JP4288454B2 - Method for measuring enzyme involved in phase I reaction of drug metabolism, probe and kit therefor - Google Patents

Description

【０００５】
新薬を開発する上で、該新薬を投与した際の薬物代謝の第I相反応に関与する酵素の働き（発現量の増減）を把握することは、殊に重要である。何故なら、この第I相反応に関与する酵素の変動が判らないと、新薬と併用される併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤、他の摂取物による新薬の効力、副作用の増減などが予測できず、該新薬の安全性を確認することができないからである。
【０００６】
従って、新薬開発などの分野においては、かかる薬物代謝の第I相反応に関与する酵素に関する情報、殊に該酵素およびその各分子種を区別して測定できる測定技術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の他剤との相互作用、特殊病態時における影響などが容易に把握でき、該新薬の副作用に関する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全性を確保することができる。
【０００７】
一方、ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばRT-PCR（Reverse Transcription-PCR）、コンペティティブRT-PCRなどが微量のmRNAの検出、定量に威力を発揮している。
【０００８】
近年、PCRを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Taq Man PCR (Genome Res., 6(10), 986 (1996)), ABI PRISM^TM Sequence Detection System (Applied Biosystems社)）。この検出法は、特定の蛍光標識プローブ（TaqMan probe）を用いて核酸を測定する方法であり、その原理は次の通りである。即ち、例えば5'末端にリポーター色素および3'末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットDNAにアニールさせた状態で、通常のPCR反応を行わせると、伸長反応の進行に伴って、DNAポリメラーゼの有する5'-3'エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが5'末端から加水分解される。その結果、5'末端のリポーター色素が3'末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるFRET（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加する。該蛍光強度の増加を測定すれば、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できる。
【０００９】
この方法には、PCR反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析するなどの複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。
【００１０】
一般に、臨床検査センターなどで臨床検査を行う場合は、非常に多数の検体について限られた時間内に検査をする必要があり、検査を効率良く行い得る手法の開発が要望されており、上記リアルタイム検出法は、この要望に合致するものとして期待できる。
【００１１】
本発明者らは、上記PCRによるリアルタイム検出法に着目し、その薬物代謝の第I相反応に関与する酵素の検出への応用を着想した。即ち、かかる応用によって、同じ装置を用いて同一のPCR条件で多数の検体を同時に検査でき、しかもこれによって各酵素の分子種までも区別して測定、検出することが可能となると考えた。
【００１２】
しかるに、現在知られている薬物代謝の第I相反応に関与する酵素は、前述したとおり、非常に多数であり、それぞれのmRNAの配列は、知られているものの、これらをターゲット遺伝子として、互いに重複する配列部分を有さず、しかも同一PCR条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられた。
【００１３】
また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一PCR条件下にこれらのプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかも薬物代謝の第I相反応に関与する各酵素に対して特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。
【００１４】
特に、ヌクレオチド配列が既知の2つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点(Tm)の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもDNA測定において好結果をもたらすわけではないことが知られており、現在知られている薬物代謝の第I相反応に関与する多種の酵素について、これらを同時に区別して測定可能な、上記PCRによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験などが必要となると予想された。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、薬物代謝の第I相反応に関与する酵素のPCRによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプローブおよびプライマー対を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的より薬物代謝の第I相反応に関与する多種の酵素について、多大な実験、研究を繰返し行った結果、上記酵素の内の39種に対する目的プライマー対およびプローブの組合せを提供するに成功し、ここに本発明を完成するに至った。
【００１７】
本発明は、薬物代謝の第I相反応に関与する酵素の測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(53)に示される領域のいずれかにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれるプローブ；特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合している該プローブ；塩基配列の長さが20-40の範囲にある該プローブ；配列番号1〜配列番号53に示される配列のいずれかを含む該プローブ；並びに配列番号1〜配列番号53に示される配列のいずれかである該プローブを提供する。
(1)EPHX1遺伝子の222-248領域
(2)EPHX2遺伝子の174-203領域
(3)PIG3遺伝子の767-796領域
(4)NMOR2遺伝子の50-77領域
(5)MAOA遺伝子の853-881領域
(6)MAOB遺伝子の1491-1519領域
(7)PTGS1遺伝子の1088-1115領域
(8)PTGS2遺伝子の830-855領域
(9)DPYD遺伝子の2345-2370領域
(10)AOX1遺伝子の3500-3527領域
(11)XDH遺伝子の3504-3533領域
(12)CEL遺伝子の468-493領域
(13)CES1遺伝子の976-1005領域
(14)CES2遺伝子の328-354領域
(15)AADAC遺伝子の86-113領域
(16)GZMA遺伝子の326-353領域
(17)GZMB遺伝子の276-301領域
(18)IL17遺伝子の99-126領域
(19)LIPA遺伝子の253-282領域
(20)NTE遺伝子の3670-3697領域
(21)UCHL1遺伝子の255-280領域
(22)UCHL3遺伝子の105-134領域
(23)FMO1遺伝子の728-755領域
(24)FMO2遺伝子の727-750領域
(25)FMO2遺伝子の1117-1143領域
(26)FMO3遺伝子の735-763領域
(27)FMO4遺伝子の1326-1351領域
(28)FMO5遺伝子の1111-1138領域
(29)ALDH1遺伝子の381-407領域
(30)ALDH2遺伝子の1204-1228領域
(31)ALDH3遺伝子の461-488領域
(32)ALDH3遺伝子の1094-1121領域
(33)ALDH4遺伝子の823-848領域
(34)ALDH5遺伝子の1212-1236領域
(35)ALDH6遺伝子の1413-1439領域
(36)ALDH7遺伝子の790-816領域
(37)ALDH8遺伝子の95-122領域
(38)ALDH9遺伝子の481-504領域
(39)ALDH10遺伝子の563-588領域
(40)ADH1遺伝子の168-197領域
(41)ADH1遺伝子の298-333領域
(42)ADH2遺伝子の144-173領域
(43)ADH2遺伝子の438-467領域
(44)ADH3遺伝子の102-131領域
(45)ADH3遺伝子の939-966領域
(46)ADH4遺伝子の927-956領域
(47)ADH5遺伝子の322-351領域
(48)ADH5遺伝子の616-641領域
(49)ADH6遺伝子の912-939の領域
(50)ADH7遺伝子の745-772の領域
(51)ESD遺伝子の451-476の領域(ジーンバンク登録番号M13450の配列に基づく、以下同じ)
(52)HADH2遺伝子の483-509の領域
(53)HEP27遺伝子の610-584の領域
また、本発明は、下記(1)〜(53)のいずれかに示される各領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの組合せを含む、薬物代謝の第I相反応に関与する酵素の測定キット；特にプローブが更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである上記測定キットを提供する。
(1)フォワードプライマー；EPHX1遺伝子の200-220領域、プローブ；同遺伝子の222-248領域およびリバースプライマー；同遺伝子の302-281領域、
(2)フォワードプライマー；EPHX2遺伝子の145-165領域、プローブ；同遺伝子の174-203領域およびリバースプライマー；同遺伝子の237-217領域、
(3)フォワードプライマー；PIG3遺伝子の743-763領域、プローブ；同遺伝子の767-796領域およびリバースプライマー；同遺伝子の858-838領域、
(4)フォワードプライマー；NMOR2遺伝子の26-46領域、プローブ；同遺伝子の50-77領域およびリバースプライマー；同遺伝子の101-80領域、
(5)フォワードプライマー；MAOA遺伝子の827-849領域、プローブ；同遺伝子の853-881領域およびリバースプライマー；同遺伝子の919-898領域、
(6)フォワードプライマー；MAOB遺伝子の1440-1461領域、プローブ；同遺伝子の1491-1519領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1555-1535領域、
(7)フォワードプライマー；PTGS1遺伝子の1066-1086領域、プローブ；同遺伝子の1088-1115領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1187-1167領域、
(8)フォワードプライマー；PTGS2遺伝子の792-813領域、プローブ；同遺伝子の830-855領域およびリバースプライマー；同遺伝子の928-908領域、
(9)フォワードプライマー；DPYD遺伝子の2321-2341領域、プローブ；同遺伝子の2345-2370領域およびリバースプライマー；同遺伝子の2399-2379領域、
(10)フォワードプライマー；AOX1遺伝子の3464-3484領域、プローブ；同遺伝子の3500-3527領域およびリバースプライマー；同遺伝子の3585-3564領域、
(11)フォワードプライマー；XDH遺伝子の3446-3468領域、プローブ；同遺伝子の3504-3533領域およびリバースプライマー；同遺伝子の3562-3540領域、
(12)フォワードプライマー；CEL遺伝子の429-451領域、プローブ；同遺伝子の468-493領域およびリバースプライマー；同遺伝子の555-533領域、
(13)フォワードプライマー；CES1遺伝子の935-956領域、プローブ；同遺伝子の976-1005領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1061-1041領域、
(14)フォワードプライマー；CES2遺伝子の298-319領域、プローブ；同遺伝子の328-354領域およびリバースプライマー；同遺伝子の383-362領域、
(15)フォワードプライマー；AADAC遺伝子の63-83領域、プローブ；同遺伝子の86-113領域およびリバースプライマー；同遺伝子の206-185領域、
(16)フォワードプライマー；GZMA遺伝子の304-324領域、プローブ；同遺伝子の326-353領域およびリバースプライマー；同遺伝子の433-413領域、
(17)フォワードプライマー；GZMB遺伝子の253-274領域、プローブ；同遺伝子の276-301領域およびリバースプライマー；同遺伝子の350-328領域、
(18)フォワードプライマー；IL17遺伝子の68-88領域、プローブ；同遺伝子の99-126領域およびリバースプライマー；同遺伝子の163-142領域、
(19)フォワードプライマー；LIPA遺伝子の226-248領域、プローブ；同遺伝子の253-282領域およびリバースプライマー；同遺伝子の347-327領域、
(20)フォワードプライマー；NTE遺伝子の3634-3655領域、プローブ；同遺伝子の3670-3697領域およびリバースプライマー；同遺伝子の3747-3725領域、
(21)フォワードプライマー；UCHL1遺伝子の233-253領域、プローブ；同遺伝子の255-280領域およびリバースプライマー；同遺伝子の306-285領域、
(22)フォワードプライマー；UCHL3遺伝子の76-97領域、プローブ；同遺伝子の105-134領域およびリバースプライマー；同遺伝子の164-140領域、
(23)フォワードプライマー；FMO1遺伝子の696-716領域、プローブ；同遺伝子の728-755領域およびリバースプライマー；同遺伝子の790-769領域、
(24)フォワードプライマー；FMO2遺伝子の705-725領域、プローブ；同遺伝子の727-750領域およびリバースプライマー；同遺伝子の826-806領域、
(25)フォワードプライマー；FMO2遺伝子の1077-1097領域、プローブ；同遺伝子の1117-1143領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1165-1145領域、
(26)フォワードプライマー；FMO3遺伝子の706-726領域、プローブ；同遺伝子の735-763領域およびリバースプライマー；同遺伝子の844-823領域、
(27)フォワードプライマー；FMO4遺伝子の1297-1317領域、プローブ；同遺伝子の1326-1351領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1422-1401領域、
(28)フォワードプライマー；FMO5遺伝子の1063-1084領域、プローブ；同遺伝子の1111-1138領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1162-1141領域、
(29)フォワードプライマー；ALDH1遺伝子の359-379領域、プローブ；同遺伝子の381-407領域およびリバースプライマー；同遺伝子の494-472領域、
(30)フォワードプライマー；ALDH2遺伝子の1179-1199領域、プローブ；同遺伝子の1204-1228領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1307-1285領域、
(31)フォワードプライマー；ALDH3遺伝子の422-442領域、プローブ；同遺伝子の461-488領域およびリバースプライマー；同遺伝子の549-528領域、
(32)フォワードプライマー；ALDH3遺伝子の1058-1078領域、プローブ；同遺伝子の1094-1121領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1194-1174領域、
(33)フォワードプライマー；ALDH4遺伝子の768-788領域、プローブ；同遺伝子の823-848領域およびリバースプライマー；同遺伝子の967-947領域、
(34)フォワードプライマー；ALDH5遺伝子の1183-1206領域、プローブ；同遺伝子の1212-1236領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1261-1241領域、
(35)フォワードプライマー；ALDH6遺伝子の1382-1404領域、プローブ；同遺伝子の1413-1439領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1466-1445領域、
(36)フォワードプライマー；ALDH7遺伝子の743-764領域、プローブ；同遺伝子の790-816領域およびリバースプライマー；同遺伝子の878-858領域、
(37)フォワードプライマー；ALDH8遺伝子の55-75領域、プローブ；同遺伝子の95-122領域およびリバースプライマー；同遺伝子の182-162領域、
(38)フォワードプライマー；ALDH9遺伝子の459-479領域、プローブ；同遺伝子の481-504領域およびリバースプライマー；同遺伝子の534-513領域、
(39)フォワードプライマー；ALDH10遺伝子の525-546領域、プローブ；同遺伝子の563-588領域およびリバースプライマー；同遺伝子の644-623領域、
(40)フォワードプライマー；ADH1遺伝子の94-115領域、プローブ；同遺伝子の168-197領域およびリバースプライマー；同遺伝子の365-345領域、
(41)フォワードプライマー；ADH1遺伝子の261-281領域、プローブ；同遺伝子の298-333領域およびリバースプライマー；同遺伝子の365-345領域、
(42)フォワードプライマー；ADH2遺伝子の94-115領域、プローブ；同遺伝子の144-173領域およびリバースプライマー；同遺伝子の431-411領域、
(43)フォワードプライマー；ADH2遺伝子の411-431領域、プローブ；同遺伝子の438-467領域およびリバースプライマー；同遺伝子の518-496領域、
(44)フォワードプライマー；ADH3遺伝子の72-93領域、プローブ；同遺伝子の102-131領域およびリバースプライマー；同遺伝子の167-144領域、
(45)フォワードプライマー；ADH3遺伝子の743-763領域、プローブ；同遺伝子の939-966領域およびリバースプライマー；同遺伝子の1113-1091領域、
(46)フォワードプライマー；ADH4遺伝子の903-924領域、プローブ；同遺伝子の927-956領域およびリバースプライマー；同遺伝子の984-964領域、
(47)フォワードプライマー；ADH5遺伝子の289-310領域、プローブ；同遺伝子の322-351領域およびリバースプライマー；同遺伝子の495-474領域、
(48)フォワードプライマー；ADH5遺伝子の564-585領域、プローブ；同遺伝子の616-641領域およびリバースプライマー；同遺伝子の676-656領域。
(49)フォワードプライマー；ADH6遺伝子の889-910領域、プローブ；同遺伝子の912-939領域およびリバースプライマー；同遺伝子の987-967領域。
(50)フォワードプライマー；ADH7遺伝子の722-743領域、プローブ；同遺伝子の745-772領域およびリバースプライマー；同遺伝子の802-781領域。
(51)フォワードプライマー；ESD遺伝子の427-447領域、プローブ；同遺伝子の451-476領域およびリバースプライマー；同遺伝子の519-497領域(ジーンバンク登録番号M13450の配列に基づく、以下同じ)。
(52)フォワードプライマー；HADH2遺伝子の451-471領域、プローブ；同遺伝子の483-509領域およびリバースプライマー；同遺伝子の539-519領域。
(53)フォワードプライマー；HEP27遺伝子の505-526領域、プローブ；同遺伝子の610-584領域およびリバースプライマー；同遺伝子の635-615領域。
【００１８】
上記測定キットを構成するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの組合せの好ましいものとしては、下記(1)〜(53)に記載の各配列番号で示される配列を含むオリゴヌクレオチドの組合せ、より好ましくは各配列番号で示される配列のオリゴヌクレオチドの組合せを挙げることができる。
(1)フォワードプライマー；配列番号54、プローブ；配列番号1およびリバースプライマー；配列番号55、
(2)フォワードプライマー；配列番号56、プローブ；配列番号2およびリバースプライマー；配列番号57、
(3)フォワードプライマー；配列番号58、プローブ；配列番号3およびリバースプライマー；配列番号59、
(4)フォワードプライマー；配列番号60、プローブ；配列番号4およびリバースプライマー；配列番号61、
(5)フォワードプライマー；配列番号62、プローブ；配列番号5およびリバースプライマー；配列番号63、
(6)フォワードプライマー；配列番号64、プローブ；配列番号6およびリバースプライマー；配列番号65、
(7)フォワードプライマー；配列番号66、プローブ；配列番号7およびリバースプライマー；配列番号67、
(8)フォワードプライマー；配列番号68、プローブ；配列番号8およびリバースプライマー；配列番号69
(9)フォワードプライマー；配列番号70、プローブ；配列番号9およびリバースプライマー；配列番号71、
(10)フォワードプライマー；配列番号72、プローブ；配列番号10およびリバースプライマー；配列番号73、
(11)フォワードプライマー；配列番号74、プローブ；配列番号11およびリバースプライマー；配列番号75、
(12)フォワードプライマー；配列番号76、プローブ；配列番号12およびリバースプライマー；配列番号77、
(13)フォワードプライマー；配列番号78、プローブ；配列番号13およびリバースプライマー；配列番号79、
(14)フォワードプライマー；配列番号80、プローブ；配列番号14およびリバースプライマー；配列番号81、
(15)フォワードプライマー；配列番号82、プローブ；配列番号15およびリバースプライマー；配列番号83、
(16)フォワードプライマー；配列番号84、プローブ；配列番号16およびリバースプライマー；配列番号85、
(17)フォワードプライマー；配列番号86、プローブ；配列番号17およびリバースプライマー；配列番号87、
(18)フォワードプライマー；配列番号88、プローブ；配列番号18およびリバースプライマー；配列番号89、
(19)フォワードプライマー；配列番号90、プローブ；配列番号19およびリバースプライマー；配列番号91、
(20)フォワードプライマー；配列番号92、プローブ；配列番号20およびリバースプライマー；配列番号93、
(21)フォワードプライマー；配列番号94、プローブ；配列番号21およびリバースプライマー；配列番号95、
(22)フォワードプライマー；配列番号96、プローブ；配列番号22およびリバースプライマー；配列番号97、
(23)フォワードプライマー；配列番号98、プローブ；配列番号23およびリバースプライマー；配列番号99、
(24)フォワードプライマー；配列番号100、プローブ；配列番号24およびリバースプライマー；配列番号101、
(25)フォワードプライマー；配列番号102、プローブ；配列番号25およびリバースプライマー；配列番号103、
(26)フォワードプライマー；配列番号104、プローブ；配列番号26およびリバースプライマー；配列番号105、
(27)フォワードプライマー；配列番号106、プローブ；配列番号27およびリバースプライマー；配列番号107、
(28)フォワードプライマー；配列番号108、プローブ；配列番号28およびリバースプライマー；配列番号109、
(29)フォワードプライマー；配列番号110、プローブ；配列番号29およびリバースプライマー；配列番号111、
(30)フォワードプライマー；配列番号112、プローブ；配列番号30およびリバースプライマー；配列番号113、
(31)フォワードプライマー；配列番号114、プローブ；配列番号31およびリバースプライマー；配列番号115、
(32)フォワードプライマー；配列番号116、プローブ；配列番号32およびリバースプライマー；配列番号117、
(33)フォワードプライマー；配列番号118、プローブ；配列番号33およびリバースプライマー；配列番号119、
(34)フォワードプライマー；配列番号120、プローブ；配列番号34およびリバースプライマー；配列番号121、
(35)フォワードプライマー；配列番号122、プローブ；配列番号35およびリバースプライマー；配列番号123、
(36)フォワードプライマー；配列番号124、プローブ；配列番号36およびリバースプライマー；配列番号125、
(37)フォワードプライマー；配列番号126、プローブ；配列番号37およびリバースプライマー；配列番号127、
(38)フォワードプライマー；配列番号128、プローブ；配列番号38およびリバースプライマー；配列番号129、
(39)フォワードプライマー；配列番号130、プローブ；配列番号39およびリバースプライマー；配列番号131、
(40)フォワードプライマー；配列番号132、プローブ；配列番号40およびリバースプライマー；配列番号133、
(41)フォワードプライマー；配列番号134、プローブ；配列番号41およびリバースプライマー；配列番号135、
(42)フォワードプライマー；配列番号136、プローブ；配列番号42およびリバースプライマー；配列番号137、
(43)フォワードプライマー；配列番号138、プローブ；配列番号43およびリバースプライマー；配列番号139、
(44)フォワードプライマー；配列番号140、プローブ；配列番号44およびリバースプライマー；配列番号141、
(45)フォワードプライマー；配列番号142、プローブ；配列番号45およびリバースプライマー；配列番号143、
(46)フォワードプライマー；配列番号144、プローブ；配列番号46およびリバースプライマー；配列番号145、
(47)フォワードプライマー；配列番号146、プローブ；配列番号47およびリバースプライマー；配列番号147、
(48)フォワードプライマー；配列番号148、プローブ；配列番号48およびリバースプライマー；配列番号149、
(49)フォワードプライマー；配列番号150、プローブ；配列番号49およびリバースプライマー；配列番号151、
(50)フォワードプライマー；配列番号152、プローブ；配列番号50およびリバースプライマー；配列番号153、
(51)フォワードプライマー；配列番号154、プローブ；配列番号51およびリバースプライマー；配列番号155、
(52)フォワードプライマー；配列番号156、プローブ；配列番号52およびリバースプライマー；配列番号157、
(53)フォワードプライマー；配列番号158、プローブ；配列番号53およびリバースプライマー；配列番号159。
【００１９】
上記各組合せは、それぞれ以下の薬物代謝の第I相反応に関与する酵素の測定用である。
(1)の組合せ；EPHX1測定用
(2)の組合せ；EPHX2測定用
(3)の組合せ；PIG3測定用
(4)の組合せ；NMOR2測定用
(5)の組合せ；MAOA測定用
(6)の組合せ；MAOB測定用
(7)の組合せ；PTGS1測定用
(8)の組合せ；PTGS2測定用
(9)の組合せ；DPYD測定用
(10)の組合せ；AOX1測定用
(11)の組合せ；XDH測定用
(12)の組合せ；CEL測定用
(13)の組合せ；CES1測定用
(14)の組合せ；CES2測定用
(15)の組合せ；AADAC測定用
(16)の組合せ；GZMA測定用
(17)の組合せ；GZMB測定用
(18)の組合せ；IL17測定用
(19)の組合せ；LIPA測定用
(20)の組合せ；NTE測定用
(21)の組合せ；UCHL1測定用
(22)の組合せ；UCHL3測定用
(23)の組合せ；FMO1測定用
(24)の組合せ；FMO2測定用
(25)の組合せ；FMO2測定用
(26)の組合せ；FMO3測定用
(27)の組合せ；FMO4測定用
(28)の組合せ；FMO5測定用
(29)の組合せ；ALDH1測定用
(30)の組合せ；ALDH2測定用
(31)の組合せ；ALDH3測定用
(32)の組合せ；ALDH3測定用
(33)の組合せ；ALDH4測定用
(34)の組合せ；ALDH5測定用
(35)の組合せ；ALDH6測定用
(36)の組合せ；ALDH7測定用
(37)の組合せ；ALDH8測定用
(38)の組合せ；ALDH9測定用
(39)の組合せ；ALDH10測定用
(40)の組合せ；ADH1測定用
(41)の組合せ；ADH1測定用
(42)の組合せ；ADH2測定用
(43)の組合せ；ADH2測定用
(44)の組合せ；ADH3測定用
(45)の組合せ；ADH3測定用
(46)の組合せ；ADH4測定用
(47)の組合せ；ADH5測定用
(48)の組合せ；ADH5測定用
(49)の組合せ；ADH6測定用
(50)の組合せ；ADH7測定用
(51)の組合せ；ESD測定用
(52)の組合せ；HADH2測定用
(53)の組合せ；HEP27測定用。
【００２０】
本発明は、更に薬物代謝の第I相反応に関与する酵素の遺伝子を含む検体について、前記いずれかに記載の本発明測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とする薬物代謝の第I相反応に関与する酵素の測定方法、特に上記加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無によりなされる上記測定方法を提供する。
【００２１】
該測定方法は、より好ましくは、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対、並びにレポーター色素およびクエンチャー色素が結合しており且つ上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う、リアルタイム検出法によって実施される。
【００２２】
本発明に係わる上記リアルタイム検出法は、同一PCR乃至RT-PCR反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、各種酵素を分別定量できるものであり、その確立は、臨床分野、医薬品分野において非常に有益である。
【００２３】
即ち、該方法によれば、医薬品開発における動態試験において重要な位置を占める薬物代謝の第I相反応に関与する酵素のヒト試料中でのmRNAの発現を容易に定量することができ、これによって、医薬品などの化学物質に曝露された場合の該第I相反応に関与する各酵素の変化を知ることができる。
また、該方法によれば、迅速且つ多種の試料を同時に処理でき、また僅かな組織片から抽出した全RNAを試料とすることもできるため、例えば、手術で摘出した組織やバイオプシーにより摘出した組織中の該第I相反応に関与する酵素のmRNA発現を検出、定量する方法として好適である。
【００２４】
更に、特定の第I相反応に関与する酵素においては、肝臓、腎臓などでの酵素誘導などによる発現量の変化が血液中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の変化と相関する可能性が考えられるが、この血液中の発現量は小さく、測定には多くの血液を必要とする。しかるに、特定のプライマー対とプローブとを用いる本発明方法によれば、少ない血液サンプル量で、既存の測定機器を用いて、該血液中の発現量を容易に測定することができる。
【００２５】
また、特定の第I相反応に関与する酵素においては、肝臓、腎臓などでの酵素誘導などによる発現量の変化が唾液中などの分泌液中に含まれる核を有する細胞の値の変化と相関する可能性も考えられるが、この唾液中など分泌液中に含まれる核を有する細胞中の発現量も僅かである。本発明方法は、かかる唾液などの分泌液をサンプルとして、該分泌液中に含まれる核を有する細胞中の発現量も、少ないサンプル量で、既存の機器を用いて容易に測定可能である。
【００２６】
以下、本発明方法に利用するプローブおよびプライマー対につき詳述する。
【００２７】
これら各プローブおよびプライマーは、上述した通り、薬物代謝の第I相反応に関与する酵素の遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００２８】
ここで「ハイブリダイズする」とは、後述するPCR(RT-PCR)の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２９】
本発明に係わるプローブおよびプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が約50-400塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるG（グアニン）およびC（シトシン）の割合がなるべく50％前後であること、G（グアニン）が4つ以上連続していないことなどを挙げることができる。また、他の要件としては、本発明プローブではTm値が70℃前後であることを、本発明プライマーでは、Tm値が60℃前後であることをそれぞれ挙げることができる。
【００３０】
薬物代謝の第I相反応に関与する各酵素のmRNAの配列は公知であり、それぞれジーンバンク（GenBank）に以下の登録番号で登録されている。
(1)EPHX1遺伝子；NM#000120
(2)EPHX2遺伝子；NM#001979
(3)PIG3遺伝子；NM#004881
(4)NMOR2遺伝子；NM#000904
(5)MAOA遺伝子；NM#000240
(6)MAOB遺伝子；NM#000898
(7)PTGS1遺伝子；M59979
(8)PTGS2遺伝子；NM#000963
(9)DPYD遺伝子；NM#000110
(10)AOX1遺伝子；NM#001159
(11)XDH遺伝子；NM#000379
(12)CEL遺伝子；NM#001807
(13)CES1遺伝子；NM#001266
(14)CES2遺伝子；NM#003869
(15)AADAC遺伝子；NM#001086
(16)GZMA遺伝子；NM#006144
(17)GZMB遺伝子；NM#004131
(18)IL17遺伝子；NM#002190
(19)LIPA遺伝子；NM#000235
(20)NTE遺伝子；NM#006702
(21)UCHL1遺伝子；NM#004181
(22)UCHL3遺伝子；NM#006002
(23)FMO1遺伝子；NM#002021
(24)FMO2遺伝子；NM#001460
(25)FMO2遺伝子；NM#001460
(26)FMO3遺伝子；NM#006894
(27)FMO4遺伝子；NM#002022
(28)FMO5遺伝子；NM#001461
(29)ALDH1遺伝子；AF003341
(30)ALDH2遺伝子；NM#000690
(31)ALDH3遺伝子；NM#000691
(32)ALDH3遺伝子；NM#000691
(33)ALDH4遺伝子；NM#003748
(34)ALDH5遺伝子；NM#000692
(35)ALDH6遺伝子；NM#000693
(36)ALDH7遺伝子；NM#000694
(37)ALDH8遺伝子；NM#000695
(38)ALDH9遺伝子；NM#000696
(39)ALDH10遺伝子；NM#000382
(40)ADH1遺伝子；NM#000667
(41)ADH1遺伝子；NM#000667
(42)ADH2遺伝子；NM#000668
(43)ADH2遺伝子；NM#000668
(44)ADH3遺伝子；NM#000669
(45)ADH3遺伝子；NM#000669
(46)ADH4遺伝子；NM#000670
(47)ADH5遺伝子；NM#000671
(48)ADH5遺伝子；NM#000671
(49)ADH6遺伝子；NM#000672
(50)ADH7遺伝子；NM#000673
(51)ESD遺伝子；M13450
(52)HADH2遺伝子；NM#004493
(53)HEP27遺伝子；NM#005794。
【００３１】
本明細書において、各酵素の特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配列に従うものである。
【００３２】
本発明に係わる各プライマーおよびプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも15個、通常15-50個、好ましくは20-40個の範囲にあるのがよい。これらプライマーおよびプローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、1本鎖DNAにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００３３】
プライマーおよびプローブの特定のヌクレオチド配列の好ましい具体的配列の例は、前述したとおりであり、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号1-53（プローブの場合）並びに配列番号54-159（プライマーの場合）に示される。
【００３４】
尚、例えば20ヌクレオチドからなるプライマーまたはプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイズし、PCRのプライマーとしてまたは検出用プローブとして機能し得ることが知られている。従って本発明プライマーおよびプローブもまた、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、該配列をその一部として含む配列や、この配列中の例えば2個以下の、特に1個のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加による修飾のなされた配列であることができる。
【００３５】
本発明プローブおよびプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばDNAシンセサイザー（パーキンエルマー社）などを用いて容易に合成することができる。かくして得られるオリゴヌクレオチドは、更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジなどを用いて精製することもできる。
【００３６】
本発明のリアルタイム検出用プローブは、その一端、例えば5'-末端にレポーター色素を結合しており、そして他端、例えば3'-末端にクエンチャー色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャーは、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合にレポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有するものであることができる。該レポーター色素の例としては、例えば6-カルボキシ−フルオレッセイン(FAM)、テトラクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(TET)、2,7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(JOE)、ヘキソクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(HEX)などが挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば6-カルボキシ−テトラメチル−ローダミン(TAMRA)などが挙げられる。
【００３７】
本発明プローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素およびクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプローブの5'側には、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にFAM分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、3'側には、下に示す構造単位を介してアミド結合によりTAMRA分子を結合させ得る。
【００３８】
【化１】

【００３９】
以下、本発明プライマー対およびプローブを利用したPCR検出法およびリアルタイム検出法につき詳述する。
【００４０】
本発明方法は、前述した本発明プライマー対およびプローブを利用することを必須として、他は公知のPCR法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参照）、RT-PCR（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）など、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996参照）に従い実施することができる。
【００４１】
該方法は、特に本発明が対象とする薬物代謝の第I相反応に関与する各酵素の発現量の測定方法として、mRNAを測定する場合に有用である。この場合、特定酵素を発現している生体組織を採取し、常法に従って全RNAを抽出し、次にそれに対して相補性のcDNAを常法に従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとを用いて、PCRを行えばよい。また、常法に従って全RNAを抽出後、本発明プライマーとプローブとを用いて、直接RT-PCRを行なうこともできる。
【００４２】
PCR反応およびRT-PCR反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特にこれらの方法と異なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件を好ましく採用できる。
【００４３】
リアルタイム検出法による検出も、基本的には常法に従って、例えば、アルゴンレーザ光をPCR反応液に照射し、放射される蛍光をCCDカメラを用いて検出することにより行なうことができる。
【００４４】
かくして、本発明方法の実施によって、所期の薬物代謝の第I相反応に関与する各酵素を容易且つ迅速に、しかも各酵素毎に区別して測定、検出することができる。
【００４５】
本発明は、上記方法の実施のためのキットをも提供する。このキットは本発明プライマー対およびプローブを含んでなる。本発明キットは、更に対照として使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対およびプローブを含むことができる。
【００４６】
本発明方法によれば、薬物代謝の第I相反応に関与する各酵素の遺伝子をその酵素毎に分別して測定、検出できる。また、該酵素の定量を迅速に、精度よく行なうことができる。かくして、新薬の他剤との相互作用や配合禁忌などに関連する基礎データを効率よく得ることができる。
【００４７】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため試験例および実施例を挙げる。
【００４８】
【試験例１】
リアルタイム検出法による検量線の作成
(1)試験方法
本試験で採用したリアルタイムワンステップRT-PCR法は、96ウエルを用いて、最大96の異なった反応を同時に実施して、一度に最大96の検体を測定できるものである。また、1チューブ内でRT反応とPCR反応とを行うことができる。
【００４９】
本定量の原理は、隣接した2種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるFRETの現象を利用している。より詳しくはこの原理は次の通り説明できる。即ち、FRETを生じる2種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（TaqMan probe）は、PCRで増幅した特定の薬物代謝の第I相反応に関与する酵素種に由来するcDNAにハイブリダイゼーションし、この状態でPCRの伸長反応が始まる。この反応系に、Taq DNAポリメラーゼを存在させると、該ポリメラーゼの有する5'-3'エンドヌクレアーゼ活性によってTaqManプローブが加水分解されて、これに結合していたリポーター色素が脱離する。該色素の脱離によれば、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、FRETによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加する。この蛍光強度の増加は、PCRの増幅産物の増加量に比例する。該蛍光強度の増加をPCR反応毎に測定すれば、所望の定量が可能となる。
【００５０】
本試験では、プローブの5'末端側にリポーター色素としてFAMを、3'末端側にクエンチャー色素としてTAMRAを結合させたTaqManプローブを使用した。これら各色素の結合およびこれによるTaqManプローブの作成は、文献記載の方法（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）に従った。
【００５１】
また、各プライマーおよびプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてABI社製のDNA/RNA合成機を利用して、基質（dNTP）および規定の試薬を用いて合成した。
【００５２】
検体RNAとしては、成人の脳、成人の腎臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓および成人の肝臓プールよりそれぞれ精製された全RNAを用いた。尚、これらの全RNAはいずれもクローンテック社（Clontech Laboratories, Inc.）より購入した。
【００５３】
成人の脳、成人の腎臓、成人の肺、成人の小腸、胎児の肝臓および成人の肝臓プールより精製された全RNAは、RNaseフリーの水で希釈し、20μg/mLに調整した。その後、これら6種類を等量ずつ混合し、検量線作成用とした。以後は、50μg/mLのイーストtRNA（Yeast tRNA, GIBCO社製）を用いて、5倍公比で希釈した。測定には5μLを使用した。
【００５４】
RT-PCR反応は、300nMフォーワードプライマー、900nMリバースプライマーおよび200nM TaqManプローブを含むキット（TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit, PE Applied Biosystems）を用いて、50μL/チューブの系で、配列検出システム（ABI PRISM^TM 7700 Sequence Detection System, PE Applied Biosystems）にて行った。
【００５５】
温度条件は、48℃で30分間および95℃で10分間で保温した後、95℃で15秒間および60℃で1分間のサイクルを50回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００５６】
下記表2および表3に示す各酵素に対して各配列番号に示される配列のプライマー対およびプローブを用いて行なった上記試験の結果（検量線）を表4および表5に示す。
【００５７】
【表２】

【００５８】
【表３】

【００５９】
【表４】

【００６０】
【表５】

【００６１】
上記表4および5に示す結果より、100000pg全RNA/50μL反応液量から5倍公比で希釈された検量線を作成したところ、EPHX1については、6.4pg全RNA/50μL反応液量まで定量性を有しており、他の酵素についても0.256pgから4000pg全RNAを定量限界とした検量線の相関係数（r）は0.99以上であった。但し、IL17は0.93、ALDH7は0.97であった。
【００６２】
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring an enzyme involved in the phase I reaction of drug metabolism, and a probe and kit therefor.
[0002]
[Prior art]
The drug metabolism reaction in humans roughly comprises phase I (phase I) oxidation, reduction and hydrolysis reactions and phase II (phase II) conjugation reactions. It is known that enzymes belonging to the drug-metabolizing enzymes involved in this drug metabolism reaction account for about 10% of about 1500 known enzymes.
[0003]
In particular, as enzymes involved in the above phase I reaction of drug metabolism, for example, enzymes (family) as shown in Table 1 below and their molecular species are known.
[0004]
[Table 1]

[0005]
In developing a new drug, it is particularly important to understand the action of the enzyme (increase / decrease in the expression level) involved in the phase I reaction of drug metabolism when the new drug is administered. This is because if the fluctuations in the enzymes involved in this phase I reaction are not known, the efficacy and side effects of the concomitant drugs used in combination with the new drug or the effects of the concomitant drugs and the effects of the new drug due to other ingested substances, the increase or decrease of the side effects This is because it cannot be predicted and the safety of the new drug cannot be confirmed.
[0006]
Therefore, in the field of new drug development and the like, there is a demand for the development of measurement technology that can distinguish and measure information relating to the enzyme involved in the phase I reaction of drug metabolism, particularly the enzyme and each of its molecular species. If this technology can be developed, for example, the interaction of the new drug with other drugs and the effects during special pathologies can be easily grasped, and useful information regarding the side effects of the new drug can be obtained, thus ensuring the safety of the new drug. can do.
[0007]
On the other hand, polymerase chain reaction (PCR) is widely known as a nucleic acid amplification method. For example, RT-PCR (Reverse Transcription-PCR), competitive RT-PCR, etc. are very effective in detecting and quantifying small amounts of mRNA. ing.
[0008]
Recently, real-time quantitative detection using PCR has been established (Taq Man PCR (Genome Res., 6 (10), 986 (1996)), ABI PRISM ^TM Sequence Detection System (Applied Biosystems)). This detection method is a method of measuring a nucleic acid using a specific fluorescently labeled probe (TaqMan probe), and the principle is as follows. That is, for example, when a normal PCR reaction is performed with a probe labeled with a reporter dye at the 5 ′ end and a quencher dye added at the 3 ′ end and annealed to the target DNA, the extension reaction proceeds. Thus, the probe is hydrolyzed from the 5 ′ end by the 5′-3 ′ exonuclease activity of the DNA polymerase. As a result, the reporter dye at the 5 'end is separated from the quencher dye at the 3' end, and as a result, a constant spatial distance was initially maintained. The phenomenon of a decrease in the fluorescence intensity due to the decrease in the energy ranking of the reporter) disappears, and the fluorescence intensity of the reporter dye that has been controlled by the quencher dye increases. By measuring the increase in fluorescence intensity, the target nucleic acid can be selectively quantitatively detected in real time.
[0009]
This method has the advantage that complicated steps such as agarose gel electrophoresis of the amplified product after PCR reaction and analysis of the electrophoresis pattern are not required, and various samples can be quantified simultaneously in a short time.
[0010]
In general, when performing a clinical test at a clinical laboratory center or the like, it is necessary to test a very large number of specimens within a limited time, and there is a demand for the development of a method that can perform the test efficiently. The detection method can be expected to meet this demand.
[0011]
The present inventors have focused on the above-described real-time detection method using PCR and have conceived its application to the detection of enzymes involved in the phase I reaction of drug metabolism. That is, by such application, it was considered that a large number of specimens can be simultaneously examined under the same PCR conditions using the same apparatus, and it is possible to distinguish and measure even the molecular species of each enzyme.
[0012]
However, as described above, there are a very large number of enzymes that are currently involved in the phase I reaction of drug metabolism, and although the sequences of the respective mRNAs are known, these are used as target genes. It was thought that it was difficult to search for oligonucleotides as primer pairs that did not have overlapping sequence parts, could be sufficiently amplified under the same PCR conditions, and could hybridize to a specific position of the target gene. .
[0013]
In addition, a specific region sandwiched between such primer pairs can hybridize faster than these primers under the same PCR conditions, and a probe specific for each enzyme involved in the phase I reaction of drug metabolism. Construction was also considered difficult.
[0014]
In particular, the ease of hybridization of two nucleic acids with known nucleotide sequences can be estimated to some extent by calculation of the melting point (Tm), but the combination of the primer and probe selected by this estimation is not necessarily measured by DNA. For real-time detection by PCR, it is possible to distinguish and measure various enzymes involved in the currently known phase I reaction of drug metabolism. It was expected that selection of a combination of each primer pair and probe would require a great deal of experimentation by skilled trial and error.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to establish a method for measuring an enzyme involved in the phase I reaction of drug metabolism by PCR, particularly a real-time detection method, and to provide a probe and primer pair therefor.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
As a result of repeating numerous experiments and researches on various enzymes involved in the phase I reaction of drug metabolism for the above purpose, the present inventor has determined combinations of target primer pairs and probes for 39 kinds of the enzymes. The present invention was successfully completed and the present invention was completed here.
[0017]
The present invention is a probe used for measurement of an enzyme involved in a phase I reaction of drug metabolism, from the group consisting of oligonucleotides that hybridize to any of the following regions (1) to (53) Selected probe; in particular, the probe in which a reporter dye and a quencher dye are bound; the probe having a base sequence length in the range of 20-40; any of the sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 53 And a probe that is any of the sequences set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 53.
(1) 222-248 region of EPHX1 gene
(2) 174-203 region of EPHX2 gene
(3) 767-796 region of PIG3 gene
(4) 50-77 region of NMOR2 gene
(5) 853-881 region of MAOA gene
(6) 1491-1519 region of MAOB gene
(7) 1088-1115 region of PTGS1 gene
(8) 830-855 region of PTGS2 gene
(9) 2345-2370 region of DPYD gene
(10) 3500-3527 region of AOX1 gene
(11) 3504-3533 region of XDH gene
(12) 468-493 region of CEL gene
(13) 976-1005 region of CES1 gene
(14) 328-354 region of CES2 gene
(15) 86-113 region of AADAC gene
(16) 326-353 region of GZMA gene
(17) 276-301 region of GZMB gene
(18) 99-126 region of IL17 gene
(19) 253-282 region of LIPA gene
(20) 3670-3697 region of the NTE gene
(21) 255-280 region of UCHL1 gene
(22) 105-134 region of UCHL3 gene
(23) 728-755 region of FMO1 gene
(24) 727-750 region of FMO2 gene
(25) 1117-1143 region of FMO2 gene
(26) 735-763 region of FMO3 gene
(27) 1326-1351 region of FMO4 gene
(28) 1111-1138 region of FMO5 gene
(29) ALDH1 gene 381-407 region
(30) 1204-1228 region of ALDH2 gene
(31) 461-488 region of ALDH3 gene
(32) 1094-1121 region of the ALDH3 gene
(33) 823-848 region of ALDH4 gene
(34) 1212-1236 region of ALDH5 gene
(35) 1413-1439 region of ALDH6 gene
(36) 790-816 region of ALDH7 gene
(37) 95-122 region of ALDH8 gene
(38) 481-504 region of ALDH9 gene
(39) ALDH10 gene 563-588 region
(40) 168-197 region of ADH1 gene
(41) 298-333 region of ADH1 gene
(42) 144-173 region of ADH2 gene
(43) 438-467 region of the ADH2 gene
(44) 102-131 region of the ADH3 gene
(45) 939-966 region of the ADH3 gene
(46) 927-956 region of ADH4 gene
(47) 322-351 region of ADH5 gene
(48) 616-641 region of the ADH5 gene
(49) 912-939 region of the ADH6 gene
(50) 745-772 region of the ADH7 gene
(51) ESD gene 451-476 region (based on the sequence of Genebank accession number M13450, the same below)
(52) 483-509 region of the HADH2 gene
(53) 610-584 region of HEP27 gene
Further, the present invention provides a phase I reaction of drug metabolism including a combination of a forward primer, a probe and a reverse primer composed of oligonucleotides that hybridize to each region shown in any of the following (1) to (53). A kit for measuring an enzyme involved; in particular, the above-described measurement kit in which a probe is further combined with a reporter dye and a quencher dye.
(1) Forward primer; 200-220 region of EPHX1 gene, probe; 222-248 region and reverse primer of the same gene; 302-281 region of the same gene,
(2) Forward primer; 145-165 region of EPHX2 gene, probe; 174-203 region and reverse primer of the same gene; 237-217 region of the same gene,
(3) Forward primer; 743-763 region of PIG3 gene, probe; 767-796 region and reverse primer of the gene; 858-838 region of the gene;
(4) forward primer; 26-46 region of NMOR2 gene, probe; 50-77 region of the same gene and reverse primer; 101-80 region of the same gene;
(5) Forward primer; 827-849 region of MAOA gene, probe; 853-881 region of the same gene and reverse primer; 919-898 region of the same gene;
(6) Forward primer; 1440-1461 region of MAOB gene, probe; 1491-1519 region of the same gene and reverse primer; 1555-1535 region of the same gene,
(7) Forward primer; 1066-1086 region of PTGS1 gene, probe; 1088-1115 region of the same gene and reverse primer; 1187-1167 region of the same gene;
(8) Forward primer; 792-813 region of PTGS2 gene, probe; 830-855 region and reverse primer of the same gene; 928-908 region of the same gene;
(9) Forward primer; 2321-2341 region of DPYD gene, probe; 2345-2370 region and reverse primer of the gene; 2399-2379 region of the gene,
(10) forward primer; 3464-3484 region of AOX1 gene, probe; 3500-3527 region and reverse primer of the same gene; 3585-3564 region of the same gene,
(11) Forward primer; 3446-3468 region of XDH gene, probe; 3504-3533 region of the same gene and reverse primer; 3562-3540 region of the same gene;
(12) forward primer; 429-451 region of CEL gene, probe; 468-493 region of the same gene and reverse primer; 555-533 region of the same gene;
(13) Forward primer; 935-956 region of CES1 gene, probe; 976-1005 region and reverse primer of the gene; 1061-1041 region of the gene;
(14) Forward primer; 298-319 region of CES2 gene, probe; 328-354 region of the same gene and reverse primer; 383-362 region of the same gene,
(15) forward primer; 63-83 region of AADAC gene, probe; 86-113 region and reverse primer of same gene; 206-185 region of same gene;
(16) Forward primer; 304-324 region of GZMA gene, probe; 326-353 region of the same gene and reverse primer; 433-413 region of the same gene;
(17) Forward primer; 253-274 region of GZMB gene, probe; 276-301 region and reverse primer of same gene; 350-328 region of same gene;
(18) forward primer; 68-88 region of IL17 gene, probe; 99-126 region of the same gene and reverse primer; 163-142 region of the same gene,
(19) Forward primer; 226-248 region of LIPA gene, probe; 253-282 region and reverse primer of same gene; 347-327 region of same gene;
(20) forward primer; 3634-3655 region of the NTE gene, probe; 3670-3697 region of the same gene and reverse primer; 3747-3725 region of the same gene;
(21) forward primer; 233-253 region of UCHL1 gene, probe; 255-280 region and reverse primer of the gene; 306-285 region of the gene;
(22) Forward primer; 76-97 region of UCHL3 gene, probe; 105-134 region and reverse primer of the gene; 164-140 region of the gene;
(23) Forward primer; 696-716 region of FMO1 gene, probe; 728-755 region and reverse primer of same gene; 790-769 region of same gene;
(24) forward primer; 705-725 region of FMO2 gene, probe; 727-750 region and reverse primer of the gene; 826-806 region of the gene;
(25) forward primer; 1077-1097 region of FMO2 gene, probe; 1117-1143 region and reverse primer of the gene; 1165-1145 region of the gene;
(26) Forward primer; 706-726 region of FMO3 gene, probe; 735-763 region of the same gene and reverse primer; 844-823 region of the same gene;
(27) forward primer; 1297-1317 region of FMO4 gene, probe; 1326-1351 region of the same gene and reverse primer; 1422-1401 region of the same gene,
(28) Forward primer; 1063-1084 region of FMO5 gene, probe; 1111-1138 region of the same gene and reverse primer; 1162-1141 region of the same gene;
(29) Forward primer; AL359 gene 359-379 region, probe; 381-407 region of the gene and reverse primer; 494-472 region of the gene,
(30) Forward primer; 1179-1199 region of ALDH2 gene, probe; 1204-1228 region and reverse primer of the gene; 1307-1285 region of the gene;
(31) forward primer; 422-442 region of ALDH3 gene, probe; 461-488 region and reverse primer of the gene; 549-528 region of the gene;
(32) forward primer; 1058-1078 region of ALDH3 gene, probe; 1094-1121 region and reverse primer of the same gene; 1194-1174 region of the same gene,
(33) forward primer; 768-788 region of ALDH4 gene, probe; 823-848 region and reverse primer of the gene; 967-947 region of the gene;
(34) forward primer; 1183-1206 region of ALDH5 gene, probe; 1212-1236 region and reverse primer of the gene; 1261-1241 region of the gene;
(35) Forward primer; 1382-1404 region of ALDH6 gene, probe; 1413-1439 region and reverse primer of the gene; 1466-1445 region of the gene;
(36) Forward primer; ALDH7 gene 743-764 region, probe; 790-816 region and reverse primer of the gene; 878-858 region of the gene;
(37) forward primer; 55-75 region of ALDH8 gene, probe; 95-122 region of the same gene and reverse primer; 182-162 region of the same gene;
(38) forward primer; 459-479 region of ALDH9 gene, probe; 481-504 region and reverse primer of the gene; 534-513 region of the gene;
(39) Forward primer; 525-546 region of ALDH10 gene, probe; 563-588 region and reverse primer of the gene; 644-623 region of the gene;
(40) forward primer; 94-115 region of ADH1 gene, probe; 168-197 region of the same gene and reverse primer; 365-345 region of the same gene;
(41) forward primer; 261-281 region of ADH1 gene, probe; 298-333 region of the same gene and reverse primer; 365-345 region of the same gene;
(42) forward primer; 94-115 region of ADH2 gene, probe; 144-173 region of the same gene and reverse primer; 431-411 region of the same gene,
(43) forward primer; 411-431 region of ADH2 gene, probe; 438-467 region of the same gene and reverse primer; 518-496 region of the same gene;
(44) forward primer; 72-93 region of ADH3 gene, probe; 102-131 region and reverse primer of the gene; 167-144 region of the gene;
(45) Forward primer; 743-763 region of the ADH3 gene, probe; 939-966 region and reverse primer of the gene; 1113-1091 region of the gene;
(46) forward primer; 903-924 region of ADH4 gene, probe; 927-956 region and reverse primer of the gene; 984-964 region of the gene;
(47) forward primer; 289-310 region of the ADH5 gene, probe; 322-351 region and reverse primer of the gene; 495-474 region of the gene;
(48) Forward primer; 564-585 region of ADH5 gene, probe; 616-641 region of the same gene and reverse primer; 676-656 region of the same gene.
(49) Forward primer; 889-910 region of ADH6 gene, probe; 912-939 region and reverse primer of the same gene; 987-967 region of the same gene.
(50) Forward primer; 722-743 region of ADH7 gene, probe; 745-772 region and reverse primer of the same gene; 802-781 region of the same gene.
(51) Forward primer; 427-447 region of ESD gene, probe; 451-476 region and reverse primer of the same gene; 519-497 region of the same gene (based on the sequence of Genebank accession number M13450, the same applies hereinafter).
(52) Forward primer; 451-471 region of HADH2 gene, probe; 483-509 region and reverse primer of the same gene; 539-519 region of the same gene.
(53) Forward primer; 505-526 region of HEP27 gene, probe; 610-584 region of the same gene and reverse primer; 635-615 region of the same gene.
[0018]
Preferred combinations of forward primer, probe, and reverse primer constituting the measurement kit include a combination of oligonucleotides containing sequences represented by the respective sequence numbers described in the following (1) to (53), more preferably each The combination of the oligonucleotide of the sequence shown by sequence number can be mentioned.
(1) forward primer; SEQ ID NO: 54, probe; SEQ ID NO: 1 and reverse primer; SEQ ID NO: 55,
(2) Forward primer; SEQ ID NO: 56, probe; SEQ ID NO: 2 and reverse primer; SEQ ID NO: 57,
(3) forward primer; SEQ ID NO: 58, probe; SEQ ID NO: 3 and reverse primer; SEQ ID NO: 59,
(4) Forward primer; SEQ ID NO: 60, probe; SEQ ID NO: 4 and reverse primer; SEQ ID NO: 61
(5) Forward primer; SEQ ID NO: 62, probe; SEQ ID NO: 5 and reverse primer; SEQ ID NO: 63
(6) forward primer; SEQ ID NO: 64, probe; SEQ ID NO: 6 and reverse primer; SEQ ID NO: 65
(7) forward primer; SEQ ID NO: 66, probe; SEQ ID NO: 7 and reverse primer; SEQ ID NO: 67,
(8) Forward primer; SEQ ID NO: 68, probe; SEQ ID NO: 8 and reverse primer; SEQ ID NO: 69
(9) Forward primer; SEQ ID NO: 70, probe; SEQ ID NO: 9 and reverse primer; SEQ ID NO: 71,
(10) Forward primer; SEQ ID NO: 72, probe; SEQ ID NO: 10 and reverse primer; SEQ ID NO: 73
(11) forward primer; SEQ ID NO: 74, probe; SEQ ID NO: 11 and reverse primer; SEQ ID NO: 75
(12) Forward primer; SEQ ID NO: 76, probe; SEQ ID NO: 12 and reverse primer; SEQ ID NO: 77
(13) Forward primer; SEQ ID NO: 78, probe; SEQ ID NO: 13 and reverse primer; SEQ ID NO: 79,
(14) Forward primer; SEQ ID NO: 80, probe; SEQ ID NO: 14 and reverse primer; SEQ ID NO: 81
(15) forward primer; SEQ ID NO: 82, probe; SEQ ID NO: 15 and reverse primer; SEQ ID NO: 83,
(16) Forward primer; SEQ ID NO: 84, probe; SEQ ID NO: 16 and reverse primer; SEQ ID NO: 85,
(17) Forward primer; SEQ ID NO: 86, probe; SEQ ID NO: 17 and reverse primer; SEQ ID NO: 87,
(18) forward primer; SEQ ID NO: 88, probe; SEQ ID NO: 18 and reverse primer; SEQ ID NO: 89,
(19) Forward primer; SEQ ID NO: 90, probe; SEQ ID NO: 19 and reverse primer; SEQ ID NO: 91
(20) forward primer; SEQ ID NO: 92, probe; SEQ ID NO: 20 and reverse primer; SEQ ID NO: 93
(21) Forward primer; SEQ ID NO: 94, probe; SEQ ID NO: 21 and reverse primer; SEQ ID NO: 95,
(22) forward primer; SEQ ID NO: 96, probe; SEQ ID NO: 22 and reverse primer; SEQ ID NO: 97
(23) forward primer; SEQ ID NO: 98, probe; SEQ ID NO: 23 and reverse primer; SEQ ID NO: 99,
(24) Forward primer; SEQ ID NO: 100, probe; SEQ ID NO: 24 and reverse primer; SEQ ID NO: 101,
(25) forward primer; SEQ ID NO: 102, probe; SEQ ID NO: 25 and reverse primer; SEQ ID NO: 103,
(26) forward primer; SEQ ID NO: 104, probe; SEQ ID NO: 26 and reverse primer; SEQ ID NO: 105,
(27) Forward primer; SEQ ID NO: 106, probe; SEQ ID NO: 27 and reverse primer; SEQ ID NO: 107,
(28) Forward primer; SEQ ID NO: 108, probe; SEQ ID NO: 28 and reverse primer; SEQ ID NO: 109,
(29) forward primer; SEQ ID NO: 110, probe; SEQ ID NO: 29 and reverse primer; SEQ ID NO: 111,
(30) forward primer; SEQ ID NO: 112, probe; SEQ ID NO: 30 and reverse primer; SEQ ID NO: 113,
(31) forward primer; SEQ ID NO: 114, probe; SEQ ID NO: 31 and reverse primer; SEQ ID NO: 115,
(32) forward primer; SEQ ID NO: 116, probe; SEQ ID NO: 32 and reverse primer; SEQ ID NO: 117
(33) forward primer; SEQ ID NO: 118, probe; SEQ ID NO: 33 and reverse primer; SEQ ID NO: 119,
(34) forward primer; SEQ ID NO: 120, probe; SEQ ID NO: 34 and reverse primer; SEQ ID NO: 121,
(35) forward primer; SEQ ID NO: 122, probe; SEQ ID NO: 35 and reverse primer; SEQ ID NO: 123,
(36) forward primer; SEQ ID NO: 124, probe; SEQ ID NO: 36 and reverse primer; SEQ ID NO: 125,
(37) forward primer; SEQ ID NO: 126, probe; SEQ ID NO: 37 and reverse primer; SEQ ID NO: 127,
(38) forward primer; SEQ ID NO: 128, probe; SEQ ID NO: 38 and reverse primer; SEQ ID NO: 129,
(39) Forward primer; SEQ ID NO: 130, probe; SEQ ID NO: 39 and reverse primer; SEQ ID NO: 131,
(40) forward primer; SEQ ID NO: 132, probe; SEQ ID NO: 40 and reverse primer; SEQ ID NO: 133,
(41) forward primer; SEQ ID NO: 134, probe; SEQ ID NO: 41 and reverse primer; SEQ ID NO: 135,
(42) forward primer; SEQ ID NO: 136, probe; SEQ ID NO: 42 and reverse primer; SEQ ID NO: 137,
(43) forward primer; SEQ ID NO: 138, probe; SEQ ID NO: 43 and reverse primer; SEQ ID NO: 139,
(44) forward primer; SEQ ID NO: 140, probe; SEQ ID NO: 44 and reverse primer; SEQ ID NO: 141,
(45) forward primer; SEQ ID NO: 142, probe; SEQ ID NO: 45 and reverse primer; SEQ ID NO: 143,
(46) forward primer; SEQ ID NO: 144, probe; SEQ ID NO: 46 and reverse primer; SEQ ID NO: 145,
(47) Forward primer; SEQ ID NO: 146, probe; SEQ ID NO: 47 and reverse primer; SEQ ID NO: 147,
(48) forward primer; SEQ ID NO: 148, probe; SEQ ID NO: 48 and reverse primer; SEQ ID NO: 149,
(49) forward primer; SEQ ID NO: 150, probe; SEQ ID NO: 49 and reverse primer; SEQ ID NO: 151,
(50) forward primer; SEQ ID NO: 152, probe; SEQ ID NO: 50 and reverse primer; SEQ ID NO: 153,
(51) forward primer; SEQ ID NO: 154, probe; SEQ ID NO: 51 and reverse primer; SEQ ID NO: 155,
(52) Forward primer; SEQ ID NO: 156, probe; SEQ ID NO: 52 and reverse primer; SEQ ID NO: 157,
(53) Forward primer; SEQ ID NO: 158, probe; SEQ ID NO: 53 and reverse primer; SEQ ID NO: 159.
[0019]
Each of the above combinations is for measuring an enzyme involved in the following phase I reaction of drug metabolism.
Combination of (1); for EPHX1 measurement
Combination of (2); for EPHX2 measurement
Combination of (3); for PIG3 measurement
Combination of (4); for NMOR2 measurement
Combination of (5); for MAOA measurement
Combination of (6); for MAOB measurement
Combination of (7); for PTGS1 measurement
Combination of (8); for PTGS2 measurement
Combination of (9); for DPYD measurement
Combination of (10); for AOX1 measurement
Combination of (11); for XDH measurement
Combination of (12); for CEL measurement
Combination of (13); for CES1 measurement
Combination of (14); for CES2 measurement
Combination of (15) for AADAC measurement
Combination of (16); for GZMA measurement
Combination of (17); for GZMB measurement
Combination of (18); for IL17 measurement
Combination of (19); for LIPA measurement
Combination of (20); for NTE measurement
Combination of (21); for UCHL1 measurement
Combination of (22); for UCHL3 measurement
Combination of (23); for FMO1 measurement
Combination of (24); for FMO2 measurement
Combination of (25); for FMO2 measurement
Combination of (26); for FMO3 measurement
Combination of (27); for FMO4 measurement
Combination of (28); for FMO5 measurement
Combination of (29); ALDH1 measurement
Combination of (30); for ALDH2 measurement
Combination of (31); ALDH3 measurement
Combination of (32); ALDH3 measurement
Combination of (33); for ALDH4 measurement
Combination of (34); for ALDH5 measurement
Combination of (35); ALDH6 measurement
Combination of (36); ALDH7 measurement
Combination of (37); ALDH8 measurement
Combination of (38); ALDH9 measurement
Combination of (39); for ALDH10 measurement
Combination of (40); for ADH1 measurement
Combination of (41); for ADH1 measurement
Combination of (42); for ADH2 measurement
Combination of (43); for ADH2 measurement
Combination of (44); for ADH3 measurement
(45) combination; for ADH3 measurement
Combination of (46); for ADH4 measurement
Combination of (47); for ADH5 measurement
Combination of (48); for ADH5 measurement
Combination of (49); for ADH6 measurement
(50) combination; for ADH7 measurement
Combination of (51) for ESD measurement
Combination of (52) for HADH2 measurement
Combination of (53); for HEP27 measurement.
[0020]
The present invention further performs polymerase chain reaction (PCR) on a sample containing an enzyme gene involved in the phase I reaction of drug metabolism using the measurement kit of the present invention described above, A method for measuring an enzyme involved in a phase I reaction of drug metabolism, characterized by measuring the presence or absence of degradation, in particular, the method for measuring the presence or absence of hydrolysis based on the presence or absence of coloration of fluorescence by excitation light irradiation. provide.
[0021]
More preferably, the measurement method preferably comprises a probe paired with a primer pair of a forward primer and a reverse primer, and a probe nucleic acid bound to a reporter dye and a quencher dye and hybridizing with a template nucleic acid in a region sandwiched between the two primers. And is performed by a real-time detection method in which a polymerase chain reaction (PCR) is performed with a DNA polymerase having 5′-3 ′ exonuclease activity.
[0022]
The above-described real-time detection method according to the present invention is capable of fractionating and quantifying various enzymes in real time simply and quickly under the same PCR or RT-PCR reaction conditions, and its establishment is very useful in the clinical field and pharmaceutical field. It is.
[0023]
That is, according to the method, mRNA expression in a human sample of an enzyme involved in a phase I reaction of drug metabolism, which occupies an important position in a kinetic test in drug development, can be easily quantified. It is possible to know the change of each enzyme involved in the phase I reaction when exposed to chemical substances such as pharmaceuticals.
In addition, according to the method, since various samples can be processed quickly and total RNA extracted from a small amount of tissue can be used as a sample, for example, a tissue extracted by surgery or a tissue extracted by biopsy It is suitable as a method for detecting and quantifying the mRNA expression of an enzyme involved in the phase I reaction.
[0024]
Furthermore, for enzymes involved in certain phase I reactions, changes in expression levels due to enzyme induction in the liver, kidneys, etc. can be correlated with changes in blood (cells with nuclei in the blood) However, the amount of expression in this blood is small, and a lot of blood is required for measurement. However, according to the method of the present invention using a specific primer pair and a probe, the expression level in the blood can be easily measured with a small amount of blood sample using an existing measuring instrument.
[0025]
In addition, for enzymes involved in specific phase I reactions, changes in the expression level due to enzyme induction in the liver, kidney, etc. correlate with changes in the value of cells with nuclei contained in secretions such as saliva. However, the expression level in cells having nuclei contained in the secretory fluid such as saliva is also small. In the method of the present invention, the expression level in cells having nuclei contained in the secretory fluid can be easily measured with a small amount of sample using a secretory fluid such as saliva as a sample.
[0026]
Hereinafter, probe and primer pairs used in the method of the present invention will be described in detail.
[0027]
Each of these probes and primers is selected from oligonucleotides that hybridize to specific regions of the genes of enzymes involved in the phase I reaction of drug metabolism, as described above.
[0028]
Here, “hybridize” means to hybridize under the conditions of PCR (RT-PCR) described later.
[0029]
Requirements common to the probes and primers according to the present invention are that the amplification product is about 50-400 base pairs in length, that the primer and the probe are as close as possible, and that G (guanine) contained in the sequence. ) And C (cytosine) are about 50% as much as possible, and four or more G (guanine) are not continuous. Other requirements include that the probe of the present invention has a Tm value of around 70 ° C., and the primer of the present invention has a Tm value of around 60 ° C.
[0030]
The mRNA sequences of the enzymes involved in the phase I reaction of drug metabolism are known and are registered in the gene bank (GenBank) with the following registration numbers.
(1) EPHX1 gene; NM # 000120
(2) EPHX2 gene; NM # 001979
(3) PIG3 gene; NM # 004881
(4) NMOR2 gene; NM # 000904
(5) MAOA gene; NM # 000240
(6) MAOB gene; NM # 000898
(7) PTGS1 gene; M59979
(8) PTGS2 gene; NM # 000963
(9) DPYD gene; NM # 000110
(10) AOX1 gene; NM # 001159
(11) XDH gene; NM # 000379
(12) CEL gene; NM # 001807
(13) CES1 gene; NM # 001266
(14) CES2 gene; NM # 003869
(15) AADAC gene; NM # 001086
(16) GZMA gene; NM # 006144
(17) GZMB gene; NM # 004131
(18) IL17 gene; NM # 002190
(19) LIPA gene; NM # 000235
(20) NTE gene; NM # 006702
(21) UCHL1 gene; NM # 004181
(22) UCHL3 gene; NM # 006002
(23) FMO1 gene; NM # 002021
(24) FMO2 gene; NM # 001460
(25) FMO2 gene; NM # 001460
(26) FMO3 gene; NM # 006894
(27) FMO4 gene; NM # 002022
(28) FMO5 gene; NM # 001461
(29) ALDH1 gene; AF003341
(30) ALDH2 gene; NM # 000690
(31) ALDH3 gene; NM # 000691
(32) ALDH3 gene; NM # 000691
(33) ALDH4 gene; NM # 003748
(34) ALDH5 gene; NM # 000692
(35) ALDH6 gene; NM # 000693
(36) ALDH7 gene; NM # 000694
(37) ALDH8 gene; NM # 000695
(38) ALDH9 gene; NM # 000696
(39) ALDH10 gene; NM # 000382
(40) ADH1 gene; NM # 000667
(41) ADH1 gene; NM # 000667
(42) ADH2 gene; NM # 000668
(43) ADH2 gene; NM # 000668
(44) ADH3 gene; NM # 000669
(45) ADH3 gene; NM # 000669
(46) ADH4 gene; NM # 000670
(47) ADH5 gene; NM # 000671
(48) ADH5 gene; NM # 000671
(49) ADH6 gene; NM # 000672
(50) ADH7 gene; NM # 000673
(51) ESD gene; M13450
(52) HADH2 gene; NM # 004493
(53) HEP27 gene; NM # 005794.
[0031]
In this specification, the display of the specific area | region of each enzyme is according to the arrangement | sequence of the gene registered by each said registration number.
[0032]
The number of nucleotides of the oligonucleotides for each primer and probe according to the present invention should be at least 15, usually 15-50, preferably 20-40. If the number of nucleotides of these primers and probes is too much greater than the above, it will be difficult to hybridize to single-stranded DNA, and conversely if too small, the specificity of hybridization will be reduced.
[0033]
Examples of preferred specific sequences of specific nucleotide sequences of the primer and probe are as described above, and SEQ ID NO: 1-53 (in the case of a probe) and SEQ ID NO: 54-159 (in the case of a primer), depending on each molecular species. Case).
[0034]
For example, it is known that a primer or probe consisting of 20 nucleotides can hybridize even if there are a small number of mismatches with the template strand and function as a PCR primer or a detection probe. Therefore, the primer and probe of the present invention are not limited to those having the above-mentioned specific nucleotide sequence, and include a sequence containing the sequence as a part thereof, or, for example, 2 or less, particularly 1 nucleotide in the sequence. The sequence may be modified by substitution, deletion and / or addition.
[0035]
Each oligonucleotide as the probe and primer of the present invention can be easily synthesized by using an automatic synthesizer such as a DNA synthesizer (Perkin Elmer) according to a conventional method. The oligonucleotide thus obtained can be further purified using a commercially available purification cartridge, if necessary.
[0036]
The probe for real-time detection of the present invention has a reporter dye bound to one end, for example, the 5′-end, and a quencher dye bound to the other end, for example, the 3′-end. The reporter dye is a substance that emits fluorescence when irradiated with excitation light, for example, and the quencher acts on the reporter dye when it is present at a distance close to the reporter dye and has the effect of eliminating the generation of the fluorescence. Can have. Examples of the reporter dye include, for example, 6-carboxy-fluorescein (FAM), tetrachloro-6-carboxyfluorescein (TET), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein. In (JOE), hexochloro-6-carboxyfluorescein (HEX), and the like. Examples of quencher dyes include 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA).
[0037]
The probe of the present invention can be prepared by binding a reporter dye and a quencher dye to the probe oligonucleotide having the specific sequence. For example, on the 5 ′ side of the probe, usually, several methylene chains are used as a linker, and a FAM molecule can be bonded to the terminal phosphate group in the form of a phosphate ester. Further, on the 3 ′ side, a TAMRA molecule can be bound by an amide bond via the structural unit shown below.
[0038]
[Chemical 1]

[0039]
The PCR detection method and real-time detection method using the primer pair and probe of the present invention will be described in detail below.
[0040]
The method of the present invention requires the use of the above-described primer pair and probe of the present invention, and others are known PCR methods (see, for example, Science, 230, 1350 (1985)), RT-PCR (Genome Res., 6 (See (10), 986 (1996)), in particular, according to a real-time detection method (see, for example, TaqMan PCR, ABI PRISM ™ 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996).
[0041]
This method is particularly useful when measuring mRNA as a method for measuring the expression level of each enzyme involved in the phase I reaction of drug metabolism targeted by the present invention. In this case, a biological tissue expressing a specific enzyme is collected, total RNA is extracted according to a conventional method, and then a complementary cDNA is synthesized according to a conventional method. And PCR may be performed. Alternatively, RT-PCR can be directly performed using the primer and probe of the present invention after extraction of total RNA according to a conventional method.
[0042]
The PCR reaction and the RT-PCR reaction can basically follow known methods. Those reaction conditions can also be appropriately determined according to known methods, and are not particularly different from these methods. Specifically, the conditions shown in Examples below can be preferably employed.
[0043]
The detection by the real-time detection method can also be performed basically according to a conventional method, for example, by irradiating the PCR reaction solution with an argon laser beam and detecting the emitted fluorescence using a CCD camera.
[0044]
Thus, by carrying out the method of the present invention, each enzyme involved in the desired phase I reaction of drug metabolism can be measured and detected easily and quickly and separately for each enzyme.
[0045]
The present invention also provides a kit for carrying out the above method. This kit comprises a primer pair of the present invention and a probe. The kit of the present invention can further contain a known nucleic acid that can be used as a control, and a primer pair and a probe for measuring the nucleic acid.
[0046]
According to the method of the present invention, genes of each enzyme involved in the phase I reaction of drug metabolism can be measured and detected separately for each enzyme. In addition, the enzyme can be quantified quickly and accurately. Thus, it is possible to efficiently obtain basic data related to the interaction of the new drug with other drugs and the contraindication of combination.
[0047]
【Example】
Hereinafter, test examples and examples will be given to explain the present invention in more detail.
[0048]
[Test Example 1]
Creating a calibration curve by real-time detection method
(1) Test method
The real-time one-step RT-PCR method used in this study can measure up to 96 specimens at a time using 96 wells and simultaneously performing up to 96 different reactions. Moreover, RT reaction and PCR reaction can be performed in one tube.
[0049]
The principle of this quantification is when two adjacent fluorescent dyes are used and the wavelength region overlaps between the fluorescence wavelength of one dye (reporter dye) and the excitation light wavelength of the other dye (quencher dye). FRET phenomenon that occurs in More specifically, this principle can be explained as follows. That is, a probe (TaqMan probe) in which two fluorescent dyes that generate FRET are bound to both ends hybridizes to cDNA derived from an enzyme species involved in a phase I reaction of a specific drug metabolism amplified by PCR. In this state, the PCR extension reaction begins. When Taq DNA polymerase is present in this reaction system, the TaqMan probe is hydrolyzed by the 5′-3 ′ endonuclease activity of the polymerase, and the reporter dye bound thereto is released. The desorption of the dye causes a physical distance from the quencher dye, and increases the fluorescence intensity of the reporter dye that has been suppressed by FRET. This increase in fluorescence intensity is proportional to the increase in PCR amplification product. If the increase in fluorescence intensity is measured for each PCR reaction, the desired quantification can be achieved.
[0050]
In this test, a TaqMan probe in which FAM was bound as a reporter dye on the 5 ′ end side of the probe and TAMRA was bound as a quencher dye on the 3 ′ end side was used. The binding of each of these dyes and the preparation of the TaqMan probe thereby followed the method described in the literature (Genome Res., 6 (10), 986 (1996)).
[0051]
In addition, each primer and oligonucleotide as a probe were synthesized using a substrate (dNTP) and a specified reagent using an ABI DNA / RNA synthesizer as an automatic synthesizer.
[0052]
As sample RNA, total RNA purified from the adult brain, adult kidney, adult lung, adult small intestine, fetal liver and adult liver pool was used. All of these RNAs were purchased from Clontech Laboratories, Inc.
[0053]
Total RNA purified from adult brain, adult kidney, adult lung, adult small intestine, fetal liver and adult liver pool was diluted with RNase-free water and adjusted to 20 μg / mL. Thereafter, these 6 types were mixed in equal amounts to prepare a calibration curve. Thereafter, dilution was carried out at a 5-fold common ratio using 50 μg / mL yeast tRNA (Yeast tRNA, manufactured by GIBCO). 5 μL was used for the measurement.
[0054]
The RT-PCR reaction was sequenced in a 50 μL / tube system using a kit containing 300 nM forward primer, 900 nM reverse primer and 200 nM TaqMan probe (TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit, PE Applied Biosystems). Detection system (ABI PRISM ^TM 7700 Sequence Detection System, PE Applied Biosystems).
[0055]
The temperature was maintained at 48 ° C. for 30 minutes and 95 ° C. for 10 minutes, followed by 50 cycles of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute, and the fluorescence intensity was measured at each cycle.
[0056]
Tables 4 and 5 show the results (calibration curves) of the above tests conducted using the primer pairs and probes having the sequences shown in the respective SEQ ID NOs for the enzymes shown in Tables 2 and 3 below.
[0057]
[Table 2]

[0058]
[Table 3]

[0059]
[Table 4]

[0060]
[Table 5]

[0061]
Based on the results shown in Tables 4 and 5 above, a calibration curve diluted by a 5-fold common ratio was created from the 100,000 pg total RNA / 50 μL reaction volume, and EPHX1 was quantitative up to a 6.4 pg total RNA / 50 μL reaction volume. For other enzymes, the correlation coefficient (r) of the calibration curve with a quantification limit of 0.256 pg to 4000 pg total RNA was 0.99 or more. However, IL17 was 0.93 and ALDH7 was 0.97.
[0062]
[Sequence Listing]

Claims (6)

A kit for measuring carboxylesterase comprising a combination of a forward primer, a probe and a reverse primer consisting of an oligonucleotide hybridizing to each region shown in any of the following ( 13 ) to ( 14 ) for use in real-time RT-PCR :
(13) a forward primer; a nucleotide having 22 bases that specifically hybridizes to the 935-956 region of the CES1 gene;
A probe; 30 nucleotides specifically hybridizing to the 976-1005 region of the same gene; and a reverse primer; 21 nucleotides specifically hybridizing to the 1061-1041 region of the same gene;
(14) a forward primer; a nucleotide having 22 bases that specifically hybridizes to the 298-319 region of the CES2 gene;
Probe: 27 nucleotides specifically hybridizing to the 328-354 region of the same gene and reverse primer; 22 nucleotides specifically hybridizing to the 383-362 region of the same gene
(However, the above-mentioned oligonucleotide hybridizes when RT-PCR is performed at 48 ° C. for 30 minutes, at 95 ° C. for 10 minutes, followed by one cycle at 95 ° C. for 15 seconds and at 60 ° C. for 1 minute. ). The measurement kit according to claim 1 , wherein the measurement kit is selected from any combination of (13) to (14) of a forward primer, a probe, and a reverse primer composed of an oligonucleotide having the sequence represented by each of the following SEQ ID NOs .
(13) Forward primer; SEQ ID NO: 78, probe; SEQ ID NO: 13 and reverse primer; SEQ ID NO: 79,
(14) Forward primer; SEQ ID NO: 80, probe; SEQ ID NO: 14 and reverse primer; SEQ ID NO: 81. The measurement kit according to claim 1 or 2 , wherein the probe further comprises a reporter dye and a quencher dye. The measurement kit according to any one of claims 1 to 3, wherein the combination (13) is for measuring CES1, and the combination (14) is for measuring CES2. For specimens containing the gene for carboxyl esterase, it performs real-time RT-PCR reactions using the measurement kit according to claim 1, characterized by measuring the presence or absence of hydrolysis of the probe used carboxyl Method for measuring esterase . The measurement method according to claim 5 , wherein the presence or absence of hydrolysis is made by the presence or absence of coloration of fluorescence by excitation light irradiation.