JP4955548B2 - 標的化のためのErbB4細胞外ドメインおよびニューレグリンヘパリン結合ドメインを有するハイブリッドタンパク質 - Google Patents
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Description
その多様な生理学的機能を果たすために、細胞は、特定の方式でその環境の細胞成分および細胞外成分に接着しなければならない。神経系において接着が必要な機能は、神経突起の伸長、シナプス形成および軸索髄鞘形成を含む。複数の環境的信号(cue)を認識し、そして特定の接着反応を起こす細胞の能力は、そのような複雑な細胞機能に必要不可欠である。認識および接着は、細胞接着分子(「CAM」)によって媒介され、それは近辺の細胞に発現される、または細胞外マトリックス(「ECM」)中の高分子に結合する。
(1)シナプス後筋において神経伝達物質レセプターの合成および濃縮に作用することによる、筋管の分化(非特許文献20);
(2)ヒヨコ筋におけるナトリウムチャネル数の増加(非特許文献25);
(3)より多くの筋管を産生する、サブコンフルエントな(subconfluent)休止ヒト筋芽細胞の分裂促進刺激およびその分化(Sklarら、特許文献18);ならびに
(4)心内膜に発現するNRG1による、心筋ErbB2およびErbB4レセプターの活性化(非特許文献26;非特許文献27)。
ヘパラン硫酸(HS)は、プロテオグリカン(HSPG)の一部としてほとんどの細胞の表面上、およびECMに見出される硫酸化多糖類である。この多糖類は、多くの異なるタンパク質の間の相互作用を媒介する。HSは、交互のヘキサウロン酸とグルコサミン単位から構成される。ヘキサウロン酸は、D−グルクロネート(GlcA)またはL−イズロネート(IdoA)のいずれかであり得る。グルコサミンのアミンは、通常、アセチル化(N−アセチルグルコサミンまたはGlcNAc)されるか、または硫酸化(N−スルホグルコサミンまたはGlcNSO3)されるが、それはまた、非置換型であり得る。潜在的な硫酸化部位は、アミノ基または各糖分子の2位、3位、および6位に位置した(非特許文献35)。ときとして、GlcNSO3単位にある3−O−硫酸基にも存在する。HSエピトープの発現は、異なる器官および組織内で時間的および空間的に制御され得る(非特許文献36;非特許文献37)。したがって、HSPG特異性は、GAG鎖の糖組成および硫酸化パターンの違いによってもたらされる多様性によってコードされ得る(非特許文献38;非特許文献39)。例えば、2種の線維芽細胞増殖因子(FGFlおよびFGF2)は、最適な結合のためにN−硫酸化の五糖配列を必要とするが、O−硫酸化のための必要条件と異なる(非特許文献40)。肝細胞成長因子、血小板由来増殖因子およびリポタンパク質リパーゼは、全て、1つ以上のGlcN 6O−硫酸基の存在に依存する(非特許文献41;非特許文献42;非特許文献43)。アンチトロンビンIIIは、3O−硫酸化GlcNS単位を必要とする(非特許文献44)。FGFシグナル伝達系におけるさらなる特異性はまた、HSおよびFGFとそのレセプターとの間の、同時かまたは連続的な相互作用のいずれかによってもたらされ得る(非特許文献45;非特許文献46)。
本明細書中で使用される略語のいくつかとしては、以下が挙げられる:NRG、ニューレグリン;HRG、ヘレグリン;HBD、ヘパリン結合ドメイン;N−HBD、ニューレグリンヘパリン結合ドメイン;AChR、アセチルコリンレセプター;B4またはB4D、erbB4レセプターの細胞外ドメイン;HSPG、ヘパラン硫酸プロテオグリカン;EGF、上皮増殖因子;IGまたはIg、免疫グロブリン;MAPK、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ;PI3−K、ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ;BSA、ウシ血清アルブミン;MEM、最少必須培地;CEE、ヒヨコ胚抽出物;α−BTX、α−ブンガロトキシン;FGF、線維芽細胞増殖因子;ECD、細胞外ドメイン;ECM、細胞外マトリックス;TGF−β、トランスフォーミング増殖因子−β;CREB、cAMP応答配列結合タンパク質。
(a)動物N−HBDポリペプチド、または上記ポリペプチドのホモログもしくは機能的誘導体をコードする約100ヌクレオチドより長くない第1の核酸配列であって、上記ポリペプチド、上記ホモログまたは上記機能的誘導体が、以下:
(i)免疫グロブリンスーパーファミリーのC2サブファミリーのメンバーであるが、同じ動物種由来の免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖のC2ドメインに対して約40%未満の配列同一性を有し;そして
(ii)従来のヘパリン結合アッセイまたはヘパラン硫酸結合アッセイにおいて測定される場合、10−5M以下のKdでヘパリンおよびヘパラン硫酸のプロテオグリカンに結合する;
ことにおいて特徴付けられる、第1の核酸配列;
(b)必要に応じて(そして好ましくは)、上記第1の核酸配列とインフレームで融合される、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列;および
(c)第2の核酸配列であって、上記第2の核酸配列が、(i)上記第1の核酸配列または上記リンカー核酸配列にインフレームで連結され、そして(ii)第2のポリペプチドPtrgをコードし、上記第2の核酸配列がerbB4レセプター(B4)ECDをコードする、第2の核酸配列、
を含み、上記コードされた融合ポリペプチドは、ニューレグリンアンタゴニストである。
(a)ヒトNRG由来の、GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPQNIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG(配列番号1);
(b)ラットNRG由来の、GSKLVLRCET SSEYSSLRFK WFKNGNELNR KNKPENIKIQ KKPGKSELRI NKASLADSGE YMCKVISKLG(配列番号2);
(c)鳥類NRG由来の、GQKLVLRCET TSEYPALRKW LKNGKEITKK NRPENVKIPK KQKKYSELHI YRATLADAGE YACRVSSKLG(配列番号3);および
(d)(a)、(b)、または(c)の機能的誘導体またはホモログ、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。上記核酸分子は、配列番号4、配列番号5または(配列番号6)からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
(a)第1の核酸配列として、上記の核酸分子のいずれか;
(b)必要に応じて、第1の核酸配列とインフレームで融合される、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列;および
(c)(i)第1の核酸配列またはリンカー核酸配列にインフレームで連結され、そして(ii)第2のポリペプチドPtrgをコードする第2の核酸配列であって、Ptrgは、好ましくはerbB4レセプターのECDを含み、そして融合ポリペプチドは、NRGアンタゴニストである、第2の核酸配列。
(a)第1の組換え発現ベクターであって、該第1の組換え発現ベクターは、その核酸中に、N−HBDポリペプチドまたは該N−HBDの生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を組み込んでいる、第1の組換え発現ベクター;および
(b)第2の組換え発現ベクターであって、該第2の組換え発現ベクターは、その核酸中に、B4 ECDであるポリペプチドPtrgをコードするヌクレオチド配列を組み込んでいる、第2の組換え発現ベクター、
を含み、該発現ベクターは、宿主細胞を同時感染または同時トランスフェクトして、PtrgおよびN−HBDポリペプチド、N−HBDフラグメント、N−HBDホモログ、またはN−HBD誘導体の同時発現をもたらし得る。
(a)融合ポリペプチドの一部として、レセプターのリガンドに結合し、それによってレセプターのリガンド活性化のアンタゴニストとして作用し得る、細胞表面レセプターの可溶性形態;
(b)融合ポリペプチドの一部として、レセプターに結合し、そしてそれによってレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し得る、細胞表面レセプターのリガンド。
ニューレグリン(NRG)は、チロシンキナーゼのEGFレセプターファミリーメンバーに結合し、そしてこれらを活性化し、それによってシグナル伝達カスケードを開始する。標的が神経筋シナプスのシナプス後膜である場合、この活性化の1つの結果はAChR合成の誘導である。レセプター結合およびチロシン自己リン酸化の原因であり、そしてそれに十分なEGF様ドメインに加えて、NRGの多くのスプライシングされた形態は、HSPGに結合し、そしてシナプスでNRGの高濃度を維持するIG様ドメイン(=N−HBD)も有する。
他に示さない限り、本発明の多くの局面の実施は、分子生物学、組換えDNA技術および免疫学の従来の技術を採用し、それは当該分野の技術の範囲内である。そのような技術は、科学的文献、例えばSambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY、1989;Ausubel,F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley−Interscience、New York、最新巻;Albers,B.ら、Molecular Biology of the Cell、第2版、Garland Publishing,Inc.、New York、NY(1989);Lewin,BM、Genes IV、Oxford University Press、Oxford(1990);Watson,J.D.ら、Recombinant DNA、第2版、Scientific American Books、New York、1992;Darnell,JEら、Molecular Cell Biology、Scientific American Books,Inc.、New York、NY(1986);Old,R.W.ら、Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering、第2版、University of
California Press、Berkeley、CA(1981);DNA Cloning:A Practical Approach、第I&II巻(D.Glover編);Oligonucleotides Synthesis(N.Gait編、最新版);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins編、最新版);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins編、最新版);Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning
Techniques(BergerおよびKimmel編、1987);Hartlow,E.ら、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1988);Coligan,JEら編、Current Protocols in Immunology、Wiley−Interscience、New York、1991においてより詳細に記載されている。タンパク質の構造および機能が、Schulz,GEら、Principles of Protein Structure、Springer−Verlag、New York、1978およびCreighton,TE、Proteins:Structure and Molecular Properties、W.H.Freeman&Co.、San Francisco、1983において議論されている。
本発明は、少なくとも1つの調節配列と作動可能に連結された、IGドメイン融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。「作動可能に連結された」は、コード配列が、コード配列の発現を可能にする様式で調節配列に結合していることを意味する。公知の調節配列が、適切な宿主細胞における所望のタンパク質の発現を指示するために選択される。従って、用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。そのような調節配列は、例えば、Goeddel,D、Methods in Enzymology、185巻、Academic Press、(1990)において記載されている。当業者は、本発明の発現ベクターの特定の設計が、トランスフェクトされる宿主細胞および/または発現されるタンパク質の型のような考慮すべき事柄に依存することを理解する。
所望のコード配列および制御配列を含む適切なベクターの構築は、当該分野で慣習的な標準的な連結および制限酵素技術を採用する。単離プラスミド、DNA配列、または合成オリゴヌクレオチドは、望ましい形態に切断、調整、および再連結される。ベクターを形成するDNA配列は、多くの供給源から入手可能である。土台のベクターおよび制御システムは、一般的に構築物中の配列の大部分に使用される、利用可能な「宿主」ベクターに見出される。適切なコード配列のために、最初の構築は、cDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーから適切な配列を回収する問題であり得、そして通常そうである。しかし、配列が一旦開示されると、個々のヌクレオチド誘導体から始めて、インビトロでその配列を合成することが可能である。かなり長い、例えば500〜1000bpの遺伝子の遺伝子配列全体を含む核酸は、個々の重複する相補的オリゴヌクレオチドを合成し、そしてdNTPの存在下でDNAポリメラーゼを用いて一本鎖の重複していない部分を埋めることによって調製され得る。このアプローチを、公知の配列のいくつかの遺伝子の構築に首尾よく使用した。例えば、Edge,MD.、Nature(1981)292:756;Nambair,K.P.ら、Science(1984)223:1299;およびJay,E.、J Biol Chem(1984)259:6311を参照のこと。
DNAまたはRNA分子のプロモーター領域は、RNAポリメラーゼに結合し、そして「作動可能に連結された」核酸配列の転写を促進する。本明細書中で使用される「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼによって転写されるDNAまたはRNAのその鎖に見出されるプロモーターのヌクレオチド配列である。プロモーターおよびコード配列のような、核酸分子の2つの配列は、それらが、両方の配列が同じRNA転写物に転写されることを可能にする、または1つの配列から始まったRNA転写物が2番目の配列に延長されることを可能にする方式でお互いに連結している場合に、「作動可能に連結」される。従って、DNAまたはRNAのプロモーター配列およびコード配列のような2つの配列は、プロモーター配列における転写開始が、作動可能に連結したコード配列のRNA転写物を産生する場合、作動可能に連結されてる。「作動可能に連結」されるために、2つの配列が直線状の配列でお互いにすぐに隣接している必要はない。
本発明は、以下の配列:
上記で述べたように、好ましい機能的誘導体は、融合タンパク質、Ptrgに融合または結合したN−HBDの機能的フラグメントを含む融合ポリペプチドである。
本発明はまた、N−HBDまたはその改変体の配列から得られた「ユニット」ペプチド配列が、介在するスペーサーまたはリンカーありまたはなしで、約2回から約100回反復する、より長いポリペプチドを含む。
(HBD−Xm)n−HBD ここでm=0または1、n=1〜100。Xは1〜20個のグリジン残基からなるスペーサーグループであり、上記で記載されたようなペプチドリンカー、または化学的架橋分子である。
N−HBDの「化学的誘導体」は、通常そのタンパク質の一部ではない、さらなる化学的部分を含む。ポリペプチドの共有結合的改変が、本発明の範囲内に含まれる。そのような誘導体化部分は、可溶性、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。そのような効果を媒介し得る部分は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、Mack Publishing Co.、Easton、PA(1980)に開示されている。ポリペプチドの標的化されるアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによって、そのような改変は分子に導入され得る。別の改変は、タンパク質の環状化である。ポリペプチドの化学的誘導体の例は、下に提供される。リシニル(lysinyl)およびアミノ末端残基は、コハク酸、または他のカルボン酸の無水物で誘導体化される。環状カルボキシル無水物による誘導体化は、リシニル残基の荷電を逆転させる効果を有する。アミノ基を含む残基を誘導体化する、他の適当な試薬は、メチルピコリンイミデート(picolinimidate);リン酸ピリドキサル;ピリドキサル;クロロボロヒドリド;トリニトロベンゼンスルホン酸;O−メチルイソウレア;2,4ペンタンジオン;およびグリオキシル酸によるトランスアミナーゼ触媒反応のような、イミドエステルを含む。カルボキシル側鎖グループ、アスパルチルまたはグルタミルは、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホロニル−(4−エチル))カルボジイミド、または1−エチル−3−(4−アゾニア(azonia)−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドのような、カルボジイミド(R−N=C=N−R’)による反応によって選択的に改変され得る。さらに、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基は、アンモニアによる反応によって、アスパラギン残基およびグルタミン残基に変換され得る。他の改変としては、プロリンおよびリジンの水酸化、セリン残基またはスレオニン残基の水酸基のリン酸化、リジンのアミノ基のメチル化(Creighton、前出、79〜86頁)、N末端アミンのアセチル化、およびC末端カルボキシル基のアミド化を含む。1つ以上のD−アミノ酸が、1つまたはそれ以上のL−アミノ酸を置換したペプチドもまた含まれる。
これに関して有用な化合物の別の種類は、N−HBDポリペプチドの活性を模倣する、低分子量ペプチド模倣物化合物である。そのようなペプチド模倣物の構造は、自由なN−HBDまたはそのリガンド(例えばヘパラン硫酸)に結合するN−HBDいずれかの構造から得ることができる。N−HBDのペプチド模倣物は、N−HBDペプチドの生物学的効果を模倣し、そしてN−HBDペプチドの立体化学的特徴を有し、そのペプチドの結合活性または生物学的活性を有するような、非天然ペプチドまたは非ペプチド薬剤であり得る。従って、本発明は、ペプチド模倣物化合物が、別のペプチドに結合された化合物を含む。
ポリペプチド、融合ポリペプチド、多量体などの形態のいずれにせよ、標的HS、HSPGまたは他の糖に対して増加した結合活性を有する(特異性、親和性または両方の増加として定義される)変異体または改変体HBD配列は、本明細書中で記載される方法および当該分野で公知の他の方法を用いて産生および試験され得る。従って、候補改変体または変異体HBDの、オリゴサッカライドアレイに対する結合特異性または親和性をスクリーニングして、そのHBDに結合する最適な糖構造を決定する。その情報を持って、HBDのペプチドライブラリーは、スクリーニングされ得るか、または指向性の方式で、HBDの選択された残基が変異され得、そしてこれらの変異体を、例えば、組織アレイに対する結合に関してスクリーニングし得る。これは、特定の組織または細胞に発現される特定のサッカライド部分に対して結合すると特徴付けられるHBDモジュールを産生する。この方法において、特定の標的(例えば腫瘍)に対して改善した結合活性を有する改変体HBDが同定され得、そしてその改変体HBDは、その特定の標的に関してはHBD含有融合ポリペプチドのような、よりよいアンタゴニストを操作するために使用され得る。組織アレイの調製および使用の方法は、Richter Jら、2000、Am J Pathol 157:787−794;Fernandez PLら、Virchows Arch 438:591−594;およびSimon Rら、2001、Cancer Res 61:4514−4519によって記載される。ヘパリン結合タンパク質の組織結合研究は、Allen BLら、2001、J Cell Biol 155:845−858;Friedl Aら、2001、Methods Mol Biol 171:535−546;Rapraeger AC、2002、Meth Cell Biol 69:83−109に、記載される。従って、本発明は、最適な組織特異性を有するHBDを同定するため、および選択された生物学的機能のアンタゴニストであり得る組織特異的標的化ベクターを作製するための方法を含む。適当な組織培養システムまたは動物モデルにおける試験が、操作したHBDの標的化の効率、毒性および生物学的機能のために行われる。
N−HBD融合ポリペプチドまたはこのポリペプチドを発現する細胞は、哺乳動物被験体、好ましくはヒトに投与される。本明細書中で記載されたようなN−HBDの活性を有する組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中で、生物学的有効量、または治療有効量で投与される。N−HBD融合ポリペプチド(またはそのポリペプチドを発現する細胞)は、単独で、または別のタンパク質、ペプチド、または他の薬物と組み合せて与えられ得る。
例えば、一般的に、「遺伝子治療」として知られるものを実施するための動物に対するDNA伝達、またはエキソビボで細胞に対するDNA伝達は、細胞および最終的には生きた動物への、「外来性」DNAの導入を含む。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子治療」は、インビボにおいて欠損遺伝子の補正または置換に限定されることを意図せず、むしろ本発明のポリヌクレオチド(好ましくは、DNA分子)(「遺伝子」である必要はない)の、発現およびそれによって記載されたような有用性を可能にする方式での伝達である。遺伝子治療のいくつかの一般的なストラテジーが研究され、そして広範囲に概説された(Yang,N−S、Crit.Rev.Biotechnol.12:335−356(1992);Anderson,W.F.、Science 256:808−813(1992);Miller,AS、Nature 357:455−460(1992);Crystal,RG、Amer.J.Med.92(補遺6A):44S−52S(1992);Zwiebel,JAら、Ann.N.Y.Acad.Sci.618:394−404(1991);McLachlin,JRら、Prog.Nucl.Acid Res.Molec.Biol.38:91−135(1990);Kohn,DBら、Cancer Invest.7:179−192(1989)(これらの参考文献は、本明細書中でそのが参考として援用される))。1つのアプローチは、培養中の一次細胞への核酸転移、続いて全身性か、または特定の臓器もしくは組織のいずれかでの、エキソビボで形質転換した細胞の宿主への自己移植を含む。
別の実施形態において、本発明のN−HBDポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、「治療的に結合体化され」、そして治療薬を、化合物が目指しそして結合する部位、すなわち腫瘍部位、腫瘍転移、または感染/炎症の中心のような、HSが豊富な組織または領域へ送達するために使用される。「治療的に結合体化された」という用語は、改変N−HBDポリペプチドが、疾患の根底にある原因に対して作用する別の治療剤、または炎症、腫瘍の侵入、もしくは新脈管形成の「成分」もしくはプロセスの工程に結合体化されることを意味する。
本発明の組成物は、ヒト腫瘍の代理であると見なされる十分に確立されたげっ歯類モデルにおいて、治療上の有効性について試験される。全体的なアプローチは、以下:
National Cancer Institute(NCI)によって実施されるような抗癌薬の前臨床における発見および開発は、一連の試験手順、データの精査、および判断工程からなる(Grever,MR、Semin Oncol,79:622−638(1992))。試験手順は、比較定量的なデータを提供し、次に、所定の化学的分類または生物学的分類からの最良の候補薬剤の選択を可能にするように設計される。1975年以来、NCIは、i.p.移植型のマウスP388白血病モデルにおける化合物のプレスクリーニングを含んだ薬物の発見を行い、次いでヒト固形腫瘍を含む移植可能な癌(Venditti,J.M.ら、In:Garrattini Sら編、Adv.Pharmacol and Chemother 2:1−20(1984))のパネルにおいて選択した化合物を評価することに取り組んでいる。後者は、免疫不全の胸腺欠損ヌード(nu/nu)マウスの開発およびこれらのマウスへのヒト腫瘍異種移植片の移植によって可能になった(Rygaard,J.ら、Acta Pathol.Microbiol Scand.77:758−760(1969);Giovanella,G.C.ら、J.Natl Canc.Inst.57:615−619(1973))。選択したマウスおよびヒト腫瘍細胞株(B 16黒色腫、A−375黒色腫、LOX−IMVI黒色腫、およびPC−3前立腺癌)の転移の可能性を評価する研究、ならびに実験的薬物評価に対するそれらの適合性は、解剖学的に適切な宿主組織における腫瘍材料の移植から得られるインビボモデルの重要性を支持した;このようなモデルは、特定の腫瘍型に対して活性を阻害する化合物の詳細な評価に良く適している。1990年の初め頃、NCIは、大規模な薬物スクリーニングのためにヒト腫瘍細胞株を利用し始めた(Boyd,MR,In:DeVita,VTら、Cancer:Principles and Practice of Oncology,Updates,第3巻,Philadelphia,Lippincott,1989,pp.1−12;B.Teicher編,Anticancer Drug Development Guide:Preclinical Screening,Clinical Trials and Approval chapter 2)。7種の癌型(脳、結腸、白血病、肺、黒色腫、卵巣、および腎臓)に由来する細胞株は、広い範囲の供給源から取得され、凍結され、そして一連のインビトロおよびインビボでの特徴付けに供された。このアプローチは、スクリーニングストラテジーを「化合物指向性」から「疾患指向性」である薬物の発見にシフトさせた(Boyd,前出)。疾患特異的である差次的な毒性(例えば、本明細書中に記載される化合物の抗黒色腫活性)を示すスクリーニングによって同定された化合物は、さらなる前臨床の評価のための「リード」と見なされた。一連のヒト腫瘍異種移植片モデルは、このような要求に対処するために作製された。ヒト腫瘍細胞培養株からs.c.異種移植片を確立するために使用されるアプローチは、Frederick,MarylandにあるNCIの腫瘍貯蔵所から得られるものである。冷凍保存された細胞株は、解凍され、10%の熱失活した胎仔ウシ血清を補充したRPMI 1640培地中で培養し、そしてその集団が108個以上の細胞を得るのに十分な量になるまで増やした。細胞は、収穫され、次いで10匹の胸腺欠損nu/nuマウスの腋窩部にs.c.で移植される(マウス1匹につき0.5mlあたり107個の細胞)。これらのマウスに対する好ましい飼育条件は、12時間の明/暗サイクルにおいて柵施設中に維持した滅菌ポリカーボネートフィルターで蓋をしたマイクロアイソレーターケージ、ならびに滅菌した食物および適宜な水の供給を含む。移植された動物は、腫瘍の出現について1週間に2回観察される。固形腫瘍の増殖は、腫瘍塊を測定するインサイチュのキャリパー測定を使用してモニタリングされる。重量(mg)は、長球面についての式を使用し、そして1.0g/cm3の特定の重力であると仮定して、2つの垂線の寸法(長さおよび幅)の測定値(mm)から算出される(Geranら、前出)。これらの腫瘍のフラグメントは、インビボ材料の特徴をモニタリングし、それらをインビトロ株の特徴と比較し、可能な場合には最初の患者の腫瘍について報告された特徴と比較するために、組織学的な分析、細胞化学的な分析、および超微細構造的な分析に供され得る(Stinson SFら、Anticancer Res 12:1035−1054(1992)。インビトロ腫瘍材料およびインビボ腫瘍材料の両方は、組織型および起源の腫瘍と一致する特徴を示すべきであるが、いくつかの培養細胞株と対応する異種移植片材料との間の分化の程度における違いは、異常なことではない。
好ましいモデルは、本明細書中で実施例2に記載される一連の乳腺腫瘍細胞株を利用する。好ましくは、これらの腫瘍は、実験的転移モデルにおいて試験され、このモデルにおいて、適切な数の腫瘍細胞が免疫無防備状態のマウスに静脈内(iv)注射され、その後、種々の時間においてその肺が微視的な転移または巨視的な転移を数えるために取り出される。本発明の組成物は、腫瘍細胞の前、腫瘍細胞と一緒、または腫瘍細胞の後(またはこれらの任意の組み合わせ)に与えられ得る。このことによって、その組成物の予防的活性と治療的活性との間の区別が可能になる。
例示的なモデル系において、ヌード(nu/nu)マウスは、その動物の右側のs.c.にMDA−MB−231細胞(ヒト乳癌)(0.2ml中に106個の細胞)を接種される。これらの腫瘍は、200mm3にされ、その後、試験組成物による処置が開始される(1日1回のIPで、1日につき動物1匹あたり100μg)。腫瘍体積は、1日おきに取得され、そしてその動物は、処置の2週間後に屠殺される。これらの腫瘍は、切除され、秤量され、パラフィン包理される。.腫瘍の組織学的切片は、例えば、H染色およびE染色、抗CD31染色、Ki−67染色、TUNEL染色、ならびにCD68染色によって分析される。
本発明の化合物はまた、実験的転移モデルを使用して後期の転移の阻害について試験される(Crowley,CWら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 90 5021−5025(1993))。後期の転移は、腫瘍細胞の接着および血管外遊出、局所浸潤、播種、増殖および新脈管形成の工程を含む。レポーター遺伝子(好ましくは、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子であるが、酵素クロラムフェニコールアセチル−トランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼまたはLacZをコードする遺伝子によって代替される)によってトランスフェクトされたヒト前立腺癌細胞(PC−3)が、ヌードマウスに接種される。このアプローチは、これらの細胞の運命を追跡するための、これらのマーカーのいずれかの利用(GFPの蛍光検出または酵素活性の組織学的な比色定量検出)を可能にする。細胞は、好ましくはivに注射され、そして転移は、特に、肺においてであるが、所属リンパ節、大腿および脳においても、約14日後に同定された。これは、ヒト前立腺癌において天然に存在する転移の器官親和性を模倣する。例えば、GFPを発現するPC−3細胞(マウス1匹あたり106個の細胞)は、ヌード(nu/nu)マウスの尾静脈にivで注射される。動物は、1日1回のIPで、1日につき動物1匹あたり100μgにて試験化合物によって処置される。単一の転移細胞および病巣は、蛍光顕微鏡もしくは光学顕微鏡の組織化学によってか、またはその組織を削ることおよび検出可能な標識の定量的比色アッセイによって、可視化され、そして定量化される。
ラット同系乳癌系(Xingら、Int.J.Cancer 67:423−429(1996))は、Mat BIIIラット乳癌細胞を利用する。腫瘍細胞細胞(例えば、0.1ml PBS中に約106個)は、雌Fisherラットの乳房の脂肪パッドに接種される。接種と同時に、14日Alza浸透圧性小型ポンプが、試験化合物の分配のために、腹腔内に移植される。この化合物は、PBS(例えば、200mMストック)中に溶解され、濾過滅菌され、そして約4mg/kg/日の放出速度を達成する小型ポンプ中に配置される。コントロール動物は、小型ポンプ中の、ビヒクル(PBS)のみか、またはビヒクルコントロールペプチドを受容する。動物は、約14日目に屠殺される。本発明の活性化合物によって処置されたラットにおいて、原発腫瘍のサイズ、ならびに脾臓、肺、腎臓、およびリンパ節における転移の数(分散した病変として数えられる)の有意な減少が、観察される。組織学的分析および免疫組織化学的分析は、処置した動物中の腫瘍において、壊死およびアポトーシスの徴候の増加を示す。広い壊死領域が、新生血管形成を欠く腫瘍領域において認められる。HBD−S−B4ベースの融合ポリペプチド(「GlyB4」)(例えば、HAまたはHisタグを有する)およびそれらの誘導体が、有効であり、そしてこれらは、関連するコントロールポリペプチドより、少なくとも2倍強力であることが見出される対照的に、コントロールポリペプチドによる処置は、腫瘍のサイズまたは転移の有意な変化を引き起こさない。
(NRGのヘパリン結合ドメインによるECMに対する標的化組換えNRGアンタゴニスト)
(材料および方法)
アミノ酸14〜276に対応するNRG β1組換えタンパク質IG−EGFは、Amgen(Thousand Oaks,CA)によって提供された。このNRGアンタゴニストIgB4構築物は、Dr.Y.Yarden(Weizmann Inst.,Rehovot,Israel)からの寄贈品であった。細胞培養のための全ての培地、緩衝液および材料ならびにトランスフェクション試薬を、Gibco−Invitrogen Life Science(Carlsbad,CA)から購入した。ヘパリンカラムを、Sigma(St.Louis,MO)製であった。ホスホチロシン抗体4G10を、Upstate Biotechnology Incorporation(Lake Placid,NY)から購入し;抗HAモノクローナルの未加工腹水HA.11は、Covance Inc.(Princeton,NJ)製であり;抗HA親和性マトリックス(3F10)は、Roche(Indianapolis,IN)製であり;ヤギ抗マウス二次抗体は、Chemicon(Temecula,CA)であった。Gelcode SilverSNAP Stainキットを、Pierce Biotechnology(Rockford,IL)から購入した。
erbB4レセプターのECDは、ヒトerbB4NM_005235 mRNA[配列番号13を参照のこと]の残基28〜1978bpに対応し、そして34〜108bpは、成熟タンパク質の局在化のための25アミノ酸のシグナル配列へと翻訳される。NRGのHBDドメインおよびHBD−Sドメインを、ヒトNRG1 NM_013964から得た。ヒトNRG1 NM_013964において、HBDドメインは、そのDNA配列の172〜489bpに対応する一方で、HBD−S(スペーサードメインを含む)は、172bp〜663bpに伸びていた。マルチクローニングサイト(MCS)がHAタグのNH2末端に配置されるプラスミドpMH(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)を使用して、プラスミドpcDM7中のNRGアンタゴニストIgB4(Chen,X,1996.,J Biol Chem 277:7620−9)からB4−HA構築物およびB4−Fc構築物を産生した。IgB4のPCRを行って、erbB4(B4HA)単独のECDおよびerbB4−Fc(B4FcHA)のECDの両方に制限酵素認識部位Kpn IおよびEcoRIを付加した。
順方向 5’−C TTG GGT ACC CAA AAA ATG AAG CCG GCG ACA G−3’ [配列番号15];
逆方向 5’−CG CGA ATT CTT AGC ATG TTG TGG TAA AGT GG−3−’[配列番号16]
であった。
順方向 5’−C TTG GGT ACC CAA AAA ATG AAG CCG GCG ACA G−3’ [配列番号17]
逆方向 5’−CCG CGA ATT CAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GG−3’ [配列番号18]。
B4−HBD−HAを、B4−Fc−HA構築物からサブクローニングした。NRGβ1形態のヒトHBDドメインを、プラスミドHARIA PATH2(S.Tejvir,University of Pennsylvaniaから得た)から増幅し、以下のプライマー対:
順方向 5’−CAG GAT CCC AAG AAG AAG GAG CGA GGC CTC C−3’;[配列番号19]
逆方向 5’−G CGA ATT CCC TAA TTT GCT GAT CAC TTT GC−3’ [配列番号20]
を使用してBamHI制限酵素部位およびEcoRI制限酵素部位を付加した。HBD PCRフラグメントを、BamHIおよびEcoRIによって消化し、そしてFc部分をB4FcHA構築物から切り出した後にMCS部位に挿入した。
順方向 5’−G CCA AGC TTG CAA AAA ATG AAG CCG GCG ACA G−3’;[配列番号21]
逆方向 5’−GA GGT ACC CTG AGA ATC GCT GGG CTG GAC G−3’ [配列番号22]
を使用してHind IIIおよびKpn Iを付加することによって、erbB4のシグナル配列(SS)をpMHのMCS部位にサブクローニングすることにより作製した。
順方向 5’−TTG GGT ACC CAG TCA GTG TGT GCA GGA ACG−3’ [配列番号23];
逆方向 5’−CG CGA ATT CTT AGC ATG TTG TGG TAA AGT GG−3’ [配列番号24]
を使用することによって、シグナル配列を有さないerbB4ECDを上記SS−HA構築物の制限酵素部位Kpn IとEcoRIとの間に挿入することによりサブクローニングした。
順方向 5’−TG GGT ACC AAG AAG AAG GAG CGA GGC TCC G−3’ [配列番号25];
逆方向 5’−GA GGT ACC TCC TAA TTT GCT TAT CAC TTT GC−3’ [配列番号26]
であった。HBD−Sドメインのために使用したプライマー対は、以下:
順方向 5’−TG GGT ACC AAG AAG AAG GAG CGA GGC TCC G−3’ [配列番号27];
逆方向 5’−GA GGT ACC GCT TGT CCC AGT GGT GGA TGT AG−3’ [配列番号28]
であった。
L6細胞を、10%CO2インキュベーターにおいて、および1000U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中で37℃にて培養した。HEK293細胞を、10%CO2インキュベーターにおいて、10%のウシ胎仔血清、1mMのL−グルタミン、2mMのピルビン酸ナトリウム、0.lmM非必須アミノ酸、1000U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中で37℃にて培養した。選択的抗生物質ジェネテシン200μg/ml(Gibco−Invitrogen)を、NRGアンタゴニストを有する安定にトランスフェクトしたHEK293細胞の細胞培養物に添加した。
HEK293細胞を、25mmフラスコ中で80%コンフルーエンスまで培養し、そして指示される通りリポフェクタミン2000(Invitrogen Life Science)を使用して4種のNRGアンタゴニスト構築物を用いてトランスフェクトした。次いで抗生物質ジェネテシンを、400μg/mlでトランスフェクトHEK293細胞に添加して、ポジティブなアンタゴニストのトランスフェクト細胞を選択した。ジェネテシン選択の3週間後、このトランスフェクトHEK293細胞を、希釈し、そして96ウェルプレートにプレートして、単一のポジティブクローンを得た。次いで、最も高いレベル(HA抗体を使用したウェスタンブロットによって確認した)のアンタゴニストを発現した単一のクローンを、200μg/mlのジェネテシンを含む培養培地中に維持した。Optimem I(Gibco−Invitrogen)を、安定にトランスフェクトしたNRGアンタゴニスト細胞株に、10%CO2インキュベーター中で37℃にて2日間適用した。次いで、調製済みOptimem I培地を、以下の実験において使用した。
上記4種のNRGアンタゴニストを含む調製済み培地を、ヘパリンカラムに通して、ヘパリンに結合させた。過剰に結合したアンタゴニストタンパク質を、1×PBSによって2回洗浄した。次いで上記アンタゴニストタンパク質を、NaClの濃度を増加(0.25M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6Mおよび1M)させて溶出させた。各工程からの流出(flow through)溶液を、後で記載されるように抗HAウェスタンブロットによって調べて、アンタゴニストのヘパリン結合能力を決定した。
NRGアンタゴニストを、製造業者の説明書に従い、抗HA親和性マトリックス(3F10)(ラットmAb)によって精製した。簡単にいうと、このカラムを、20mMのTris(pH7.5)、0.1MのNaCl、0.1MのEDTAを含む緩衝液によって平衡化した、そして調整済み培地中の各アンタゴニストを、上記抗HA親和性マトリックスに個別に適用した。過剰な結合していないアンタゴニストタンパク質を、20容量の洗浄緩衝液(20mMのTris(pH7.5)、0.1MのNaCl、0.1MのEDTAおよび0.05%のTween 20)によって洗浄した。結合したNRGアンタゴニストを、0.1Mのグリシン(pH2)によって溶出させた。次いで精製した組換えタンパク質を、BioRad Protein Assayキット(Bio−Rad,Hercules,CA)を使用して定量化した。
調製済み培地および精製したNRGアンタゴニストの両方を、7.5%還元SDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。このゲルを、30%のエタノールおよび10%の酢酸によって30分間固定した。その後10%のエタノールおよび超純水を使用してそのゲルを洗浄し、その後増感剤を含むSilverSNAP染色溶液によって30分間染色した。次いでそのゲルを、エンハンサーを含むSilverSNAP現像溶液を使用して現像した。5%の酢酸を使用して、所望のバンド強度に達したときにその反応を止めた。そのゲルを、真空ゲル染色機を使用して濾紙上で乾燥した。
50pMのNRGと組み合わせた比較可能な量のNRGアンタゴニストを、細胞のプレート後8日目にL6細胞に適用し、そして10%CO2インキュベーターにおいて37℃にて45分間インキュベートした。ポジティブコントロールのL6細胞を、50pMのNRGのみによって処理した。L6細胞溶解物を、調製し、そして5% SDS−PAGEゲル上で電気泳動した。erbBレセプターリン酸化のウェスタンブロットを、4G10抗体を使用して行った。
ウェスタンブロットを、調製済みNRGアンタゴニスト培地およびアンタゴニスト処理L6細胞の両方について行った。アンタゴニストタンパク質およびL6細胞を、上に記載されるように、SDSサンプル緩衝液中で可溶化し、そして5分間煮沸した(Liら,前出も参照のこと)。7.5%SDS−PAGEゲル上で電気泳動したNRGアンタゴニストを、抗HA mAb HA.11によって検出した。ホスホチロシンmAb 4G10を使用して、オーバーラン5%還元SDS−ポリアクリルアミドゲル上での分離後、L6細胞ウェスタンブロット分析においてリン酸化erbBレセプター(p185)を検出した。次いでそのフィルターを、ペルオキシダーゼと結合したヤギ抗マウスIgG二次抗体を用いてプローブし、化学発光試薬(PerkinElmer Life Science,Boston,MA)によって処理し、そしてX−ブルーフィルム(Eastman Kodak Co.)に曝露した。
これらの研究の目的は、付加した「標的化」HBDドメインを有するerbB4レセプターの細胞外リガンド結合ドメインを使用して強力なNRGアンタゴニストを作製することであった。発現を追跡し、そしてそのアンタゴニスト構築物を精製するために、9アミノ酸のHAタグを、erbB4ドメインおよびHBDが異なる関連した位置において試験されたerbB4構築物のC末端に導入した(図2A)。コントロールとして、erbB4のECDを、HBDドメイン(B4−HA)を含まずに単独で発現させた。他の3種のアンタゴニストを、ドミナントネガティブなerbB4レセプター(B4−HA)のN末端(HBD−B4−HAおよびHBD−S−B4−HA)またはC末端(B4−HBD−HA)のいずれかにHBDドメインを付加することによって構築した。erbB4レセプターの25アミノ酸のシグナル配列を、各組換えタンパク質のN−末端に維持した。なぜなら翻訳後修飾の間に短縮されることが知られていたからである。HBD−B4−HA構築物およびHBD−S−B4−HA構築物は、HBDとerbB4レセプターとの間に天然に存在するグリコシル化スペーサードメイン(S)を挿入することによって異なる。全てのNRGアンタゴニストを、配列決定によって検証した。
(ヒト乳腺細胞の悪性転換によるオートクラインニューレグリンシグナル伝達ループの発生)
使用される略語:NRG、ニューレグリン;PBS、リン酸緩衝化生理食塩水;p185、リン酸化erbBレセプター;IgB4、可溶性erbB4免疫グロブリンFc融合アンタゴニスト、EGF、上皮増殖因子。
試薬および細胞株:インスリンおよびヒドロコルチゾンを、Sigma(St.Louis,MO)から購入した;上皮増殖因子を、Upstate Biotechnology Incorporation(Lake Placid,NY)から得た;これら毒素およびAG1478を、Calbiochem(La Jolla,CA)から購入した。細胞培養のための全ての他の培地、緩衝液、および材料を、Invitrogen Life Sciences(Carlsbad,CA)から購入した。アミノ酸14〜276に対応するニューレグリンβ1組換えタンパク質IG−EGF形態は、Amgen(Thousand Oaks,CA)によって提供された。トラスツズマブは、Dr.Wei−Zen Wei(Karmanos Institute,Wayne State University)からの惜しみのない寄贈品であった。ホスホチロシン抗体4G10を、Upstate Biotechnology Incorporation(Lake Placid,NY)から購入した;erbB2抗体およびerbB3抗体を、Santa Cruz(Santa Cruz,CA)から得た;ヤギ抗マウス抗体およびヤギ抗ウサギ抗体を、Chemicon(Temecula,CA)から得た。正常乳腺上皮MCF10A細胞、前悪性MCF10AT細胞および悪性MCF10CA1細胞は、Barbara Ann Karmanos Cancer Institute,Core Cell Facility,Wayne State Universityによって提供された。NRGアンタゴニストIgB4によって安定にトランスフェクトしたHEK293細胞は、Dr.Corfas(Harvard)からの寄贈品であり、そしてこのプラスミドは、本来は、Dr.Yarden(Weizmann Institute,Israel)からのものであった。
細胞増殖アッセイ:全3種の乳腺上皮細胞株を、ウェル1つあたり5000個の細胞で48ウェルプレートにおいて通常のMCF10A/AT培地またはMCF10CA1培地にプレートした。3日間インキュベートした後、MCF10A/AT培地中に1nMのNRG またはただMCF10A/AT培地単独を、それらの細胞にさらに24時間適用し、次いでそれらを、培養培地によって洗浄し、その後、4日目、5日目、6日目、7日目、および8日目に血球計を使用して、細胞数を計測した。
(NRGは、MCF10シリーズにおいて、抗増殖性因子から増殖性因子に変化し、そして細胞増殖遺伝子をダウンレギュレートするその能力を失う)
MCF10シリーズの細胞株の増殖速度に対するNRGの効果を、血清含有培地中で増殖させたMCF10A、MCF10ATおよびMCF10CA1を用いて調べた(図6A〜6C)。プレートした3日後、24時間の1nM NRG処理は、MCF10A細胞の増殖速度の持続性の減少をもたらした。対照的に、NRG処理は、より悪性のMCF10CA1細胞の初期の増殖速度を増加させた。MCF10AT細胞のNRG処理は、これらの中間であり、増殖速度の、小さい初期の減少のみであった。これらの結果は、細胞が、より悪性になるにつれて、抗増殖性効果から増殖性効果に切り換わるMCF10細胞の増殖に対するNRGの効果における漸進的な移行を示す。
1つの可能性は、差次的なerbBレセプターの発現および/または活性化が、MCF10細胞株シリーズにおいてNRGに対する異なる応答に寄与し得ることである。実際に、erbB2を過剰発現するMCF10A細胞は、NRGの分裂促進効果に、より感受性である(Ram TGら、(1995)J Cell Physiol;l63:589−596)。したがって、NRG誘導性レセプターチロシンリン酸化(p185)の程度を、ホスホチロシン抗体、ならびにMCF10A細胞、MCF10AT細胞およびMCF10CA1細胞において活性レセプターのヘテロダイマーを形成し得るerbB2およびerbB3の相対的な存在量を使用して測定した。p185は、複数のerbBレセプターから構成され得るので、図8Aにおけるホスホチロシンのウェスタンブロットを、erbB2(図8B)およびerbB3(図8C)に対して特異的な抗体を用いて再度プローブした。上のバンド(p185)は、主に、erbB2およびerbB3から構成される。より下のバンドはより小量のerbB3免疫反応性を含んだが、その主な構成成分は、NRG処置の非存在下において3種全ての細胞株中でリン酸化され続けるerbBl(EGFレセプター;示さず)である。erbBレセプターが互いにヘテロダイマー化すると考えると、個々のレセプターサブタイプの免疫沈降は、他のサブタイプを沈めることなくしては不可能である。
悪性の細胞株における外来性NRGの非存在下でのp185レセプターリン酸化の高い基礎レベルの存在は、これらの細胞がNRGを分泌し、次に、オートクライン経路においてerbB2レセプターおよびerbB3レセプターを活性化する可能性を生じる。NRGの存在について試験するために、MCF10A細胞、MCF10AT細胞およびMCF10CA1細胞のRT−PCRを、ヒトNRGのヘパリン結合ドメインに対して特異的なプライマー対を使用して行った(図9A)。このドメインは、NRGの全ての可溶性形態において発現される(Falls DL、(2003)Exp Cell Res 284:14−30)。定量的ではないが、これらの結果は、上記乳腺上皮細胞がより悪性の癌細胞になるにつれて、増加するレベルのNRGが発現されることを示唆する。同じ数の上記3種の細胞株の各々から上記調整済み培地中に放出されるNRG活性の量を、p185レセプターリン酸化によって、可溶性のNRG活性を測定する感度のよい手段として、L6筋細胞株を使用して測定した(Corfasら、前出)。図9Bは、上記3種の細胞株の各々に由来する調整済み培地中のNRG活性の量が、細胞がより悪性になるにつれて有意に増加したことを示す。これは、それらの基礎p185リン酸化の程度を平行して増加させ、このことは、内因性NRG産生が、より悪性の細胞におけるerbBレセプターリン酸化の高い基礎レベルの原因であることを示唆する。
上で報告した結果は、MCF10細胞がより悪性になるにつれて、それらが、細胞増殖を促進するオートクラインNRGシグナル伝達ループを発生するという概念と一致する。したがって、高度に悪性のMCF10CA1細胞におけるこのオートクラインループの遮断は、細胞の増殖速度を減少させると予想された。NRGシグナル伝達を、以下の3つの相補的なアプローチを使用してブロックした:(A)培養培地中に放出される可溶性NRGに対する細胞表面レセプターと競合することによって作用するアンタゴニストを産生するIg Fcドメインに融合されるerbB4のECDを含んだ、IgB4と称される可溶性erbB4レセプターアンタゴニスト使用して、細胞特異的erbBレセプターの活性化から内因性NRGをブロックすることによる;(B)erbBレセプター特異的チロシンキナーゼインヒビターAG1478(Levitzki Aら、(1995)Science 267:1782−88)を使用して薬理学的にerbBレセプターシグナル伝達をブロックすることによる;および(C)erbB2レセプターを特定のmAb(例えば、市販されているmAb(トラスツズマブ、すなわちHerceptin(登録商標)(現在、臨床上で使用中)))を用いてダウンレギュレートすることによる。
この実施例は、MCF10細胞株の漸進的な悪性転換が、NRGの通常の抗増殖性効果の喪失および細胞増殖を刺激するオートクラインNRGシグナル伝達ループの発生に関連することを示す。MCF10細胞シリーズは、単一の、同系シリーズにおいて、全く正常なMCF10A細胞から前悪性のMCF10AT細胞まで、前悪性のMCF10AT細胞から高度に悪性のMCF10CA1細胞までの腫瘍形成のスペクトル全体を網羅する。このシリーズの細胞株に対する外来性NRGの効果は、この細胞が正常から悪性へと変化するにつれて、抗増殖性から増殖性へと「切り換わった」。これは、相対的なerbB2の増加およびerbB3発現の減少と関連していた。erbB2はNRGを結合できず、そしてerbB3は不活性なチロシンキナーゼドメインを有するので、erbB2/3の比率の変化は、erbB3に対するNRGの結合およびerbB2によるシグナル伝達を著しく変更し得る。NRGの応答性のこの変化についての機構がerbBレセプターサブタイプの発現の変化に起因し得るが、それはまたオートクラインシグナル伝達ループを介するerbBレセプター活性化の高い基礎レベルをもたらす内因性NRG分泌の著しくより高いレベルから生じ得る(図13)。一貫して、数種の異なるアプローチによるこのオートクラインループの途絶は、持続性のerbBレセプター活性化および細胞増殖の速度の両方を効率的に減少させる。
(ヘパラン硫酸プロテオグリカンの特定の構造的特徴は、ニューレグリン−1シグナル伝達を増強する)
この実施例は、NRG1とヘパリンとの相互作用に必要とされる特定の構造的特徴を定義し、そしてインビトロでのこれらの特徴の生理学的重要性を示す。特定の硫酸基についての重要性の明確な上下関係が示され、N−硫酸基が、NRG1に結合しそしてerbBレセプターリン酸化をブロックするために最も重要であり、次いで2O−硫酸基および6O−硫酸基が重要である。一貫して、塩素酸塩による全ての内因性硫酸基の除去、またhN−硫酸化を促す酵素を指向するsiRNAによるN−硫酸化の選択的遮断は、NRG1誘導性のerbBレセプター活性化の低下を生じた。この特異性は、組織が、GAG組成物における改変によってNRG1シグナル伝達を局在化し得、そして増強し得る手段を提供する。
試薬:組換えヒトNRG1 β1ポリペプチドを、R&D(Minneapolis MN)から得た。単離EGF様ドメインは、アミノ酸177〜246に対応し、そしてNRG1のインタクトなIgEGF形態は、アミノ酸14〜246に対応する。塩素酸ナトリウムを、Sigmaから購入した。ヘパラン硫酸抗体(10e4)を、Seikagaku(Japan)から得た。脱−N硫酸化ヘパリン、脱−2O硫酸化ヘパリン、および脱−6O硫酸化ヘパリンを、先に記載されるように調製した(Ostrovsky、Oら、(2002)J Biol Cliem 277;2444−53)。長さが12個〜2個の二糖類の異なるサイズのヘパリンフラグメントを、先に記載されるように、低分子量ヘパリンの高分解能ゲルクロマトグラフィーによって調製した(Goger、Bら、(2002)Biochemistry 47:1640−46)。全ての実験について、上記ヘパリンを、等しい重量/容量(μg/ml)の濃度にて使用した。
(特定のヘパリン硫酸基が、NRG1の結合に必要とされる)
全ての硫酸基(完全に脱硫酸化)、N−硫酸基(脱−N硫酸化)、2O−硫酸基(脱−2O硫酸化)、または6O−硫酸基(脱−6O硫酸化)のいずれかを欠く、化学的に改変したヘパリンのセットを、ヘパリンとNRG1との相互作用における硫酸基の重要性を、Rosenbergら(Wuら、前出)によって記載される後のGMSAモデルを使用して評価するために調製した。ヘパリンオリゴ糖類を、選択した。なぜならそれらは、より高度かつ均一に硫酸化されるが、内因性の細胞表面ヘパラン硫酸に対する高度の構造類似性を有するからである(Honke、Kら、(2002)Med Res Rev 22:637−54)。このGMSAは、タンパク質/オリゴ糖類複合体を、質量比およびコンホメーションに対するゲルの電荷に基づいて分離する非変性ポリアクリルアミドゲルを使用する。緩衝液条件を最適化し、その結果、NRG1(pI8.8)は、荷電領域において最小限の易動度を生じる網目の中性の電荷に近かった(図14A)。しかし、ヘパリンと複合体化した場合、NRG1−ヘパリン複合体は、さらに移動し、そしてウェスタンブロットによるNRG1の易動度において「シフト」を示した。図14Aは、ヘパリンの増加性の濃度が、図14Bにおいて定量化される用量依存性の様式でNRG1をシフトさせることを示す。
他のヘパリン結合タンパク質に対して行われた(Wuら.、2002、2003、前出)ような放射標識したオリゴ糖類ではなくNRG1に対するウェスタンブロットを使用するゲルシフトアッセイの制限は、結合していないNRG1がより高いpHにおいてさえほとんどゲルに進入しなかったことである。これは、ゲルの上端において結合していないNRG1を示すNRG1バンドの強度における可変性をもたらした。この問題に起因して、そして第2に、ヘパリンとNRG1との相互作用における特定のヘパリン硫酸化パターンの相対的な重要性を確認する独立の手段として、これらの同じ脱硫酸化ヘパリンのL6筋細胞においてerbBレセプターリン酸化をブロックする能力を試験した可溶性ヘパリンがerbBレセプター活性化をブロックする正確な機構は知られていないが、生物学的に関連する系においてNRG1とヘパリンとの相互作用の親和性を比較することは、有用なアッセイであり、そして異なる硫酸化オリゴ糖類の相対的親和性を規定するために先に使用されている(Loebら.、1995、前出)。図16Aは、NRG1誘導性のerbBレセプターリン酸化が十分に硫酸化したヘパリンによって、用量依存性の様式で阻害されることを示す。図16Bは、改変したヘパリンの各々について、NRG1誘導性のerbBレセプターリン酸化をブロックする有効性の減少を示す。ゲル易動度シフトアッセイと同様に、完全に脱硫酸化したヘパリンおよび脱−N硫酸化ヘパリンは、100μg/mlにおいてさえほとんど阻害を有さなかった。同様に、2O−脱硫酸化ヘパリンおよび6O−脱硫酸化ヘパリンは、再び、十分に硫酸化したヘパリンと比較して、類似する中間の効果を示した。この結果を、図16Cにおいて定量化し、そしてコントロールの%として提示した。珍しいことに、低濃度(1μg/ml)の脱−N硫酸化ヘパリンは、レセプターリン酸化に対して小幅な刺激性を有した。この再現可能な観察は、低濃度の低親和性ヘパリンが細胞表面上の内因性HSPG結合部位からNRG1を放出することによってerbBレセプター活性化を増強し得るという可能性を生じる。
この結果は、これまでのところ、NRG1とヘパリンとの相互作用を促すための特定の硫酸化パターンの重要性を示唆し、そして硫酸基についての重要性の上下関係を示した。NRG1とヘパリンとの相互作用に対する鎖長の重要性を、12個の二糖類から2個の二糖類へとサイズが減少する十分に硫酸化したヘパリンフラグメントのセットを使用して、GMSA(図17A)およびレセプターリン酸化アッセイ(図17B)の両方において調査した。ヘパリンの鎖長が減少した場合、これらのオリゴ糖類の等しい重量/容量濃度は、優勢なNRG1−ヘパリン複合体において上方向へのシフトをもたらした。シフトされたNRG1の相対量は、より短いヘパリンの鎖長によって減少し、このことは、より長いヘパリンが、より効率的にNRG1を結合することを示唆する。等モル量の各オリゴ糖類によって、より長いオリゴ糖類とより小さいオリゴ糖類との間のさらに大きな違いが、予想された。所定のオリゴ糖類の長さに対する複数のバンドの出現は、複数のNRG1モノマーが単一のヘパリン鎖を結合することか、または複数のオリゴ糖類モノマーが単一のNRG1を結合することのいずれかの可能性をもたらす。長さが2個の二糖類と同じ小ささであるヘパリンは、少量のNRG1をシフトさせ得、これは、ゲルの右側において見られる(そして、より長いフィルムの露出において明確に見られ、ここでは示されない)。種々のサイズのヘパリンフラグメントの能力を、図17A中のNRG1の結合の効果に沿って、NRG1誘導性レセプターリン酸化のブロックについて比較した。ヘパリンの鎖長が減少するにつれて、NRG1誘導性のerbBレセプターリン酸化を阻害するヘパリンの能力は、漸進的に損なわれた(図17B)。一旦その鎖長が、約4個の二糖類以下に減少すると、ヘパリンによる有意な阻害は存在しなくなる。内因性ヘパラン硫酸基は、NRG1 誘導性のerbBレセプター活性化を増強する。
内因性HSPGは、NRG1(IgEGF)のヘパリン結合形態によって、erbBレセプター活性化を有意に増強するが、ヘパリン結合Ig様ドメイン(EGF)を欠くNRG1の形態によっては増強しない(WO 03/012045;Li & Loeb、前出)。内因性硫酸化の役割を、L6筋細胞を、3’−ホスホアデノシン−5’−ホスホスルフェート(PAPS)(スルホトランスフェラーゼ反応のためのスルフェート供与体)の形成を競合的に阻害する塩素酸塩を用いて48時間処理することによって調べた(Safaiyan,Fら、(1999)J Biol Chem 274:36267−73;Gao,Rら、(2004)J Biol Chem 279:8848−55;Kaneider,Nら、(2004) Biochemistry 43:237−44)。全長の、NRG1のヘパリン結合形態(IgEGF)を使用することで、塩素酸処理は、レセプターリン酸化を53%減少させたのに対して、ヘパリン結合ドメインを欠くEGF形態を用いた場合に減少は認められなかった(図18A〜18B)。このことは、NRG1との細胞の相互作用を増強するための内因性HSPG硫酸基の重要性を実証する。
実質的に全ての細胞が、HSPGを発現し、そしてヘパリン結合因子の一覧が増加し続けるとすると仮定すると、発生の間および一生を通じた動的な要求に応じて、どの因子が所定の細胞表面に結合し、そしてそれに沿って集まるのかを識別するために、機構が必要とされる。HSPGの量におけるバリエーションおよびそれらの特定の硫酸化パターンは、このことが達成され得る方法である。特定の増殖因子が必要とされる場合、それに応じて、細胞は、GAG鎖を改変する酵素の発現を調節し得る。実際に、HSPG構造における領域特異性は、抗ヘパラン硫酸mAbによって観察されており、抗ヘパラン硫酸mAbの各々は、発達の間の骨格筋の独特な領域を染色する(Jenniskens,GJら、(2000)J Neurosci 20:4099−4111)。ヒヨコ肢芽の前方および後方または基部における2つの異なる6O−スルホトランスフェラーゼ酵素の局在化した発現、および肢芽全体にわたる2O−スルホトランスフェラーゼのより均一な発現は、それぞれ、この知見が無秩序ではないが、合成酵素の発現によって発生の間で高度に協調していることを示唆する(Nogami,Kら.、(2004)J Biol Chem 279:8219−29)。特定のスルファターゼの活性化によってHSPGの硫酸化の状態を調節し得るHS鎖の合成後の改変がまた、記載されている。これは、HSのS−ドメインを標的化し、そしてWntシグナル伝達を促進する鳥類のスルファターゼQ−sulfl(Dhoot,GKら、(2001)Science 293:1663−66)、および癌における増殖因子シグナル伝達をアップレギュレートするのに必要とされる哺乳動物のホモログHsulf−1(Lai,Jら、(2003)J Biol Chem 278:23107−17)を含む。
処置される全ての患者は、生検または細胞学によって確認された(組織学的に確認された)悪性塊を有する。悪性疾患としては、癌腫、肉腫、神経膠腫および髄芽腫が挙げられる。患者は、従来の治療に応答しないか、またはその癌が従来の治療にも関わらず進行している人達である。任意の臓器系に関する悪性疾患の全ての段階における患者を含める。病気分類は、腫瘍の起源の臓器、組織学的型、組織学的悪性度、腫瘍サイズの範囲、転移の部位およびその患者の機能の状態を含む、腫瘍および宿主の両方を記述する。一般的な分類は、ステージ1(局所的な疾患)からステージ4(広範な転移)の既知の範囲を包含する(Abraham Jら.、Bethesda Handbook of Clinical Oncology、Lippincott、Williams & Wilkins、Philadelphia、PA、2001、またはより最近の版を参照のこと)。患者の病歴を得て、従来の心血管および肺機能の試験、ならびに適切な放射線手順と一緒に、理学的試験を実施する。この悪性塊は、X線もしくはCTスキャンで可視であり、そして/またはカリパスで測定可能である。患者は、任意の他の抗癌処置を少なくとも1ヶ月間受けておらず、少なくとも50の臨床KPSを有する。
治療に対する腫瘍の応答の評価は、CTまたはX線可視化を使用して、治療の間およびその後30日間、1週間に1回行う。処置への応答、副作用、および患者の健康状態に依存して、処置を終了するか、または上述の標準的なプロトコールから延長する。腫瘍の応答基準は、以下にまとめるWHOおよびRECIST(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)によって確立されたものである(例えば、Abrahamら、前出)。
合計400人の患者が、処置される患者である。各腫瘍の型についての患者の数および処置の結果は、表1にまとめる。陽性の腫瘍応答が、乳房腫瘍、卵巣腫瘍および胃腸(胃、食道、結腸および直腸を含む)腫瘍の患者の77〜85%もの多数の患者において観察される。
Claims (29)
- ニューレグリンヘパリン結合ドメイン(N−HBD)融合ポリペプチドをコードするハイブリッド核酸分子であって、該分子は、以下:
(a)ヒトN−HBDポリペプチドをコードする第1の核酸配列;
(b)該第1の核酸配列とインフレームで融合された、スペーサー(S)をコードする第2の核酸配列であって、該スペーサー(S)は、ヒトニューレグリンの天然のアミノ酸スペーサーであり、該スペーサー(S)の配列は、配列番号14の残基131〜195にある、第2の核酸配列;および
(c)第3の核酸配列であって、該第3の核酸配列が、(i)該第2の核酸配列にインフレームで連結され、そして(ii)Sに対してC末端側に融合された標的化ポリペプチドをコードし、該標的化ポリペプチドは、ヘパラン硫酸に富んだ細胞または組織表面に標的化および局在化され、そして、ヒトerbB4レセプター(B4)細胞外ドメイン(B4−ECD)を含む、第3の核酸配列、
を含む、ハイブリッド核酸分子。 - 配列番号13のコード部分である、請求項1に記載の核酸分子。
- 配列番号4のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 以下に作動可能に連結された請求項1〜3のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクターであって:
(a)プロモーターおよび
(b)真核生物細胞における該核酸の発現を調節する、さらなる調節配列、
該ベクターが、細胞へのインビトロまたはインビボでの送達の後に、該細胞中で発現され得る、発現ベクター。 - プラスミドである、請求項4に記載の発現ベクター。
- ウイルスベクターである、請求項4の発現ベクター。
- ベクター組成物であって、以下:
(a)第1の組換え発現ベクターであって、請求項1〜3のいずれかに記載の第1および第2の核酸配列を含む、第1の組換え発現ベクター;
(b)第2の組換え発現ベクターであって、請求項1〜3のいずれかに記載の第3の核酸配列を含む、第2の組換え発現ベクター、ならびに
(c)請求項4に定義されるプロモーターおよび調節配列
を含み、該発現ベクターは、宿主細胞を同時感染または同時トランスフェクトして、コードされるN−HBD融合ポリペプチドの同時発現をもたらし得る、ベクター組成物。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の核酸分子によって、形質転換されたか、またはトランスフェクトされた細胞。
- 請求項4〜6のいずれかに記載の発現ベクターによって、形質転換されたか、またはトランスフェクトされた細胞。
- 請求項7に記載の組成物によって、形質転換されたか、またはトランスフェクトされた細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項8〜10のいずれかに記載の細胞。
- ヒト細胞である、請求項11に記載の細胞。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の核酸分子または請求項4〜6のいずれかに記載のベクターによってコードされる、N−HBD融合ポリペプチド。
- 請求項8〜12のいずれかに記載の細胞によって産生される、N−HBD融合ポリペプチド。
- 融合ポリペプチドであって、以下:
(a)ヒトN−HBDを含む第1のポリペプチド;
(b)(a)のポリペプチドに対してC末端側に融合されたスペーサー(S)であって、該スペーサー(S)は、ヒトニューレグリンの天然のアミノ酸スペーサーであり、該スペーサー(S)の配列は、配列番号14の残基131〜195にある、スペーサー(S);および
(c)Sに対してC末端側に融合された第2のポリペプチドであって、該第2のポリペプチドは、ヘパラン硫酸に富んだ細胞または組織表面に標的化および局在化されたヒトB4−ECDを含む、第2のポリペプチド
を含む、融合ポリペプチド。 - 配列番号13のコード部分によってコードされる、請求項15に記載の融合ポリペプチド。
- 前記N−HBDが配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項15または16に記載の融合ポリペプチド。
- C末端タグ配列をさらに含む、請求項15〜17のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
- 前記タグ配列が、インフルエンザ赤血球凝集素(HA)配列である、請求項18に記載の融合ポリペプチド。
- 前記融合ポリペプチドの配列が配列番号14であり、該配列において、前記N−HBDが残基31〜130にあり、B4−ECDが残基200〜820にある、請求項15〜19のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
- 標的化されるポリペプチドを細胞または組織表面に送達するため、および該標的化されるポリペプチドの生物学的活性を増強するために有用な薬学的組成物であって、以下:
(a)請求項15〜20のいずれかに記載の融合ポリペプチド;および
(b)薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、
を含む、薬学的組成物。 - EGF−レセプターのニューレグリンによる活性化および/またはニューレグリンによるこのようなレセプターを有する細胞の増殖の刺激を阻害するための組成物であって、該組成物は、該細胞において発現され、そして(i)ニューレグリンの結合、(ii)該レセプターの活性化および/または(iii)該細胞の増殖の刺激を阻害する融合ポリペプチドを産生する、請求項1〜3のいずれかに記載の核酸の有効量を含む、組成物。
- EGF−レセプターのニューレグリンによる活性化および/またはニューレグリンによるこのようなレセプターを有する細胞の増殖の刺激を阻害するための組成物であって、該組成物は、該細胞において発現され、そして(i)ニューレグリンの結合、(ii)該レセプターの活性化および/または(iii)該細胞の増殖の刺激を阻害する融合ポリペプチドを産生する、請求項4〜6のいずれかに記載の発現ベクターの有効量を含む、組成物。
- EGF−レセプターのニューレグリンによる活性化および/またはニューレグリンによるこのようなレセプターを有する細胞の増殖の刺激を阻害するための組成物であって、該組成物は、請求項7に記載のベクターが該細胞において同時発現され、そして(i)ニューレグリンの結合、(ii)該レセプターの活性化および/または(iii)該細胞の増殖の刺激を阻害する融合ポリペプチドを産生するように、請求項7に記載のベクター組成物の有効量を含む、組成物。
- EGF−レセプターのニューレグリンによる活性化および/またはニューレグリンによるこのようなレセプターを有する細胞の増殖の刺激を阻害するための組成物であって、該組成物は、(i)ニューレグリンの結合、(ii)該レセプターの活性化および/または(iii)該細胞の増殖の刺激を阻害する、請求項15〜20のいずれかに記載の融合ポリペプチドの有効量を含む、組成物。
- ニューレグリンシグナル伝達の阻害によって処置可能な被験体における疾患または状態を処置するための組成物であって、該組成物は、請求項21に記載の薬学的組成物の有効量を含み、ここで、前記融合ポリペプチドの生物学的活性は、ネイティブのB4−ECDまたは前記標的化ポリペプチドに融合されないB4−ECDの活性と比較して増加される、組成物。
- 前記疾患または前記状態は、腫瘍の増殖および/もしくは転移がNRGによるオートクライン刺激に依存する腫瘍、または癌である、請求項26に記載の組成物。
- 前記腫瘍または前記癌の細胞表面における前記ヘパラン硫酸が、N−硫酸化、2−O−硫酸化および6−O硫酸化を含むパターンで硫酸化される、請求項27に記載の組成物。
- 前記腫瘍または前記癌が、乳房もしくは卵巣の腫瘍または癌である、請求項27に記載の組成物。
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