JP4908093B2 - Method for measuring mRNA of metabolism-related enzyme in cynomolgus monkey, probe and kit therefor - Google Patents
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Description
本発明は、カニクイザルにおける代謝関連酵素のｍＲＮＡの測定方法及びそのためのプローブ及びキットに関する。 The present invention relates to a method for measuring mRNA of a metabolism-related enzyme in cynomolgus monkeys, a probe and a kit therefor.
新薬を開発する上で、カニクイザルを用いた試験は一般的に行なわれている。 Studies using cynomolgus monkeys are commonly used in developing new drugs.
上記新薬を開発する上では、該新薬を投与した際のカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素（酵素）の働き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素の変動が判らないと、該新薬と併用される併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他の摂取物による新薬の効力や副作用の起こる機構が予測できず、該新薬の安全性を確認することができないからである。 In developing the new drug, it is important to understand the action (increase/decrease in expression level) of various metabolism-related enzymes (enzymes) in cynomolgus monkeys when the new drug is administered. The reason is that if changes in various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkeys are not known, increase or decrease in efficacy and side effects of concomitant drugs used in combination with the new drug or mechanism of occurrence of efficacy and side effects of new drugs due to concomitant drugs and other ingested substances This is because the safety of the new drug cannot be confirmed.
そこで、上記新薬開発等の分野においては、かかるカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAに関する情報、特にこれら各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを区別して測定できる測定技術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時における影響の機構解明が容易にでき、該新薬の副作用に関する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全性を確保することができる。 Therefore, in the field of new drug development, etc., information on mRNAs encoding various metabolism-related enzymes in such cynomolgus monkeys, in particular, the development of a measurement technique capable of separately measuring mRNAs encoding various metabolism-related enzymes in each of these cynomolgus monkeys has been developed. , Is requested. If such a technology can be developed, for example, the mechanism of the interaction with other drug of the new drug and the effect at the time of special disease state can be easily clarified, and useful information regarding the side effect of the new drug can be obtained, thus improving the safety of the new drug. Can be secured.
一方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のmRNAの検出、定量に威力を発揮している。 On the other hand, polymerase chain reaction (PCR) is widely known as a nucleic acid amplification method, and for example, RT-PCR (Reverse Transcription-PCR), competitive RT-PCR, etc. exert their power in detecting and quantifying a small amount of mRNA. ing.
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Taq Man PCR (Genome Res., 6(10), 986 (1996)), ABI PRISMTM Sequence Detection System (Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標識プローブ（TaqMan probe）を用いて核酸を測定する方法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、かくして、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。
先に上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これをヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の検出に利用することが提案されている（特許文献１）。
In recent years, a real-time quantitative detection method using PCR has been established (Taq Man PCR (Genome Res., 6(10), 986 (1996)), ABI PRISM ™ Sequence Detection System (Applied Biosystems)). This is a method of measuring a nucleic acid using a specific fluorescently labeled probe (TaqMan probe). More specifically, for example, when a normal PCR reaction is performed in a state where a fluorescently labeled probe having a reporter dye added to the 5′ end and a quencher dye added to the 3′ end is annealed to the target DNA, the extension reaction proceeds. Accordingly, the probe is hydrolyzed from the 5'end by the 5'-3' exonuclease activity of the DNA polymerase. As a result, the reporter dye at the 5′-end is separated from the quencher dye at the 3′-end, which keeps a certain spatial distance at the beginning. The effect of decreasing the fluorescence intensity due to the decrease in the energy level of the) is no longer effective, and the fluorescence intensity of the reporter dye that was controlled by the quencher dye is increased. Thus, by measuring the increase in the fluorescence intensity, the target nucleic acid is detected. It is possible to detect quantitatively selectively in real time. According to this method, complicated steps such as agarose gel electrophoresis of the amplified product after the PCR reaction to analyze the migration pattern are unnecessary, and there is an advantage that various samples can be quantified simultaneously in a short time.
Focusing on the real-time detection method by PCR, it has been proposed to utilize it for detecting an enzyme involved in glucuronidation in human (Patent Document 1).
本発明者らは、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これが、カニクイザルにおける代謝関連酵素をコードするmRNAの検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一のＰＣＲ条件で上記各mRNAを区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。 The present inventors focused their attention on the above-mentioned real-time detection method by PCR, and if this can be used for the detection of mRNA encoding a metabolism-related enzyme in cynomolgus monkey, the above-mentioned each mRNA can be distinguished at the same time under the same PCR conditions using the same device. Since the idea that it can be measured and detected, we have conducted intensive research.
しかるに、カニクイザルにおける代謝関連酵素をコードするmRNAは、それぞれのmRNAの配列は知られているものの、これらをターゲット遺伝子として、同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられた。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下にこれらのプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかもカニクイザルにおける特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られていることより、現在知られているカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAについて、これらを同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験等が必要となると予想された。
本発明の目的は、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAのＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプローブ及びプライマー対を提供することにある。 An object of the present invention is to establish a method for measuring mRNAs encoding various enzymes related to metabolism in cynomolgus monkeys by PCR, particularly a real-time detection method, and to provide a probe and a primer pair therefor.
本発明者らは、上記目的よりカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAについて、更に、多大な実験、研究を繰返し行った結果、１４種類の各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAに対する目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供することに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに至った。 For the above-mentioned purpose, the present inventors further repeated extensive experiments and studies on mRNAs encoding various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkeys, and as a result, mRNAs encoding various metabolism-related enzymes in each of 14 kinds of cynomolgus monkeys. We have succeeded in providing a target primer pair and probe combination for, and have completed the present invention described below.
本発明によれば、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(30)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ；特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合している該プローブ；塩基配列の長さが２０〜４５である該プローブ；配列番号１〜配列番号１４および配列番号４３〜配列番号５８に示される配列のいずれかを含む該プローブ；並びに配列番号１〜配列番号１４および配列番号４３〜配列番号５８に示される配列のいずれかである該プローブが提供される。
(1)GAPDH遺伝子の183-209の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158631での位置）
(2)β-actin遺伝子の236-265の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号U20576での位置）
(3)HPRT遺伝子の460-486の領域
(4)B2M遺伝子の53-82の領域
(5)PGK1遺伝子の1138-1160の領域
(6)CYP1A1遺伝子の1313-1347の領域
(7)CYP1A2遺伝子の927-955の領域
(8)CYP2D17遺伝子の431-454の領域
(9)CYP2E1遺伝子の714-742の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号S55205での位置）
(10)CYP3A8遺伝子の154-186の領域
(11)MRP1遺伝子の1447-1474の領域
(12)GSS遺伝子の774-801の領域
(13)CTH遺伝子の155-178の領域
(14)albumin遺伝子の91-115の領域域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158629での位置）
(15)MDR1遺伝子の1438-1470の領域
(16)MRP1遺伝子の749-778の領域
(17)PEPT1遺伝子の215-240の領域
(18)OATP1B3遺伝子の1533-1564の領域
(19)UGT1A01遺伝子の619-644の領域
(20)UGT1A06遺伝子の437-464の領域
(21)UGT1A08遺伝子の274-298の領域
(22)UGT1A09遺伝子の279-304の領域
(23)UGT2B18遺伝子の277-315の領域
(24)UGT2B20遺伝子の183-224の領域
(25)UGT2B30遺伝子の681-650の領域
(26)HST遺伝子の250-281の領域
(27)PST遺伝子の742-767の領域
(28)GSTM1遺伝子の495-524の領域
(29)GSTM2遺伝子の498-523の領域
(30)CES1遺伝子の468-491の領域
ここで、上記(1)〜(5)の遺伝子は、代謝に直接関与する酵素をコードするものではないが、所謂ハウスキーピング遺伝子として知られており、各酵素の発現量を定量するための比較対象として、これらの発現量を測定することが重要である。また、上記(6)〜(10)の遺伝子は、薬物代謝酵素Ｐ４５０の各分子種をコードする遺伝子であり、これらの発現量を定量することは極めて重要である。更に、(11)〜(18)の遺伝子も薬物の代謝、輸送などに関与する遺伝子であり、薬の安全性を確認するためには、これらの発現量を定量することは大きな意義がある。また、(19)〜(29)の遺伝子は、薬物代謝の第II相反応に関与する酵素の各分子種をコードする遺伝子であり、これらの発現量を定量することは極めて重要である。(30)の遺伝子はカルボン酸エステルやアミド及びチオエステルを基質とする加水分解酵素であるカルボキシエステラーゼの分子種の１つをコードする遺伝子であり、この発現量を定量することも極めて重要である。
According to the present invention, a probe used for the measurement of mRNA encoding various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkey, which is selected from oligonucleotides that hybridize to each of the following regions (1) to (30): A probe having a reporter dye and a quencher dye bound thereto; a probe having a base sequence length of 20 to 45; SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: The probe comprising any of the sequences set forth in 58; and the probes having any of the sequences set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 43 to SEQ ID NO: 58.
(1) 183-209 region of GAPDH gene (position in GenBank accession number AB158631)
(2) 236-265 region of the β-actin gene (position at GenBank accession number U20576)
(3) 460-486 region of HPRT gene
(4) 53-82 region of B2M gene
(5) 1138-1160 region of PGK1 gene
(6) 1313-1347 region of CYP1A1 gene
(7) 927-955 region of CYP1A2 gene
(8) 431-454 region of CYP2D17 gene
(9) 714-742 region of CYP2E1 gene (position at GenBank accession number S55205)
(10) 154-186 region of CYP3A8 gene
(11) 1447-1474 region of MRP1 gene
(12) 774-801 region of GSS gene
(13) CTH gene region 155-178
(14) 91-115 region of albumin gene (position in GenBank accession number AB158629)
(15) 1438-1470 region of MDR1 gene
(16) 749-778 region of MRP1 gene
(17) 215-240 region of PEPT1 gene
(18) 1533-1564 region of OATP1B3 gene
(19) 619-644 region of UGT1A01 gene
(20) 437-464 region of UGT1A06 gene
(21) 274-298 region of UGT1A08 gene
(22) Region 279-304 of UGT1A09 gene
(23) 277-315 region of UGT2B18 gene
(24) 183-224 region of UGT2B20 gene
(25) 681-650 region of UGT2B30 gene
(26) 250-281 region of HST gene
(27) 742-767 region of PST gene
(28) Region 495-524 of GSTM1 gene
(29) 498-523 region of GSTM2 gene
(30) 468-491 region of CES1 gene Here, the gene of the above (1) to (5), which does not encode an enzyme directly involved in metabolism, is known as a so-called housekeeping gene, It is important to measure the expression level of each enzyme as a comparison target for quantifying the expression level of each enzyme. Further, the above-mentioned genes (6) to (10) are genes encoding each molecular species of the drug-metabolizing enzyme P450, and it is extremely important to quantify their expression levels. Furthermore, the genes (11) to (18) are also genes involved in drug metabolism, transport, etc., and it is of great significance to quantify their expression levels in order to confirm the safety of drugs. Further, the genes (19) to (29) are genes encoding each molecular species of enzymes involved in the phase II reaction of drug metabolism, and it is extremely important to quantify their expression levels. The gene (30) is a gene encoding one of the molecular species of carboxyesterase, which is a hydrolase that uses carboxylic acid esters, amides and thioesters as substrates, and it is also extremely important to quantify its expression level.
また、本発明によれば、カニクイザルにおける各種の蛋白質をコードする遺伝子の下記各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの検出および定量キットであって、上記両プライマー対およびプローブが(1)〜(30)に示される遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであるキット。
(1)プライマー対；GAPDH遺伝子の157-175領域及び248-228領域、プローブ；183-209領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158631での位置）
(2)プライマー対；β-actin遺伝子の207-225領域及び289-271領域、プローブ；236-265領域ジーンバンク(GenBank)の登録番号U20576での位置）
(3)プライマー対；HPRT遺伝子の438-458領域及び507-488領域、プローブ；460-486領域
(4)プライマー対；B2M遺伝子の26-46領域及び105-86領域、プローブ；53-82領域
(5)プライマー対；PGK1遺伝子の1096-1116領域及び1183-1163領域、プローブ；1138-1160領域
(6)プライマー対；CYP1A1遺伝子の1284-1304領域及び1385-1365領域、プローブ；1313-1347領域
(7)プライマー対；CYP1A2遺伝子の904-924領域及び982-962領域、プローブ；927-955領域
(8)プライマー対；CYP2D17遺伝子の403-421領域及び544-524領域、プローブ；431-454領域
(9)プライマー対；CYP2E1遺伝子の692-712領域及び775-757領域、プローブ；714-742領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号S55205での位置）
(10)プライマー対；CYP3A8遺伝子の122-142領域及び221-201領域、プローブ；154-186領域
(11)プライマー対；MRP1遺伝子の1422-1440領域及び1494-1476領域、プローブ；1447-1474領域
(12)プライマー対；GSS遺伝子の751-771領域及び880-860領域、プローブ；774-801領域
(13)プライマー対；CTH遺伝子の130-150領域及び203-183領域、プローブ；155-178領域
(14)プライマー対；albumin遺伝子の61-81領域及び168-148領域、プローブ；91-115領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158629での位置）
(15)プライマー対；MDR1遺伝子の1414-1434領域及び1500-1480領域、プローブ；1438-1470領域
(16)プライマー対；MRP1遺伝子の714-737領域及び800-782領域、プローブ；749-778領域
(17)プライマー対；PEPT1遺伝子の194-213領域及び262-242領域、プローブ；215-240領域
(18)プライマー対；OATP1B3遺伝子の1507-1531領域及び1587-1570領域、プローブ；1533-1564領域
(19)プライマー対；UGT1A01遺伝子の593-613領域及び678-658領域、プローブ；619-644領域
(20)プライマー対；UGT1A06遺伝子の414-434領域及び496-476領域、プローブ；437-464領域
(21)プライマー対；UGT1A08遺伝子の253-272領域及び333-304領域、プローブ；274-298領域
(22)プライマー対；UGT1A09遺伝子の253-271領域及び353-325領域、プローブ；279-304領域
(23)プライマー対；UGT2B18遺伝子の252-275領域及び352-330領域、プローブ；277-315領域
(24)プライマー対；UGT2B20遺伝子の144-166領域及び287-258領域、プローブ；183-224領域
(25)プライマー対；UGT2B30遺伝子の609-634領域及び709-685領域、プローブ；681-650領域
(26)プライマー対；HST遺伝子の215-235領域及び302-283領域、プローブ；250-281領域
(27)プライマー対；PST遺伝子の716-734領域及び788-769領域、プローブ；742-767領域
(28)プライマー対；GSTM1遺伝子の471-491領域及び638-617領域、プローブ；495-524領域
(29)プライマー対；GSTM2遺伝子の460-480領域及び644-622領域、プローブ；498-523領域
(30)プライマー対；CES1遺伝子の441-461領域及び548-528領域、プローブ；468-491領域
Further, according to the present invention, a cynomolgus monkey containing at least one of a primer pair of a forward primer and a reverse primer consisting of an oligonucleotide hybridizing to each of the following regions of genes encoding various proteins in cynomolgus monkey and a set of probes. Is a kit for detecting and quantifying mRNAs encoding various metabolic-related enzymes in, wherein the above-mentioned primer pair and probe are oligonucleotides capable of hybridizing to respective regions of the gene shown in (1) to (30), respectively. kit.
(1) Primer pair; GAPDH gene 157-175 region and 248-228 region, probe; 183-209 region (position in GenBank accession number AB158631)
(2) primer pair; 207-225 region and 289-271 region of β-actin gene, probe; 236-265 region position in GenBank with registration number U20576)
(3) primer pair; HPRT gene 438-458 region and 507-488 region, probe; 460-486 region
(4) primer pair; 26-46 region and 105-86 region of B2M gene, probe; 53-82 region
(5) Primer pair; 1096-1116 region and 1183-1163 region of PGK1 gene, probe; 1138-1160 region
(6) primer pair; CYP1A1 gene 1284-1304 region and 1385-1365 region, probe; 1313-1347 region
(7) Primer pair; 904-924 region and 982-962 region of CYP1A2 gene, probe; 927-955 region
(8) Primer pair; 403-421 region and 544-524 region of CYP2D17 gene, probe; 431-454 region
(9) Primer pair; 692-712 region and 775-757 region of CYP2E1 gene, probe; 714-742 region (position in GenBank accession number S55205)
(10) primer pair; 122-142 region and 221-201 region of CYP3A8 gene, probe; 154-186 region
(11) Primer pair; 1422-1440 region and 1494-1476 region of MRP1 gene, probe; 1447-1474 region
(12) primer pair; 751-771 region and 880-860 region of GSS gene, probe; 774-801 region
(13) Primer pair; 130-150 region and 203-183 region of CTH gene, probe; 155-178 region
(14) Primer pair; 61-81 region and 168-148 region of albumin gene, probe; 91-115 region (position in GenBank accession number AB158629)
(15) Primer pair; 1414-1434 region and 1500-1480 region of MDR1 gene, probe; 1438-1470 region
(16) primer pair; 714-737 region and 800-782 region of MRP1 gene, probe; 749-778 region
(17) Primer pair; PEPT1 gene 194-213 region and 262-242 region, probe; 215-240 region
(18) Primer pair; 1507-1531 region and 1587-1570 region of OATP1B3 gene, probe; 1533-1564 region
(19) Primer pair; 593-613 region and 678-658 region of UGT1A01 gene, probe; 619-644 region
(20) primer pair; UGT1A06 gene 414-434 region and 496-476 region, probe; 437-464 region
(21) Primer pair; 253-272 region and 333-304 region of UGT1A08 gene, probe; 274-298 region
(22) primer pair; UGT1A09 gene 253-271 region and 353-325 region, probe; 279-304 region
(23) primer pair; 252-275 region and 352-330 region of UGT2B18 gene, probe; 277-315 region
(24) primer pair; 144-166 region and 287-258 region of UGT2B20 gene, probe; 183-224 region
(25) primer pair; 609-634 region and 709-685 region of UGT2B30 gene, probe; 681-650 region
(26) Primer pair; HST gene 215-235 region and 302-283 region, probe; 250-281 region
(27) primer pair; 716-734 region and 788-769 region of PST gene, probe; 742-767 region
(28) Primer pair; 471-491 region and 638-617 region of GSTM1 gene, probe; 495-524 region
(29) primer pair; 460-480 region and 644-622 region of GSTM2 gene, probe; 498-523 region
(30) primer pair; 441-461 region and 548-528 region of CES1 gene, probe; 468-491 region
上記キットを構成するプライマー対とプローブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下記(1)〜(30)から選ばれる各配列番号で示される配列を含むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列のものを挙げることができる。
(1)プライマー対；配列番号１５及び１６、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号１７及び１８、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号１９及び２０、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号２１及び２２、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号２３及び２４、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号２５及び２６、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号２７及び２８、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号２９及び３０、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号３１及び３２、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号３３及び３４、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号３５及び３６、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号３７及び３８、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号３９及び４０、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号４１及び４２、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号５９及び６０、プローブ；配列番号４３
(16)プライマー対；配列番号６１及び６２、プローブ；配列番号４４
(17)プライマー対；配列番号６３及び６４、プローブ；配列番号４５
(18)プライマー対；配列番号６５及び６６、プローブ；配列番号４６
(19)プライマー対；配列番号６７及び６８、プローブ；配列番号４７
(20)プライマー対；配列番号６９及び７０、プローブ；配列番号４８
(21)プライマー対；配列番号７１及び７２、プローブ；配列番号４９
(22)プライマー対；配列番号７３及び７４、プローブ；配列番号５０
(23)プライマー対；配列番号７５及び７６、プローブ；配列番号５１
(24)プライマー対；配列番号７７及び７８、プローブ；配列番号５２
(25)プライマー対；配列番号７９及び８０、プローブ；配列番号５３
(26)プライマー対；配列番号８１及び８２、プローブ；配列番号５４
(27)プライマー対；配列番号８３及び８４、プローブ；配列番号５５
(28)プライマー対；配列番号８５及び８６、プローブ；配列番号５６
(29)プライマー対；配列番号８７及び８８、プローブ；配列番号５７
(30)プライマー対；配列番号８９及び９０、プローブ；配列番号５８
As a preferred combination (set) of the primer pair and the probe constituting the above kit, those containing a sequence represented by each SEQ ID NO: selected from the following (1) to (30), more preferably each SEQ ID NO: Mention may be made of the sequences shown.
(1) Primer pair; SEQ ID NOS: 15 and 16, probe; SEQ ID NO: 1
(2) primer pair; SEQ ID NOS: 17 and 18, probe; SEQ ID NO: 2
(3) primer pair; SEQ ID NOS: 19 and 20, probe; SEQ ID NO: 3
(4) primer pair; SEQ ID NOs: 21 and 22, probe; SEQ ID NO: 4
(5) primer pair; SEQ ID NOs: 23 and 24, probe; SEQ ID NO: 5
(6) primer pair; SEQ ID NOs: 25 and 26, probe; SEQ ID NO: 6
(7) primer pair; SEQ ID NOS: 27 and 28, probe; SEQ ID NO: 7
(8) primer pair; SEQ ID NOs: 29 and 30, probe; SEQ ID NO: 8
(9) Primer pair; SEQ ID NOS: 31 and 32, probe; SEQ ID NO: 9
(10) primer pair; SEQ ID NOS: 33 and 34, probe; SEQ ID NO: 10
(11) Primer pair; SEQ ID NOS: 35 and 36, probe; SEQ ID NO: 11
(12) primer pair; SEQ ID NOS: 37 and 38, probe; SEQ ID NO: 12
(13) primer pair; SEQ ID NOs: 39 and 40, probe; SEQ ID NO: 13
(14) Primer pair; SEQ ID NOS: 41 and 42, probe; SEQ ID NO: 14
(15) Primer pair; SEQ ID NOs: 59 and 60, probe; SEQ ID NO: 43
(16) primer pair; SEQ ID NOs: 61 and 62, probe; SEQ ID NO: 44
(17) primer pair; SEQ ID NOs: 63 and 64, probe; SEQ ID NO: 45
(18) primer pair; SEQ ID NOs: 65 and 66, probe; SEQ ID NO: 46
(19) primer pair; SEQ ID NOs: 67 and 68, probe; SEQ ID NO: 47
(20) primer pair; SEQ ID NOs: 69 and 70, probe; SEQ ID NO: 48
(21) primer pair; SEQ ID NOS: 71 and 72, probe; SEQ ID NO: 49
(22) primer pair; SEQ ID NOs: 73 and 74, probe; SEQ ID NO: 50
(23) primer pair; SEQ ID NOS: 75 and 76, probe; SEQ ID NO: 51
(24) primer pair; SEQ ID NOS: 77 and 78, probe; SEQ ID NO: 52
(25) primer pair; SEQ ID NOs: 79 and 80, probe; SEQ ID NO: 53
(26) primer pair; SEQ ID NOs: 81 and 82, probe; SEQ ID NO: 54
(27) Primer pair; SEQ ID NOS: 83 and 84, probe; SEQ ID NO: 55
(28) primer pair; SEQ ID NOs: 85 and 86, probe; SEQ ID NO: 56
(29) primer pair; SEQ ID NOS: 87 and 88, probe; SEQ ID NO: 57
(30) primer pair; SEQ ID NOs: 89 and 90, probe; SEQ ID NO: 58
また、上記各セットはそれぞれ以下のカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの測定用であることができる。
(1)のセット；GAPDH測定用
(2)のセット；β-actin測定用
(3)のセット；HPRT測定用
(4)のセット；B2M測定用
(5)のセット；PGK1測定用
(6)のセット；CYP1A1測定用
(7)のセット；CYP1A2測定用
(8)のセット；CYP2D17測定用
(9)のセット；CYP2E1測定用
(10)のセット；CYP3A8測定用
(11)のセット；MRP1測定用
(12)のセット；GSS測定用
(13)のセット；CTH測定用
(14)のセット；albumin測定用
(15)のセット；MDR1の測定用
(16)のセット；MRP1（再設計分）の測定用
(17)のセット；PEPT1の測定用
(18)のセット；OATP1B3の測定用
(19)のセット；UGT1A01の測定用
(20)のセット；UGT1A06の測定用
(21)のセット；UGT1A08の測定用
(22)のセット；UGT1A09の測定用
(23)のセット；UGT2B18の測定用
(24)のセット；UGT2B20の測定用
(25)のセット；UGT2B30の測定用
(26)のセット；HSTの測定用
(27)のセット；PSTの測定用
(28)のセット；GSTM1の測定用
(29)のセット；GSTM2の測定用
(30)のセット；CES1の測定用
本発明によれば、更にカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを含む検体について、上記いずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを含む）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするヒトにおける核内レセプター、転写因子などの蛋白質をコードするmRNAの測定方法、特に上記加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされる上記測定方法が提供される。
In addition, each of the above-mentioned sets can be used for measuring mRNAs encoding various metabolism-related enzymes in the following cynomolgus monkeys.
(1) set; for GAPDH measurement
(2) set; for β-actin measurement
(3) set; for HPRT measurement
(4) set; for B2M measurement
(5) set; for PGK1 measurement
(6) set; for CYP1A1 measurement
(7) set; for CYP1A2 measurement
(8) set; for CYP2D17 measurement
(9) set; for CYP2E1 measurement
(10) set; for CYP3A8 measurement
(11) set; for MRP1 measurement
(12) set; for GSS measurement
(13) set; for CTH measurement
(14) set; for albumin measurement
(15) set; for MDR1 measurement
(16) set; for measuring MRP1 (redesigned part)
(17) set; for measuring PEPT1
(18) set; for OATP1B3 measurement
(19) set; for UGT1A01 measurement
(20) set; for UGT1A06 measurement
(21) set; for UGT1A08 measurement
(22) set; for UGT1A09 measurement
(23) set; for UGT2B18 measurement
(24) set; for UGT2B20 measurement
(25) set; for UGT2B30 measurement
(26) set; for HST measurement
(27) set; for PST measurement
(28) set; for GSTM1 measurement
(29) set; for GSTM2 measurement
Set of (30); for measurement of CES1 According to the present invention, for a sample further containing mRNA encoding various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkey, polymerase chain reaction (PCR, PCR using the measurement kit according to any one of the above. RT-PCR) and the presence or absence of hydrolysis of the probe used, and a method for measuring mRNA encoding a protein such as a nuclear receptor or a transcription factor in human, particularly the presence or absence of the above hydrolysis. However, there is provided the above-mentioned measuring method, which is carried out depending on the presence or absence of coloration of fluorescence due to irradiation of excitation light.
より詳しくは、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、ヒトにおけるレセプター関連の蛋白質をコードする遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提供される。 More specifically, a 5'-3' exo is used by using a primer pair of a forward primer and a reverse primer and a probe having a reporter dye and a quencher dye and hybridizing with a template nucleic acid in a region sandwiched between the both primers. A real-time detection method for measuring a gene encoding a receptor-related protein in human by performing a polymerase chain reaction (PCR) with a DNA polymerase having a nuclease activity is provided.
本発明に係わるカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAのリアルタイム検出方法は、同一ＰＣＲ乃至ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、各種、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを定量できるものであり、その確立は、臨床分野において非常に有益である。 A method for real-time detection of mRNAs encoding various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkeys according to the present invention encodes various metabolism-related enzymes in various cynomolgus monkeys simply and quickly in real time under the same PCR or RT-PCR reaction conditions. The amount of mRNA can be quantified, and its establishment is very useful in the clinical field.
また、カニクイザルより手術で摘出した組織やバイオプシーにより摘出した組織中のカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNA発現を見る上で、迅速且つ多種の試料を処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可能である。 In addition, in view of mRNA expression encoding various metabolic-related enzymes in cynomolgus monkeys in tissues excised by surgery from cynomolgus monkeys and tissues excised by biopsy, rapid and various samples can be processed, and from a few tissue pieces It can be detected with the extracted total RNA.
以下、本発明方法に利用するプローブ及びプライマー対につき詳述すれば、これら各プローブ及びプライマーは、上述した通り、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードする遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。 Hereinafter, the probe and primer pairs used in the method of the present invention will be described in detail.Each of these probes and primers is, as described above, an oligonucleotide that hybridizes to a specific region of a gene encoding various metabolism-related enzyme in cynomolgus monkey. Selected.
ここで「ハイブリダイズする」とは、後述するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズすることをいう。 Here, "hybridize" means to hybridize under the conditions of PCR (RT-PCR) described later.
本発明に係わるプローブ及びプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及びＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことを挙げることができる。また、その他の本発明プローブにみられる要件としてはＴｍ値が７０℃前後であることを挙げることができ、同様にプライマーにはＴｍ値が６０℃前後であることを挙げることができる。 Common requirements for the probe and the primer according to the present invention are that the amplification product has a length of 50 to 400 base pairs, that the primer and the probe are as close as possible, and G (guanine) contained in the sequence. The ratio of C (cytosine) is preferably around 50%, and the number of G (guanine) is not 4 or more in succession. Further, other requirements found in the probe of the present invention include a Tm value of around 70°C, and similarly, a Tm value of around 60°C for the primer.
それぞれのmRNA配列は公知であり、それぞれジーンバンク（GenBank）に以下の登録番号で登録されている。
(1)GAPDH遺伝子；AB158631
(2)β-actin遺伝子；U20576
(3)HPRT遺伝子；S43335
(4)B2M遺伝子；AF485817
(5)PGK1遺伝子；AB125189
(6)CYP1A1遺伝子；D17575
(7)CYP1A2遺伝子；D86474
(8)CYP2D17遺伝子；U38218
(9)CYP2E1遺伝子；S55205
(10)CYP3A8遺伝子；S53047
(11)MRP1遺伝子；AY146672
(12)GSS遺伝子；AB083314
(13)CTH遺伝子；AB125160
(14)albumin遺伝子；AB158629
(15)MDR1遺伝子；AF537134
(16)MRP1遺伝子；AY146672
(17)PEPT1遺伝子；AY289936
(18)OATP1B3遺伝子；AY787036
(19)UGT1A01遺伝子；AF104339
(20)UGT1A06遺伝子；AF104337
(21)UGT1A08遺伝子；AF104338
(22)UGT1A09遺伝子；AF104336
(23)UGT2B18遺伝子；AF016310
(24)UGT2B20遺伝子；AF072223
(25)UGT2B30遺伝子；AF401657
(26)HST遺伝子；D85521
(27)PST遺伝子；D85514
(28)GSTM1遺伝子；AF200709
(29)GSTM2遺伝子；AF200710
(30)CES1遺伝子；AB010633
Each mRNA sequence is publicly known, and is registered in GenBank under the following registration numbers.
(1) GAPDH gene; AB158631
(2) β-actin gene; U20576
(3) HPRT gene; S43335
(4) B2M gene; AF485817
(5) PGK1 gene; AB125189
(6) CYP1A1 gene; D17575
(7) CYP1A2 gene; D86474
(8) CYP2D17 gene; U38218
(9) CYP2E1 gene; S55205
(10) CYP3A8 gene; S53047
(11) MRP1 gene; AY146672
(12) GSS gene; AB083314
(13) CTH gene; AB125160
(14) albumin gene; AB158629
(15) MDR1 gene; AF537134
(16) MRP1 gene; AY146672
(17) PEPT1 gene; AY289936
(18) OATP1B3 gene; AY787036
(19) UGT1A01 gene; AF104339
(20) UGT1A06 gene; AF104337
(21) UGT1A08 gene; AF104338
(22) UGT1A09 gene; AF104336
(23) UGT2B18 gene; AF016310
(24) UGT2B20 gene; AF072223
(25) UGT2B30 gene; AF401657
(26) HST gene; D85521
(27) PST gene; D85514
(28) GSTM1 gene; AF200709
(29) GSTM2 gene; AF200710
(30) CES1 gene; AB010633
本明細書において、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の開始コドンからの配列に従うものである。 In the present specification, the indication of the specific region of mRNA encoding various enzymes related to metabolism in cynomolgus monkey is based on the sequence from the start codon of the gene registered with each of the above registration numbers.
これら各プライマー及びプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、通常１５〜５０個、好ましくは２０〜４５個の範囲にあるのがよい。これらプライマー及びプローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。 The number of nucleotides in the oligonucleotide for each of these primers and probes is at least 15, usually 15 to 50, preferably 20 to 45. If the number of nucleotides of these primers and probes is too much larger than the above, it becomes difficult to hybridize to single-stranded DNA, and if too small, the specificity of hybridization is lowered.
プライマー及びプローブの特定のヌクレオチド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとおり、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１〜１４、４３〜５８（プローブの場合）並びに配列番号１５〜４２、５９〜９０（プライマーの場合）に示されるとおりである。 Examples of preferable specific sequences of the specific nucleotide sequences of the primer and the probe are, as described above, SEQ ID NOS: 1 to 14, 43 to 58 (in the case of probe) and SEQ ID NOS: 15 to 42, respectively, depending on each molecular species. 59-90 (for primers).
尚、例えば２０ヌクレオチドからなるプライマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして又は検出用プローブとして機能し得ることが知られている。従って本発明プライマー及びプローブもまた、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、これをその一部として含むものや、この配列中の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加による修飾のなされた配列を包含することができる。 It is known that, for example, a primer or probe consisting of 20 nucleotides hybridizes even if there is a small mismatch with the template strand and can function as a PCR primer or a detection probe. Therefore, the primer and probe of the present invention are also not limited to those having the above-mentioned specific nucleotide sequence, and those including this as a part thereof, or substitution, deletion and/or deletion of, for example, 2 or less nucleotides in this sequence. Or, a sequence modified by addition can be included.
上記本発明プローブ及びプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。 The above-mentioned respective oligonucleotides as the probe and primer of the present invention can be easily synthesized according to a conventional method using an automatic synthesizer, for example, a DNA synthesizer (Perkin Elmer Co., Ltd.), etc. Then, it can be purified using a commercially available cartridge for purification or the like.
本発明のリアルタイム検出用プローブは、その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合しており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー色素は、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有するものであることができる。該レポーター色素の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。 The probe for real-time detection of the present invention has a reporter dye attached to one end, for example, the 5'-end, and a quencher dye attached to the other end, for example, the 3'-end. The reporter dye is a substance that fluoresces upon irradiation with excitation light, for example, and the quencher dye acts on the reporter dye when it exists in close proximity to the reporter dye, thereby eliminating the fluorescence emission. Can have. Examples of the reporter dye include 6-carboxy-fluorescein (FAM), tetrachloro-6-carboxyfluorescein (TET), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein. In (JOE), hexochloro-6-carboxyfluorescein (HEX) and the like. Examples of quencher dyes include, for example, 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA) and the like.
本発明プローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、３′側には、下に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させ得る。 The probe of the present invention can be prepared by binding a reporter dye and a quencher dye to the probe oligonucleotide having the specific sequence. For example, on the 5'side of the probe, usually several methylene chains are used as a linker, and a FAM molecule can be bound to the terminal phosphate group in the form of a phosphate ester. In addition, a TAMRA molecule can be bound to the 3'side by an amide bond via the structural unit shown below.
以下、本発明プライマー対及びプローブを利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法につき詳述する。 Hereinafter, the real-time detection method by PCR using the primer pair and probe of the present invention will be described in detail.
本発明方法は、前述した本発明プライマー対及びプローブを利用することを必須として、他は公知のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施することができる。 The method of the present invention essentially requires the use of the above-described primer pair and probe of the present invention, and other known PCR methods (see, for example, Science, 230, 1350 (1985)), RT-PCR (Genome Res., 6). (10), 986 (1996)), etc., and in particular according to a real-time detection method (see, for example, TaqMan PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996).
前記方法は、特に本発明が対象とするカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの発現量の測定方法として、mRNAを測定する場合に有用である。この場合、特定のカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとを用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明プライマーとプローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともできる。 The method is particularly useful for measuring mRNA as a method for measuring the expression level of mRNA encoding various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkeys, which is the subject of the present invention. In this case, biological tissues expressing mRNAs encoding various metabolic-related enzymes in a specific cynomolgus monkey are collected, total RNA is extracted according to a conventional method, and then cDNA complementary thereto is synthesized according to a conventional method. After that, PCR may be performed using the primer pair of the present invention and the probe. Alternatively, RT-PCR can be directly performed using the primer and probe of the present invention after extracting total RNA according to a conventional method.
ＰＣＲ反応、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件を好ましく採用できる。 The PCR reaction and RT-PCR reaction can basically follow known methods. The reaction conditions can also be appropriately determined according to known methods and are not particularly different. Specifically, the conditions shown in Examples below can be preferably adopted.
検出も、基本的には常法に従って、例えば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行なうことができる。 The detection can also be performed basically by a conventional method, for example, by irradiating the PCR reaction solution with argon laser light and detecting the emitted fluorescence using a CCD camera.
かくして、本発明方法の実施によって、所期のハウスキーピング遺伝子、薬物代謝酵素やトランスポーターなどの調節に関与する各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAを容易且つ迅速に、しかも各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNA毎に測定、検出することができる。 Thus, by carrying out the method of the present invention, the desired housekeeping gene, mRNA encoding various metabolism-related enzymes in each cynomolgus monkey involved in the regulation of drug-metabolizing enzymes, transporters, etc. is easily and quickly, and in each cynomolgus monkey. It can be measured and detected for each mRNA encoding various metabolism-related enzymes.
本発明は更に、上記方法の実施のためのキットをも提供する。このキットは上記プライマー対及びプローブを含んでなる。本発明キットには、対照として使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対及びプローブを更に含んでいてもよい。 The present invention further provides a kit for carrying out the above method. This kit comprises the above primer pair and probe. The kit of the present invention may further contain a known nucleic acid that can be used as a control, a primer pair and a probe for measuring the nucleic acid.
本発明方法によれば、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAをそのカニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNA毎に測定、検出できるため、これによって、カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAの定量が迅速に、精度よく行なうことができる。 According to the method of the present invention, mRNAs encoding various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkeys can be measured and detected for each mRNA encoding various metabolism-related enzymes in the cynomolgus monkeys, so that various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkeys can be detected. Quantification of the encoded mRNA can be performed quickly and accurately.
以下、本発明を更に詳しく説明するため試験例及び実施例を挙げる。 Hereinafter, test examples and examples will be described in order to explain the present invention in more detail.
[リアルタイム検出法による検量線の作成]
(1)試験方法
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行なうことができる。さらに、３８４ウエルでの測定も可能である。
[Creation of calibration curve by real-time detection method]
(1) Test method The real-time one-step RT-PCR method adopted in this test is capable of simultaneously performing a maximum of 96 different reactions using 96 wells and measuring a maximum of 96 samples at one time. Further, RT reaction and PCR reaction can be performed in one tube. Furthermore, measurement with 384 wells is also possible.
本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用したものである。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（TaqMan probe）がＰＣＲで増幅した特定のヒトにおける核内レセプター、転写因子などの蛋白質をコードするmRNA種由来のｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まり、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望の定量が可能となる。 The principle of this quantification is that when two adjacent fluorescent dyes are used, the wavelength range overlaps between the fluorescence wavelength of one dye (reporter dye) and the excitation light wavelength of the other dye (quencher dye). It uses the FRET generated in. A probe (TaqMan probe) in which two types of FRET-producing fluorescent dyes are bound to both ends hybridizes to a PCR-amplified cDNA derived from an mRNA species encoding a protein such as a nuclear receptor or transcription factor in a particular human. In this state, the extension reaction of PCR is started, the TaqMan probe is hydrolyzed by the 5′-3′ endonuclease activity of Taq DNA polymerase, the reporter dye is released, and the physical distance between the quencher dye is generated. , The fluorescence intensity of the reporter dye, which was suppressed by FRET, increases, and this increase in fluorescence intensity is proportional to the increase amount of PCR amplification product. Therefore, by measuring this in each PCR reaction, the desired quantification can be performed. Becomes
本試験では、プローブの５’末端側にはリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。これら各色素の結合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）に従って行なった。 In this test, FAM was used as a reporter dye on the 5'end side of the probe, and TAMRA was used as a quencher dye on the 3'end side. The binding of each of these dyes and the preparation of the TaqMan probe by this were performed according to the method described in the literature (Genome Res., 6(10), 986 (1996)).
また、各プライマー及びプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢＩ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。 The oligonucleotides as the primers and the probes were synthesized by using a DNA/RNA synthesizer manufactured by ABI as an automatic synthesizer, using a substrate (dNTP) and a specified reagent.
検体ＲＮＡとしては、カニクイザルの肝臓より精製された全ＲＮＡを用いた。尚、これらの全ＲＮＡはカニクイザルの各組織よりRneasyR Mini kit（QIAGEN社製）を用いて調製した。 As the sample RNA, total RNA purified from cynomolgus monkey liver was used. Incidentally, these total RNAs were prepared from each tissue of cynomolgus monkey using Rneasy R Mini kit (manufactured by QIAGEN).
カニクイザルの肝臓プールより精製された全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、２０μｇ／ｍＬとし、検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（Yeast tRNA, GIBCO社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。 Total RNA purified from the cynomolgus monkey liver pool was diluted with RNase-free water to 20 μg/mL, which was used for preparing a calibration curve. After that, 50 μg/mL yeast tRNA (Yeast tRNA, manufactured by GIBCO) was used and diluted at a 5-fold common ratio. 5 μL was used for the measurement.
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー及び２００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (PE Applied Biosystems)を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM７７００ Sequence Detection System（PE Applied Biosystems）にて行なった。 The RT-PCR reaction was performed using a TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (PE Applied Biosystems) containing 300 nM forward primer, 900 nM reverse primer and 200 nM TaqMan probe in a system of 50 μL/tube, and ABI PRISM ™. 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems).
温度条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間で保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。 The temperature was maintained at 48° C. for 30 minutes and at 95° C. for 10 minutes, and then a cycle of 95° C. for 15 seconds and 60° C. for 1 minute was performed 50 times, and the fluorescence intensity was measured for each cycle.
下記表１に示す各カニクイザルにおける各種の代謝関連酵素をコードするmRNAに対して各配列番号に示される配列のプライマー対及びプローブを用いて行った上記試験の結果（検量線）を表２に示す。 Table 2 shows the results (calibration curve) of the above-mentioned test conducted using the primer pair and the probe having the sequences shown by the respective SEQ ID NOs: for the mRNAs encoding the various metabolism-related enzymes in the respective cynomolgus monkeys shown in the following Table 1. .
◎
上記表２より、１０００００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、定量下限は１．２８ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量から４０００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量であり、検量線の相関係数（ｒ）は全てにおいて０．９９以上であった。 From Table 2 above, when a calibration curve was prepared by diluting from 100,000 pg total RNA/50 μL reaction volume with a 5-fold common ratio, the lower limit of quantification was 1.28 pg total RNA/50 μL reaction volume and 4000 pg total RNA/50 μL reaction volume. And the correlation coefficient (r) of the calibration curve was 0.99 or more in all cases.
Claims (7)
(1)プライマー対；GAPDH遺伝子の157-175領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び248-228領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；183-209領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158631での位置）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(2)プライマー対；秉och-actin遺伝子の207-225領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び289-271領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；236-265領域ジーンバンク(GenBank)の登録番号U20576での位置）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(3)プライマー対；HPRT遺伝子の438-458領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び507-488領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；460-486領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(4)プライマー対；B2M遺伝子の26-46領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び105-86領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；53-82領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(5)プライマー対；PGK1遺伝子の1096-1116領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び1183-1163領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；1138-1160領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(6)プライマー対；CYP1A1遺伝子の1284-1304領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び1385-1365領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；1313-1347領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(7)プライマー対；CYP1A2遺伝子の904-924領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び982-962領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；927-955領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(8)プライマー対；CYP2D17遺伝子の403-421領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び544-524領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；431-454領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(9)プライマー対；CYP2E1遺伝子の692-712領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び775-757領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；714-742領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号S55205での位置）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(10)プライマー対；CYP3A8遺伝子の122-142領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び221-201領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；154-186領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(11)プライマー対；MRP1遺伝子の1422-1440領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び1494-1476領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；1447-1474領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(12)プライマー対；GSS遺伝子の751-771領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び880-860領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；774-801領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(13)プライマー対；CTH遺伝子の130-150領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び203-183領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；155-178領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(14)プライマー対；albumin遺伝子の61-81領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び168-148領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；91-115領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AB158629での位置）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(15)プライマー対；MDR1遺伝子の1414-1434領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び1500-1480領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；1438-1470領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(16)プライマー対；MRP1遺伝子の714-737領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び800-782領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；749-778領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(17)プライマー対；PEPT1遺伝子の194-213領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び262-242領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；215-240領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(18)プライマー対；OATP1B3遺伝子の1507-1531領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び1587-1570領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；1533-1564領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(19)プライマー対；UGT1A01遺伝子の593-613領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び678-658領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；619-644領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(20)プライマー対；UGT1A06遺伝子の414-434領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び496-476領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；437-464領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(21)プライマー対；UGT1A08遺伝子の253-272領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び333-304領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；274-298領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(22)プライマー対；UGT1A09遺伝子の253-271領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び353-325領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；279-304領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(23)プライマー対；UGT2B18遺伝子の252-275領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び352-330領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；277-315領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(24)プライマー対；UGT2B20遺伝子の144-166領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び287-258領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；183-224領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(25)プライマー対；UGT2B30遺伝子の609-634領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び709-685領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；681-650領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(26)プライマー対；HST遺伝子の215-235領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び302-283領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；250-281領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(27)プライマー対；PST遺伝子の716-734領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び788-769領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；742-767領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(28)プライマー対；GSTM1遺伝子の471-491領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び638-617領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；495-524領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(29)プライマー対；GSTM2遺伝子の460-480領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び644-622領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；498-523領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(30)プライマー対；CES1遺伝子の441-461領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び548-528領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、プローブ；468-491領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（但し、前記オリゴヌクレオチドは、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間保温後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルでＲＴ−ＰＣＲ反応を行なったときに、前記ハイブリダイズする。） Various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkeys containing at least one of a primer pair of a forward primer and a reverse primer consisting of oligonucleotides hybridizing to the following regions of genes encoding various metabolism-related enzymes in cynomolgus monkeys and a set of probes A kit for the detection and quantification of mRNA encoding, wherein the primer pair and the probe are oligonucleotides capable of hybridizing with the respective regions of the gene shown in (1) to (30), respectively , for real-time RT-PCR. Kit for use .
(1) a primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 157-175 region of the GAPDH gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 248-228 region; a probe; 183-209 region (of GenBank) An oligonucleotide that specifically hybridizes to the registration number AB158631)
(2) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 207-225 region and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 289-271 region of the och-actin gene, probe; 236-265 region gene bank (GenBank) (Registration number U20576 position)), which specifically hybridizes to
(3) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 438-458 region of the HPRT gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 507-488 region; a probe; specifically hybridizes to the 460-486 region Oligonucleotide
(4) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 26-46 region of the B2M gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 105-86 region; a probe; a hybrid that specifically hybridizes to the 53-82 region Oligonucleotide
(5) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1096-1116 region of the PGK1 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1183-1163 region; a probe; specifically hybridizes to the 1138-1160 region Oligonucleotide
(6) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1284-1304 region of the CYP1A1 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1385-1365 region, a probe; specifically hybridizes to the 1313-1347 region Oligonucleotide
(7) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 904-924 region of the CYP1A2 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 982-962 region, a probe; specifically hybridizes to the 927-955 region Oligonucleotide
(8) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 403-421 region of the CYP2D17 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 544-524 region; a probe; specifically hybridizes to the 431-454 region Oligonucleotide
(9) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 692-712 region of the CYP2E1 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 775-757 region; a probe; 714-742 region (of GenBank) An oligonucleotide that specifically hybridizes to the position (registration number S55205)
(10) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 122-142 region and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 221-201 region of the CYP3A8 gene , a probe; specifically hybridizes to the 154-186 region Oligonucleotide
(11) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1422-1440 region of the MRP1 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1494-1476 region, a probe; specifically hybridizes to the 1447-1474 region Oligonucleotide
(12) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 751-771 region of the GSS gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 880-860 region, a probe; specifically hybridizes to the 774-801 region Oligonucleotide
(13) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 130-150 region of the CTH gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 203-183 region, probe; specifically hybridizes to the 155-178 region Oligonucleotide
(14) a primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 61-81 region of the albumin gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 168-148 region; a probe; 91-115 region (of GenBank) An oligonucleotide that specifically hybridizes to the position (registration number AB158629)
(15) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1414-1434 region of the MDR1 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1500-1480 region, a probe; specifically hybridizes to the 1438-1470 region Oligonucleotide
(16) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 714-737 region and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 800-782 region of the MRP1 gene, a probe; a hybrid that specifically hybridizes to the 749-778 region Oligonucleotide
(17) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 194-213 region of the PEPT1 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 262-242 region; a probe; specifically hybridizes to the 215-240 region Oligonucleotide
(18) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1507-1531 region of the OATP1B3 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 1587-1570 region, probe; specifically hybridizes to the 1533-1564 region Oligonucleotide
(19) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 593-613 region of the UGT1A01 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 678-658 region, probe; specifically hybridizes to the 619-644 region Oligonucleotide
(20) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 414-434 region of the UGT1A06 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 496-476 region, a probe; specifically hybridizes to the 437-464 region Oligonucleotide
(21) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 253-272 region of the UGT1A08 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 333-304 region, probe; specifically hybridizes to the 274-298 region Oligonucleotide
(22) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 253-271 region of the UGT1A09 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 353-325 region, probe; specifically hybridizes to the 279-304 region Oligonucleotide
(23) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 252-275 region of the UGT2B18 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 352-330 region, probe; specifically hybridizes to the 277-315 region Oligonucleotide
(24) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 144-166 region of the UGT2B20 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 287-258 region, probe; specifically hybridizes to the 183-224 region Oligonucleotide
(25) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 609-634 region of the UGT2B30 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 709-685 region, probe; specifically hybridizes to the 681-650 region Oligonucleotide
(26) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 215-235 region of the HST gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 302-283 region, a probe; specifically hybridizes to the 250-281 region Oligonucleotide
(27) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 716-734 region of the PST gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 788-769 region; a probe; specifically hybridizes to the 742-767 region Oligonucleotide
(28) primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 471-491 region of the GSTM1 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 638-617 region; a probe; specifically hybridizes to the 495-524 region Oligonucleotide
(29) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 460-480 region of the GSTM2 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 644-622 region; a probe; specifically hybridizes to the 498-523 region Oligonucleotide
(30) Primer pair; an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 441-461 region of the CES1 gene and an oligonucleotide that specifically hybridizes to the 548-528 region, a probe; specifically hybridizes to the 468-491 region Oligonucleotide
(However, the above-mentioned oligonucleotides hybridize when incubated at 48°C for 30 minutes, at 95°C for 10 minutes, and then at RT-PCR reaction in a cycle of 95°C for 15 seconds and 60°C for 1 minute. .)
(1)プライマー対；配列番号１５及び１６、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号１７及び１８、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号１９及び２０、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号２１及び２２、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号２３及び２４、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号２５及び２６、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号２７及び２８、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号２９及び３０、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号３１及び３２、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号３３及び３４、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号３５及び３６、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号３７及び３８、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号３９及び４０、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号４１及び４２、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号５９及び６０、プローブ；配列番号４３
(16)プライマー対；配列番号６１及び６２、プローブ；配列番号４４
(17)プライマー対；配列番号６３及び６４、プローブ；配列番号４５
(18)プライマー対；配列番号６５及び６６、プローブ；配列番号４６
(19)プライマー対；配列番号６７及び６８、プローブ；配列番号４７
(20)プライマー対；配列番号６９及び７０、プローブ；配列番号４８
(21)プライマー対；配列番号７１及び７２、プローブ；配列番号４９
(22)プライマー対；配列番号７３及び７４、プローブ；配列番号５０
(23)プライマー対；配列番号７５及び７６、プローブ；配列番号５１
(24)プライマー対；配列番号７７及び７８、プローブ；配列番号５２
(25)プライマー対；配列番号７９及び８０、プローブ；配列番号５３
(26)プライマー対；配列番号８１及び８２、プローブ；配列番号５４
(27)プライマー対；配列番号８３及び８４、プローブ；配列番号５５
(28)プライマー対；配列番号８５及び８６、プローブ；配列番号５６
(29)プライマー対；配列番号８７及び８８、プローブ；配列番号５７
(30)プライマー対；配列番号８９及び９０、プローブ；配列番号５８ The measurement kit according to claim 2, which is selected from a combination of a primer pair consisting of an oligonucleotide having a sequence shown by each SEQ ID NO: and a probe in the set shown in (1) to (30) below.
(1) Primer pair; SEQ ID NOS: 15 and 16, probe; SEQ ID NO: 1
(2) primer pair; SEQ ID NOS: 17 and 18, probe; SEQ ID NO: 2
(3) primer pair; SEQ ID NOS: 19 and 20, probe; SEQ ID NO: 3
(4) primer pair; SEQ ID NOs: 21 and 22, probe; SEQ ID NO: 4
(5) primer pair; SEQ ID NOs: 23 and 24, probe; SEQ ID NO: 5
(6) primer pair; SEQ ID NOs: 25 and 26, probe; SEQ ID NO: 6
(7) primer pair; SEQ ID NOS: 27 and 28, probe; SEQ ID NO: 7
(8) primer pair; SEQ ID NOs: 29 and 30, probe; SEQ ID NO: 8
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