JP2008206443A - METHOD FOR ASSAYING mRNA OF TRANSPORTER IN RAT, AND PROBE AND KIT THEREFOR - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡの測定方法及びそのためのプローブ及びキットに関する。 The present invention relates to a method for measuring mRNA encoding a transporter in rats, and a probe and kit therefor.
新薬を開発する上で、ラットを用いた試験は一般的に行なわれている。 In developing new drugs, studies using rats are generally conducted.
例えば、新薬を開発する上で、該新薬を投与した際のラットにおけるトランスポーターの働き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、ラットにおけるトランスポーターの変動が判らないと、該新薬と併用される併用薬剤の効力や副作用の増減、或いは併用薬剤や他の摂取物による新薬の効力や副作用の起こる機構が予測できず、該新薬の安全性を確認することができないからである。 For example, in developing a new drug, it is important to understand the function of the transporter (increase / decrease in the expression level) in rats when the new drug is administered. This is because if changes in transporters in rats are not known, the efficacy and side effects of the concomitant drugs used in combination with the new drug, or the effects of the new drug due to the concomitant drug and other ingestions and the mechanisms that cause side effects cannot be predicted. This is because the safety of the new drug cannot be confirmed.
そこで、上記新薬開発等の分野においては、かかるラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡに関する情報、特にこれら各ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡを区別して測定できる測定技術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時における影響の機構解明が容易にでき、該新薬の副作用に関する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の安全性を確保することができる。 Therefore, in the fields of the above-mentioned new drug development and the like, there is a demand for the development of measurement techniques capable of distinguishing and measuring information related to mRNAs encoding transporters in such rats, in particular, mRNAs encoding transporters in these rats. If such technology can be developed, for example, it is possible to easily elucidate the mechanism of the interaction of a new drug with other drugs and the effects during special pathological conditions, and to obtain useful information on the side effects of the new drug, thus improving the safety of the new drug. Can be secured.
他方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のｍＲＮＡの検出、定量に威力を発揮している。 On the other hand, polymerase chain reaction (PCR) is widely known as a nucleic acid amplification method. For example, RT-PCR (Reverse Transcription-PCR), competitive RT-PCR, etc. are effective in detecting and quantifying a very small amount of mRNA. ing.
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Taq Man PCR (Genome Res., 6(10), 986 (1996)), ABI PRISMTMSequence Detection System (Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標識プローブ（TaqMan probe）を用いて核酸を測定する方法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、かくして、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。先に上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これをヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の検出に利用することが提案されている（特許文献１）。 Recently, a real-time quantitative detection method using PCR has been established (Taq Man PCR (Genome Res., 6 (10), 986 (1996)), ABI PRISM ™ Sequence Detection System (Applied Biosystems)). This is a method of measuring a nucleic acid using a specific fluorescently labeled probe (TaqMan probe). More specifically, for example, when a normal PCR reaction is performed with a probe labeled with a reporter dye added to the 5 ′ end and a quencher dye added to the 3 ′ end and annealed to the target DNA, the extension reaction proceeds. Accordingly, the probe is hydrolyzed from the 5 ′ end by the 5′-3 ′ exonuclease activity of the DNA polymerase. As a result, the reporter dye at the 5 ′ end is separated from the quencher dye at the 3 ′ end, thereby maintaining a constant spatial distance at the beginning, and the reporter dye by resonance of both fluorescent dyes is FRET (Fluoresence Resonance Energy Transfer). The fluorescence intensity decreases due to the decrease in the energy ranking of the reporter) and the fluorescence intensity of the reporter dye that was controlled by the quencher dye increases. Thus, by measuring the increase in the fluorescence intensity, the target nucleic acid It can be selectively quantitatively detected in real time. According to this method, there is an advantage that complicated steps such as agarose gel electrophoresis of the amplified product after PCR reaction and analysis of the migration pattern are not required, and various samples can be quantified simultaneously in a short time. It has been proposed to pay attention to the above-mentioned real-time detection method by PCR and use it for detection of an enzyme involved in glucuronidation in humans (Patent Document 1).
本発明者らは、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これが、ラットにおけるトランスポーターの蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一のＰＣＲ条件で上記各ｍＲＮＡを区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。 The present inventors paid attention to the above-mentioned real-time detection method by PCR, and if this can be used for detection of mRNA encoding a transporter protein in rats, each of the above mRNAs can be separated simultaneously under the same PCR conditions using the same apparatus. From the idea of being able to measure and detect it separately, we conducted extensive research.
しかしながら、ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡは、それぞれのｍＲＮＡの配列は知られているものの、これらをターゲット遺伝子として、同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられた。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下にこれらのプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかもラットにおける特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られていることより、現在知られているラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡについて、これらを同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験等が必要となると予想された。
本発明の目的は、ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡのＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプローブ及びプライマー対を提供することにある。 An object of the present invention is to establish a method for measuring mRNA encoding a transporter in rats by PCR, particularly a real-time detection method, and to provide a probe and primer pair therefor.
本発明者らは、上記目的よりラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡについて、更に、多大な実験、研究を繰返し行った結果、５１種類の各ラットにおけるトランスポーターの蛋白質をコードするｍＲＮＡに対する目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供することに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに至った。 As a result of repeated repeated experiments and researches on the mRNA encoding the transporter in the rat for the above purpose, the present inventors have found that the target primer for the mRNA encoding the transporter protein in each of 51 types of rats. The present inventors have succeeded in providing a combination of a pair and a probe, and have completed the present invention described below.
本発明によれば、ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(51)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ；特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合している前記プローブ；塩基配列の長さが２０〜４５である前記プローブ；配列番号１〜配列番号５１に示される配列のいずれかを含む前記プローブ；並びに配列番号１〜配列番号５１に示される配列のいずれかである前記プローブが提供される。
(1)Abca1遺伝子の3844-3876の領域
(2)Abcg1遺伝子の1910-1935の領域
(3)Abcg2遺伝子の249-278の領域
(4)Abcg5遺伝子の1546-1575の領域
(5)Abcg8遺伝子の1766-1790の領域
(6)Abca4遺伝子の3562-3587の領域
(7)Abca7遺伝子の4727-4758の領域
(8)Abcc4遺伝子の2353-2383の領域
(9)Abcc8遺伝子の2526-2556の領域
(10)Abcc9遺伝子の1478-1512の領域
(11)Abcc10遺伝子の1591-1618の領域
(12)Abcc12遺伝子の3249-3276の領域
(13)Abcd2遺伝子の436-466の領域
(14)Abcd3遺伝子の1851-1883の領域
(15)Abcg4遺伝子の1358-1387の領域
(16)SLC1A1遺伝子の332-363の領域
(17)SLC1A2遺伝子の1193-1218の領域
(18)SLC1A3遺伝子の851-877の領域
(19)SLC1A4遺伝子の558-586の領域
(20)SLC1A6遺伝子の1443-1468の領域
(21)SLC3A1遺伝子の76-104の領域
(22)SLC3A2遺伝子の1317-1344の領域
(23)SLC6A5遺伝子の1786-1812の領域
(24)SLC6A6遺伝子の664-694の領域
(25)SLC6A7遺伝子の1256-1281の領域
(26)SLC6A9遺伝子の725-750の領域
(27)SLC7A1遺伝子の1275-1303の領域
(28)SLC7A2遺伝子の800-825の領域
(29)SLC7A5遺伝子の1286-1311の領域
(30)SLC7A7遺伝子の270-295の領域
(31)SLC7A8遺伝子の973-1001の領域
(32)SLC7A9遺伝子の964-989の領域
(33)SLC7A10遺伝子の623-646の領域
(34)SLC10A1遺伝子の103-129の領域
(35)SLC10A2遺伝子の411-434の領域
(36)SLC15A1遺伝子の1898-1924の領域
(37)SLC15A2遺伝子の498-523の領域
(38)SLC15A3遺伝子の1611-1642の領域
(39)SLC15A4遺伝子の545-572の領域
(40)SLC16A1遺伝子の1052-1079の領域
(41)SLC16A2遺伝子の1287-1314の領域
(42)SLC16A3遺伝子の1012-1037の領域
(43)SLC16A4遺伝子の1153-1179の領域
(44)SLC22A4遺伝子の857-885の領域
(45)SLC22A5遺伝子の846-875の領域
(46)SLC22A8遺伝子の533-556の領域
(47)SLC36A1遺伝子の949-975の領域
(48)SLC38A1遺伝子の582-608の領域
(49)SLC38A2遺伝子の1302-1326の領域
(50)SLC38A3遺伝子の544-569の領域
(51)SLC38A4遺伝子の1378-1404の領域
According to the present invention, a probe used for measurement of mRNA encoding a transporter in a rat, wherein the probe is selected from oligonucleotides that hybridize to each of the following regions (1) to (51): A probe to which the reporter dye and the quencher dye are bound; the probe having a base sequence length of 20 to 45; and any one of the sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 51 Probes are provided as well as any of the sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 51.
(1) 3844-3876 region of Abca1 gene
(2) 1910-1935 region of Abcg1 gene
(3) 249-278 region of the Abcg2 gene
(4) 1546-1575 region of the Abcg5 gene
(5) 1766-1790 region of the Abcg8 gene
(6) Region 3562-3587 of Abca4 gene
(7) 4727-4758 region of Abca7 gene
(8) 2353-2383 region of Abcc4 gene
(9) Region 256-2556 of Abcc8 gene
(10) 1478-1512 region of Abcc9 gene
(11) 1591-1618 region of Abcc10 gene
(12) 3249-3276 region of Abcc12 gene
(13) Region 436-466 of the Abcd2 gene
(14) 1851-1883 region of the Abcd3 gene
(15) 1358-1387 region of the Abcg4 gene
(16) 332-363 region of SLC1A1 gene
(17) 1193-1218 region of SLC1A2 gene
(18) 851-877 region of SLC1A3 gene
(19) Region 558-586 of the SLC1A4 gene
(20) 1443-1468 region of SLC1A6 gene
(21) 76-104 region of SLC3A1 gene
(22) 1317-1344 region of SLC3A2 gene
(23) 1786-1812 region of SLC6A5 gene
(24) 664-694 region of SLC6A6 gene
(25) 1256-1281 region of the SLC6A7 gene
(26) 725-750 region of SLC6A9 gene
(27) 1275-1303 region of the SLC7A1 gene
(28) 800-825 region of SLC7A2 gene
(29) Region 1286-1311 of SLC7A5 gene
(30) 270-295 region of SLC7A7 gene
(31) 973-1001 region of the SLC7A8 gene
(32) 964-989 region of SLC7A9 gene
(33) 623-646 region of SLC7A10 gene
(34) 103-129 region of SLC10A1 gene
(35) 411-434 region of SLC10A2 gene
(36) 1898-1924 region of SLC15A1 gene
(37) 498-523 region of SLC15A2 gene
(38) 1611-1642 region of the SLC15A3 gene
(39) 545-572 region of SLC15A4 gene
(40) Region 1052-1079 of the SLC16A1 gene
(41) 1287-1314 region of the SLC16A2 gene
(42) 1012-1037 region of the SLC16A3 gene
(43) 1153-1179 region of the SLC16A4 gene
(44) 857-885 region of the SLC22A4 gene
(45) 846-875 region of the SLC22A5 gene
(46) 533-556 region of SLC22A8 gene
(47) 949-975 region of SLC36A1 gene
(48) 582-608 region of SLC38A1 gene
(49) 1302-1326 region of SLC38A2 gene
(50) 544-569 region of the SLC38A3 gene
(51) 1378-1404 region of the SLC38A4 gene
また、本発明によれば、ラットにおけるトランスポーターをコードする遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡの検出および定量キットであって、上記両プライマー対およびプローブが下記(1)〜(51)に示される遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであるキットが提供される。
(1)プライマー対；Abca1遺伝子の3823-3841領域及び3904-3886領域、プローブ；3844-3876領域
(2)プライマー対；Abcg1遺伝子の1884-1904領域及び1993-1973領域、プローブ；1910-1935領域
(3)プライマー対；Abcg2遺伝子の224-244領域及び356-337領域、プローブ；249-278領域
(4)プライマー対；Abcg5遺伝子の1524-1544領域及び1642-1623領域、プローブ；1546-1575領域
(5)プライマー対；Abcg8遺伝子の1743-1764領域及び1819-1799領域、プローブ；1766-1790領域
(6)プライマー対；Abca4遺伝子の3539-3559領域及び3611-3591領域、プローブ；3562-3587領域
(7)プライマー対；Abca7遺伝子の4707-4725領域及び4855-4832領域、プローブ；4727-4758領域
(8)プライマー対；Abcc4遺伝子の2329-2349領域及び2411-2391領域、プローブ；2353-2383領域
(9)プライマー対；Abcc8遺伝子の2502-2521領域及び2576-2557領域、プローブ；2526-2556領域
(10)プライマー対；Abcc9遺伝子の1446-1466領域及び1549-1529領域、プローブ；1478-1512領域
(11)プライマー対；Abcc10遺伝子の1558-1578領域及び1701-1682領域、プローブ；1591-1618領域
(12)プライマー対；Abcc12遺伝子の3228-3247領域及び3311-3290領域、プローブ；3249-3276領域
(13)プライマー対；Abcd2遺伝子の413-434領域及び495-475領域、プローブ；436-466領域
(14)プライマー対；Abcd3遺伝子の1827-1847領域及び1932-1914領域、プローブ；1851-1883領域
(15)プライマー対；Abcg4遺伝子の1333-1353領域及び1468-1448領域、プローブ；1358-1387領域
(16)プライマー対；SLC1A1遺伝子の302-322領域及び438-418領域、プローブ；332-363領域
(17)プライマー対；SLC1A2遺伝子の1168-1187x領域及び1242-1222領域、プローブ；1193-1218領域
(18)プライマー対；SLC1A3遺伝子の829-849領域及び927-904領域、プローブ；851-877領域
(19)プライマー対；SLC1A4遺伝子の538-556領域及び610-590領域、プローブ；558-586領域
(20)プライマー対；SLC1A6遺伝子の1421-1441領域及び1538-1520領域、プローブ；1443-1468領域
(21)プライマー対；SLC3A1遺伝子の55-74領域及び138-118領域、プローブ；76-104領域
(22)プライマー対；SLC3A2遺伝子の1294-1314領域及び1369-1351領域、プローブ；1317-1344領域
(23)プライマー対；SLC6A5遺伝子の1764-1783領域及び1882-1862領域、プローブ；1786-1812領域
(24)プライマー対；SLC6A6遺伝子の639-659領域及び776-758領域、プローブ；664-694領域
(25)プライマー対；SLC6A7遺伝子の1230-1253領域及び1309-1286領域、プローブ；1256-1281領域
(26)プライマー対；SLC6A9遺伝子の700-721領域及び779-758領域、プローブ；725-750領域
(27)プライマー対；SLC7A1遺伝子の1254-1273領域及び1357-1334領域、プローブ；1275-1303領域
(28)プライマー対；SLC7A2遺伝子の778-797領域及び859-839領域、プローブ；800-825領域
(29)プライマー対；SLC7A5遺伝子の1257-1277領域及び1334-1314領域、プローブ；1286-1311領域
(30)プライマー対；SLC7A7遺伝子の247-266領域及び335-315領域、プローブ；270-295領域
(31)プライマー対；SLC7A8遺伝子の952-970領域及び1077-1057領域、プローブ；973-1001領域
(32)プライマー対；SLC7A9遺伝子の937-955領域及び1018-998領域、プローブ；964-989領域
(33)プライマー対；SLC7A10遺伝子の601-621領域及び696-676領域、プローブ；623-646領域
(34)プライマー対；SLC10A1遺伝子の77-97領域及び149-130領域、プローブ；103-129領域
(35)プライマー対；SLC10A2遺伝子の388-408領域及び471-452領域、プローブ；411-434領域
(36)プライマー対；SLC15A1遺伝子の1877-1896領域及び1998-1978領域、プローブ；1898-1924領域
(37)プライマー対；SLC15A2遺伝子の475-495領域及び611-592領域、プローブ；498-523領域
(38)プライマー対；SLC15A3遺伝子の1586-1606領域及び1693-1673領域、プローブ；1611-1642領域
(39)プライマー対；SLC15A4遺伝子の518-537領域及び620-600領域、プローブ；545-572領域
(40)プライマー対；SLC16A1遺伝子の1030-1050領域及び1103-1084領域、プローブ；1052-1079領域
(41)プライマー対；SLC16A2遺伝子の1258-1278領域及び1335-1316領域、プローブ；1287-1314領域
(42)プライマー対；SLC16A3遺伝子の986-1006領域及び1073-1053領域、プローブ；1012-1037領域
(43)プライマー対；SLC16A4遺伝子の1126-1150領域及び1204-1182領域、プローブ；1153-1179領域
(44)プライマー対；SLC22A4遺伝子の827-847領域及び908-889領域、プローブ；857-885領域
(45)プライマー対；SLC22A5遺伝子の818-838領域及び928-910領域、プローブ；846-875領域
(46)プライマー対；SLC22A8遺伝子の511-531領域及び580-562領域、プローブ；533-556領域
(47)プライマー対；SLC36A1遺伝子の927-947領域及び1004-984領域、プローブ；949-975領域
(48)プライマー対；SLC38A1遺伝子の559-578領域及び630-610領域、プローブ；582-608領域
(49)プライマー対；SLC38A2遺伝子の1280-1300領域及び1415-1395領域、プローブ；1302-1326領域
(50)プライマー対；SLC38A3遺伝子の522-541領域及び592-572領域、プローブ；544-569領域
(51)プライマー対；SLC38A4遺伝子の1358-1376領域及び1500-1480領域、プローブ；1378-1404領域
In addition, according to the present invention, a trans in a rat comprising at least one of a primer pair of a forward primer and a reverse primer each consisting of an oligonucleotide that hybridizes to each region of a gene encoding a transporter in the rat and a probe set There is provided a kit for detecting and quantifying mRNA encoding a porter, wherein both the primer pairs and the probe are oligonucleotides capable of hybridizing to the respective regions of the genes shown in (1) to (51) below. The
(1) Primer pair; 3823-3841 region and 3904-3886 region of Abca1 gene, probe; 3844-3876 region
(2) Primer pair; 1884-1904 region and 1993-1973 region of Abcg1 gene, probe; 1910-1935 region
(3) Primer pair; 224-244 region and 356-337 region of Abcg2 gene, probe; 249-278 region
(4) Primer pair; 1524-1544 region and 1642-1623 region of Abcg5 gene, probe; 1546-1575 region
(5) Primer pair; 1743-1764 region and 189-1799 region of Abcg8 gene, probe; 1766-1790 region
(6) Primer pair; 3539-3559 region and 3611-3591 region of Abca4 gene, probe; 3562-3587 region
(7) Primer pair; 4707-4725 region and 4855-4832 region of Abca7 gene, probe; 4727-4758 region
(8) Primer pair; 2329-2349 region and 241-21-2391 region of Abcc4 gene, probe; 2353-2383 region
(9) Primer pair; 2502-2521 region and 2576-2557 region of Abcc8 gene, probe; 2526-2556 region
(10) Primer pair; 1446-1466 region and 1549-1529 region of Abcc9 gene, probe; 1478-1512 region
(11) Primer pair; 1558-1578 region and 1701-1682 region of Abcc10 gene, probe; 1591-1618 region
(12) Primer pair; 3228-3247 region and 3311-3290 region of Abcc12 gene, probe; 3249-3276 region
(13) Primer pair; 413-434 region and 495-475 region of Abcd2 gene, probe; 436-466 region
(14) Primer pair; 182-1847 region and 1932-1914 region of Abcd3 gene, probe; 1851-1883 region
(15) Primer pair; 1333-1353 region and 1468-1448 region of Abcg4 gene, probe; 1358-1387 region
(16) Primer pair; 302-322 region and 438-418 region of SLC1A1 gene, probe; 332-363 region
(17) Primer pair; 1168-1187x region and 1242-1222 region of SLC1A2 gene, probe; 1193-1218 region
(18) Primer pair; 829-849 region and 927-904 region of SLC1A3 gene, probe; 851-877 region
(19) Primer pair; 538-556 region and 610-590 region of SLC1A4 gene, probe; 558-586 region
(20) Primer pair; 1421-1441 region and 1538-1520 region of SLC1A6 gene, probe; 1443-1468 region
(21) Primer pair; 55-74 region and 138-118 region of SLC3A1 gene, probe; 76-104 region
(22) Primer pair; 1294-1314 region and 1369-1351 region of SLC3A2 gene, probe; 1317-1344 region
(23) Primer pair; 1764-1783 region and 1882-1862 region of SLC6A5 gene, probe; 1786-1812 region
(24) Primer pair; 639-659 region and 776-758 region of SLC6A6 gene, probe; 664-694 region
(25) Primer pair; 1230-1253 region and 1309-1286 region of SLC6A7 gene, probe; 1256-1281 region
(26) Primer pair; 700-721 region and 779-758 region of SLC6A9 gene, probe; 725-750 region
(27) Primer pair; 1254-1273 region and 1357-1334 region of SLC7A1 gene, probe; 1275-1303 region
(28) Primer pair; 778-797 region and 859-839 region of SLC7A2 gene, probe; 800-825 region
(29) Primer pair; 1257-1277 region and 1334-1314 region of SLC7A5 gene, probe; 1286-1311 region
(30) Primer pair; 247-266 region and 335-315 region of SLC7A7 gene, probe; 270-295 region
(31) Primer pair; 952-970 region and 1077-1057 region of SLC7A8 gene, probe; 973-1001 region
(32) Primer pair; 937-955 region and 1018-998 region of SLC7A9 gene, probe; 964-989 region
(33) Primer pair; 601-621 region and 696-676 region of SLC7A10 gene, probe; 623-646 region
(34) Primer pair; 77-97 region and 149-130 region of SLC10A1 gene, probe; 103-129 region
(35) Primer pair; 388-408 region and 471-452 region of SLC10A2 gene, probe; 411-434 region
(36) Primer pair; 1877-1896 region and 1998-1978 region of SLC15A1 gene, probe; 1898-1924 region
(37) Primer pair; 475-495 region and 611-592 region of SLC15A2 gene, probe; 498-523 region
(38) Primer pair; 1586-1606 region and 1693-1673 region of SLC15A3 gene, probe; 1611-1642 region
(39) Primer pair; 518-537 region and 620-600 region of SLC15A4 gene, probe; 545-572 region
(40) Primer pair; 1030-1050 region and 1103-1084 region of SLC16A1 gene, probe; 1052-1079 region
(41) Primer pair; 1258-1278 region and 1335-1316 region of the SLC16A2 gene, probe; 1287-1314 region
(42) Primer pair; 986-1006 region and 1073-1053 region of SLC16A3 gene, probe; 1012-1037 region
(43) Primer pair; 1126-1150 region and 1204-1182 region of SLC16A4 gene, probe; 1153-1179 region
(44) Primer pair; 827-847 region and 908-889 region of SLC22A4 gene, probe; 857-885 region
(45) Primer pair; 818-838 region and 928-910 region of SLC22A5 gene, probe; 846-875 region
(46) Primer pair; 511-531 region and 580-562 region of SLC22A8 gene, probe; 533-556 region
(47) Primer pair; 927-947 region and 1004-984 region of SLC36A1 gene, probe; 949-975 region
(48) Primer pair; 559-578 region and 630-610 region of the SLC38A1 gene, probe; 582-608 region
(49) Primer pair; 1280-1300 region and 1415-1395 region of the SLC38A2 gene, probe; 1302-1326 region
(50) Primer pair; 522-541 region and 592-572 region of SLC38A3 gene, probe; 544-569 region
(51) Primer pair; 1358-1376 region and 1500-1480 region of the SLC38A4 gene, probe; 1378-1404 region
上記キットにおけるプローブは、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものであることが好ましい。
上記キットを構成するプライマー対とプローブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下記(1)〜(51)から選ばれる各配列番号で示される配列を含むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列を有するものを挙げることができる。
(1)プライマー対；配列番号５２及び５３、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号５４及び５５、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号５６及び５７、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号５８及び５９、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号６０及び６１、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号６２及び６３、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号６４及び６５、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号６６及び６７、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号６８及び６９、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号７０及び７１、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号７２及び７３、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号７４及び７５、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号７６及び７７、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号７８及び７９、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号８０及び８１、プローブ；配列番号１５
(16)プライマー対；配列番号８２及び８３、プローブ；配列番号１６
(17)プライマー対；配列番号８４及び８５、プローブ；配列番号１７
(18)プライマー対；配列番号８６及び８７、プローブ；配列番号１８
(19)プライマー対；配列番号８８及び８９、プローブ；配列番号１９
(20)プライマー対；配列番号９０及び９１、プローブ；配列番号２０
(21)プライマー対；配列番号９２及び９３、プローブ；配列番号２１
(22)プライマー対；配列番号９４及び９５、プローブ；配列番号２２
(23)プライマー対；配列番号９６及び９７、プローブ；配列番号２３
(24)プライマー対；配列番号９８及び９９、プローブ；配列番号２４
(25)プライマー対；配列番号１００及び１０１、プローブ；配列番号２５
(26)プライマー対；配列番号１０２及び１０３、プローブ；配列番号２６
(27)プライマー対；配列番号１０４及び１０５、プローブ；配列番号２７
(28)プライマー対；配列番号１０６及び１０７、プローブ；配列番号２８
(29)プライマー対；配列番号１０８及び１０９、プローブ；配列番号２９
(30)プライマー対；配列番号１１０及び１１１、プローブ；配列番号３０
(31)プライマー対；配列番号１１２及び１１３、プローブ；配列番号３１
(32)プライマー対；配列番号１１４及び１１５、プローブ；配列番号３２
(33)プライマー対；配列番号１１６及び１１７、プローブ；配列番号３３
(34)プライマー対；配列番号１１８及び１１９、プローブ；配列番号３４
(35)プライマー対；配列番号１２０及び１２１、プローブ；配列番号３５
(36)プライマー対；配列番号１２２及び１２３、プローブ；配列番号３６
(37)プライマー対；配列番号１２４及び１２５、プローブ；配列番号３７
(38)プライマー対；配列番号１２６及び１２７、プローブ；配列番号３８
(39)プライマー対；配列番号１２８及び１２９、プローブ；配列番号３９
(40)プライマー対；配列番号１３０及び１３１、プローブ；配列番号４０
(41)プライマー対；配列番号１３２及び１３３、プローブ；配列番号４１
(42)プライマー対；配列番号１３４及び１３５、プローブ；配列番号４２
(43)プライマー対；配列番号１３６及び１３７、プローブ；配列番号４３
(44)プライマー対；配列番号１３８及び１３９、プローブ；配列番号４４
(45)プライマー対；配列番号１４０及び１４１、プローブ；配列番号４５
(46)プライマー対；配列番号１４２及び１４３、プローブ；配列番号４６
(47)プライマー対；配列番号１４４及び１４５、プローブ；配列番号４７
(48)プライマー対；配列番号１４６及び１４７、プローブ；配列番号４８
(49)プライマー対；配列番号１４８及び１４９、プローブ；配列番号４９
(50)プライマー対；配列番号１５０及び１５１、プローブ；配列番号５０
(51)プライマー対；配列番号１５２及び１５３、プローブ；配列番号５１
The probe in the kit is preferably one in which a reporter dye and a quencher dye are further bound.
As a preferable combination (set) of a primer pair and a probe constituting the kit, those including a sequence represented by each SEQ ID NO selected from the following (1) to (51), more preferably each SEQ ID NO: Mention may be made of those having the sequence shown.
(1) Primer pair; SEQ ID NOs: 52 and 53, probe; SEQ ID NO: 1
(2) Primer pair; SEQ ID NOs: 54 and 55, probe; SEQ ID NO: 2
(3) Primer pair; SEQ ID NOs: 56 and 57, probe; SEQ ID NO: 3
(4) Primer pair; SEQ ID NOs: 58 and 59, probe; SEQ ID NO: 4
(5) Primer pair; SEQ ID NOs: 60 and 61, probe; SEQ ID NO: 5
(6) Primer pair; SEQ ID NOs: 62 and 63, probe; SEQ ID NO: 6
(7) Primer pair; SEQ ID NOs: 64 and 65, probe; SEQ ID NO: 7
(8) Primer pair; SEQ ID NOs: 66 and 67, probe; SEQ ID NO: 8
(9) Primer pair; SEQ ID NO: 68 and 69, probe; SEQ ID NO: 9
(10) Primer pair; SEQ ID NOs: 70 and 71, probe; SEQ ID NO: 10
(11) Primer pair; SEQ ID NOs: 72 and 73, probe; SEQ ID NO: 11
(12) Primer pair; SEQ ID NOs: 74 and 75, probe; SEQ ID NO: 12
(13) Primer pair; SEQ ID NOs: 76 and 77, probe; SEQ ID NO: 13
(14) Primer pair; SEQ ID NOs: 78 and 79, probe; SEQ ID NO: 14
(15) Primer pair; SEQ ID NOs: 80 and 81, probe; SEQ ID NO: 15
(16) Primer pair; SEQ ID NOs: 82 and 83, probe; SEQ ID NO: 16
(17) Primer pair; SEQ ID NO: 84 and 85, probe; SEQ ID NO: 17
(18) Primer pair; SEQ ID NO: 86 and 87, probe; SEQ ID NO: 18
(19) Primer pair; SEQ ID NO: 88 and 89, probe; SEQ ID NO: 19
(20) Primer pair; SEQ ID NOs: 90 and 91, probe; SEQ ID NO: 20
(21) Primer pair; SEQ ID NOs: 92 and 93, probe; SEQ ID NO: 21
(22) Primer pair; SEQ ID NOs: 94 and 95, probe; SEQ ID NO: 22
(23) Primer pair; SEQ ID NO: 96 and 97, probe; SEQ ID NO: 23
(24) Primer pair; SEQ ID NOs: 98 and 99, probe; SEQ ID NO: 24
(25) Primer pair; SEQ ID NOs: 100 and 101, probe; SEQ ID NO: 25
(26) Primer pair; SEQ ID NOs: 102 and 103, probe; SEQ ID NO: 26
(27) Primer pair; SEQ ID NOs: 104 and 105, probe; SEQ ID NO: 27
(28) Primer pair; SEQ ID NOs: 106 and 107, probe; SEQ ID NO: 28
(29) Primer pair; SEQ ID NOs: 108 and 109, probe; SEQ ID NO: 29
(30) Primer pair; SEQ ID NOs: 110 and 111, probe; SEQ ID NO: 30
(31) Primer pair; SEQ ID NOs: 112 and 113, probe; SEQ ID NO: 31
(32) Primer pair; SEQ ID NOs: 114 and 115, probe; SEQ ID NO: 32
(33) Primer pair; SEQ ID NOs: 116 and 117, probe; SEQ ID NO: 33
(34) Primer pair; SEQ ID NOs: 118 and 119, probe; SEQ ID NO: 34
(35) Primer pair; SEQ ID NOs: 120 and 121, probe; SEQ ID NO: 35
(36) Primer pair; SEQ ID NOS: 122 and 123, probe; SEQ ID NO: 36
(37) Primer pair; SEQ ID NOs: 124 and 125, probe; SEQ ID NO: 37
(38) Primer pair; SEQ ID NOs: 126 and 127, probe; SEQ ID NO: 38
(39) Primer pair; SEQ ID NOs: 128 and 129, probe; SEQ ID NO: 39
(40) Primer pair; SEQ ID NOs: 130 and 131, probe; SEQ ID NO: 40
(41) Primer pair; SEQ ID NOs: 132 and 133, probe; SEQ ID NO: 41
(42) Primer pair; SEQ ID NOs: 134 and 135, probe; SEQ ID NO: 42
(43) Primer pair; SEQ ID NOs: 136 and 137, probe; SEQ ID NO: 43
(44) Primer pair; SEQ ID NOs: 138 and 139, probe; SEQ ID NO: 44
(45) Primer pair; SEQ ID NOs: 140 and 141, probe; SEQ ID NO: 45
(46) Primer pair; SEQ ID NOs: 142 and 143, probe; SEQ ID NO: 46
(47) Primer pair; SEQ ID NOs: 144 and 145, probe; SEQ ID NO: 47
(48) Primer pair; SEQ ID NOs: 146 and 147, probe; SEQ ID NO: 48
(49) Primer pair; SEQ ID NOS: 148 and 149, probe; SEQ ID NO: 49
(50) Primer pair; SEQ ID NOs: 150 and 151, probe; SEQ ID NO: 50
(51) Primer pair; SEQ ID NOs: 152 and 153, probe; SEQ ID NO: 51
また、上記各セットはそれぞれ以下のラットにおけるトランスポーターの蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定用であることが好ましい。
(1)のセット；Abca1測定用
(2)のセット；Abcg1測定用
(3)のセット；Abcg2測定用
(4)のセット；Abcg5測定用
(5)のセット；Abcg8測定用
(6)のセット；Abca4測定用
(7)のセット；Abca7測定用
(8)のセット；Abcc4測定用
(9)のセット；Abcc8測定用
(10)のセット；Abcc9測定用
(11)のセット；Abcc10測定用
(12)のセット；Abcc12測定用
(13)のセット；Abcd2測定用
(14)のセット；Abcd3測定用
(15)のセット；Abcg4測定用
(16)のセット；SLC1A1測定用
(17)のセット；SLC1A2測定用
(18)のセット；SLC1A3測定用
(19)のセット；SLC1A4測定用
(20)のセット；SLC1A6測定用
(21)のセット；SLC3A1測定用
(22)のセット；SLC3A2測定用
(23)のセット；SLC6A5測定用
(24)のセット；SLC6A6測定用
(25)のセット；SLC6A7測定用
(26)のセット；SLC6A9測定用
(27)のセット；SLC7A1測定用
(28)のセット；SLC7A2測定用
(29)のセット；SLC7A5測定用
(30)のセット；SLC7A7測定用
(31)のセット；SLC7A8測定用
(32)のセット；SLC7A9測定用
(33)のセット；SLC7A10測定用
(34)のセット；SLC10A1測定用
(35)のセット；SLC10A2測定用
(36)のセット；SLC15A1測定用
(37)のセット；SLC15A2測定用
(38)のセット；SLC15A3測定用
(39)のセット；SLC15A4測定用
(40)のセット；SLC16A1測定用
(41)のセット；SLC16A2測定用
(42)のセット；SLC16A3測定用
(43)のセット；SLC16A4測定用
(44)のセット；SLC22A4測定用
(45)のセット；SLC22A5測定用
(46)のセット；SLC22A8測定用
(47)のセット；SLC36A1測定用
(48)のセット；SLC38A1測定用
(49)のセット；SLC38A2測定用
(50)のセット；SLC38A3測定用
(51)のセット；SLC38A4測定用
さらに、本発明によれば、ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡを含む検体について、上記いずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするラットにおけるトランスポーターの蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定方法、特に上記加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無により測定される上記測定方法が提供される。
Each of the above sets is preferably used for measurement of mRNA encoding the transporter protein in the following rats.
Set of (1); for Abca1 measurement
Set (2); for Abcg1 measurement
Set (3) for Abcg2 measurement
Set of (4); for Abcg5 measurement
Set (5); for Abcg8 measurement
Set of (6); Abca4 measurement
Set of (7); for Abca7 measurement
(8) set; for Abcc4 measurement
Set (9); for Abcc8 measurement
(10) set; for Abcc9 measurement
(11) set; for Abcc10 measurement
(12) set; for Abcc12 measurement
(13) set; for Abcd2 measurement
(14) set; for Abcd3 measurement
(15) set; for Abcg4 measurement
Set (16); for SLC1A1 measurement
(17) set; for SLC1A2 measurement
(18) set; for SLC1A3 measurement
Set (19); for SLC1A4 measurement
(20) set; for SLC1A6 measurement
Set (21); for SLC3A1 measurement
Set (22); for SLC3A2 measurement
Set of (23); for SLC6A5 measurement
(24) set; for SLC6A6 measurement
(25) set; for SLC6A7 measurement
Set of (26); for SLC6A9 measurement
Set (27); for SLC7A1 measurement
(28) set; for SLC7A2 measurement
(29) set; for SLC7A5 measurement
(30) set; for SLC7A7 measurement
(31) set; for SLC7A8 measurement
(32) set; for SLC7A9 measurement
(33) set; for SLC7A10 measurement
(34) set; for SLC10A1 measurement
(35) set; for SLC10A2 measurement
(36) set; for SLC15A1 measurement
(37) set; for SLC15A2 measurement
Set of (38); for SLC15A3 measurement
Set of (39); for SLC15A4 measurement
(40) set; for SLC16A1 measurement
(41) set; for SLC16A2 measurement
(42) set; for SLC16A3 measurement
(43) set; for SLC16A4 measurement
(44) set; for SLC22A4 measurement
(45) set; for SLC22A5 measurement
(46) set; for SLC22A8 measurement
(47) set; for SLC36A1 measurement
(48) set; for SLC38A1 measurement
(49) set; for SLC38A2 measurement
(50) set; for SLC38A3 measurement
(51) set; for SLC38A4 measurement Further, according to the present invention, a sample containing a mRNA encoding a transporter in a rat is subjected to polymerase chain reaction (PCR or RT-PCR) using any of the measurement kits described above. ) And measuring the presence or absence of hydrolysis of the probe used, and measuring the mRNA encoding the transporter protein in rats, in particular, The above-described measurement method is provided that is measured by the presence or absence.
より詳しくは、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、ラットにおけるトランスポーターをコードする遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提供される。 More specifically, using a primer pair of a forward primer and a reverse primer, and a probe that has a reporter dye and a quencher dye and hybridizes with a template nucleic acid within a region sandwiched between the two primers, 5′-3 ′ exo A real-time detection method for measuring a gene encoding a transporter in a rat by performing a polymerase chain reaction (PCR) with a DNA polymerase having nuclease activity is provided.
本発明によれば、同一ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、ラットにおけるトランスポーターをコードする各種ｍＲＮＡを定量することができる。このようなラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡのリアルタイム検出方法の確立は、臨床分野において非常に有益である。 According to the present invention, various mRNAs encoding transporters in rats can be quantified easily and rapidly in real time under the same PCR or RT-PCR reaction conditions. Establishment of such a method for real-time detection of mRNA encoding a transporter in rats is very beneficial in the clinical field.
また、上記方法によれば、ラットより手術で摘出した組織やバイオプシーにより摘出した組織中に発現するラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡを見るにあたり、迅速に且つ多種の試料を処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可能である、という効果も得られる。 In addition, according to the above method, various types of samples can be processed quickly and slightly when looking at mRNA encoding a transporter in a rat expressed in a tissue surgically removed from a rat or a tissue removed by biopsy. It is also possible to detect with total RNA extracted from various tissue pieces.
以下、本発明におけるプローブ及びプライマー対について詳述する。本発明における各プローブ及びプライマーは、上述した通り、ラットにおけるトランスポーターの蛋白質をコードする遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。 Hereinafter, the probe and primer pair in the present invention will be described in detail. As described above, each probe and primer in the present invention are selected from oligonucleotides that hybridize to a specific region of a gene encoding a transporter protein in rats.
本発明において「ハイブリダイズする」とは、後述するＰＣＲ（又はＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズすることをいう。 In the present invention, “hybridize” means to hybridize under the conditions of PCR (or RT-PCR) described later.
本発明におけるプローブ及びプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及びＣ（シトシン）の割合が好ましくは５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないこと、を挙げることができる。加えて、本発明におけるプローブにみられる要件としては、Ｔｍ値が７０℃前後であることを挙げることができ、本発明におけるプライマーにみられる要件としてはＴｍ値が６０℃前後であることを挙げることができる。 The requirements common to the probe and primer in the present invention are that the amplification product has a length of 50 to 400 base pairs, that the primer and the probe are as close as possible, G (guanine) contained in the sequence, and The ratio of C (cytosine) is preferably around 50%, and four or more G (guanine) are not continuous. In addition, the requirement found in the probe in the present invention can be that the Tm value is around 70 ° C., and the requirement found in the primer in the present invention is that the Tm value is around 60 ° C. be able to.
それぞれのｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジーンバンク（BenBank）に以下の登録番号で登録されている。
(1)Abca1遺伝子；NM_178095
(2)Abcg1遺伝子；NM_053502
(3)Abcg2遺伝子；NM_181381
(4)Abcg5遺伝子；NM_053754
(5)Abcg8遺伝子；NM_130414
(6)Abca4遺伝子；XM_241525
(7)Abca7遺伝子；NM_207598
(8)Abcc4遺伝子；NM_133411
(9)Abcc8遺伝子；NM_013039
(10)Abcc9遺伝子；NM_013040
(11)Abcc10遺伝子；XM_236930
(12)Abcc12遺伝子；NM_199377
(13)Abcd2遺伝子；NM_033352
(14)Abcd3遺伝子；NM_012804
(15)Abcg4遺伝子；XM_236186
(16)SLC1A1遺伝子；NM_013032
(17)SLC1A2遺伝子；NM_017215
(18)SLC1A3遺伝子；NM_019225
(19)SLC1A4遺伝子；NM_198763
(20)SLC1A6遺伝子；NM_032065
(21)SLC3A1遺伝子；NM_017216
(22)SLC3A2遺伝子；NM_019283
(23)SLC6A5遺伝子；NM_203334
(24)SLC6A6遺伝子；NM_017206
(25)SLC6A7遺伝子；NM_053996
(26)SLC6A9遺伝子；NM_053818
(27)SLC7A1遺伝子；NM_013111
(28)SLC7A2遺伝子；NM_022619
(29)SLC7A5遺伝子；NM_017353
(30)SLC7A7遺伝子；NM_031341
(31)SLC7A8遺伝子；NM_053442
(32)SLC7A9遺伝子；NM_053929
(33)SLC7A10遺伝子；NM_053726
(34)SLC10A1遺伝子；NM_017047
(35)SLC10A2遺伝子；NM_017222
(36)SLC15A1遺伝子；NM_057121
(37)SLC15A2遺伝子；NM_031672
(38)SLC15A3遺伝子；NM_139341
(39)SLC15A4遺伝子；NM_144758
(40)SLC16A1遺伝子；NM_012716
(41)SLC16A2遺伝子；NM_147216
(42)SLC16A3遺伝子；NM_030834
(43)SLC16A4遺伝子；NM_001013913
(44)SLC22A4遺伝子；NM_022270
(45)SLC22A5遺伝子；NM_019269
(46)SLC22A8遺伝子；NM_031332
(47)SLC36A1遺伝子；NM_130415
(48)SLC38A1遺伝子；NM_138832
(49)SLC38A2遺伝子；NM_181090
(50)SLC38A3遺伝子；NM_145776
(51)SLC38A4遺伝子；NM_130748
Each mRNA sequence is publicly known, and is registered in the gene bank (BenBank) with the following registration number.
(1) Abca1 gene; NM_178095
(2) Abcg1 gene; NM_053502
(3) Abcg2 gene; NM_181381
(4) Abcg5 gene; NM_053754
(5) Abcg8 gene; NM_130414
(6) Abca4 gene; XM_241525
(7) Abca7 gene; NM_207598
(8) Abcc4 gene; NM_133411
(9) Abcc8 gene; NM_013039
(10) Abcc9 gene; NM_013040
(11) Abcc10 gene; XM_236930
(12) Abcc12 gene; NM_199377
(13) Abcd2 gene; NM_033352
(14) Abcd3 gene; NM_012804
(15) Abcg4 gene; XM_236186
(16) SLC1A1 gene; NM_013032
(17) SLC1A2 gene; NM_017215
(18) SLC1A3 gene; NM_019225
(19) SLC1A4 gene; NM_198763
(20) SLC1A6 gene; NM_032065
(21) SLC3A1 gene; NM_017216
(22) SLC3A2 gene; NM_019283
(23) SLC6A5 gene; NM_203334
(24) SLC6A6 gene; NM_017206
(25) SLC6A7 gene; NM_053996
(26) SLC6A9 gene; NM_053818
(27) SLC7A1 gene; NM_013111
(28) SLC7A2 gene; NM_022619
(29) SLC7A5 gene; NM_017353
(30) SLC7A7 gene; NM_031341
(31) SLC7A8 gene; NM_053442
(32) SLC7A9 gene; NM_053929
(33) SLC7A10 gene; NM_053726
(34) SLC10A1 gene; NM_017047
(35) SLC10A2 gene; NM_017222
(36) SLC15A1 gene; NM_057121
(37) SLC15A2 gene; NM_031672
(38) SLC15A3 gene; NM_139341
(39) SLC15A4 gene; NM_144758
(40) SLC16A1 gene; NM_012716
(41) SLC16A2 gene; NM_147216
(42) SLC16A3 gene; NM_030834
(43) SLC16A4 gene; NM_001013913
(44) SLC22A4 gene; NM_022270
(45) SLC22A5 gene; NM_019269
(46) SLC22A8 gene; NM_031332
(47) SLC36A1 gene; NM_130415
(48) SLC38A1 gene; NM_138832
(49) SLC38A2 gene; NM_181090
(50) SLC38A3 gene; NM_145776
(51) SLC38A4 gene; NM_130748
本明細書において、ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡの特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の開始コドンからの配列に従うものである。 In this specification, the display of the specific region of mRNA encoding the transporter in the rat is in accordance with the sequence from the start codon of the gene registered with each of the above registration numbers.
これら各プライマー及びプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、１５個以上、好ましくは１５〜５０個、より好ましくは２０〜４５個の範囲にあるのがよい。これらプライマー及びプローブのヌクレオチド数が上記範囲よりも多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆に、少なすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する傾向がある。 The number of nucleotides of these oligonucleotides for each primer and probe should be 15 or more, preferably 15 to 50, more preferably 20 to 45. When the number of nucleotides of these primers and probes is excessively larger than the above range, it becomes difficult to hybridize to single-stranded DNA, and conversely, when it is too small, the specificity of hybridization tends to decrease.
プライマー及びプローブの特定のヌクレオチド配列の好ましい具体的配列例は、前述したとおり、各分子種に応じてそれぞれ、配列番号１〜５１（プローブの場合）並びに配列番号５２〜１５３（プライマーの場合）に示されるとおりである。 As described above, preferable specific sequence examples of specific nucleotide sequences of the primer and the probe are shown in SEQ ID NOs: 1 to 51 (in the case of a probe) and SEQ ID NOs: 52 to 153 (in the case of a primer), respectively, according to each molecular species. As shown.
なお、例えば２０ヌクレオチドからなるプライマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして又は検出用プローブとして機能し得ることが知られている。従って、本発明におけるプライマー及びプローブもまた、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、その配列をその一部として含むものや、その配列中の例えば２個以下のヌクレオチドに置換、欠失及び／又は付加による修飾がなされた配列等をも包含することができる。 For example, it is known that a primer or probe consisting of 20 nucleotides can hybridize even if a small number of mismatches exist with the template strand, and function as a PCR primer or a detection probe. Therefore, the primers and probes in the present invention are not limited to those having the above-mentioned specific nucleotide sequence, and those containing the sequence as a part thereof, or substituting or lacking, for example, by 2 or less nucleotides in the sequence. Sequences modified by deletion and / or addition can also be included.
上述した本発明におけるプローブ及びプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機（例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社製））等を用いて容易に合成することができ、さらに必要に応じて、得られたオリゴヌクレオチドを市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。 Each oligonucleotide as the probe and primer in the present invention described above can be easily synthesized using an automatic synthesizer (for example, a DNA synthesizer (manufactured by PerkinElmer)) according to a conventional method, and further if necessary. The obtained oligonucleotide can also be purified using a commercially available purification cartridge or the like.
本発明のリアルタイム検出用のプローブは、その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合しており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー色素を結合していることが好ましい。レポーター色素としては、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー色素としては、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合、該レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有する物質が挙げられる。このようなレポーター色素の例としては、例えば、６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。 The probe for real-time detection of the present invention preferably has a reporter dye bound to one end, for example, the 5'-end, and a quencher dye bound to the other end, for example, the 3'-end. The reporter dye is, for example, a substance that emits fluorescence when irradiated with excitation light, and the quencher dye acts on the reporter dye when it is located close to the reporter dye to generate fluorescence. Examples thereof include substances having an erasing action. Examples of such reporter dyes include, for example, 6-carboxy-fluorescein (FAM), tetrachloro-6-carboxyfluorescein (TET), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6 Carboxyfluorescein (JOE), hexochloro-6-carboxyfluorescein (HEX), etc. are mentioned. Examples of quencher dyes include 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA).
本発明におけるプローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えば、プローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、プローブの３′側には、下記に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させ得る。 The probe in the present invention can be prepared by binding a reporter dye and a quencher dye to the probe oligonucleotide having the specific sequence. For example, on the 5 ′ side of the probe, usually several methylene chains are used as a linker, and a FAM molecule can be bonded to the terminal phosphate group in the form of a phosphate ester. Further, a TAMRA molecule can be bound to the 3 ′ side of the probe by an amide bond via the structural unit shown below.
以下、本発明におけるプライマー対及びプローブを利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法について詳述する。 The real-time detection method by PCR using the primer pair and probe in the present invention will be described in detail below.
本発明にかかる測定方法は、前述した本発明におけるプライマー対及びプローブを利用することを必須として、他は公知のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, ABI PRISM TM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June (1996)参照）に従い実施することができる。 The measurement method according to the present invention requires the use of the primer pair and probe in the present invention described above, and others are known PCR methods (see, for example, Science, 230, 1350 (1985)), RT-PCR (Genome Res., 6 (10), 986 (1996)), etc., in particular, according to real-time detection methods (for example, see TaqMan PCR, ABI PRISM ™ 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June (1996)). .
これらの方法は、特に、本発明が対象とするラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡの発現量の測定方法として、ｍＲＮＡを測定する場合に有用である。この場合、例えば、特定のラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡを発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次いで、それに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明におけるプライマー対とプローブとを用いてＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明におけるプライマーとプローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともできる。 These methods are particularly useful when measuring mRNA as a method for measuring the expression level of mRNA encoding a transporter in the rat targeted by the present invention. In this case, for example, a biological tissue expressing mRNA encoding a transporter in a specific rat is collected, total RNA is extracted according to a conventional method, and then complementary cDNA is synthesized according to a conventional method. Thereafter, PCR may be performed using the primer pair and the probe in the present invention. Moreover, after extracting total RNA according to a conventional method, RT-PCR can be directly performed using the primer and probe in the present invention.
ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も、公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に制限されるものではない。具体的には、後述する実施例に示す条件を好ましく採用できる。 The PCR reaction and the RT-PCR reaction can basically follow known methods. Those reaction conditions can also be appropriately determined according to known methods, and are not particularly limited. Specifically, the conditions shown in Examples described later can be preferably adopted.
検出も、基本的には常法に従い、例えば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行なうことができる。 The detection can also be performed basically in accordance with a conventional method, for example, by irradiating a PCR reaction solution with an argon laser beam and detecting emitted fluorescence using a CCD camera.
以上のようにして、本発明にかかる測定方法によって、薬物の輸送に関与する各ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡを容易且つ迅速に、しかも各ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡ毎に測定、検出することができる。 As described above, by the measurement method according to the present invention, mRNA encoding a transporter in each rat involved in drug transport can be measured and detected easily and rapidly for each mRNA encoding the transporter in each rat. can do.
本発明のキットは、上記本発明におけるプライマー対及びプローブを含んでなる。本発明のキットは、さらに、対照として使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対及びプローブを含んでいてもよい。 The kit of the present invention comprises the primer pair and the probe according to the present invention. The kit of the present invention may further contain a known nucleic acid that can be used as a control, and a primer pair and a probe for measuring the nucleic acid.
本発明のキットによれば、ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡをそのラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡ毎に測定、検出でき、ひいては、ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡの定量を迅速に、精度よく行なうことができる。 According to the kit of the present invention, the mRNA encoding the transporter in the rat can be measured and detected for each mRNA encoding the transporter in the rat, and thus the quantification of the mRNA encoding the transporter in the rat can be rapidly and accurately performed. Can be done well.
以下、本発明をさらに詳しく説明するため、実施例を挙げる。 Examples are given below to illustrate the present invention in more detail.
（実施例）
ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡについて以下の試験を行い、リアルタイム検出方法による検量線を作成した。
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行なうことができるものであり、さらに、３８４ウエルでの測定も可能なものである。
(Example)
The following tests were performed on mRNA encoding transporters in rats, and a calibration curve was prepared by a real-time detection method.
The real-time one-step RT-PCR method employed in this test is capable of measuring 96 samples at a time by simultaneously performing 96 different reactions using 96 wells. In addition, RT reaction and PCR reaction can be performed in one tube, and measurement in 384 wells is also possible.
本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用したものである。すなわち、ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（TaqMan probe）が、ＰＣＲで増幅した特定のラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡ種由来のｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まると、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解される。それにより、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加する。この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望の定量が可能となる。 The principle of this quantification is when two adjacent fluorescent dyes are used and the wavelength region overlaps between the fluorescence wavelength of one dye (reporter dye) and the excitation light wavelength of the other dye (quencher dye). FRET generated in the above is utilized. That is, a probe (TaqMan probe) in which two fluorescent dyes that generate FRET are bound to both ends hybridizes to cDNA derived from a mRNA species encoding a transporter in a specific rat amplified by PCR. When the PCR extension reaction starts, the TaqMan probe is hydrolyzed by the 5′-3 ′ endonuclease activity of Taq DNA polymerase. As a result, the reporter dye is detached, a physical distance from the quencher dye is generated, and the fluorescence intensity of the reporter dye that has been suppressed by FRET is increased. Since this increase in fluorescence intensity is proportional to the amount of increase in PCR amplification products, desired quantification can be achieved by measuring this in each PCR reaction.
本試験では、プローブの５’末端側にはリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。これら各色素の結合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）記載の方法に従って行なった。 In this test, FAM was used as a reporter dye on the 5 'end side of the probe, and TAMRA was used as a quencher dye on the 3' end side. The binding of each of these dyes and the preparation of the TaqMan probe thereby were performed according to the methods described in the literature (Genome Res., 6 (10), 986 (1996)).
また、各プライマー及びプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザー（ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（ＡＢＩ社製））を利用して、基質（ｄＮＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。 Moreover, each primer and oligonucleotide as a probe were synthesized using a substrate (dNTP) and a specified reagent using an automatic synthesizer (DNA / RNA synthesizer (manufactured by ABI)).
検体ＲＮＡとしては、ラットの組織プールより精製された全ＲＮＡを用いた。なお、これらの全ＲＮＡは、ラットの各組織よりMini kit（「Rneasy（登録商標）」QIAGEN社製）を用いて調製した。 As sample RNA, total RNA purified from a rat tissue pool was used. These total RNAs were prepared from each rat tissue using a Mini kit ("Rneasy (registered trademark)" manufactured by QIAGEN).
ラットの組織プールより精製された全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈して２０μｇ／ｍＬとし、検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（「Yeast tRNA」GIBCO社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。 Total RNA purified from the rat tissue pool was diluted with RNase-free water to a concentration of 20 μg / mL for preparation of a calibration curve. Thereafter, dilution was performed at a common ratio of 5 times using 50 μg / mL yeast tRNA (“Yeast tRNA” manufactured by GIBCO). 5 μL was used for the measurement.
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、及び２００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems)を用いて、２０μＬ／チューブの系で、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）にて行なった。 The RT-PCR reaction was carried out using a TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems) containing 300 nM forward primer, 900 nM reverse primer, and 200 nM TaqMan probe in an Applied Biosystems 7500 system at 20 μL / tube. This was performed with Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
温度等の測定条件は、４８℃で３０分間保温した後、９５℃で１０分間保温し、その後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を１サイクルとして該サイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。 Measurement conditions such as temperature were kept at 48 ° C. for 30 minutes, then kept at 95 ° C. for 10 minutes, and then the cycle was repeated 50 times with 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute as one cycle. The fluorescence intensity was measured every time.
下記表１および表２に示す各ラットにおけるトランスポーターをコードするｍＲＮＡに対して各配列番号に示される配列のプライマー対及びプローブを用いて上記試験を行った。結果（検量線）を表３および表４に示す。 The above test was performed using the primer pairs and probes having the sequences shown in the respective SEQ ID NOs against the mRNA encoding the transporter in each rat shown in Table 1 and Table 2 below. The results (calibration curve) are shown in Table 3 and Table 4.
上記表３および表４より、６００００ｐｇ全ＲＮＡ／２０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、定量下限は０．７６８ｐｇ全ＲＮＡ／２０μＬ反応液量から２４００ｐｇ全ＲＮＡ／２０μＬ反応液量であり、検量線の相関係数（ｒ）は全てにおいて０．９９以上であった。 From Table 3 and Table 4 above, a calibration curve diluted 5 times from the 60000 pg total RNA / 20 μL reaction volume was prepared. The lower limit of quantification was 0.768 pg total RNA / 20 μL reaction volume to 2400 pg total RNA / The reaction volume was 20 μL, and the correlation coefficient (r) of the calibration curve was 0.99 or more in all cases.
Claims (12)
(1)Abca1遺伝子の3844-3876の領域
(2)Abcg1遺伝子の1910-1935の領域
(3)Abcg2遺伝子の249-278の領域
(4)Abcg5遺伝子の1546-1575の領域
(5)Abcg8遺伝子の1766-1790の領域
(6)Abca4遺伝子の3562-3587の領域
(7)Abca7遺伝子の4727-4758の領域
(8)Abcc4遺伝子の2353-2383の領域
(9)Abcc8遺伝子の2526-2556の領域
(10)Abcc9遺伝子の1478-1512の領域
(11)Abcc10遺伝子の1591-1618の領域
(12)Abcc12遺伝子の3249-3276の領域
(13)Abcd2遺伝子の436-466の領域
(14)Abcd3遺伝子の1851-1883の領域
(15)Abcg4遺伝子の1358-1387の領域
(16)SLC1A1遺伝子の332-363の領域
(17)SLC1A2遺伝子の1193-1218の領域
(18)SLC1A3遺伝子の851-877の領域
(19)SLC1A4遺伝子の558-586の領域
(20)SLC1A6遺伝子の1443-1468の領域
(21)SLC3A1遺伝子の76-104の領域
(22)SLC3A2遺伝子の1317-1344の領域
(23)SLC6A5遺伝子の1786-1812の領域
(24)SLC6A6遺伝子の664-694の領域
(25)SLC6A7遺伝子の1256-1281の領域
(26)SLC6A9遺伝子の725-750の領域
(27)SLC7A1遺伝子の1275-1303の領域
(28)SLC7A2遺伝子の800-825の領域
(29)SLC7A5遺伝子の1286-1311の領域
(30)SLC7A7遺伝子の270-295の領域
(31)SLC7A8遺伝子の973-1001の領域
(32)SLC7A9遺伝子の964-989の領域
(33)SLC7A10遺伝子の623-646の領域
(34)SLC10A1遺伝子の103-129の領域
(35)SLC10A2遺伝子の411-434の領域
(36)SLC15A1遺伝子の1898-1924の領域
(37)SLC15A2遺伝子の498-523の領域
(38)SLC15A3遺伝子の1611-1642の領域
(39)SLC15A4遺伝子の545-572の領域
(40)SLC16A1遺伝子の1052-1079の領域
(41)SLC16A2遺伝子の1287-1314の領域
(42)SLC16A3遺伝子の1012-1037の領域
(43)SLC16A4遺伝子の1153-1179の領域
(44)SLC22A4遺伝子の857-885の領域
(45)SLC22A5遺伝子の846-875の領域
(46)SLC22A8遺伝子の533-556の領域
(47)SLC36A1遺伝子の949-975の領域
(48)SLC38A1遺伝子の582-608の領域
(49)SLC38A2遺伝子の1302-1326の領域
(50)SLC38A3遺伝子の544-569の領域
(51)SLC38A4遺伝子の1378-1404の領域 A probe used for measurement of mRNA encoding a transporter in a rat, wherein the probe is selected from oligonucleotides that hybridize to each of the following regions (1) to (51).
(1) 3844-3876 region of Abca1 gene
(2) 1910-1935 region of Abcg1 gene
(3) 249-278 region of the Abcg2 gene
(4) 1546-1575 region of the Abcg5 gene
(5) 1766-1790 region of the Abcg8 gene
(6) Region 3562-3587 of Abca4 gene
(7) 4727-4758 region of Abca7 gene
(8) 2353-2383 region of Abcc4 gene
(9) Region 256-2556 of Abcc8 gene
(10) 1478-1512 region of Abcc9 gene
(11) 1591-1618 region of Abcc10 gene
(12) 3249-3276 region of Abcc12 gene
(13) Region 436-466 of the Abcd2 gene
(14) 1851-1883 region of the Abcd3 gene
(15) 1358-1387 region of the Abcg4 gene
(16) 332-363 region of SLC1A1 gene
(17) 1193-1218 region of SLC1A2 gene
(18) 851-877 region of SLC1A3 gene
(19) Region 558-586 of the SLC1A4 gene
(20) 1443-1468 region of SLC1A6 gene
(21) 76-104 region of SLC3A1 gene
(22) 1317-1344 region of SLC3A2 gene
(23) 1786-1812 region of SLC6A5 gene
(24) 664-694 region of SLC6A6 gene
(25) 1256-1281 region of the SLC6A7 gene
(26) 725-750 region of SLC6A9 gene
(27) 1275-1303 region of the SLC7A1 gene
(28) 800-825 region of SLC7A2 gene
(29) Region 1286-1311 of SLC7A5 gene
(30) 270-295 region of SLC7A7 gene
(31) 973-1001 region of the SLC7A8 gene
(32) 964-989 region of SLC7A9 gene
(33) 623-646 region of SLC7A10 gene
(34) 103-129 region of SLC10A1 gene
(35) 411-434 region of SLC10A2 gene
(36) 1898-1924 region of SLC15A1 gene
(37) 498-523 region of SLC15A2 gene
(38) 1611-1642 region of the SLC15A3 gene
(39) 545-572 region of SLC15A4 gene
(40) Region 1052-1079 of the SLC16A1 gene
(41) 1287-1314 region of the SLC16A2 gene
(42) 1012-1037 region of the SLC16A3 gene
(43) 1153-1179 region of the SLC16A4 gene
(44) 857-885 region of the SLC22A4 gene
(45) 846-875 region of the SLC22A5 gene
(46) 533-556 region of SLC22A8 gene
(47) 949-975 region of SLC36A1 gene
(48) 582-608 region of SLC38A1 gene
(49) 1302-1326 region of SLC38A2 gene
(50) 544-569 region of the SLC38A3 gene
(51) 1378-1404 region of the SLC38A4 gene
(1)プライマー対；Abca1遺伝子の3823-3841領域及び3904-3886領域、プローブ；3844-3876領域
(2)プライマー対；Abcg1遺伝子の1884-1904領域及び1993-1973領域、プローブ；1910-1935領域
(3)プライマー対；Abcg2遺伝子の224-244領域及び356-337領域、プローブ；249-278領域
(4)プライマー対；Abcg5遺伝子の1524-1544領域及び1642-1623領域、プローブ；1546-1575領域
(5)プライマー対；Abcg8遺伝子の1743-1764領域及び1819-1799領域、プローブ；1766-1790領域
(6)プライマー対；Abca4遺伝子の3539-3559領域及び3611-3591領域、プローブ；3562-3587領域
(7)プライマー対；Abca7遺伝子の4707-4725領域及び4855-4832領域、プローブ；4727-4758領域
(8)プライマー対；Abcc4遺伝子の2329-2349領域及び2411-2391領域、プローブ；2353-2383領域
(9)プライマー対；Abcc8遺伝子の2502-2521領域及び2576-2557領域、プローブ；2526-2556領域
(10)プライマー対；Abcc9遺伝子の1446-1466領域及び1549-1529領域、プローブ；1478-1512領域
(11)プライマー対；Abcc10遺伝子の1558-1578領域及び1701-1682領域、プローブ；1591-1618領域
(12)プライマー対；Abcc12遺伝子の3228-3247領域及び3311-3290領域、プローブ；3249-3276領域
(13)プライマー対；Abcd2遺伝子の413-434領域及び495-475領域、プローブ；436-466領域
(14)プライマー対；Abcd3遺伝子の1827-1847領域及び1932-1914領域、プローブ；1851-1883領域
(15)プライマー対；Abcg4遺伝子の1333-1353領域及び1468-1448領域、プローブ；1358-1387領域
(16)プライマー対；SLC1A1遺伝子の302-322領域及び438-418領域、プローブ；332-363領域
(17)プライマー対；SLC1A2遺伝子の1168-1187x領域及び1242-1222領域、プローブ；1193-1218領域
(18)プライマー対；SLC1A3遺伝子の829-849領域及び927-904領域、プローブ；851-877領域
(19)プライマー対；SLC1A4遺伝子の538-556領域及び610-590領域、プローブ；558-586領域
(20)プライマー対；SLC1A6遺伝子の1421-1441領域及び1538-1520領域、プローブ；1443-1468領域
(21)プライマー対；SLC3A1遺伝子の55-74領域及び138-118領域、プローブ；76-104領域
(22)プライマー対；SLC3A2遺伝子の1294-1314領域及び1369-1351領域、プローブ；1317-1344領域
(23)プライマー対；SLC6A5遺伝子の1764-1783領域及び1882-1862領域、プローブ；1786-1812領域
(24)プライマー対；SLC6A6遺伝子の639-659領域及び776-758領域、プローブ；664-694領域
(25)プライマー対；SLC6A7遺伝子の1230-1253領域及び1309-1286領域、プローブ；1256-1281領域
(26)プライマー対；SLC6A9遺伝子の700-721領域及び779-758領域、プローブ；725-750領域
(27)プライマー対；SLC7A1遺伝子の1254-1273領域及び1357-1334領域、プローブ；1275-1303領域
(28)プライマー対；SLC7A2遺伝子の778-797領域及び859-839領域、プローブ；800-825領域
(29)プライマー対；SLC7A5遺伝子の1257-1277領域及び1334-1314領域、プローブ；1286-1311領域
(30)プライマー対；SLC7A7遺伝子の247-266領域及び335-315領域、プローブ；270-295領域
(31)プライマー対；SLC7A8遺伝子の952-970領域及び1077-1057領域、プローブ；973-1001領域
(32)プライマー対；SLC7A9遺伝子の937-955領域及び1018-998領域、プローブ；964-989領域
(33)プライマー対；SLC7A10遺伝子の601-621領域及び696-676領域、プローブ；623-646領域
(34)プライマー対；SLC10A1遺伝子の77-97領域及び149-130領域、プローブ；103-129領域
(35)プライマー対；SLC10A2遺伝子の388-408領域及び471-452領域、プローブ；411-434領域
(36)プライマー対；SLC15A1遺伝子の1877-1896領域及び1998-1978領域、プローブ；1898-1924領域
(37)プライマー対；SLC15A2遺伝子の475-495領域及び611-592領域、プローブ；498-523領域
(38)プライマー対；SLC15A3遺伝子の1586-1606領域及び1693-1673領域、プローブ；1611-1642領域
(39)プライマー対；SLC15A4遺伝子の518-537領域及び620-600領域、プローブ；545-572領域
(40)プライマー対；SLC16A1遺伝子の1030-1050領域及び1103-1084領域、プローブ；1052-1079領域
(41)プライマー対；SLC16A2遺伝子の1258-1278領域及び1335-1316領域、プローブ；1287-1314領域
(42)プライマー対；SLC16A3遺伝子の986-1006領域及び1073-1053領域、プローブ；1012-1037領域
(43)プライマー対；SLC16A4遺伝子の1126-1150領域及び1204-1182領域、プローブ；1153-1179領域
(44)プライマー対；SLC22A4遺伝子の827-847領域及び908-889領域、プローブ；857-885領域
(45)プライマー対；SLC22A5遺伝子の818-838領域及び928-910領域、プローブ；846-875領域
(46)プライマー対；SLC22A8遺伝子の511-531領域及び580-562領域、プローブ；533-556領域
(47)プライマー対；SLC36A1遺伝子の927-947領域及び1004-984領域、プローブ；949-975領域
(48)プライマー対；SLC38A1遺伝子の559-578領域及び630-610領域、プローブ；582-608領域
(49)プライマー対；SLC38A2遺伝子の1280-1300領域及び1415-1395領域、プローブ；1302-1326領域
(50)プライマー対；SLC38A3遺伝子の522-541領域及び592-572領域、プローブ；544-569領域
(51)プライマー対；SLC38A4遺伝子の1358-1376領域及び1500-1480領域、プローブ；1378-1404領域 Detection of mRNA encoding a transporter in a rat comprising at least one of a primer pair of a forward primer and a reverse primer and a set of probes each consisting of an oligonucleotide that hybridizes to each region of the gene encoding the transporter in the rat, and A quantification kit, wherein both the primer pair and the probe are oligonucleotides capable of hybridizing to each region of the gene shown in the following (1) to (51)
(1) Primer pair; 3823-3841 region and 3904-3886 region of Abca1 gene, probe; 3844-3876 region
(2) Primer pair; 1884-1904 region and 1993-1973 region of Abcg1 gene, probe; 1910-1935 region
(3) Primer pair; 224-244 region and 356-337 region of Abcg2 gene, probe; 249-278 region
(4) Primer pair; 1524-1544 region and 1642-1623 region of Abcg5 gene, probe; 1546-1575 region
(5) Primer pair; 1743-1764 region and 189-1799 region of Abcg8 gene, probe; 1766-1790 region
(6) Primer pair; 3539-3559 region and 3611-3591 region of Abca4 gene, probe; 3562-3587 region
(7) Primer pair; 4707-4725 region and 4855-4832 region of Abca7 gene, probe; 4727-4758 region
(8) Primer pair; 2329-2349 region and 241-21-2391 region of Abcc4 gene, probe; 2353-2383 region
(9) Primer pair; 2502-2521 region and 2576-2557 region of Abcc8 gene, probe; 2526-2556 region
(10) Primer pair; 1446-1466 region and 1549-1529 region of Abcc9 gene, probe; 1478-1512 region
(11) Primer pair; 1558-1578 region and 1701-1682 region of Abcc10 gene, probe; 1591-1618 region
(12) Primer pair; 3228-3247 region and 3311-3290 region of Abcc12 gene, probe; 3249-3276 region
(13) Primer pair; 413-434 region and 495-475 region of Abcd2 gene, probe; 436-466 region
(14) Primer pair; 182-1847 region and 1932-1914 region of Abcd3 gene, probe; 1851-1883 region
(15) Primer pair; 1333-1353 region and 1468-1448 region of Abcg4 gene, probe; 1358-1387 region
(16) Primer pair; 302-322 region and 438-418 region of SLC1A1 gene, probe; 332-363 region
(17) Primer pair; 1168-1187x region and 1242-1222 region of SLC1A2 gene, probe; 1193-1218 region
(18) Primer pair; 829-849 region and 927-904 region of SLC1A3 gene, probe; 851-877 region
(19) Primer pair; 538-556 region and 610-590 region of SLC1A4 gene, probe; 558-586 region
(20) Primer pair; 1421-1441 region and 1538-1520 region of SLC1A6 gene, probe; 1443-1468 region
(21) Primer pair; 55-74 region and 138-118 region of SLC3A1 gene, probe; 76-104 region
(22) Primer pair; 1294-1314 region and 1369-1351 region of SLC3A2 gene, probe; 1317-1344 region
(23) Primer pair; 1764-1783 region and 1882-1862 region of SLC6A5 gene, probe; 1786-1812 region
(24) Primer pair; 639-659 region and 776-758 region of SLC6A6 gene, probe; 664-694 region
(25) Primer pair; 1230-1253 region and 1309-1286 region of SLC6A7 gene, probe; 1256-1281 region
(26) Primer pair; 700-721 region and 779-758 region of SLC6A9 gene, probe; 725-750 region
(27) Primer pair; 1254-1273 region and 1357-1334 region of SLC7A1 gene, probe; 1275-1303 region
(28) Primer pair; 778-797 region and 859-839 region of SLC7A2 gene, probe; 800-825 region
(29) Primer pair; 1257-1277 region and 1334-1314 region of SLC7A5 gene, probe; 1286-1311 region
(30) Primer pair; 247-266 region and 335-315 region of SLC7A7 gene, probe; 270-295 region
(31) Primer pair; 952-970 region and 1077-1057 region of SLC7A8 gene, probe; 973-1001 region
(32) Primer pair; 937-955 region and 1018-998 region of SLC7A9 gene, probe; 964-989 region
(33) Primer pair; 601-621 region and 696-676 region of SLC7A10 gene, probe; 623-646 region
(34) Primer pair; 77-97 region and 149-130 region of SLC10A1 gene, probe; 103-129 region
(35) Primer pair; 388-408 region and 471-452 region of SLC10A2 gene, probe; 411-434 region
(36) Primer pair; 1877-1896 region and 1998-1978 region of SLC15A1 gene, probe; 1898-1924 region
(37) Primer pair; 475-495 region and 611-592 region of SLC15A2 gene, probe; 498-523 region
(38) Primer pair; 1586-1606 region and 1693-1673 region of SLC15A3 gene, probe; 1611-1642 region
(39) Primer pair; 518-537 region and 620-600 region of SLC15A4 gene, probe; 545-572 region
(40) Primer pair; 1030-1050 region and 1103-1084 region of SLC16A1 gene, probe; 1052-1079 region
(41) Primer pair; 1258-1278 region and 1335-1316 region of the SLC16A2 gene, probe; 1287-1314 region
(42) Primer pair; 986-1006 region and 1073-1053 region of SLC16A3 gene, probe; 1012-1037 region
(43) Primer pair; 1126-1150 region and 1204-1182 region of SLC16A4 gene, probe; 1153-1179 region
(44) Primer pair; 827-847 region and 908-889 region of SLC22A4 gene, probe; 857-885 region
(45) Primer pair; 818-838 region and 928-910 region of SLC22A5 gene, probe; 846-875 region
(46) Primer pair; 511-531 region and 580-562 region of SLC22A8 gene, probe; 533-556 region
(47) Primer pair; 927-947 region and 1004-984 region of SLC36A1 gene, probe; 949-975 region
(48) Primer pair; 559-578 region and 630-610 region of the SLC38A1 gene, probe; 582-608 region
(49) Primer pair; 1280-1300 region and 1415-1395 region of the SLC38A2 gene, probe; 1302-1326 region
(50) Primer pair; 522-541 region and 592-572 region of SLC38A3 gene, probe; 544-569 region
(51) Primer pair; 1358-1376 region and 1500-1480 region of the SLC38A4 gene, probe; 1378-1404 region
(1)プライマー対；配列番号５２及び５３、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号５４及び５５、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号５６及び５７、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号５８及び５９、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号６０及び６１、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号６２及び６３、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号６４及び６５、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号６６及び６７、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号６８及び６９、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号７０及び７１、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号７２及び７３、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号７４及び７５、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号７６及び７７、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号７８及び７９、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号８０及び８１、プローブ；配列番号１５
(16)プライマー対；配列番号８２及び８３、プローブ；配列番号１６
(17)プライマー対；配列番号８４及び８５、プローブ；配列番号１７
(18)プライマー対；配列番号８６及び８７、プローブ；配列番号１８
(19)プライマー対；配列番号８８及び８９、プローブ；配列番号１９
(20)プライマー対；配列番号９０及び９１、プローブ；配列番号２０
(21)プライマー対；配列番号９２及び９３、プローブ；配列番号２１
(22)プライマー対；配列番号９４及び９５、プローブ；配列番号２２
(23)プライマー対；配列番号９６及び９７、プローブ；配列番号２３
(24)プライマー対；配列番号９８及び９９、プローブ；配列番号２４
(25)プライマー対；配列番号１００及び１０１、プローブ；配列番号２５
(26)プライマー対；配列番号１０２及び１０３、プローブ；配列番号２６
(27)プライマー対；配列番号１０４及び１０５、プローブ；配列番号２７
(28)プライマー対；配列番号１０６及び１０７、プローブ；配列番号２８
(29)プライマー対；配列番号１０８及び１０９、プローブ；配列番号２９
(30)プライマー対；配列番号１１０及び１１１、プローブ；配列番号３０
(31)プライマー対；配列番号１１２及び１１３、プローブ；配列番号３１
(32)プライマー対；配列番号１１４及び１１５、プローブ；配列番号３２
(33)プライマー対；配列番号１１６及び１１７、プローブ；配列番号３３
(34)プライマー対；配列番号１１８及び１１９、プローブ；配列番号３４
(35)プライマー対；配列番号１２０及び１２１、プローブ；配列番号３５
(36)プライマー対；配列番号１２２及び１２３、プローブ；配列番号３６
(37)プライマー対；配列番号１２４及び１２５、プローブ；配列番号３７
(38)プライマー対；配列番号１２６及び１２７、プローブ；配列番号３８
(39)プライマー対；配列番号１２８及び１２９、プローブ；配列番号３９
(40)プライマー対；配列番号１３０及び１３１、プローブ；配列番号４０
(41)プライマー対；配列番号１３２及び１３３、プローブ；配列番号４１
(42)プライマー対；配列番号１３４及び１３５、プローブ；配列番号４２
(43)プライマー対；配列番号１３６及び１３７、プローブ；配列番号４３
(44)プライマー対；配列番号１３８及び１３９、プローブ；配列番号４４
(45)プライマー対；配列番号１４０及び１４１、プローブ；配列番号４５
(46)プライマー対；配列番号１４２及び１４３、プローブ；配列番号４６
(47)プライマー対；配列番号１４４及び１４５、プローブ；配列番号４７
(48)プライマー対；配列番号１４６及び１４７、プローブ；配列番号４８
(49)プライマー対；配列番号１４８及び１４９、プローブ；配列番号４９
(50)プライマー対；配列番号１５０及び１５１、プローブ；配列番号５０
(51)プライマー対；配列番号１５２及び１５３、プローブ；配列番号５１ The kit according to claim 6 or 7, which is selected from a combination of a primer pair consisting of an oligonucleotide containing the sequence represented by each SEQ ID NO. And a probe in the set shown in (1) to (51) below.
(1) Primer pair; SEQ ID NOs: 52 and 53, probe; SEQ ID NO: 1
(2) Primer pair; SEQ ID NOs: 54 and 55, probe; SEQ ID NO: 2
(3) Primer pair; SEQ ID NOs: 56 and 57, probe; SEQ ID NO: 3
(4) Primer pair; SEQ ID NOs: 58 and 59, probe; SEQ ID NO: 4
(5) Primer pair; SEQ ID NOs: 60 and 61, probe; SEQ ID NO: 5
(6) Primer pair; SEQ ID NOs: 62 and 63, probe; SEQ ID NO: 6
(7) Primer pair; SEQ ID NOs: 64 and 65, probe; SEQ ID NO: 7
(8) Primer pair; SEQ ID NOs: 66 and 67, probe; SEQ ID NO: 8
(9) Primer pair; SEQ ID NO: 68 and 69, probe; SEQ ID NO: 9
(10) Primer pair; SEQ ID NOs: 70 and 71, probe; SEQ ID NO: 10
(11) Primer pair; SEQ ID NOs: 72 and 73, probe; SEQ ID NO: 11
(12) Primer pair; SEQ ID NOs: 74 and 75, probe; SEQ ID NO: 12
(13) Primer pair; SEQ ID NOs: 76 and 77, probe; SEQ ID NO: 13
(14) Primer pair; SEQ ID NOs: 78 and 79, probe; SEQ ID NO: 14
(15) Primer pair; SEQ ID NOs: 80 and 81, probe; SEQ ID NO: 15
(16) Primer pair; SEQ ID NOs: 82 and 83, probe; SEQ ID NO: 16
(17) Primer pair; SEQ ID NO: 84 and 85, probe; SEQ ID NO: 17
(18) Primer pair; SEQ ID NO: 86 and 87, probe; SEQ ID NO: 18
(19) Primer pair; SEQ ID NO: 88 and 89, probe; SEQ ID NO: 19
(20) Primer pair; SEQ ID NOs: 90 and 91, probe; SEQ ID NO: 20
(21) Primer pair; SEQ ID NOs: 92 and 93, probe; SEQ ID NO: 21
(22) Primer pair; SEQ ID NOs: 94 and 95, probe; SEQ ID NO: 22
(23) Primer pair; SEQ ID NO: 96 and 97, probe; SEQ ID NO: 23
(24) Primer pair; SEQ ID NOs: 98 and 99, probe; SEQ ID NO: 24
(25) Primer pair; SEQ ID NOs: 100 and 101, probe; SEQ ID NO: 25
(26) Primer pair; SEQ ID NOs: 102 and 103, probe; SEQ ID NO: 26
(27) Primer pair; SEQ ID NOs: 104 and 105, probe; SEQ ID NO: 27
(28) Primer pair; SEQ ID NOs: 106 and 107, probe; SEQ ID NO: 28
(29) Primer pair; SEQ ID NOs: 108 and 109, probe; SEQ ID NO: 29
(30) Primer pair; SEQ ID NOs: 110 and 111, probe; SEQ ID NO: 30
(31) Primer pair; SEQ ID NOs: 112 and 113, probe; SEQ ID NO: 31
(32) Primer pair; SEQ ID NOs: 114 and 115, probe; SEQ ID NO: 32
(33) Primer pair; SEQ ID NOs: 116 and 117, probe; SEQ ID NO: 33
(34) Primer pair; SEQ ID NOs: 118 and 119, probe; SEQ ID NO: 34
(35) Primer pair; SEQ ID NOs: 120 and 121, probe; SEQ ID NO: 35
(36) Primer pair; SEQ ID NOS: 122 and 123, probe; SEQ ID NO: 36
(37) Primer pair; SEQ ID NOs: 124 and 125, probe; SEQ ID NO: 37
(38) Primer pair; SEQ ID NOs: 126 and 127, probe; SEQ ID NO: 38
(39) Primer pair; SEQ ID NOs: 128 and 129, probe; SEQ ID NO: 39
(40) Primer pair; SEQ ID NOs: 130 and 131, probe; SEQ ID NO: 40
(41) Primer pair; SEQ ID NOs: 132 and 133, probe; SEQ ID NO: 41
(42) Primer pair; SEQ ID NOs: 134 and 135, probe; SEQ ID NO: 42
(43) Primer pair; SEQ ID NOs: 136 and 137, probe; SEQ ID NO: 43
(44) Primer pair; SEQ ID NOs: 138 and 139, probe; SEQ ID NO: 44
(45) Primer pair; SEQ ID NOs: 140 and 141, probe; SEQ ID NO: 45
(46) Primer pair; SEQ ID NOs: 142 and 143, probe; SEQ ID NO: 46
(47) Primer pair; SEQ ID NOs: 144 and 145, probe; SEQ ID NO: 47
(48) Primer pair; SEQ ID NOs: 146 and 147, probe; SEQ ID NO: 48
(49) Primer pair; SEQ ID NOS: 148 and 149, probe; SEQ ID NO: 49
(50) Primer pair; SEQ ID NOs: 150 and 151, probe; SEQ ID NO: 50
(51) Primer pair; SEQ ID NOs: 152 and 153, probe; SEQ ID NO: 51
The measurement method according to claim 11, wherein the presence or absence of hydrolysis is measured by the presence or absence of coloration of fluorescence by excitation light irradiation.
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|---|---|---|---|---|
| WO2023010326A1 (en) * | 2021-08-04 | 2023-02-09 | 杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司 | PRIMER-PROBE SET AND KIT FOR HUMAN β-TRYPTASE MRNA RT-PCR DETECTION |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2007006704A (en) * | 2005-06-01 | 2007-01-18 | Otsuka Pharmaceut Factory Inc | METHOD FOR ASSAYING mRNA OF ENZYME ASSOCIATED WITH GLUCURONIC ACID CONJUGATION IN HUMAN, PROBE AND KIT THEREFOR |
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