、ならびに
(d) 段階(b)および(c)において形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量を測定する段階。
(a) リン酸化ZAP-70を含有する少なくとも一つの細胞をそれぞれ含む二つのアリコートを提供する段階、
(b) 一方のアリコートを所与の化合物とともにインキュベーションする段階、
(c) それぞれのアリコートの細胞を収集する段階、
(d) タンパク質調製物を得るために細胞を溶解させる段階、
(e) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、ならびに
(f) 段階(e)においてそれぞれのアリコートで形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量を測定する段階。
(a) 上記のZAP-70相互作用化合物を同定する段階、および
(b) 相互作用化合物を薬学的組成物へと製剤化する段階。
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物を提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、および
(c) 固定化アミノピリド-ピリミジンリガンド24からリン酸化ZAP-70を分離する段階。
[本発明101]
以下の段階を含む、ZAP-70相互作用化合物の同定のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物を提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、
(c) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体を所与の化合物とともにインキュベーションする段階、および
(d) 化合物が固定化アミノピリド-ピリミジンリガンド24からリン酸化ZAP-70を分離できるかどうかを判定する段階。
[本発明102]
段階(d)が、分離されたリン酸化ZAP-70の検出または分離されたリン酸化ZAP-70の量の測定を含む、本発明101の方法。
[本発明103]
好ましくはリン酸化ZAP-70に対する抗体を用いる、好ましくはリン酸化ZAP-70の493位でのリン酸化を認識する抗体を用いる、質量分析法または免疫検出法により、分離されたリン酸化ZAP-70が検出されるかまたは分離されたリン酸化ZAP-70の量が測定される、本発明102の方法。
[本発明104]
以下の段階を含む、ZAP-70相互作用化合物の同定のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物を提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、所与の化合物および固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、ならびに
(c) 段階(b)において形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体を検出する段階。
[本発明105]
段階(c)において検出がアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量を測定することにより行われる、本発明104の方法。
[本発明106]
段階(a)〜(c)が、異なる化合物を試験するためにいくつかのタンパク質調製物を用いて行われる、本発明104または105の方法。
[本発明107]
以下の段階を含む、ZAP-70相互作用化合物の同定のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物の二つのアリコートを提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24と一方のアリコートを接触させる段階、
(c) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、所与の化合物および固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24ともう一方のアリコートを接触させる段階、ならびに
(d) 段階(b)および(c)において形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量を測定する段階。
[本発明108]
以下の段階を含む、ZAP-70相互作用化合物の同定のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有する少なくとも一つの細胞をそれぞれ含む、二つのアリコートを提供する段階、
(b) 一方のアリコートを所与の化合物とともにインキュベーションする段階、
(c) それぞれのアリコートの細胞を収集する段階、
(d) タンパク質調製物を得るために細胞を溶解させる段階、
(e) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、ならびに
(f) 段階(e)においてそれぞれのアリコートで形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量を測定する段階。
[本発明109]
化合物とともにインキュベーションされなかったアリコートに比べて、化合物とともにインキュベーションされたアリコートにおいて形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量が減少したことにより、ZAP-70が化合物の標的であることが示される、本発明107または108の方法。
[本発明110]
アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量が、固定化アミノピリド-ピリミジンリガンド24からのリン酸化ZAP-70の分離、および、分離されたリン酸化ZAP-70のその後の検出または分離されたリン酸化ZAP-70の量のその後の測定によって測定される、本発明105〜109のいずれかの方法。
[本発明111]
好ましくはリン酸化ZAP-70に対する抗体を用いる、好ましくはリン酸化ZAP-70の493位でのリン酸化を認識する抗体を用いる、質量分析法または免疫検出法により、リン酸化ZAP-70が検出されるかまたはZAP-70の量が測定される、本発明110の方法。
[本発明112]
中処理スクリーニングまたは高処理スクリーニングとして行われる、本発明101〜111のいずれかの方法。
[本発明113]
化合物が、合成化合物、または有機合成薬物、より好ましくは小分子有機薬物および天然小分子化合物からなる群より選択される、本発明101〜112のいずれかの方法。
[本発明114]
ZAP-70相互作用化合物がZAP-70阻害剤である、本発明101〜113のいずれかの方法。
[本発明115]
固体支持体がアガロース、修飾アガロース、セファロースビーズ(例えば、NHS活性化セファロース)、ラテックス、セルロース、および強磁性粒子またはフェリ磁性粒子からなる群より選択される、本発明101〜114のいずれかの方法。
[本発明116]
アミノピリド-ピリミジンリガンド24が固体支持体に共有結合する、本発明101〜115のいずれかの方法。
[本発明117]
以下の段階を含む、薬学的組成物の調製のための方法:
(a) 本発明101〜116のいずれかのZAP-70相互作用化合物を同定する段階、および
(b) 相互作用化合物を薬学的組成物へと製剤化する段階。
[本発明118]
以下の段階を含む、リン酸化ZAP-70の精製のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物を提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、および
(c) 固定化アミノピリド-ピリミジンリガンド24からリン酸化ZAP-70を分離する段階。
[本発明119]
段階(c)の後に、リン酸化ZAP-70に結合できるタンパク質の同定をさらに含む、本発明118の方法。
[本発明120]
段階(c)の後に、リン酸化ZAP-70の翻訳後修飾の判定をさらに含む、本発明118の方法。
[本発明121]
段階(c)の後に、リン酸化ZAP-70および/またはリン酸化ZAP-70に結合できるタンパク質のいずれかを質量分析法または免疫検出法によって特徴決定する、本発明118〜120のいずれかの方法。
[本発明122]
タンパク質調製物の提供が、リン酸化ZAP-70を含有する少なくとも一つの細胞を収集する段階および細胞を溶解させる段階を含む、本発明101〜121のいずれかの方法。
[本発明123]
アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成の段階が本質的に生理学的な条件の下で行われる、本発明101〜122のいずれかの方法。
[本発明124]
ZAP-70相互作用化合物の同定のためのアミノピリド-ピリミジンリガンド24の使用。
[本発明125]
リン酸化ZAP-70の精製のためのアミノピリド-ピリミジンリガンド24の使用。
[本発明126]
慢性リンパ性白血病(CLL)用の診断薬(diagnosticum)の調製のためのアミノピリド-ピリミジンリガンド24の使用。
[本発明127]
ZAP-70の全量に関連して試料中のリン酸化ZAP-70の存在/量を測定する段階を含む、CLLの診断/予後診断のための方法であって、CLL患者由来の試料中のZAP-70 (非リン酸化ZAP-70およびリン酸化ZAP-70)の全量に比べてリン酸化ZAP-70の量が増大したことにより、侵襲型CLLの可能性がより高いことが示される、方法。
本実施例は、細胞溶解物からキナーゼを親和性捕捉するための親和性マトリックスの調製を例示する。アミノ官能基による共有結合を通じて、捕捉用リガンドを固体支持体に共有結合的に固定化した。この親和性マトリックスを実施例2および実施例3のなかで使用した。
合成の最初の7段階はKlutchko, S.R. et al., 1998, Journal of Medicinal Chemistry 41, 3276-3292に記述されているように行った。残りの段階は下記のように行った。
J. Med. Chem. 1998, 41, 3276-3292中の手順に従って、6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-メタンスルホニル-8-メチル-8H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オンを4-クロロ-2-メチルスルファニル-5-ピリミジンカルボキシレートエチルエステルから合成した。
6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-メタンスルホニル-8-メチル-8H-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-オン(0.100 g, 0.2 mmol)および3-(N-Boc-メチルアミノ)アニリン(0.421 g, 2.0 mmol)を固形物として混合し、30分間140℃に加熱した。粗反応混合物をジクロロメタンに溶解し、2 N HCl (aq)で2回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し濃縮した。粗生成物を熱酢酸エチルから再結晶化して、{4-[3-(2,6-ジクロロ-フェニル)-1-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-[1,6]ナフチリジン-7-イルアミノ]ベンジル}-カルバミン酸tert-ブチルエステルを黄色の固形物(0.031 g- 25%)として得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 10.18 (s, 1H); 8.83 (s, 1H); 7.76 (d, 2H); 7.58 (d, 2H); 7.46 (dd, 1H); 7.32 (brt, 1H); 7.23 (d, 2H); 4.10 (d, 2H); 3.66 (s, 3H); 1.40 (s, 9H)。LCMS: 方法A, RT = 5.60分。
{4-[3-(2,6-ジクロロ-フェニル)-1-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-[1,6]ナフチリジン-7-イルアミノ]ベンジル}-カルバミン酸tert-ブチルエステル(0.026 g, 0.05 mmol)をメタノール(3 ml)に溶解し、塩酸(ジオキサン中4 N, 1.2 ml)を加えた。反応物を1.5時間室温で撹拌し、その時点では、HPLCから残存する出発材料は示されなかった。溶媒を真空で除去した。残留物を水に溶解し、溶液を炭酸ナトリウム(sat., aq.)で塩基性化した。得られた沈殿物を回収し乾燥して、7-(4-アミノメチル-フェニルアミノ)-3-(2,6-ジクロロ-フェニル)-1-メチル-1H-[1,6]ナフチリジン-2-オン(0.021 g -100%)を黄色の固形物として得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 10.20 (brd, 1H); 8.83 (d, 1H); 7.90 (d, 1H); 7.76 (d, 1H); 7.72 (d, 1H); 7.60 (dd, 2H); 7.47 (ddd, 1H); 7.33 (d, 1H); 7.24 (d, 1H); 4.07 (d, 2H); 3.66 (s, 3H)。LCMS: 方法A, RT = 4.44分, [MH+=426]。
NHS-活性化Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, 17-0906-01)を無水DMSO (ジメチルスルホキシド, Fluka, 41648, H20 <= 0.005%)で平衡化した。沈降したビーズ1 mlを15 mlのFalcon試験管に入れ、化合物貯蔵液(通常はDMFまたはDMSO中100 mM)を加えた(終濃度0.2〜2 μmol/mlビーズ)ほか、トリエチルアミン(Sigma, T-0886, 純度99%) 15 μlも加えた。ビーズを回転振盪器(Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.)上で暗所中室温にて16〜20時間インキュベーションした。カップリング効率はHPLCにより判定する。回転振盪器上で室温にてアミノエタノールと終夜インキュベーションすることにより、未反応のNHS基を遮断した。ビーズをDMSO 10 mlで洗浄し、イソプロパノール中にて-20℃で保存した。これらのビーズを実施例2および実施例3のなかで親和性マトリックスとして使用した。上記のようにアミノエタノールとのインキュベーションによってNHS基を遮断することにより、対照ビーズ(リガンドの固定化なし)を作出した。
本実施例はヒトT細胞株(Jurkat細胞)の細胞溶解物からのZAP-70の同定に向けた固定化アミノピリド-ピリミジンリガンド24の使用を実証する。この目的を達成するため、無処理および処理Jurkat細胞の溶解物を実施例1に記述した親和性マトリックスと接触させた。アミノピリド-ピリミジンリガンド24に結合するタンパク質をウエスタンブロットおよび質量分析(MS)により同定した。
Jurkat細胞(ATCCのクローンE6-1, 番号TIB-152)を1リットルのSpinnerフラスコ(Integra Biosciences, #182101)中、0.15×106細胞/ml〜1.2×106細胞/mlの密度で、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen)を補充したRPMI 1640培地(Invitrogen, #21875-034)中にて浮遊状態で増殖させた。刺激実験の場合、細胞を1時間およそ1.0×106細胞/mlの密度で30 μM過バナジン酸(pervanadate)(終濃度)により処理し、引き続き遠心分離によって収集した。1×PBS緩衝液(Invitrogen, #14190-094)での激しい洗浄の後、細胞ペレットを液体窒素中で凍結し、その後-80℃で保存した。
無菌蒸留水に終濃度100 mMでオルトバナジウム酸ナトリウム(Sigma, #6508)を溶解し、0.1 M NaOHにより溶液のpH値をpH 10.0に調整する。溶液が澄むまたは半透明になるまで、溶液を沸騰水浴に入れておく。必要なら、pHを10.0に再調整し、この貯蔵液を-20℃で保存する。貯蔵液の頻回の凍結融解は避ける。
30% H2O2 (Sigma, カタログ番号H1009) 500 μlおよび1×PBS 375 μlを混合する(混合液1)。
100 mMバナジン酸溶液(pH 10.0) 3.5 mlを1×PBS 31.5 mlと混合する(混合液2)。
混合液1 650 μlおよび混合液2 32.5 mlを混合する(混合液3)。細胞培養液に適用する前に混合液3を室温で10分間インキュベーションする。
Jurkat細胞を溶解用緩衝液: 50 mM Tris-HCl, 0.8% NP40, 5%グリセロール, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mMバナジン酸ナトリウム, 1 mM DTT, pH 7.5中、Potter Sホモジナイザー内でホモジナイズした。緩衝液25 mlあたり1つの完全EDTA不含錠(プロテアーゼ阻害剤カクテル, Roche Diagnostics, 1 873 580)を加えた。この材料を機械化POTTER Sにより10回ダウンスし、50 mlのファルコン試験管に移し、氷上で30分間インキュベーションし、4℃で20,000 g (予冷したSorvall SLA600中で10,000 rpm)にて10分間スピンダウンした。上清を超遠心分離機(UZ)-ポリカーボネート試験管(Beckmann, 355654)に移し、4℃で100.000 g (予冷したTi50.2中で33.500 rpm)にて1時間回転した。上清を新しい50 mlファルコン試験管に再び移し、タンパク質濃度をBradfordアッセイ(BioRad)法により測定し、アリコートあたりタンパク質50 mgを含有する試料を調製した。試料は実験にすぐに用いるか、または液体窒素中で凍結し、-80℃で凍結保存した。
固定化された化合物を有するSepharoseビーズ(プルダウン実験1回につきビーズ100 μl)を溶解用緩衝液中で平衡化し、回転振盪器(Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.)上で4℃にて2時間、タンパク質50 mgを含有する細胞溶解物試料とともにインキュベーションした。ビーズを回収し、Mobicol-カラム(MoBiTech 10055)に移し、0.5% NP40界面活性剤を含有する溶解用緩衝液10 mlで洗浄し、引き続き0.25%界面活性剤を含む溶解用緩衝液5 mlで洗浄した。結合タンパク質を溶出するため、2×SDS試料用緩衝液60 μlを加え、カラムを50℃で30分間加熱し、溶出液を遠心分離により微量遠心管に移した。次いで、タンパク質をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)によって分離した。
ウエスタンブロットを標準的な手順にしたがって行い、製造元によって提供された使用説明書(Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence. 2004年5月LI-COR Biosciences刊行, www.licor.com)にしたがって特異的な抗ホスホZAP-70抗体(一次抗体)、蛍光標識二次抗体およびLI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska, USA)のOdyssey赤外線撮像システムを用いることによりZAP-70タンパク質を検出し、定量化した。
5.1 質量分析前のタンパク質消化
ゲル分離したタンパク質を、Shevchenko et al., 1996, Anal. Chem. 68:850-858により記述されている手順に本質的にはしたがってゲル内で還元し、アルキル化し、消化した。手短に言えば、ゲル分離したタンパク質をきれいな外科用メスによってゲルから切り出し、10 mM DTT (5 mM重炭酸アンモニウム中, 54℃, 45分)によって還元し、引き続き暗所中室温で55 mMヨードアセトアミド(5 mM重炭酸アンモニウム中)によりアルキル化した(30分)。還元されアルキル化されたタンパク質をブタトリプシン(Promega)により、5 mM重炭酸アンモニウム中12.5 ng/μlのプロテアーゼ濃度にてゲル内で消化した。消化を37℃で4時間進行させ、その後、5%ギ酸5 μlを用いて反応停止した。
ゲルプラグを1% TFA 20 μlで2回抽出し、酸性化された消化上清とプールした。試料を真空遠心分離機中で乾燥し、0.1%ギ酸10 μlに再懸濁した。乾燥した試料を250 mM酢酸、30%アセトニトリルおよび4 μlのPHOS-select Iron Affinityビーズ(Sigma, P9740; IMAC材料)を含有する水30 μlに再懸濁し、穏やかに水平振盪しながら室温で2時間インキュベーションした。その後、このスラリーを、IMAC材料を制止するためのくびれを含有するゲルローダーチップに負荷した。ビーズを少しの間沈降させてから、溶媒をP10ピペットによってカラムに通し、Eppendorf試験管に回収した。250 mM酢酸、30%アセトニトリルを含有する水溶液20 μlでIMACカラムを2回洗浄した。溶出した画分を合わせ、真空遠心分離機中で乾燥した。この画分を非結合画分(NBF)と呼ぶ。400 mMアンモニアおよび30%アセトニトリルを含有する水溶液20 μlを用いてIMACカラムからホスホ-ペプチドを溶出した。この溶出を2回繰り返し、溶出した画分を合わせ、真空遠心分離機中で乾燥した(結合画分, BF)。LC-MS/MS分析の前に両画分(NBFおよびBF)を0.1%ギ酸10 μlに再懸濁した(Pozuelo Rubio et al., 2005, Biochemical Journal 392(Part 1), 163-172)。
ペプチド試料を、四重極TOF質量分析計(QT0F2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass)またはイオントラップ(LCQ Deca XP)質量分析計のいずれかに直結したナノLCシステム(CapLC, WatersまたはUltimate, Dionex)に注入した。ペプチドを水性溶媒および有機溶媒の勾配によりLCシステムにて分離した(下記参照)。溶媒Aは0.5%ギ酸中5%のアセトニトリルであり、溶媒Bは0.5%ギ酸中70%のアセトニトリルであった。
LC-MS/MS実験において生じたペプチド質量データおよび断片化データは、NCBI (NCBInr、dbESTならびにヒトおよびマウスゲノムの場合)および欧州バイオインフォマティクス研究所(EBI; ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)および線虫プロテオームデータベースの場合)で維持され定期的に更新されるfastaフォーマットのタンパク質およびヌクレオチド配列データベースの問い合わせに使用した。タンパク質はペプチド質量および断片化の測定データを、ソフトウェアツールMascot (Matrix Science; Perkins et al., 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20, 3551-3567)によってデータベース中のエントリから計算した同じデータと相関させることにより同定した。検索基準は、どの質量分析計を分析に用いたかに応じて違った。
リン酸化ペプチドの同定はセリン、スレオニンおよびチロシン残基でのリン酸化をMascot検索パラメータ中の可変修飾(variable modification)として許可することにより、引き続き配列の割り当てのためスペクトルを人手で検査することにより達成した。
ヒトZAPタンパク質配列(IPI00329789.5, 628アミノ酸)の質量分析によって同定されたホスホ-ペプチドを示す(観測値: 測定された質量対電荷比; Mr(exp.): 「観測値」×電荷)。
アミノピリド-ピリミジンリガンド24親和性マトリックスの調製は、実施例1に記述したように行った。96ウェルプレート中で最大80種の化合物をスクリーニングするため、溶出実験を下記のように行う。
親和性マトリックス(ビーズ1600 μl)を1×DP緩衝液30 mlで2回洗浄した。各洗浄段階の後、ビーズをHeraeus遠心分離機中、4℃にて1300 rpmでの4分間の遠心分離により回収した。上清を捨てた。最後に、ビーズを結合用緩衝液(1×DP緩衝液/0.4% NP40) 50 ml中で平衡化し、4℃でROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.)上にて30〜45分間回転させた。このインキュベーション時間の後、ビーズを回収し、タンパク質濃度5 mg/mlの、過バナジン酸で活性化した清澄化済Jurkat細胞溶解物45 mlと混合した。溶解物の調製は実施例2に記述したように行った。ビーズおよび溶解物を4℃で2時間インキュベーションした。溶解物とのインキュベーション後、ビーズを記述のように遠心分離によって回収し、結合用緩衝液25 mlで3回洗浄した。各洗浄段階の間、ビーズを4℃でROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.)上にて8分間インキュベーションした。3回目の洗浄の後、ビーズを2 mlのカラム(MoBiTec, #S10129)に移し、1×DP緩衝液/0.2% NP40 20 mlで洗浄した。洗浄用緩衝液がカラムを完全に通過したら、カラムに残ったビーズの容量を計算した(およそ1000 μl)。ビーズを4倍過剰の1×DP緩衝液/0.2% NP40 (4 ml)に再懸濁して、1:4のスラリーを作出した。化合物溶出試験のため、この懸濁液50 μlを96ウェルプレート(Millipore MultiScreenHTS, MSBVN1210, ふたおよび1.2 μmの親水性低タンパク質結合性Durapore膜付き)の各ウェルに加えた。残存緩衝液を除去するため、96ウェルプレートをアセンブルフィルタおよび回収プレートとアセンブルし、このサンドイッチアセンブリを遠心分離機中にて800 rpmで10秒間スピンダウンした。その後、試験化合物を補充した溶出用緩衝液(1×DP緩衝液/0.2% NP40) 40 μlをビーズに加えた。試験化合物は、それらをDMSO中40倍濃縮の貯蔵液から始めて、希釈用緩衝液に希釈することにより調製した。プレートを回収プレート上にアセンブルし、Eppendorfインキュベータに取り付け、振盪数650 rpmで4℃にて30分間インキュベーションした。溶出液を回収するため、96ウェル回収用プレート上にアセンブルした96ウェルフィルタプレートを卓上遠心分離機(Heraeus)中、4℃にて800 rpmで1分間遠心分離した。溶出液の典型的な容量はおよそ35 μlである。溶出液を-8O℃で保存した。ドットブロット手順を用いることにより、ZAP-70が存在するかどうか溶出液を調べた。
製造元によって提供された使用説明書(Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence. 2004年5月LI-COR Biosciences刊行, www.licor.com)にしたがって特異的な抗ホスホZAP-70抗体(一次抗体)、蛍光標識二次抗体およびLI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska, USA)のOdyssey赤外線撮像システムを用いたドットブロット手順により、溶出したZAP-70タンパク質を検出し、定量化した。
本実施例では、試験化合物が細胞溶解物の中に直接加えられるか、または生細胞とともにインキュベーションされる競合的結合アッセイ法を実証する。細胞溶解物の競合的結合アッセイ法の場合、さまざまな濃度の試験化合物を溶解物試料に加え、溶解物試料中に含有されるタンパク質に結合させた。その後、試験化合物に結合していないタンパク質を捕捉するために、固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24を含有する親和性マトリックスを加えた。インキュベーション時間の後、捕捉タンパク質を有するビーズを、遠心分離により溶解物から分離した。次いで、結合タンパク質を溶出し、特異抗体およびOdyssey infrared検出システムを用いてZAP-70の存在を検出し、定量化した(図6A)。化合物CZC15497の用量反応曲線を作出し、IC50値1.72 μMを得た(図6B)。
実施例1に記述の親和性マトリックス(乾燥容量0.3 ml)を1×DP緩衝液15 mlで2回洗浄し、その後0.4% NP40を含有する1×DP緩衝液15 mlで洗浄し、最後に0.4% NP40を含有する1×DP緩衝液0.3 mlに再懸濁した(50%ビーズスラリー)。
溶解物中での競合の場合、所望の最終試験濃度に比べて200倍高い濃度に相当する試験化合物の貯蔵液をDMSO中で調製した(例えば、最終試験濃度5 μMの場合には1 mMの貯蔵液を調製した)。この希釈スキームにより、DMSOの終濃度は0.5%となる。対照実験(試験化合物なし)の場合、全ての試験試料に0.5% DMSOが含まれるように、0.5% DMSOを含有する緩衝液を使用した。
細胞溶解物を過バナジン酸処理Jurkat細胞から実施例2に記述したように調製した。典型的な実験の場合、タンパク質50 mgを含有する溶解物の1アリコートを37℃の水浴中で融解し、その後、4℃で保持した。この溶解物に、NP40終濃度0.4%が達成されるように、プロテアーゼ阻害剤緩衝液を含有する1×DP 1容量(プロテアーゼ阻害剤1錠を1×DP緩衝液25 mlまたは0.4% NP40含有の1×DP緩衝液25 mlに溶解; EDTA不含錠のプロテアーゼ阻害剤カクテル Roche Diagnostics, カタログ番号41647)を加えた。タンパク質終濃度5 mg/mlが達成されるように、0.4% NP40およびプロテイナーゼ阻害剤を含有する1×DP緩衝液を加えることによって、溶解物をさらに希釈した。
Jurkat溶解物(タンパク質5 mgを含有する) 1 mlに、化合物CZC15497 (DMSOに希釈) 5 μlを加え、4℃で45分間インキュベーションした。その後、固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24を有する親和性マトリックス20 μlを加え、4℃でもう1時間インキュベーションした。遠心分離による溶解物からのビーズの分離後、結合タンパク質を2×濃縮試料用緩衝液50 μl (4×NuPAGE LDS試料用緩衝液, Invitrogen, NP0007 25 μl; 1 Mジチオスレイトール(DTT) 2.5 μl; H2O 22.5 μl)で溶出した。
ウエスタンブロットを標準的な手順にしたがって行い、製造元によって提供された使用説明書(Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence. 2004年5月LI-COR Biosciences刊行, www.licor.com)にしたがって特異的な抗ZAP-70抗体(一次抗体)、蛍光標識二次抗体およびLI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska, USA)のOdyssey赤外線撮像システムを用いることによりZAP-70タンパク質を検出し、定量化した。Lckの検出の場合、抗Lck抗体を使用した(Upstate 3A5)。
細胞処理のため、試験化合物の貯蔵液を、所望の最終試験濃度に比べて5000倍高い濃度で調製した。細胞培地中のDMSO終濃度は0.02% DMSOであった。
ZAP-70阻害剤として作用するCZC15497と一致して、本発明者らは、その化合物がIC50値0.24 μMで抗CD3抗体刺激Jurkat T細胞におけるカルシウム放出を阻害することを見出した(図8)。
蛍光プローブの開発によって、単一生細胞での細胞内遊離カルシウムイオン濃度を測定することが可能になる。細胞に、細胞透過性Ca2+-感受性色素を最初に負荷し、次いで試験化合物を加える。最後に、フローサイトメーターでのデータ収集の直前に抗CD3抗体によりT細胞受容体を通じて細胞を活性化する。Ca2+の放出を細胞刺激後の時間に応じて測定する。本プロトコルではJurkat細胞中の細胞内Ca2+濃度を測定するためにFluo-3およびFluo-4色素を用いるフローサイトメトリー法について記述する(Minta et al., 1989, J. Biol. Chem. 264(14): 8171-8178) (同様にJune et al., 1997, Measurement of intracellular calcium ions by flow cytometry. In: Current Protocols in Cytometry (1997) Unit 9.8.1-9.8.19, John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと)。
一般に、細胞をできるだけ短時間で取り扱って、その安定性を確保するべきである。それゆえ、全ての材料を予め調製するのは当然ながら、次の段階(例えば、化合物の希釈液を調製する段階またはフローサイトメーターを開始する段階)を準備するのにいずれかのインキュベーションまたは遠心分離時間を使うことも大いに推奨される。
1) 対照を含む、分析する試料の数を示す作業計画を準備する。
2) 細胞収集: Jurkat細胞培養液50〜100 mlを1100 rpmで5分間遠心分離する。上清を捨て、再懸濁した細胞ペレットを単一の50 mlファルコン試験管の中にプールし、50 mlまでPBS-CaCl2 (FCSなし)を入れる。試料を何度も遠心分離する。
3) 細胞ペレットをPBS-CaCl2 (FCSなし)により再懸濁して、10×106細胞/ml以上の濃度を達成する。十分な希釈液を調製して、細胞濃度を評価し細胞をカウントする。
4) 50 mlファルコン試験管中で、負荷するのに必要な細胞の量(例えば20試料に対して107細胞)を分離する。107細胞に対して900 μlまでPBS-CaCl2を入れる。
5) 暗所中でFLUO-4 (1 mM) + Pluronic F-127 (20%)の1:1混合液を調製する。107細胞あたりFluo-4 5 μlが必要とされる。
6) PBS-CaCl2によりこの混合物の10分の1希釈液を調製する(暗所中; 例えばFluo-4 5 μl + F-127 5 μlを100 μlにする)。
7) 色素溶液を細胞に加える。1試験管あたり30×106細胞を超えて負荷してはいけない。
8) 細胞インキュベータ(37℃, 5% CO2)中で30分間試料をインキュベーションする。時々混合する。
9) この間に十分な試験化合物希釈液をPBS-CaCl2 (10% FCSを含む)中で調製する。この溶液は所望の終濃度よりも10倍以上濃縮されるべきである。各希釈液をボルテックスする。同様に抗体希釈液: 抗CD3 (1/200)および抗GAM (1/25)を調製する。
10) FACS試験管にラベルを付け、対応する試験管の中に化合物希釈液30 μlまたは対照試験管には緩衝液のみを分注する。
11) 30分のインキュベーション後、細胞をPBS-CaCl2 (10% FCSを含む)中で2回洗浄する。洗浄段階の間、レーザーを温めるためにフローサイトメーターが既に「動作中」であることを確認する。
12) PBS-CaCl2 (10% FCSを含む)に細胞ペレットを濃度1.5×106細胞/mlで懸濁する。
13) 細胞懸濁液300 μlをFACS試験管の中に分注し、穏やかに混合する。化合物のインキュベーションは始まっている。試料を暗所中にて室温で保持する。
14) サイトメーターの設定を開く。全ての測定にすぐ使えるテンプレートを持つよう勧める。機械の設定は同様に、実験ごとで同じとすべきであり、これにより細胞調製の再現性を評価することができる。
15) セットアップ様式のなかで、サイトメーター上の細胞調製物を制御する。細胞は所定のゲートに適合すべきである。
16) 化合物のインキュベーション時間の間に、予想通り細胞が抗CD3活性化に反応していることも調べる。タイマーを8秒にセットする。抗CD3希釈液(最終0.2 μg/ml) 6 μlを加え、穏やかに混合する。GAM希釈液(最終0.75 μg/ml) 1 μlを加え、穏やかに混合する。タイマー開始と同時に、試料を37℃の水浴中でインキュベーションする。8秒のインキュベーションの後、中速で200秒間データを収集する。明らかな蛍光増大が1分後に現れる。
17) FACSデータ収集の15分前に細胞が室温で平衡化し休止していることを確認する。
18) データ収集: 比較する試料は連続して測定するべきである。
19) より良好な再現性のため、負荷細胞のデータを2時間以内に得ることを確実にする。
20) FlowJo (登録商標)ソフトウェア(Tree Star, Inc.)を用いることによりデータを分析する。
Jurkat細胞株J77はAmerican Type Cell Collection (ATCC)から得た。Jurkat細胞株は熱不活化ウシ胎仔血清(Gibco, ref. 10270-106. FCSは水浴中56℃で45分間により熱不活化される)を補充したRPMI 1640培地(Gibco, ref. 21875-034)中で維持した。
Fluo-3, AM (Molecular Probes, F14218, DMSO中1 mMの既製溶液1 mlとして供給されており、-20℃にて5 μlまたは7.5 μlのアリコートで保存する)。
Fluo-4, AM (Molecular Probes, F14217, DMSO中1 mMの既製溶液1 mlとして供給されており、-20℃にて5 μlまたは7.5 μlのアリコートで保存する)。
Pluronic F-127 (Molecular Probes, P3000MP, DMSO中20%の既製溶液1 mlとして供給されている)。
PBS-CaCl2-MgCl2 (Gibco, 14040-91)。
抗CD3抗体(Calbiochem, 217570, 1 mg/mlで供給されている)。
ヤギ抗マウスIgG抗体(GAM; Sigma, M8890, 6 mg/mlで供給されている)。
フローサイトメーター(Becton-Dickinson, FACSCalibur)およびFlowJo (登録商標)ソフトウェア(Tree Star, Inc.)。
Claims (28)
- 以下の段階を含む、ZAP-70相互作用化合物の同定のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物を提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、
(c) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体を所与の化合物とともにインキュベーションする段階、および
(d) 化合物が固定化アミノピリド-ピリミジンリガンド24からリン酸化ZAP-70を分離できるかどうかを判定する段階。 - 段階(d)が、分離されたリン酸化ZAP-70の検出または分離されたリン酸化ZAP-70の量の測定を含む、請求項1記載の方法。
- 質量分析法または免疫検出法により、分離されたリン酸化ZAP-70が検出されるかまたは分離されたリン酸化ZAP-70の量が測定される、請求項2記載の方法。
- 分離されたリン酸化ZAP-70がリン酸化ZAP-70に対する抗体を用いて検出される、請求項3記載の方法。
- 分離されたリン酸化ZAP-70がリン酸化ZAP-70の493位でのリン酸化を認識する抗体を用いて検出される、請求項4記載の方法。
- 以下の段階を含む、ZAP-70相互作用化合物の同定のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物を提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、所与の化合物および固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、ならびに
(c) 段階(b)において形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体を検出する段階。 - 段階(c)において検出がアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量を測定することにより行われる、請求項6記載の方法。
- 段階(a)〜(c)が、異なる化合物を試験するためにいくつかのタンパク質調製物を用いて行われる、請求項6または7記載の方法。
- 以下の段階を含む、ZAP-70相互作用化合物の同定のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物の二つのアリコートを提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24と一方のアリコートを接触させる段階、
(c) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、所与の化合物および固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24ともう一方のアリコートを接触させる段階、ならびに
(d) 段階(b)および(c)において形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量を測定する段階。 - 以下の段階を含む、ZAP-70相互作用化合物の同定のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有する少なくとも一つの細胞をそれぞれ含む、二つのアリコートを提供する段階、
(b) 一方のアリコートを所与の化合物とともにインキュベーションする段階、
(c) それぞれのアリコートの細胞を収集する段階、
(d) タンパク質調製物を得るために細胞を溶解させる段階、
(e) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、ならびに
(f) 段階(e)においてそれぞれのアリコートで形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量を測定する段階。 - 化合物とともにインキュベーションされなかったアリコートに比べて、化合物とともにインキュベーションされたアリコートにおいて形成されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量が減少したことにより、ZAP-70が化合物の標的であることが示される、請求項9または10記載の方法。
- アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の量が、固定化アミノピリド-ピリミジンリガンド24からのリン酸化ZAP-70の分離、および、分離されたリン酸化ZAP-70のその後の検出または分離されたリン酸化ZAP-70の量のその後の測定によって測定される、請求項7〜11のいずれか一項記載の方法。
- 質量分析法または免疫検出法により、リン酸化ZAP-70が検出されるかまたはZAP-70の量が測定される、請求項12記載の方法。
- リン酸化ZAP-70がリン酸化ZAP-70に対する抗体を用いて検出される、請求項13記載の方法。
- リン酸化ZAP-70がリン酸化ZAP-70の493位でのリン酸化を認識する抗体を用いて検出される、請求項14記載の方法。
- 中処理スクリーニングまたは高処理スクリーニングとして行われる、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 化合物が、合成化合物、有機合成薬物および天然小分子化合物からなる群より選択される、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- ZAP-70相互作用化合物がZAP-70阻害剤である、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- 固体支持体がアガロース、修飾アガロース、セファロースビーズ、ラテックス、セルロース、および強磁性粒子またはフェリ磁性粒子からなる群より選択される、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
- セファロースビーズがNHS活性化セファロースの形態である、請求項19記載の方法。
- アミノピリド-ピリミジンリガンド24が固体支持体に共有結合する、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、リン酸化ZAP-70の精製のための方法:
(a) リン酸化ZAP-70を含有するタンパク質調製物を提供する段階、
(b) アミノピリド-ピリミジンリガンド24-リン酸化ZAP-70複合体の形成を可能にする条件の下で、固体支持体に固定化されたアミノピリド-ピリミジンリガンド24とタンパク質調製物を接触させる段階、および
(c) 固定化アミノピリド-ピリミジンリガンド24からリン酸化ZAP-70を分離する段階。 - 段階(c)の後に、リン酸化ZAP-70に結合できるタンパク質の同定をさらに含む、請求項22記載の方法。
- 段階(c)の後に、リン酸化ZAP-70の翻訳後修飾の判定をさらに含む、請求項22記載の方法。
- 段階(c)の後に、リン酸化ZAP-70および/またはリン酸化ZAP-70に結合できるタンパク質のいずれかを質量分析法または免疫検出法によって特徴決定する、請求項22〜24のいずれか一項記載の方法。
- タンパク質調製物の提供が、リン酸化ZAP-70を含有する少なくとも一つの細胞を収集する段階および細胞を溶解させる段階を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
- ZAP-70相互作用化合物の同定のためのアミノピリド-ピリミジンリガンド24の使用。
- リン酸化ZAP-70の精製のためのアミノピリド-ピリミジンリガンド24の使用。
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