JP4967128B2 - 扁平上皮癌の予後判定方法 - Google Patents
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Description
ヒトケラチノサイト(ヒト表皮細胞、NCE16:ヒューマンサイエンス振興財団より購入)を用いて、正常細胞中のCRの存在を確認した。まず、SCC抗原の組み換え蛋白質としてGST融合蛋白(以下、GST−SCCA1、GST−SCCA2とする)を大腸菌で誘導・合成した。この大腸菌を超音波破砕機で処理した破砕菌液を、glutatione sepharose 4B beads(アマシャム・ファルマシア社製)と混合し、反応・結合させた。次いで、ヒトケラチノサイト1X107個の細胞破砕物と上記で得られたbeadsを混合し反応させた。反応終了後、beads を十分に洗浄し、このbeads にSDS−PAGE サンプルバッファーを添加し、100度で5分間インキュベート後、GST−SCCA1、GST−SCCA2およびコントロールであるGSTと結合する物質をSDS−PAGEで分離した(図1)。肉眼的に異なるバンドを切り出し、これを質量分析器(島津製作所)によるpeptide finger printingによりこの結果、SCCA1およびSCCA2と結合する分子の1つとしてCRを確認し、ヒトケラチノサイトにCRが存在することが明らかとなった。
配列番号1に示すCRのアミノ酸配列の情報を解析し、CRの抗原決定部位を検索した。その結果、配列番号1のアミノ酸配列の第184番目のヒスチジン(His)から第195番目のグリシン(Gly)までのアミノ酸配列部位が優れた抗原決定部位と分かった。そこで、CRの抗体を作成するために、N末端側のヒスチジンの前にシステインを付加した合成ペプチドCHQKEGWPSSAYG(配列表の配列番号2)を作製した。
実施例2で作成した合成ペプチドを、フロイントアジュバントを用いてエマルジョンを作製し、当該エマルジョンをウサギの皮下に注射して免疫した。免疫は、第1回目に0.15mgの合成ペプチドを投与し、2週間後に0.3mg、その後は2週間おきに計4回の投与を行った。採血は、合成ペプチドを投与する前、合成ペプチドを3回投与した1週間後、さらに4回目を投与した1週間後に各1ccずつ、計3回の試験採血を行った。各試験採血におけるCRの抗体価はELISA法で測定した。最終免疫終了の1週間後に、免疫したウサギから全血を最終採血した。最終採血分はCNBr−acvivated Sepharose 4B(アマシャム・ファルマシア社製)によるaffinity精製を実施し、CRのポリクローナル抗体を得た。
実施例3で得られたポリクローナル抗体は、ウエスタンブロット法によりCRとの反応性を確認した。さらに、CRの存在が確認されたヒトケラチノサイト、および6種類の子宮頸部扁平上皮癌培養細胞を用いて、CRの発現を確認した。この結果、当該ポリクローナル抗体の優れた反応性を証明した。
CRと作製したポリクローナル抗体の反応性をウエスタンブロットで確認した。下記(1)〜(4)の手順で処置したものを、(5)のウエスタンブロットにより解析した。
さらに、ヒトケラチノサイト、および以下の子宮頸部扁平上皮癌培養細胞 BOKU、ME−180、SKGI、SKG II(以上ヒューマンサイエンス振興財団より購入)、SiHa(東北大学加齢医学研究所より購入)、SKG IIIa(慶応大学医学部産科婦人科 野澤 志朗博士より供与)におけるCRの発現を解析した。方法は上記に従い、SDS−PAGEおよびウエスタンブロットにより解析した。結果は、図3に示すように、いずれの培養細胞でもCRの発現を認めるが、ケラチノサイトと比較し6種類の子宮頸部扁平上皮癌培養細胞での発現は低く、CRの測定を行うための対照としては、ケラチノサイトが優れていることが分かった。
実施例3で作製した抗体を用いて、培養細胞であるヒトケラチノサイトと患者の同意を得て採取した子宮頸部正常扁平上皮組織におけるCRの発現を免疫染色により確認した。実験法は、精製したポリクローナル抗体と、ヒストファインSAB−PO(R)キット(ニチレイ社)を用いて、プロトコールに従い、免疫組織染色を(1)〜(8)の手順に従って実施した。(1)ホルマリン固定パラフィン包埋組織を5μm厚に切り出し、キシレンに3回浸した後、100%エタノールに浸して、脱パラフィン操作を行う。(2)0.3%過酸化水素入りメタノールに組織切片を50分浸し、内因性ペルオキシダーゼを失活させる。(3)組織切片をPBSで3回洗浄後、作製した抗CR抗体の非特異的吸着を防ぐため、ヒストファインSAB−PO(R)キットに付属する10%ヤギ正常血清を用いて室温で10分間ブロッキングを行う。(4)一次抗体反応として、1%ウシアルブミン含有PBSで2μg/mlの濃度に調整した抗CRポリクローナル抗体と4℃で一晩反応させる。(5)組織切片をPBSで3回洗浄後、キットに含まれる二次抗体ビオチン標識ヤギ抗ラビットIgG抗体と室温で10分間反応させる。(6)終了後、組織切片をPBSで3回洗浄し、キットに含まれるペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン溶液を添加する。室温で5分間反応させる。(7)終了後、組織切片をPBSで3回洗浄し0.02% DAB液(30mg DABを、130ml 0.05M Tris HCl bufferと、20ml 0.05MTrisma baseに溶解する。)に1分間浸す。終了後、5分間流水で洗浄する。(8)へマトキシリン染色し、流水で10分間洗浄し、封入する。
組織の採取および検討に対し、インフォームド・コンセントが得られた手術前未治療で予後の追跡が可能である子宮頸部扁平上皮癌患者の組織中のCRを検出した。癌患者例数およびその病態レベルを表1に示した。
Claims (3)
- 癌の予後を判定する方法であって、癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンがheteroであるか、W&Hである場合を、全生存期間の短縮と判定することを特徴とする扁平上皮癌の全生存期間判定方法。
- 癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体を用いた免疫反応により測定することを特徴とする請求項1に記載の扁平上皮癌の全生存期間判定方法。
- 扁平上皮癌が子宮頚部扁平上皮癌である請求項1〜2のいずれか一項に記載の扁平上皮癌の全生存期間判定方法。
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