JP2004008072A - METHOD FOR ASSAYING mRNA OF RAT CYTOCHROME P450 MOLECULAR SPECIES, PROBE AND KIT THEREFOR - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定方法およびそのためのプローブおよびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
チトクロムＰ４５０には、多数の分子種があり、これらの各分子種はそれぞれ薬物代謝の第Ｉ相反応に関与する主な酵素としてよく知られている。
【０００３】
新薬を開発する上で、該新薬（候補化合物）を投与した際のチトクロムＰ４５０の働き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、チトクロムＰ４５０の変動が判らないと、該新薬と併用される併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他の摂取物による新薬の効力や副作用の増減が予測できず、該新薬の安全性を確認することができないからである。
【０００４】
上記新薬の安全性試験のためには、ヒトにおけるチトクロムＰ４５０の変動を調べる必要があるが、医薬品業界では、ヒトにおける試験の前段階としてラットなどの動物を用いた試験が行われる。この動物試験では、ヒトのチトクロムＰ４５０に対応する各動物種のチトクロムＰ４５０の働きを調べる必要がある。特に、上記供試動物としてのラットの利用が公的に要求されつつある。
【０００５】
従って、ラットチトクロムＰ４５０に関する情報、特にヒトチトクロムｐ４５０の各分子種に対応するラットチトクロムＰ４５０の各分子種をコードするｍＲＮＡに関する情報およびこれらラットチトクロムＰ４５０の各分子種をコードするｍＲＮＡを区別して測定する技術の開発が、当業界で要望されてきている。このような測定技術が開発できれば、ヒトへの投与に先だって、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時における影響などが予測できる。即ち、該新薬の副作用などに関する有用な情報を、臨床試験の前に得ることができ、かくして該新薬のヒトへの投与の安全性を確保することができる。
【０００６】
一方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲなどが、微量のｍＲＮＡの検出、定量に威力を発揮している。
【０００７】
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ６（１０）， ９８６ （１９９６）： ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））。該検出法は、特定の蛍光標識プローブ（ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ）を用いて核酸を測定する方法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター色素および３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行わせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加する。かくして、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析するなどの複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。
【０００８】
一般に、新薬の候補化合物を選別する場合などは、非常に多数の検体について限られた時間内に定量検出を行うことが望ましく、このような定量検出を効率良く行い得る手法として、上記リアルタイム定量検出法は期待されている。
【０００９】
本発明者らは、上記ＰＣＲを利用するリアルタイム定量検出法に着目し、これがラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一のＰＣＲ条件で上記各分子種のｍＲＮＡを区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。
【００１０】
しかるに、ラットチトクロムＰ４５０の各分子種をコードするｍＲＮＡの配列は、それぞれ知られているが、これらの各配列をターゲット遺伝子として、同一ＰＣＲ条件でそれぞれ充分に増幅し得、更に、各々のターゲット遺伝子の特定位置にのみハイブリダイズし得るプライマー対としてのオリゴヌクレオチドを検索することは困難であると考えられた。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下にこれらのプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかも各分子種に対して特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られている。このことより、現在知られているラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする各ｍＲＮＡについて、これらを同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム定量検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択は、熟練者の試行錯誤による多大な実験などが必要となると予想された。
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、先に２９種のヒトチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡに対して、これらを区別して定量測定することができるＰＣＲによる定量検出用のプライマー対およびプローブの組合せ（セット）を提供することに成功した（ＷＯ２００１／９２５３８）。しかしながら、これらはヒトチトクロムＰ４５０分子種の定量検出用であり、該ヒトチトクロムＰ４５０分子種とはそれぞれ異なる配列を有するラットＰ４５０の各分子種の定量検出には利用できないものであった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡのＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム定量検出法の確立と、そのためのプローブおよびプライマー対のセットを提供することにある。
【００１３】
本発明者らは、上記目的よりラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡについて、更に、多大な実験、研究を繰返し行った結果、ラットチトクロムＰ４５０をコードするｍＲＮＡの１４種の分子種に対して、目的のプライマー対およびプローブのセットを提供することに成功し、ここに本発明を完成するに至った。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記項１−１２に記載のラットチトクロムＰ４５０分子種のｍＲＮＡ測定用プローブ、測定キットおよびこれらを用いた測定方法を提供する。
【００１５】
項１．ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、下記（１）−（１４）に示す各遺伝子の所定領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれるオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプローブ；
（１） Ｃｙｐ１ａ１遺伝子の６２４−６５０の領域
（２） Ｃｙｐ１ａ２遺伝子の１２００−１２２７の領域
（３） Ｃｙｐ２ａ２遺伝子の３５６−３８２の領域
（４） Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の９８９−１０１３の領域または１２０４−１２３２の領域
（５） Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の９８９−１０１３の領域または１２０４−１２３２の領域
（６） Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子の１０１０−１０３５の領域
（７） Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子の４６９−４９７の領域
（８） Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子の１１５８−１１８１の領域
（９） Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子の３９−６９の領域
（１０） Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子の６８３−７０８の領域
（１１） Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子の２００−２２５の領域
（１２） Ｃｙｐ３ａ１遺伝子の１２２３−１２４８の領域
（１３） Ｃｙｐ３ａ２遺伝子の６８−９１の領域
（１４） Ｃｙｐ４ａ１遺伝子の１３５−１６０の領域。
【００１６】
項２．オリゴヌクレオチドが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである項１に記載のプローブ。
【００１７】
項３．オリゴヌクレオチドが、２０−４０の塩基長を有するものである項１に記載のプローブ。
【００１８】
項４．オリゴヌクレオチドが、配列番号１−配列番号１６のいずれかに示される配列を含むものである項１−３のいずれかに記載のプローブ。
【００１９】
項５．オリゴヌクレオチドが、配列番号１−配列番号１６のいずれかに示される配列からなるものである項１−３のいずれかに記載のプローブ。
【００２０】
項６．フォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対とプローブとのセットの少なくともひとつを含むラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定キットであって、上記プライマー対とプローブとが下記（１）−（１４）に示されるラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである上記キット；
（１）プライマー対；Ｃｙｐ１ａ１遺伝子の６０１−６２２領域および６７５−６５２領域、プローブ；６２４−６５０領域
（２）プライマー対；Ｃｙｐ１ａ２遺伝子の１１７５−１１９５領域および１２４９−１２２９領域、プローブ；１２００−１２２７領域
（３）プライマー対；Ｃｙｐ２ａ２遺伝子の３００−３１８領域および４２５−４０７領域、プローブ；３５６−３８２領域
（４）プライマー対；Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の９６１−９８２領域および１０３７−１０１６領域、プローブ；９８９−１０１３領域またはプライマー対；Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の１１７９−１２０２領域および１２３７−１２５８領域、プローブ；１２０４−１２３２領域
（５）プライマー対；Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の９６１−９８２領域および１０３７−１０１６領域、プローブ；９８９−１０１３領域またはプライマー対；Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の１１７９−１２０２領域および１２３７−１２５８領域、プローブ；１２０４−１２３２領域
（６）プライマー対；Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子の９８９−１００８領域および１０５８−１０３７領域、プローブ；１０１０−１０３５領域
（７）プライマー対；Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子の４４５−４６５領域および５３５−５１６領域、プローブ；４６９−４９７領域
（８）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子の１１３５−１１５４領域および１２０５−１１８５領域、プローブ；１１５８−１１８１領域
（９）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子の６−２６領域および９７−７９領域、プローブ；３９−６９領域
（１０）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子の６６１−６８１領域および７４８−７２９領域、プローブ；６８３−７０８領域
（１１）プライマー対；Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子の１７２−１９０領域および２５１−２３３領域、プローブ；２００−２２５領域
（１２）プライマー対；Ｃｙｐ３ａ１遺伝子の１１９９−１２１７領域および１２７６−１２５８領域、プローブ；１２２３−１２４８領域
（１３）プライマー対；Ｃｙｐ３ａ２遺伝子の４７−６５領域および１２７−１１０領域、プローブ；６８−９１領域
（１４）プライマー対；Ｃｙｐ４ａ１遺伝子の１０８−１２９領域および１８５−１６６領域、プローブ；１３５−１６０領域。
【００２１】
項７．プローブが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである項６に記載の測定キット。
【００２２】
項８．プライマー対とプローブとが、下記（１）−（１４）に示される各配列番号の配列を含むオリゴヌクレオチドである項７に記載の測定キット；
（１）プライマー対；配列番号１７および１８、プローブ；配列番号１
（２）プライマー対；配列番号１９および２０、プローブ；配列番号２
（３）プライマー対；配列番号２１および２２、プローブ；配列番号３
（４）プライマー対；配列番号２３および２４、プローブ；配列番号４またはプライマー対；配列番号２５および２６、プローブ；配列番号５
（５）プライマー対；配列番号２７および２８、プローブ；配列番号６またはプライマー対；配列番号２９および３０、プローブ；配列番号７
（６）プライマー対；配列番号３１および３２、プローブ；配列番号８
（７）プライマー対；配列番号３３および３４、プローブ；配列番号９
（８）プライマー対；配列番号３５および３６、プローブ；配列番号１０
（９）プライマー対；配列番号３７および３８、プローブ；配列番号１１
（１０）プライマー対；配列番号３９および４０、プローブ；配列番号１２
（１１）プライマー対；配列番号４１および４２、プローブ；配列番号１３
（１２）プライマー対；配列番号４３および４４、プローブ；配列番号１４
（１３）プライマー対；配列番号４５および４６、プローブ；配列番号１５
（１４）プライマー対；配列番号４７および４８、プローブ；配列番号１６。
【００２３】
項９．項８に記載の測定キットであって、（１）のセットがＣｙｐ１ａ１の測定用で、（２）のセットがＣｙｐ１ａ２の測定用で、（３）のセットがＣｙｐ２ａ２の測定用で、（４）のセットがＣｙｐ２ｂ１の測定用で、（５）のセットがＣｙｐ２ｂ２の測定用で、（６）のセットがＣｙｐ２ｃ１１の測定用で、（７）のセットがＣｙｐ２ｃ１２の測定用で、（８）のセットがＣｙｐ２ｄ１の測定用で、（９）のセットがＣｙｐ２ｄ２の測定用で、（１０）のセットがＣｙｐ２ｄ３の測定用で、（１１）のセットがＣｙｐ２ｅ１の測定用で、（１２）のセットがＣｙｐ３ａ１の測定用で、（１３）のセットがＣｙｐ３ａ２の測定用で、（１４）のセットがＣｙｐ４ａ１の測定用である測定キット。
【００２４】
項１０．プライマー対とプローブとが、項８の（１）−（１４）に記載の各配列番号の配列からなるオリゴヌクレオチドである、項９に記載の測定キット。
【００２５】
項１１．ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを含む検体を調製し、該検体について、請求項６−１０のいずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該ポリメラーゼ連鎖反応の間に加水分解されるプローブを測定することを特徴とするラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定方法。
【００２６】
項１２．加水分解されるプローブの測定が、励起光照射による蛍光の発色測定によりなされる項１１に記載の測定方法。
【００２７】
本発明方法は、より詳しくは、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該ＰＣＲの間に加水分解されるプローブを測定することによって、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを測定するリアルタイム定量検出方法を提供する。
【００２８】
本発明のリアルタイム定量検出方法は、同一ＰＣＲ乃至ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする各ｍＲＮＡを検出および定量できるものであり、その確立は、医薬品分野において非常に有益である。特に、本発明のリアルタイム定量検出法は、迅速に且つ多種のサンプルを処理できるものであり、例えば摘出した組織や培養細胞などから抽出した僅かなＲＮＡサンプルを利用して、正確に、該サンプル中のラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを定量、検出することができる利点がある。
【００２９】
更に、特定のラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡは、肝臓、腎臓などでの発現量の変化が血液中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の変化と相関する可能性が考えられるが、この血液中の値は小さく、測定には多くの血液を必要とする。しかるに、本発明プライマーとプローブとのセットを用いれば、かかる血液を検体としても、少ないサンプル量で、特別の機器を利用することなく、該血液中のｍＲＮＡ量を正確に測定することができる。
【００３０】
以下、本発明方法に利用するプローブおよびプライマー対につき詳述すれば、これら各プローブおよびプライマー対は、上述した通り、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００３１】
ここで「ハイブリダイズする」とは、後述するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００３２】
本発明に係わるプローブおよびプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が５０−４００塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）およびＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことなどを挙げることができる。また、その他の本発明プローブの有する好ましい要件としては、Ｔｍ値が７０℃前後であることを挙げることができる。同様に、プライマーは、Ｔｍ値が６０℃前後であることを好ましい要件として挙げることができる。
【００３３】
ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする各ｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に以下の登録番号で登録されている。
（１）Ｃｙｐ１ａ１遺伝子；ＮＭ＿０１２５４０
（２）Ｃｙｐ１ａ２遺伝子；ＮＭ＿０１２５４１
（３）Ｃｙｐ２ａ２遺伝子；ＮＭ＿０１２６９３
（４）Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子；ＡＨ００２１６１
（５）Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子；ＡＨ００２１６２
（６）Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子；Ｕ３３１７３
（７）Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子；ＮＭ＿０３１５７２
（８）Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子；ＡＢ００８４２２
（９）Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子；ＮＭ＿０１２７３０
（１０）Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子；ＡＢ００８４２４
（１１）Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子；ＡＦ０６１４４２
（１２）Ｃｙｐ３ａ１遺伝子；Ｌ２４２０７
（１３）Ｃｙｐ３ａ２遺伝子；Ｕ０９７４２
（１４）Ｃｙｐ４ａ１遺伝子；Ｍ５７７１８
本明細書において、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配列（開始コドンを１とする）に従うものである。
【００３４】
これら各プライマーおよびプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、通常１５−５０個、好ましくは２０−４０個の範囲にあるのがよい。これらプライマーおよびプローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００３５】
プライマーおよびプローブのヌクレオチド配列の好ましい具体例は、前述した項８に示すとおりであり、各分子種に応じて、それぞれ配列番号１−１６（プローブの場合）並びに配列番号１７−４８（プライマーの場合）に示される。
【００３６】
尚、例えば２０ヌクレオチドからなるプライマーまたはプローブは、鋳型鎖との間に少数、通常１−２個、のミスマッチが存在しても鋳型鎖とハイブリダイズし得、従ってＰＣＲのプライマーとしてまたは検出用プローブとして機能し得ることが知られている。本発明プライマーおよびプローブもまた、上記特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、該配列をその一部として含むものや、この配列中の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加による修飾のなされた配列を有するものであってもよい。
【００３７】
本発明プローブおよびプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）などを用いて容易に合成することができる。得られるオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、市販の精製用カートリッジなどを用いて更に精製することもできる。
【００３８】
以下、リアルタイム定量検出用の本発明プローブにつき詳述すれば、該プローブは、その一端、例えば５’−末端、にレポーター色素を結合しており、他端、例えば３’−末端、にクエンチャー色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャーは、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合に該レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有するものである。該レポーター色素の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）などが挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）などが挙げられる。
【００３９】
本発明プローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素およびクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプローブの５’側には、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、その場合、３’側には、下に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させる。
【００４０】
【化１】
本発明プライマー対およびプローブを利用してラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを測定する方法は、本発明プライマー対およびプローブを利用することを必須として、通常のｍＲＮＡの測定技術に従うことができる。該技術としては、ＰＣＲ法（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０， １３５０ （１９８５）参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ６（１０）， ９８６ （１９９６）参照）など、特にリアルタイム定量検出法（例えばＴａｑＭａｎ ＰＣＲ， ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ７７００ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｖｅｒ１， Ｊｕｎｅ １９９６参照）などを挙げることができる。
【００４２】
即ち本発明方法は、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを含む検体を調製し、該検体について前述した（１）−（１４）に示される少なくともひとつの本発明プライマー対とプローブとのセットを含む測定キットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲの間に加水分解されるプローブを測定することにより実施される。具体的には、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを発現している生体組織を採取し、該組織より常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとのセットを含む測定キットを用いてＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明プライマーとプローブとを含む測定キットを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲを行うこともできる。
【００４３】
ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法に準じて適宜決定することができる。より具体的には、後記実施例に示す条件を採用して実施することができる。
【００４４】
加水分解されたプローブの測定、検出は、基本的には常法に従って実施することができる。例えば、リアルタイム定量検出法の場合は、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて測定、検出することによって実施することができる。
【００４５】
かくして、本発明方法の実施によって、所期のラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを容易且つ迅速に、しかも各分子種をコードするｍＲＮＡ毎に測定、検出することができる。
【００４６】
本発明は、上記方法の実施のための測定キットをも提供する。このキットは前記項６に示す（１）−（１４）のプライマー対とプローブとのセットからなる群から選ばれる少なくともひとつを含んでいる。また、本発明キットは、対照として使用することができる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対とプローブとのセットを更に含んでいてもよい。
【００４７】
本発明方法によれば、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする各ｍＲＮＡを、当該ｍＲＮＡ毎に測定、検出でき、しかも各ｍＲＮＡの測定、検出を迅速に且つ精度よく行うことができる。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため試験例および実施例を挙げる。
【００４９】
【試験例１】リアルタイム定量検出法による検量線の作成
（１）試験方法
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウェルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行い得るものである。更に、３８４ウェルでの測定も可能である。
【００５０】
本法の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用している。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ）がＰＣＲで増幅した特定のラットチトクロムＰ４５０をコードするｍＲＮＡ種に由来するｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まり、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、この増加をＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望の定量が可能となる。
【００５１】
本試験では、プローブの５’末端側にリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。これら各色素の結合およびこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献記載の方法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ６（１０）， ９８６ （１９９６））に従って行った。
【００５２】
また、各プライマーおよびプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢＩ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮＴＰ）および規定の試薬を用いて合成した。
【００５３】
検体ＲＮＡとしては、ラットの肝臓プールより精製した全ＲＮＡを用いた。
【００５４】
ラットの肝臓プールより精製した全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈して２０μｇ／ｍＬとした（検量線作成用）。また、このものを５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（Ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ， ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマーおよび２００ｎＭ ＴａｑＭａｎプローブを含むＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して実施した。
【００５６】
温度条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００５７】
下記表１に示す各ラットチトクロムＰ４５０分子種（酵素種）に対して各配列番号のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対およびプローブを用いて、上記試験を行った結果（検量線）を表２に示す。
【００５８】
【表１】
【表２】
表２に示す結果より、１０００００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、Ｃｙｐ２ａ２分子種については、１．２８ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量まで定量性を有しており、他の各分子種においても１．２８−４０００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量を定量限界とした検量線の相関係数（ｒ）は０．９９以上（ただし、Ｃｙｐ２ｄ３分子種においては０．９７）であった。
【００６１】
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞ Ｏｔｓｕｋａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆａｃｔｏｒｙ Ｉｎｃ．
＜１２０＞ Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｒａｔ Ｐ４５０ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ａ ｐｒｏｂｅ ａｎｄ ｋｉｔ ｔｈｅｒｅｆｏｒ
＜１３０＞ ３６００２ＪＰ
＜１６０＞ ４８
＜１７０＞ ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｖｅｒ． ２．１
＜２１０＞ １
＜２１１＞ ２７
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ１ａ１
＜４００＞ １
ｃａｇａｃｇｔｔａｔ ｇａｃｃａｃｇａｔｇ ａｃｃａａｇａ ２７
＜２１０＞ ２
＜２１１＞ ２８
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ１ａ２
＜４００＞ ２
ｃａａｇｇａｇｃｇｃ ｔｇｃａｔｃｔｔｃａ ｔａａａｃｃａｇ ２８
＜２１０＞ ３
＜２１１＞ ２７
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ａ２
＜４００＞ ３
ａｔｇｔｇｇａａｃａ ｇｇｃｃａａｇｃｇｔ ａｔｃａｇｇｃ ２７
＜２１０＞ ４
＜２１１＞ ２５
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞ ４
ｔｔｃａｃａｃｃｇｇ ｃｔａｃｃａａｃｃｃ ｔｔｇａｔ ２５
＜２１０＞ ５
＜２１１＞ ２９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞ ５
ｃａｇａｃａｇｃｔｔ ｃａａｔｃｃｔｇａａ ｃａｃｔｔｃｃｔｇ ２９
＜２１０＞ ６
＜２１１＞ ２５
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞ ６
ｃｔｃｔｃａｃａｇｇ ｃｃａｃｃａｔｃｃｃ ｔｔｇａｔ ２５
＜２１０＞ ７
＜２１１＞ ２９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞ ７
ｃａｇａｃａｃｃｔｔ ｃａａｔｃｃｔｇａｇ ｃａｃｔｔｃｃｔｇ ２９
＜２１０＞ ８
＜２１１＞ ２６
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｃ１１
＜４００＞ ８
ｃｃｔｇｃａｔｇａａ ａｇａｃａｇｇａｇｃ ｃａｇａｔｇ ２６
＜２１０＞ ９
＜２１１＞ ２９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｃ１２
＜４００＞ ９
ａａｇａａａａｃｃａ ａａｇｇｃｔｃａｃｃ ｃｔｇｔｇａｔｃｃ ２９
＜２１０＞ １０
＜２１１＞ ２４
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｄ１
＜４００＞ １０
ａｇｔｃｃａｇｇａｃ ｔｔｃｇｔｃａｔｃｃ ｃｃａａ ２４
＜２１０＞ １１
＜２１１＞ ３１
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｄ２
＜４００＞ １１
ｃａｔａｔｔｃａｃａ ｇｃｃａｔｃｔｔｃｔ ｔｇｃｔｔｃｔｇｇｔ ｇ ３１
＜２１０＞ １２
＜２１１＞ ２６
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｄ３
＜４００＞ １２
ａｃａｔｇｔｔｃｃｃ ａｇｔｔｃｔｃｃｔｇ ｃｇｃａｔｃ ２６
＜２１０＞ １３
＜２１１＞ ２６
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ２ｅ１
＜４００＞ １３
ｔｇｔｔｃａｃａｃｔ ｇｃａｃｃｔｔｇｇｃ ｔｃａａｇｇ ２６
＜２１０＞ １４
＜２１１＞ ２６
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ３ａ１
＜４００＞ １４
ｃａｇａｇｃｃｔｇａ ｇｇａａｔｔｔｃｇｃ ｃｃａｇａａ ２６
＜２１０＞ １５
＜２１１＞ ２４
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ３ａ２
＜４００＞ １５
ａｃｃｇａｃｔｔｇｇ ａａｃｃｃａｔａｇａ ｃａｔｇ ２４
＜２１０＞ １６
＜２１１＞ ２６
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｙｐ４ａ１
＜４００＞ １６
ｃａａｇｇｃｔｔｔｃ ｃａｇｃａｇｔｔｃｃ ｃａｔｃａｃ ２６
＜２１０＞ １７
＜２１１＞ ２２
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ１ａ１
＜４００＞ １７
ｇｔｃａｔｃｔｇｔｇ ｃｃａｔａｔｇｃｔｔ ｔｇ ２２
＜２１０＞ １８
＜２１１＞ ２４
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ１ａ１
＜４００＞ １８
ｇｃｔｔａｇａｔｔｇ ａｃｔａｔｇｃｔｇａ ｇｃａｇ ２４
＜２１０＞ １９
＜２１１＞ ２１
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ１ａ２
＜４００＞ １９
ｃｃｔｃａｃｔｇａａ ｔｇｇｃｔｔｃｃａｃ ａ ２１
＜２１０＞ ２０
＜２１１＞ ２１
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ１ａ２
＜４００＞ ２０
ｔｃｔｃａｔｃａｔｇ ｇｔｔｇａｃｃｔｇｃ ｃ ２１
＜２１０＞ ２１
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ａ２
＜４００＞ ２１
ｔｇｇｃｇａａｃｔｇ ｃｃｔａｃｃｔｔｔ １９
＜２１０＞ ２２
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ａ２
＜４００＞ ２２
ｃｇｃｔｔｇｃｃｃａ ｃａｃｃａａａａｔ １９
＜２１０＞ ２３
＜２１１＞ ２２
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞ ２３
ｇｃａｇａａａｇｇａ ｇｇｔｔｇａｔｃａｇ ｇｔ ２２
＜２１０＞ ２４
＜２１１＞ ２２
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞ ２４
ａｇｔｇｔａｔｇｇｃ ａｔｔｔｔａｃｔｇｃ ｇｇ ２２
＜２１０＞ ２５
＜２１１＞ ２４
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞ ２５
ｃａｔｇａｃｃｃａｃ ａｇｔａｃｔｔｔｇａ ｃｃａｃ ２４
＜２１０＞ ２６
＜２１１＞ ２２
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞ ２６
ｃｔｃｔｔｔｔｔｃａ ｇｔｇｃｃｃｃｇｔｔ ａａ ２２
＜２１０＞ ２７
＜２１１＞ ２２
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞ ２７
ａｃａｇａａａｇｇａ ｇａｔｔｇａｔｃａｇ ｇｔ ２２
＜２１０＞ ２８
＜２１１＞ ２２
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞ ２８
ａｇｔｇｔａｔｇｇｃ ａｔｔｔｔｇｇｔａｃ ｇａ ２２
＜２１０＞ ２９
＜２１１＞ ２４
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞ ２９
ｃａｔｇａｃｃｃａｃ ａｇｔａｃｔｔｔｇａ ｃｃａｔ ２４
＜２１０＞ ３０
＜２１１＞ ２２
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞ ３０
ｃｔｃｔｔｔｔｔｃａ ｇｔｇｔｃｃｃａｔｃ ｇｇ ２２
＜２１０＞ ３１
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｃ１１
＜４００＞ ３１
ｔａａｔｔｇｇｃａｇ ａａａｃｃｇｇａｇｃ ２０
＜２１０＞ ３２
＜２１１＞ ２２
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｃ１１
＜４００＞ ３２
ｔｇｃａｃｔａｃａｇ ｃａｔｃｃｇｔｇｔａ ｇｇ ２２
＜２１０＞ ３３
＜２１１＞ ２１
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｃ１２
＜４００＞ ３３
ｇｃａｇａｇｔｇｇｃ ｔａｇｔｇａｔｇｇａ ａ ２１
＜２１０＞ ３４
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｃ１２
＜４００＞ ３４
ａｇａｔｇａｃａｔｔ ｇｃａｇｇｇａｇｃａ ２０
＜２１０＞ ３５
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｄ１
＜４００＞ ３５
ｃｇｃａｔｃａｃｇａ ｇｔｔｇｔｇａｃａｔ ２０
＜２１０＞ ３６
＜２１１＞ ２１
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｄ１
＜４００＞ ３６
ａｇｇｔｔｇａｔｇａ ｔｇａｇｇｇｔｃｇｔ ｃ ２１
＜２１０＞ ３７
＜２１１＞ ２１
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｄ２
＜４００＞ ３７
ｇｃｔｇｃｔｇａｔｔ ｇｇａｇａｔｇａｃｃ ｔ ２１
＜２１０＞ ３８
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｄ２
＜４００＞ ３８
ｔｃｃａｇａａｔｔｔ ｇｔｇｃｃｇｇｔｇ １９
＜２１０＞ ３９
＜２１１＞ ２１
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｄ３
＜４００＞ ３９
ｇｇｃｔｔｇｔｔｔｃ ｃｔｇａｇｇｔｔｔｔ ｇ ２１
＜２１０＞ ４０
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｄ３
＜４００＞ ４０
ａｔｇｔｃｔｔｔｔｇ ｃｃｃａｇｇｇａａｇ ２０
＜２１０＞ ４１
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｅ１
＜４００＞ ４１
ａｃｃａａｇｔｔｇｇ ｃａａａｇｃｇｃｔ １９
＜２１０＞ ４２
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ２ｅ１
＜４００＞ ４２
ｔｔｇｔａｇｃｃａｔ ｇｃａｇｇａｃｃａ １９
＜２１０＞ ４３
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ３ａ１
＜４００＞ ４３
ｔｔｃａｃｃｇｔｇａ ｔｃｃａｃａｇｃａ １９
＜２１０＞ ４４
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ３ａ１
＜４００＞ ４４
ｔｇｃｔｇｃｃｃｔｔ ｇｔｔｃｔｃｃｔｔ １９
＜２１０＞ ４５
＜２１１＞ １９
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ３ａ２
＜４００＞ ４５
ｃａｇｔｃａｔｃｃｔ ｇｇｔｇｃｔｔｃｔ １９
＜２１０＞ ４６
＜２１１＞ １８
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ３ａ２
＜４００＞ ４６
ｇｔｔｔｔｇｇｃｃｃ ａｇｇａａｔｔｃ １８
＜２１０＞ ４７
＜２１１＞ ２２
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｆｏｒｗａｒｄ） ｏｆ Ｃｙｐ４ａ１
＜４００＞ ４７
ｇｔｔｃｔａｃｃｔｇ ｃａａａｇｇｃａａｔ ｇｇ ２２
＜２１０＞ ４８
＜２１１＞ ２０
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （ｒｅｖｅｒｓｅ） ｏｆ Ｃｙｐ４ａ１
＜４００＞ ４８
ｔｇｃｃｃａａａｇａ ａｃｃａｇｔｇｇａａ ２０[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring mRNA encoding a rat cytochrome P450 molecular species, and a probe and a kit therefor.
[0002]
[Prior art]
Cytochrome P450 has a number of molecular species, each of which is well known as a major enzyme involved in the phase I reaction of drug metabolism.
[0003]
In developing a new drug, it is important to understand the function (increase / decrease in expression level) of cytochrome P450 when the new drug (candidate compound) is administered. Because, if the fluctuation of cytochrome P450 is not known, the increase or decrease of the efficacy or side effect of the concomitant drug used in combination with the new drug or the increase or decrease of the efficacy or side effect of the new drug due to the concomitant drug or other ingestion cannot be predicted. This is because security cannot be confirmed.
[0004]
In order to test the safety of the above-mentioned new drugs, it is necessary to examine the fluctuation of cytochrome P450 in humans. In the pharmaceutical industry, tests using animals such as rats are performed as a preliminary stage of human tests. In this animal test, it is necessary to examine the action of cytochrome P450 of each animal species corresponding to human cytochrome P450. In particular, the use of rats as the test animals is being required publicly.
[0005]
Therefore, information on rat cytochrome P450, particularly information on mRNA encoding each molecular species of rat cytochrome P450 corresponding to each molecular species of human cytochrome p450, and mRNA encoding each molecular species of rat cytochrome P450 are separately measured. Technology development has been demanded in the industry. If such a measurement technique could be developed, it would be possible to predict the interaction of the new drug with other drugs and the effects during special disease states, etc., before administration to humans. That is, useful information on the side effects of the new drug and the like can be obtained before a clinical test, and thus the safety of administration of the new drug to humans can be ensured.
[0006]
On the other hand, polymerase chain reaction (PCR) is widely known as a method for amplifying nucleic acids. For example, RT-PCR (Reverse Transcription-PCR), competitive RT-PCR, and the like exert their power in detecting and quantifying a small amount of mRNA. are doing.
[0007]
In recent years, a real-time quantitative detection method using PCR has been established (Taq Man PCR, Genome Res., 6 (10), 986 (1996): ABI PRISM). TM Sequence Detection System (Applied Biosystems)). The detection method is a method of measuring a nucleic acid using a specific fluorescently labeled probe (TaqMan probe). More specifically, for example, when a normal PCR reaction is performed in a state in which a reporter dye is added to the 5 ′ end and a quencher dye is added to the 3 ′ end and a fluorescently labeled probe is annealed to the target DNA, the extension reaction proceeds. Accordingly, the probe is hydrolyzed from the 5 ′ end by the 5′-3 ′ exonuclease activity of the DNA polymerase. As a result, the reporter dye at the 5′-end is separated from the quencher dye at the 3′-end, and thus, a FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer, a reporter dye based on resonance of both fluorescent dyes) due to maintaining a certain spatial distance at first. (Phenomenon of lowering the fluorescence intensity due to the lowering of the energy order), the effect disappears, and the fluorescence intensity of the reporter dye controlled by the quencher dye increases. Thus, by measuring the increase in the fluorescence intensity, the target nucleic acid can be selectively quantitatively detected in real time. According to this method, there is no need for a complicated process such as analyzing an electrophoresis pattern by, for example, agarose gel electrophoresis of the amplified product after the PCR reaction, and there is an advantage that a variety of samples can be simultaneously quantified in a short time.
[0008]
In general, when selecting a candidate compound for a new drug, it is desirable to perform quantitative detection on a very large number of samples within a limited time, and as a method capable of efficiently performing such quantitative detection, the above-described real-time quantitative detection is performed. The law is expected.
[0009]
The present inventors have focused on the real-time quantitative detection method using the above PCR, and if this method can be used for the detection of mRNA encoding the rat cytochrome P450 molecular species, the above-described molecular species can be simultaneously analyzed under the same PCR conditions using the same apparatus. Intensive research was conducted based on the idea that the mRNA could be measured and detected separately.
[0010]
However, the sequences of mRNAs encoding each molecular species of rat cytochrome P450 are known, but these sequences can be sufficiently amplified under the same PCR conditions using these sequences as target genes. It was thought that it was difficult to search for an oligonucleotide as a primer pair that could hybridize only to a specific position. In addition, it is possible to hybridize to a specific region sandwiched by such a primer pair faster than these primers under the same PCR conditions, and it is similarly difficult to construct a probe specific to each molecular species. It was considered. In particular, the ease of hybridization between two nucleic acids whose nucleotide sequences are known can be estimated to some extent by calculating the melting point (Tm), but the combination of the primer and the probe selected based on this estimation is not necessarily the DNA measurement. Is not known to produce good results. From this, for each mRNA encoding the currently known rat cytochrome P450 molecular species, these can be simultaneously distinguished and measured, and the selection of a combination of each primer pair and probe for real-time quantitative detection by PCR is as follows. It was expected that a great deal of experimentation, such as trial and error by a skilled person, would be required.
[0011]
The present inventors have conducted intensive studies and found that, with respect to mRNA encoding 29 kinds of human cytochrome P450 molecular species, a primer pair and a probe for quantitative detection by PCR capable of distinguishing and quantitatively measuring the mRNAs can be distinguished from each other. The combination (set) was successfully provided (WO 2001/92538). However, these are for quantitative detection of human cytochrome P450 molecular species, and cannot be used for quantitative detection of rat P450 molecular species having sequences different from the human cytochrome P450 molecular species.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to establish a method for measuring mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species by PCR, particularly a real-time quantitative detection method, and to provide a set of a probe and a primer pair for the method.
[0013]
The present inventors have further repeated extensive experiments and studies on mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species for the above purpose. As a result, 14 mRNA species of rat cytochrome P450 mRNA were identified. The present inventors succeeded in providing a target primer pair and a set of probes, and thus completed the present invention.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides a probe for measuring mRNA of rat cytochrome P450 molecular species, a measuring kit, and a measuring method using the same as described in the following item 1-12.
[0015]
Item 1. An oligonucleotide selected from the group consisting of oligonucleotides capable of hybridizing to a predetermined region of each gene shown in the following (1) to (14), which is a probe used for measuring mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species: A probe characterized in that:
(1) Region 624-650 of Cyp1a1 gene
(2) Region 1200-1227 of Cyp1a2 gene
(3) 356-382 region of Cyp2a2 gene
(4) region 989-1013 or region 1204-1232 of the Cyp2b1 gene
(5) Region 989-1013 or region 1204-1232 of Cyp2b2 gene
(6) 1010-1035 region of Cyp2c11 gene
(7) Region 469-497 of Cyp2c12 gene
(8) 1158-1181 region of Cyp2d1 gene
(9) Region 39-69 of Cyp2d2 gene
(10) Region 683-708 of Cyp2d3 gene
(11) 200-225 region of Cyp2e1 gene
(12) Region 1223-1248 of Cyp3a1 gene
(13) 68-91 region of Cyp3a2 gene
(14) The 135-160 region of the Cyp4a1 gene.
[0016]
Item 2. Item 2. The probe according to item 1, wherein the oligonucleotide further comprises a reporter dye and a quencher dye.
[0017]
Item 3. Item 2. The probe according to item 1, wherein the oligonucleotide has a base length of 20 to 40.
[0018]
Item 4. Item 4. The probe according to any one of Items 1-3, wherein the oligonucleotide comprises the sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 16.
[0019]
Item 5. Item 4. The probe according to any one of Items 1-3, wherein the oligonucleotide has a sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 16.
[0020]
Item 6. A kit for measuring mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species, comprising at least one of a set of a primer pair of a forward primer, a reverse primer and a probe, wherein the primer pair and the probe have the following (1)-(14) The above-mentioned kit, which is an oligonucleotide capable of hybridizing to each region of the gene encoding the rat cytochrome P450 molecular species shown in the above;
(1) Primer pair; 601-622 region and 675-652 region of Cyp1a1 gene, probe; 624-650 region
(2) Primer pair; 1175-1195 region and 1249-1229 region of Cyp1a2 gene, probe; 1200-1227 region
(3) Primer pair; 300-318 region and 425-407 region of Cyp2a2 gene, probe; 356-382 region
(4) Primer pair; 961-982 region and 1037-1016 region of Cyp2b1 gene, probe; 989-1013 region or primer pair; 1177-1202 region and 1237-1258 region of Cyp2b1 gene, probe; 1204-1232 region
(5) Primer pair; 961-982 region and 1037-1016 region of Cyp2b2 gene, probe; 989-1013 region or primer pair; 1176-1202 region and 1237-1258 region of Cyp2b2 gene, probe; 1204-1232 region
(6) Primer pair; 989-1008 region and 1058-1037 region of Cyp2c11 gene; probe; 1010-1035 region
(7) Primer pair; 445-465 region and 535-516 region of Cyp2c12 gene, probe; 469-497 region
(8) Primer pair; 1135-1154 region and 1205-1185 region of Cyp2d1 gene; probe; 1158-1181 region
(9) Primer pair; 6-26 region and 97-79 region of Cyp2d2 gene, probe; 39-69 region
(10) Primer pair; 661-681 region and 748-729 region of Cyp2d3 gene, probe; 683-708 region
(11) Primer pair; 172-190 region and 251-233 region of Cyp2e1 gene; probe; 200-225 region
(12) Primer pair; 1199-1217 region and 1276-1258 region of Cyp3a1 gene, probe; 1223-1248 region
(13) Primer pair; 47-65 region and 127-110 region of Cyp3a2 gene, probe; 68-91 region
(14) Primer pair; 108-129 region and 185-166 region of Cyp4a1 gene, probe; 135-160 region.
[0021]
Item 7. Item 7. The measurement kit according to Item 6, wherein the probe further comprises a reporter dye and a quencher dye.
[0022]
Item 8. Item 8. The measurement kit according to Item 7, wherein the primer pair and the probe are oligonucleotides each containing a sequence of each SEQ ID NO shown in (1) to (14) below;
(1) Primer pair; SEQ ID NOS: 17 and 18, probe; SEQ ID NO: 1
(2) primer pair; SEQ ID NOs: 19 and 20, probe; SEQ ID NO: 2
(3) primer pair; SEQ ID NOS: 21 and 22, probe; SEQ ID NO: 3
(4) Primer pair; SEQ ID NOS: 23 and 24, probe; SEQ ID NO: 4 or primer pair; SEQ ID NOS: 25 and 26, probe; SEQ ID NO: 5
(5) Primer pair; SEQ ID NOs: 27 and 28, probe; SEQ ID NO: 6 or primer pair; SEQ ID NOs: 29 and 30, probe; SEQ ID NO: 7
(6) primer pair; SEQ ID NOS: 31 and 32, probe; SEQ ID NO: 8
(7) Primer pair; SEQ ID NOs: 33 and 34; probe; SEQ ID NO: 9
(8) primer pair; SEQ ID NOS: 35 and 36, probe; SEQ ID NO: 10
(9) Primer pair; SEQ ID NOS: 37 and 38; probe; SEQ ID NO: 11
(10) primer pair; SEQ ID NOs: 39 and 40, probe; SEQ ID NO: 12
(11) primer pair; SEQ ID NOs: 41 and 42, probe; SEQ ID NO: 13
(12) primer pair; SEQ ID NOs: 43 and 44, probe; SEQ ID NO: 14
(13) primer pair; SEQ ID NOs: 45 and 46; probe; SEQ ID NO: 15
(14) primer pairs; SEQ ID NOs: 47 and 48; probe; SEQ ID NO: 16.
[0023]
Item 9. Item 8. The measurement kit according to Item 8, wherein the set (1) is for measuring Cyp1a1, the set (2) is for measuring Cyp1a2, the set (3) is for measuring Cyp2a2, and (4) Set is for measuring Cyp2b1, set (5) is for measuring Cyp2b2, set (6) is for measuring Cyp2c11, set (7) is for measuring Cyp2c12, and set (8). Are for measurement of Cyp2d1, the set of (9) is for measurement of Cyp2d2, the set of (10) is for measurement of Cyp2d3, the set of (11) is for measurement of Cyp2e1, and the set of (12) is Cyp3a1. The set of (13) is for measurement of Cyp3a2, and the set of (14) is for measurement of Cyp4a1.
[0024]
Item 10. Item 10. The measurement kit according to Item 9, wherein the primer pair and the probe are oligonucleotides each having the sequence of each SEQ ID No. described in Item 8 (1) to (14).
[0025]
Item 11. A sample containing mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species is prepared, and the sample is subjected to a polymerase chain reaction using the measurement kit according to any one of claims 6 to 10, and the sample is subjected to hydrolysis during the polymerase chain reaction. A method for measuring mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species, comprising measuring a probe to be degraded.
[0026]
Item 12. Item 12. The measurement method according to Item 11, wherein the measurement of the probe to be hydrolyzed is performed by measuring the color of fluorescence by irradiation with excitation light.
[0027]
More specifically, the method of the present invention uses a primer pair of a forward primer and a reverse primer, and a probe having a reporter dye and a quencher dye and hybridizing with a template nucleic acid in a region sandwiched by both primers. Real-time measurement of mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species by performing the polymerase chain reaction (PCR) with a DNA polymerase having '-3' exonuclease activity and measuring the probes that are hydrolyzed during the PCR Provide a method for quantitative detection.
[0028]
The real-time quantitative detection method of the present invention can detect and quantify each mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species in real time simply and quickly under the same PCR to RT-PCR reaction conditions. Very useful in the field. In particular, the real-time quantitative detection method of the present invention is capable of processing a variety of samples quickly and accurately, for example, by using a small RNA sample extracted from an extracted tissue or a cultured cell to accurately detect the sample. This has the advantage that mRNA encoding the rat cytochrome P450 molecular species can be quantified and detected.
[0029]
Furthermore, it is considered that the change in the expression level of mRNA encoding a specific rat cytochrome P450 molecular species in the liver, kidney, etc. may correlate with the change in the value in blood (cells having nuclei contained in blood). However, the value in this blood is small and a lot of blood is required for the measurement. However, if a set of the primer and the probe of the present invention is used, even if such blood is used as a sample, the amount of mRNA in the blood can be accurately measured with a small sample amount without using a special instrument.
[0030]
Hereinafter, the probe and primer pair used in the method of the present invention will be described in detail. Each probe and primer pair is selected from oligonucleotides that hybridize to a specific region of mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species as described above. Is done.
[0031]
Here, “to hybridize” means to hybridize under PCR (RT-PCR) conditions described later.
[0032]
The common requirements for the probes and primers according to the present invention are that the amplification product is 50-400 base pairs in length, that the primer and the probe are as close as possible, and that G (guanine) contained in the sequence And that the ratio of C (cytosine) is about 50% as much as possible, and that four or more G (guanine) are not continuous. Another preferable requirement of the probe of the present invention is that the Tm value is around 70 ° C. Similarly, the primer may have a Tm value of about 60 ° C. as a preferable requirement.
[0033]
Each mRNA sequence encoding a rat cytochrome P450 molecular species is known and registered with the following accession numbers in GeneBank.
(1) Cyp1a1 gene; NM — 012540
(2) Cyp1a2 gene; NM — 012541
(3) Cyp2a2 gene; NM — 012693
(4) Cyp2b1 gene; AH002161
(5) Cyp2b2 gene; AH002162
(6) Cyp2c11 gene; U33173
(7) Cyp2c12 gene; NM_031572
(8) Cyp2d1 gene; AB008422
(9) Cyp2d2 gene; NM_012730
(10) Cyp2d3 gene; AB008424
(11) Cyp2e1 gene; AF061442
(12) Cyp3a1 gene; L24207
(13) Cyp3a2 gene; U09742
(14) Cyp4a1 gene; M57718
In the present specification, the indication of the specific region of the mRNA encoding the rat cytochrome P450 molecular species is in accordance with the sequence of the gene registered with each accession number (start codon is 1).
[0034]
The number of nucleotides of each of the primer and probe oligonucleotides should be at least 15, usually 15 to 50, and preferably 20 to 40. When the number of nucleotides of these primers and probes is too large, hybridization to single-stranded DNA becomes difficult, and when too small, the specificity of hybridization decreases.
[0035]
Preferred specific examples of the nucleotide sequences of the primer and the probe are as shown in the aforementioned item 8, and according to each molecular species, SEQ ID NOS: 1 to 16 (for a probe) and SEQ ID NOs: 17 to 48 (for a primer) ).
[0036]
A primer or probe consisting of, for example, 20 nucleotides can hybridize with the template strand even if a small number, usually 1-2 mismatches, exist between the primer and the template strand. It is known that it can function as The primers and probes of the present invention are also not limited to those having the specific nucleotide sequence described above, and may include the sequence as a part thereof, or may have substitution, deletion and / or substitution of, for example, 2 or less nucleotides in this sequence. It may have a sequence modified by addition.
[0037]
Each oligonucleotide as the probe and the primer of the present invention can be easily synthesized by an automatic synthesizer, for example, a DNA synthesizer (Perkin Elmer) according to a conventional method. The resulting oligonucleotide can be further purified, if necessary, using a commercially available purification cartridge or the like.
[0038]
Hereinafter, the probe of the present invention for real-time quantitative detection will be described in detail. The probe has a reporter dye bound to one end, for example, the 5'-end, and a quencher at the other end, for example, the 3'-end. Has a dye attached. The reporter dye is, for example, a substance that emits fluorescence upon irradiation with excitation light, and the quencher acts on the reporter dye when present in close proximity to the reporter dye to eliminate the generation of the fluorescence. It has. Examples of the reporter dye include, for example, 6-carboxy-fluorescein (FAM), tetrachloro-6-carboxyfluorescein (TET), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein. (JOE), hexachloro-6-carboxyfluorescein (HEX) and the like. Examples of quencher dyes include, for example, 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA).
[0039]
The probe of the present invention can be prepared by binding a reporter dye and a quencher dye to the probe oligonucleotide having the specific sequence. For example, a few methylene chains are usually used as a linker on the 5 ′ side of the probe, and a FAM molecule can be bound to a terminal phosphate group in the form of a phosphate ester. In this case, a TAMRA molecule is bonded to the 3 'side by an amide bond via a structural unit shown below.
[0040]
Embedded image
The method for measuring mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species by using the primer pair and the probe of the present invention can be performed according to ordinary techniques for measuring mRNA, using the primer pair and the probe of the present invention as essential. Such techniques include PCR (see, for example, Science, 230, 1350 (1985)) and RT-PCR (see, Genome Res., 6 (10), 986 (1996)), particularly real-time quantitative detection (for example, TaqMan). PCR, ABI PRISM TM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996).
[0042]
That is, in the method of the present invention, a sample containing mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species is prepared, and a set of at least one primer pair of the present invention and a probe shown in the above (1) to (14) is prepared for the sample. The PCR is carried out using a measurement kit including the kit, and a probe that is hydrolyzed during the PCR is measured. Specifically, a biological tissue expressing mRNA encoding a rat cytochrome P450 molecular species is collected, total RNA is extracted from the tissue according to a conventional method, and cDNA complementary thereto is then extracted according to a conventional method. After the synthesis, PCR may be performed using a measurement kit including a set of the primer pair of the present invention and a probe. Alternatively, after extracting total RNA according to a conventional method, RT-PCR can be directly performed using a measurement kit including the primer and the probe of the present invention.
[0043]
The PCR reaction and the RT-PCR reaction can basically follow a known method. These reaction conditions can also be appropriately determined according to a known method. More specifically, it can be carried out by employing the conditions described in the examples described later.
[0044]
Measurement and detection of the hydrolyzed probe can be basically performed according to a conventional method. For example, in the case of the real-time quantitative detection method, the method can be performed by irradiating a PCR reaction solution with an argon laser beam and measuring and detecting the emitted fluorescence using a CCD camera.
[0045]
Thus, the practice of the method of the present invention makes it possible to easily and quickly measure and detect the mRNA encoding the desired rat cytochrome P450 molecular species, and for each mRNA encoding each molecular species.
[0046]
The present invention also provides a measurement kit for performing the above method. This kit contains at least one selected from the group consisting of a primer pair and a probe set of (1) to (14) shown in the above item 6. The kit of the present invention may further include a known nucleic acid that can be used as a control, and a set of a primer pair and a probe for measuring the nucleic acid.
[0047]
According to the method of the present invention, each mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species can be measured and detected for each mRNA, and the measurement and detection of each mRNA can be performed quickly and accurately.
[0048]
【Example】
Hereinafter, Test Examples and Examples will be given to explain the present invention in more detail.
[0049]
[Test Example 1] Preparation of calibration curve by real-time quantitative detection method
(1) Test method
The real-time one-step RT-PCR method employed in this test can simultaneously perform up to 96 different reactions using 96 wells and measure up to 96 samples at a time. In addition, the RT reaction and the PCR reaction can be performed in one tube. Further, measurement in 384 wells is also possible.
[0050]
The principle of this method is that when two adjacent fluorescent dyes are used and the wavelength region overlaps between the fluorescent wavelength of one dye (reporter dye) and the excitation light wavelength of the other dye (quencher dye) Utilizing FRET that occurs in A probe (TaqMan probe) in which two types of fluorescent dyes that generate FRET are bound to both ends is hybridized to cDNA derived from an mRNA species encoding a specific rat cytochrome P450 amplified by PCR, and PCR is extended in this state. The reaction began, and the TaqMan probe was hydrolyzed by the 5'-3 'endonuclease activity of the Taq DNA polymerase, the reporter dye was eliminated, and a physical distance between the quencher dye was generated, which was suppressed by FRET. Since the fluorescence intensity of the reporter dye increases and the increase in the fluorescence intensity is proportional to the amount of increase in the PCR amplification product, a desired quantification can be performed by measuring the increase for each PCR reaction.
[0051]
In this test, FAM was used as a reporter dye at the 5 'end of the probe, and TAMRA was used as a quencher dye at the 3' end of the probe. The binding of these dyes and the production of TaqMan probes using the dyes were performed according to the method described in the literature (Genome Res., 6 (10), 986 (1996)).
[0052]
Oligonucleotides as each primer and probe were synthesized using an ABI DNA / RNA synthesizer as an automatic synthesizer, using a substrate (dNTP) and a specified reagent.
[0053]
As the sample RNA, total RNA purified from a rat liver pool was used.
[0054]
Total RNA purified from rat liver pool was diluted to 20 μg / mL with RNase-free water (for preparing a calibration curve). Further, this was diluted with 50 μg / mL yeast tRNA (Yeast tRNA, manufactured by GIBCO) at a 5-fold common ratio. 5 μL was used for the measurement.
[0055]
The RT-PCR reaction was performed using a TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems) containing 300 nM forward primer, 900 nM reverse primer, and 200 nM TaqMan probe in a 50 μL / tube system with an AB in a PR system. TM The test was performed using a 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems).
[0056]
The temperature was maintained at 48 ° C. for 30 minutes and at 95 ° C. for 10 minutes, and then 50 cycles of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute were performed 50 times, and the fluorescence intensity was measured for each cycle.
[0057]
Table 2 shows the results (calibration curves) of the above-mentioned tests performed on each rat cytochrome P450 molecular species (enzyme species) shown in Table 1 below using a primer pair and a probe consisting of oligonucleotides of each SEQ ID NO.
[0058]
[Table 1]
[Table 2]
From the results shown in Table 2, when a calibration curve diluted at a 5-fold common ratio was prepared from 100,000 pg total RNA / 50 μL reaction solution, quantitative analysis was performed for Cyp2a2 molecular species up to 1.28 pg total RNA / 50 μL reaction solution. For each of the other molecular species, the correlation coefficient (r) of the calibration curve with 1.28-4000 pg total RNA / 50 μL reaction volume as the quantification limit is 0.99 or more (however, Cyp2d3 molecular species Was 0.97).
[0061]
[Sequence list]
SEQUENCE LISTING
<110> Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.
<120> A method of measuring molecular specifications of rat P450 mRNAs and a probe and kit therefor
<130> 36002 JP
<160> 48
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp1a1
<400> 1
cagacgttat gaccacgatg accaaga 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp1a2
<400> 2
caaggagcgc tgcatctttca taacaccag 28
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2a2
<400> 3
atgtgggaaca ggccaaggcgt atcaggc 27
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2b1
<400> 4
ttcaccaccgg ctaccacacct ttgat 25
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2b1
<400> 5
cacaggct caatcctgaa actctcctg 29
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2b2
<400> 6
ctctcacagg cccaccccc ttgat 25
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2b2
<400> 7
caaccacct caatcctgag cactcctg 29
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2c11
<400> 8
cctgcatgaa agacaggaggc catagg 26
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2c12
<400> 9
aagaaaaacca aggctcacc ctgtgatcc 29
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2d1
<400> 10
agtccaggac ttcgtcatcc ccaa 24
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2d2
<400> 11
cattcaca gccatcttct tgcttctggt g 31
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2d3
<400> 12
acattgtccc agttctcctg cgcatc 26
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp2e1
<400> 13
tgtcactact gcaccttgggc tcagg 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp3a1
<400> 14
cagagcctga ggaattttcgc cccagaa 26
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp3a2
<400> 15
accgacttgg aacccataga catg 24
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> probe sequence of Cyp4a1
<400> 16
caaggtttc cagcagttcc catcac 26
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp1a1
<400> 17
gtcatctgttg ccatatgctt tg 22
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp1a1
<400> 18
gcttagatttg actatgctga gcag 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp1a2
<400> 19
cctcactgaa tggcttccac a 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp1a2
<400> 20
tctcatcatg gttgacctgc c 21
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2a2
<400> 21
tggcgaactg cctacctttt 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2a2
<400> 22
cgctttgccca caccaaaat 19
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2b1
<400> 23
gcagaaagga ggttgatcag gt 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2b1
<400> 24
agtgttatggc attttactgc gg 22
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2b1
<400> 25
catgacccac agacttttga ccac 24
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2b1
<400> 26
ctctttttca gtgccccgtt aa 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2b2
<400> 27
acagaaaagga gattgatcag gt 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2b2
<400> 28
agtgttatggc atttttggtac ga 22
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2b2
<400> 29
catgaccccac agacttttga ccat 24
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2b2
<400> 30
ctctttttca gtgtcccatc gg 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2c11
<400> 31
taattgggag aaccggagc 20
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2c11
<400> 32
tgcactacag catccgtgta gg 22
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2c12
<400> 33
gcagagtggc tagtgatgga a 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2c12
<400> 34
agatgcatt gcagggagca 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2d1
<400> 35
cgcatcacga gttgtgacat 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2d1
<400> 36
aggttgatga tgagggtcgt c 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2d2
<400> 37
gctgctgatt ggagatgacc t 21
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2d2
<400> 38
tccagaattt gtgccggtg 19
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2d3
<400> 39
ggctttgtttc ctgaggtttt g 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2d3
<400> 40
atgtctttttg cccagggaag 20
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp2e1
<400> 41
accagagtttgg caagcgct 19
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp2e1
<400> 42
ttgtagccat gcaggcca 19
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp3a1
<400> 43
ttcaccgtga tccacagca 19
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp3a1
<400> 44
tgctgccctt gttctcctt 19
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp3a2
<400> 45
cagtcatcct ggtgcttct 19
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp3a2
<400> 46
gttttggccc aggaattc 18
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (forward) of Cyp4a1
<400> 47
gttctacctg caaaaggcaat gg 22
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<223> primer sequence (reverse) of Cyp4a1
<400> 48
tgccccaaga accacctggaa 20
Claims (12)
（１） Ｃｙｐ１ａ１遺伝子の６２４−６５０の領域
（２） Ｃｙｐ１ａ２遺伝子の１２００−１２２７の領域
（３） Ｃｙｐ２ａ２遺伝子の３５６−３８２の領域
（４） Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の９８９−１０１３の領域または１２０４−１２３２の領域
（５） Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の９８９−１０１３の領域または１２０４−１２３２の領域
（６） Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子の１０１０−１０３５の領域
（７） Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子の４６９−４９７の領域
（８） Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子の１１５８−１１８１の領域
（９） Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子の３９−６９の領域
（１０） Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子の６８３−７０８の領域
（１１） Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子の２００−２２５の領域
（１２） Ｃｙｐ３ａ１遺伝子の１２２３−１２４８の領域
（１３） Ｃｙｐ３ａ２遺伝子の６８−９１の領域
（１４） Ｃｙｐ４ａ１遺伝子の１３５−１６０の領域An oligonucleotide selected from the group consisting of oligonucleotides capable of hybridizing to a predetermined region of each gene shown in the following (1) to (14), which is a probe used for measuring mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species: A probe, characterized in that:
(1) Region 624-650 of Cyp1a1 gene (2) Region 1200-1227 of Cyp1a2 gene (3) Region 356-382 of Cyp2a2 gene (4) Region 989-1013 or region 1204-1232 of Cyp2b1 gene (5) 989-1013 region or 1204-1232 region of Cyp2b2 gene (6) 1010-1035 region of Cyp2c11 gene (7) 469-497 region of Cyp2c12 gene (8) 1158-1181 region of Cyp2d1 gene (9) Region 39-69 of Cyp2d2 gene (10) Region 683-708 of Cyp2d3 gene (11) Region 200-225 of Cyp2e1 gene (12) Region 1223-1248 of Cyp3a1 gene (13) Cyp3a2 68-91 region of the gene (14) 135-160 region of the Cyp4a1 gene
（１）プライマー対；Ｃｙｐ１ａ１遺伝子の６０１−６２２領域および６７５−６５２領域、プローブ；６２４−６５０領域
（２）プライマー対；Ｃｙｐ１ａ２遺伝子の１１７５−１１９５領域および１２４９−１２２９領域、プローブ；１２００−１２２７領域
（３）プライマー対；Ｃｙｐ２ａ２遺伝子の３００−３１８領域および４２５−４０７領域、プローブ；３５６−３８２領域
（４）プライマー対；Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の９６１−９８２領域および１０３７−１０１６領域、プローブ；９８９−１０１３領域またはプライマー対；Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の１１７９−１２０２領域および１２３７−１２５８領域、プローブ；１２０４−１２３２領域
（５）プライマー対；Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の９６１−９８２領域および１０３７−１０１６領域、プローブ；９８９−１０１３領域またはプライマー対；Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の１１７９−１２０２領域および１２３７−１２５８領域、プローブ；１２０４−１２３２領域
（６）プライマー対；Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子の９８９−１００８領域および１０５８−１０３７領域、プローブ；１０１０−１０３５領域
（７）プライマー対；Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子の４４５−４６５領域および５３５−５１６領域、プローブ；４６９−４９７領域
（８）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子の１１３５−１１５４領域および１２０５−１１８５領域、プローブ；１１５８−１１８１領域
（９）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子の６−２６領域および９７−７９領域、プローブ；３９−６９領域
（１０）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子の６６１−６８１領域および７４８−７２９領域、プローブ；６８３−７０８領域
（１１）プライマー対；Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子の１７２−１９０領域および２５１−２３３領域、プローブ；２００−２２５領域
（１２）プライマー対；Ｃｙｐ３ａ１遺伝子の１１９９−１２１７領域および１２７６−１２５８領域、プローブ；１２２３−１２４８領域
（１３）プライマー対；Ｃｙｐ３ａ２遺伝子の４７−６５領域および１２７−１１０領域、プローブ；６８−９１領域
（１４）プライマー対；Ｃｙｐ４ａ１遺伝子の１０８−１２９領域および１８５−１６６領域、プローブ；１３５−１６０領域A kit for measuring mRNA encoding rat cytochrome P450 molecular species, comprising at least one of a set of a primer pair of a forward primer, a reverse primer and a probe, wherein the primer pair and the probe have the following (1)-(14) The above kit, which is an oligonucleotide capable of hybridizing to each region of the gene encoding the rat cytochrome P450 molecular species shown in (1).
(1) Primer pair; 601-622 region and 675-652 region of Cyp1a1 gene, probe; 624-650 region (2) Primer pair; 1175-1195 region and 1249-1229 region of Cyp1a2 gene, probe; 1200-1227 region (3) Primer pair; 300-318 region and 425-407 region of Cyp2a2 gene, probe; 356-382 region (4) Primer pair; 961-982 region and 1037-1016 region of Cyp2b1 gene, probe; 989-1013 region Or a primer pair; 1179-1202 and 1237-1258 regions of Cyp2b1 gene; probe; 1204-1232 region (5) primer pair; 961-982 region and 1037-1 of Cyp2b2 gene 1689 regions, probe; 989-1013 region or primer pair; 1179-1202 region and 1237-1258 region of Cyp2b2 gene, probe; 1204-1232 region (6) primer pair; 989-1008 region and 1058-1037 region of Cyp2c11 gene 1010-1035 region (7) primer pair; 445-465 region and 535-516 region of Cyp2c12 gene; probe; 469-497 region (8) primer pair; 1135-1154 region and 1205-1185 region of Cyp2d1 gene 1158-1181 region (9) primer pair; 6-26 region and 97-79 region of Cyp2d2 gene; probe; 39-69 region (10) primer pair; Cyp2d3 gene 661-681 region and 748-729 region, probe; 683-708 region (11) primer pair; 172-190 region and 251-233 region of Cyp2e1 gene, probe; 200-225 region (12) primer pair; Cyp3a1 gene 1199-1217 region and 1276-1258 region, probe; 1223-1248 region (13) primer pair; 47-65 region and 127-110 region of Cyp3a2 gene, probe; 68-91 region (14) primer pair; Cyp4a1 gene 108-129 region and 185-166 region, probe; 135-160 region
（１）プライマー対；配列番号１７および１８、プローブ；配列番号１
（２）プライマー対；配列番号１９および２０、プローブ；配列番号２
（３）プライマー対；配列番号２１および２２、プローブ；配列番号３
（４）プライマー対；配列番号２３および２４、プローブ；配列番号４またはプライマー対；配列番号２５および２６、プローブ；配列番号５
（５）プライマー対；配列番号２７および２８、プローブ；配列番号６またはプライマー対；配列番号２９および３０、プローブ；配列番号７
（６）プライマー対；配列番号３１および３２、プローブ；配列番号８
（７）プライマー対；配列番号３３および３４、プローブ；配列番号９
（８）プライマー対；配列番号３５および３６、プローブ；配列番号１０
（９）プライマー対；配列番号３７および３８、プローブ；配列番号１１
（１０）プライマー対；配列番号３９および４０、プローブ；配列番号１２
（１１）プライマー対；配列番号４１および４２、プローブ；配列番号１３
（１２）プライマー対；配列番号４３および４４、プローブ；配列番号１４
（１３）プライマー対；配列番号４５および４６、プローブ；配列番号１５
（１４）プライマー対；配列番号４７および４８、プローブ；配列番号１６The measurement kit according to claim 7, wherein the primer pair and the probe are oligonucleotides containing the sequences of the respective sequence numbers shown in the following (1) to (14).
(1) Primer pair; SEQ ID NOS: 17 and 18, probe; SEQ ID NO: 1
(2) primer pair; SEQ ID NOs: 19 and 20, probe; SEQ ID NO: 2
(3) primer pair; SEQ ID NOS: 21 and 22, probe; SEQ ID NO: 3
(4) Primer pair; SEQ ID NOS: 23 and 24, probe; SEQ ID NO: 4 or primer pair; SEQ ID NOS: 25 and 26, probe; SEQ ID NO: 5
(5) Primer pair; SEQ ID NOs: 27 and 28, probe; SEQ ID NO: 6 or primer pair; SEQ ID NOs: 29 and 30, probe; SEQ ID NO: 7
(6) primer pair; SEQ ID NOS: 31 and 32, probe; SEQ ID NO: 8
(7) Primer pair; SEQ ID NOs: 33 and 34; probe; SEQ ID NO: 9
(8) primer pair; SEQ ID NOS: 35 and 36, probe; SEQ ID NO: 10
(9) Primer pair; SEQ ID NOS: 37 and 38; probe; SEQ ID NO: 11
(10) primer pair; SEQ ID NOs: 39 and 40, probe; SEQ ID NO: 12
(11) primer pair; SEQ ID NOs: 41 and 42, probe; SEQ ID NO: 13
(12) primer pair; SEQ ID NOs: 43 and 44, probe; SEQ ID NO: 14
(13) primer pair; SEQ ID NOs: 45 and 46; probe; SEQ ID NO: 15
(14) Primer pair; SEQ ID NOs: 47 and 48; probe; SEQ ID NO: 16
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