JP4876922B2 - Biological sample storage device - Google Patents
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Description
本発明は、生物学的試料を凍結保存容器内で保存するためのデバイスであって、前記生物学的試料を置くための試料載置部と、前記試料載置部に付設された取手部を備え、前記デバイスの少なくとも試料載置部が凍結保存容器に収納しうる構造からなる生物学的試料保存用デバイスに関する。 The present invention is a device for storing a biological sample in a cryopreservation container, comprising: a sample placing part for placing the biological sample; and a handle part attached to the sample placing part. And a biological sample storage device having a structure in which at least a sample mounting portion of the device can be stored in a cryopreservation container.
希少な検体として胚や卵子が挙げられる。胚や卵子の凍結保存は、不妊治療プログラムの基幹技術として、その重要性が指摘されている。生体から採取した幹細胞や、卵子等の希少な細胞は凍結保存液に懸濁することで細胞懸濁液を調製した後、該細胞懸濁液を細胞保存容器中に収納して保存していた。微量体液を採取するための採取具については、例えば、特許文献１の器具が挙げられる。しかしながら、細胞懸濁液１〜２ｍｌ中に１００個未満というレベルで存在する希少な細胞は、該細胞懸濁液中のどこに浮遊しているのか特定することが困難であり、回収の際に細胞を損失するケースが多々存在していた。
Rare specimens include embryos and eggs. The importance of cryopreservation of embryos and ova has been pointed out as a key technology for infertility treatment programs. Stem cells collected from living bodies and rare cells such as eggs were suspended in a cryopreservation solution to prepare a cell suspension, and the cell suspension was then stored and stored in a cell storage container. . An example of a collecting tool for collecting a trace amount of body fluid is the instrument disclosed in
また、これらの細胞を凍結する際には、急速凍結よりも緩速凍結する方が好ましい。急速凍結では細胞を取り巻く水分が結晶（氷晶）を形成しやすく、細胞膜を氷晶が破壊するためである。しかしながら、緩速凍結には、プログラムフリーザーなどの、専用の設備が必要であり、必ずしも不妊治療を実施する全ての施設に設置されてはいないのが現状である。 Further, when freezing these cells, it is preferable to freeze them slowly rather than rapidly. This is because in quick freezing, the water surrounding the cells tends to form crystals (ice crystals), and the ice crystals destroy the cell membrane. However, slow freezing requires special equipment such as a program freezer, and is not necessarily installed in all facilities that perform infertility treatment.
さらに、細胞を解凍する際には、速やかに解凍する方が好ましい。解凍が緩速であると、解凍途中に氷晶が形成しやすくなり細胞を破壊するおそれがあるためである。従来は凍結した細胞液を解凍するのに、３７℃の温浴に凍結容器を浸していたが、１〜２ｍｌの容量では、解凍にやや時間を要し、必ずしも最適な条件とは言えない。 Furthermore, when thawing cells, it is preferable to thaw quickly. This is because if the thawing is slow, ice crystals are likely to be formed during the thawing and the cells may be destroyed. Conventionally, in order to thaw a frozen cell solution, a freezing container was immersed in a 37 ° C. warm bath. However, with a volume of 1 to 2 ml, it takes some time for thawing, and it is not necessarily the optimum condition.
卵細胞を凍結保存するための筒状部材保持用具については特許文献２に開示されている。しかしながら、この器具に卵細胞のガラス化液を付着する作業は決して容易ではない。特に上記作業を顕微鏡を用いて行う場合は、把持部を持ちながら作業を行う必要があり、片手で作業をしなければならない。
A cylindrical member holding tool for cryopreserving egg cells is disclosed in
また、取り扱いの困難な検体の例として膜組織が挙げられる。膜組織としては、例えば、粘膜上皮組織、角膜上皮組織、培養角膜組織等が挙げられ、これらは、何れも非常に薄い膜厚を有するものである。このような平膜状の膜組織の原形状を保った状態で、生物学的な特性を損なうことなく保存／輸送方法及びそのための容器が開示されている（特許文献３、４）。しかしながら、特許文献３の方法は容器の壁面に接触しているため、容器の壁面から直接熱が伝わるために、急速凍結により膜組織が損傷することがある。また、特許文献４の容器は冷蔵条件で保存することが可能であるが、凍結保存の場合は裏打ち部材により膜が引き裂かれる可能性がある。
希少な検体や取り扱いの困難な検体を含む生物学的試料の凍結保存の際、検体を損失又は損傷することなく凍結保存することができ、また凍結した生物学的試料を容易に解凍することができる生物学的試料保存用デバイスを提供することを課題とする。 When storing biological samples, including rare and difficult-to-handle samples, the samples can be stored frozen without loss or damage, and frozen biological samples can be easily thawed. It is an object to provide a biological sample storage device that can be used.
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を進めた結果、試料載置部と取手部を含むデバイスの試料載置部上に検体を含む生物学的試料をのせ、該デバイス若しくは試料載置部を凍結保存容器に収納すれば、容器内の空気を利用して緩速凍結することができることを見出した。また、解凍の際には該試料載置部に解凍液を流し込むか、該試料載置部を直接解凍液に流し込むことにより容易に解凍することが可能となるため、該試料載置部上の生物学的試料に含まれる希少な検体を損失及び損傷することなく回収できることを見出した。 In order to solve the above problems, the present inventors have conducted extensive research, and as a result, placed a biological sample including a specimen on the sample mounting portion of the device including the sample mounting portion and the handle portion, and the device or It has been found that if the sample placement part is housed in a cryopreservation container, it can be slowly frozen using the air in the container. In addition, when thawing, it is possible to easily thaw by pouring the thawing solution into the sample placement unit or by directly pouring the sample placement unit into the thawing solution. It has been found that rare specimens contained in biological samples can be recovered without loss and damage.
すなわち、本発明は、以下よりなる。
１．生物学的試料を凍結保存容器内で保存するためのデバイスであって、前記デバイスは、生物学的試料を置くための試料載置部と、前記試料載置部に付設された取手部とを備え、前記デバイスの少なくとも試料載置部が前記凍結保存容器に収納しうる構造からなる生物学的試料保存用デバイス。
２．前記凍結保存容器がバッグである前項１に記載の生物学的試料保存用デバイス。
３．前記凍結保存容器がバイアルである前項１に記載の生物学的試料保存用デバイス。
４．前記凍結保存容器がバイアルであり、かつ、前記デバイスの取手部が前記バイアルを密封するためのキャップ構造を含む前項１に記載の生物学的試料保存用デバイス。
５．前記試料載置部の形状が、平面状である前項１に記載の生物学的試料保存用デバイス。
６．前記試料載置部の形状が、凹状である前項１に記載の生物学的試料保存用デバイス。
７．前記試料載置部の先端側に、テーパー部を設けてなる前項６に記載の生物学的試料保存用デバイス。
８．前記試料載置部の素材が、非晶性高分子である前項１に記載の生物学的試料保存用デバイス。
９．前記試料載置部の素材が、ポリエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリイミド及びポリアミドから選択されるいずれか１つを含む前項１に記載の生物学的試料保存用デバイス。
１０．前記試料載置部の素材が、ポリエチレンテレフタレートである前項１に記載の生物学的試料保存用デバイス。
１１．凍結保存容器と、生物学的試料保存用デバイスとを含む生物学的試料保存用セットであって、
前記デバイスは、生物学的試料を置くための試料載置部と、取手部とを備え、
前記デバイスの少なくとも試料載置部が、前記凍結保存容器に収納しうる構造からなることを特徴とする生物学的試料保存用セット。
１２．前記凍結保存容器がバイアルであり、前記デバイスの取手部が前記バイアルを密封するためのキャップ構造を含む前項１１に記載の生物学的試料保存用デバイスセット。
１３．生物学的試料を置くための試料載置部と、前記試料載置部に付設された取手部とを備えてなるデバイスを用いて凍結保存容器内で生物学的試料を保存する方法において、
１）生物学的試料を前記試料載置部に置く工程；
２）生物学的試料を置いた前記試料載置部を凍結保存容器に収納する工程；
３）凍結保存容器内の生物学的試料を０℃以下で保存する工程；
を含む生物学的試料の保存方法。
１４．さらに、４）生物学的試料を解凍する工程、を含む前項１３に記載の生物学的試料の保存方法。
１５．生物学的試料に含まれる検体が、細胞又は生体由来膜である前項１３または１４に記載の生物学的試料の凍結保存方法。That is, this invention consists of the following.
1. A device for storing a biological sample in a cryopreservation container, the device comprising: a sample placing part for placing a biological sample; and a handle attached to the sample placing part. And a biological sample storage device having a structure in which at least a sample mounting portion of the device can be stored in the cryopreservation container.
2. 2. The biological sample storage device according to 1 above, wherein the cryopreservation container is a bag.
3. 2. The biological sample storage device according to 1 above, wherein the cryopreservation container is a vial.
4). 2. The biological sample storage device according to
5. 2. The biological sample storage device according to
6). 2. The biological sample storage device according to
7). 7. The biological sample storage device according to item 6 above, wherein a tapered portion is provided on the distal end side of the sample mounting portion.
8). 2. The biological sample storage device according to 1 above, wherein the material of the sample mounting portion is an amorphous polymer.
9. 2. The biological sample storage device according to 1 above, wherein the material of the sample mounting portion includes any one selected from polyethylene, polyester, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, polyimide, and polyamide.
10. 2. The biological sample storage device according to 1 above, wherein the material of the sample mounting portion is polyethylene terephthalate.
11. A biological sample storage set comprising a cryopreservation container and a biological sample storage device;
The device comprises a sample placement part for placing a biological sample, and a handle part,
The biological sample storage set, wherein at least a sample mounting portion of the device has a structure that can be stored in the cryopreservation container.
12 12. The biological sample storage device set according to 11 above, wherein the cryopreservation container is a vial and the handle portion of the device includes a cap structure for sealing the vial.
13. In a method for storing a biological sample in a cryopreservation container using a device comprising a sample placement unit for placing a biological sample and a handle attached to the sample placement unit,
1) A step of placing a biological sample on the sample mounting portion;
2) A step of storing the sample placement part on which the biological sample is placed in a cryopreservation container;
3) storing the biological sample in the cryopreservation container at 0 ° C. or lower;
A method of storing a biological sample comprising:
14 The method for storing a biological sample according to item 13, further comprising 4) thawing the biological sample.
15. 15. The method for cryopreserving a biological sample according to 13 or 14 above, wherein the specimen contained in the biological sample is a cell or a biological membrane.
本発明の生物学的試料保存用デバイス（以下単に、「デバイス」という場合がある。）を用いて生物学的試料を凍結すると、生物学的試料に含まれる希少な検体や取り扱いの困難な検体を損傷することなく凍結することができる。また該凍結した生物学的試料は容易に解凍でき、含まれる検体を損失することなく回収することができる。また、本発明のデバイスは顕微鏡下での作業を容易にすることが可能となる。 When a biological sample is frozen using the biological sample storage device of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “device”), the rare sample contained in the biological sample or the difficult-to-handle sample is included. Can be frozen without damage. In addition, the frozen biological sample can be easily thawed and collected without losing the contained specimen. In addition, the device of the present invention can easily work under a microscope.
１ 生物学的試料保存用デバイス
１１ 試料載置部
１１１ 凹部
１１２ テーパー部
１２ 取手部
２ 凍結保存容器
２１ 凍結保存容器本体
２２ 凍結保存容器のキャップ
３１ 解凍用培地
３２ ミネラルオイル
Ａ 生物学的試料DESCRIPTION OF
本発明において、「生物学的試料保存用デバイス」とは、先端側と基部側を有し、先端側に前記生物学的試料を置くための試料載置部を備え、基部側に前記試料載置部に付設された取手部を備える。 In the present invention, the “biological sample storage device” has a tip side and a base side, and includes a sample mounting part for placing the biological sample on the tip side, and the sample mounting on the base side. A handle portion attached to the mounting portion is provided.
本発明の生物学的試料保存用デバイスのうち、少なくとも前記試料載置部が凍結保存容器に収納可能であり、前記試料載置部上に生物学的試料を置き、凍結保存容器に収納した状態で該生物学的試料を凍結保存しうる。本発明のデバイス若しくデバイスの試料載置部の形状は、容器に収納可能であれば良い。 Among the biological sample storage devices of the present invention, at least the sample mounting part can be stored in a cryopreservation container, and a biological sample is placed on the sample mounting part and stored in a cryopreservation container The biological sample can be stored frozen. The shape of the sample mounting portion of the device of the present invention or the device may be stored in a container.
ここで、「試料載置部が凍結保存容器に収納」とは、生物学的試料を置いた試料載置部を凍結保存容器本体内に挿入・配置させ、凍結保存容器本体を密封可能なキャップにより密封することをいう。また、「少なくとも試料載置部が凍結保存容器に収納」とは、本発明のデバイスに備えられた取手部が、後述するように凍結保存容器本体と嵌合若しくは螺合する構造を有することで、凍結保存容器のキャップ構造を含む場合があり、かかる場合には本発明のデバイスのうち、試料載置部のみが凍結保存容器に収納され、取手部は凍結保存容器を密封するキャップとして機能し、凍結保存容器には収納されない場合もあり得るからである。
また、「生物学的試料を置く」とは、生物学的試料が該デバイスの試料載置部に接触した状態をいい、好ましくはさらに生物学的試料が該試料載置部から脱落しないような状態をいう。例えば、試料液を滴下したり、組織を含む試料をのせて組織を付着させたりすることを含む。Here, “the sample placement part is stored in the cryopreservation container” means that the specimen placement part in which the biological sample is placed is inserted and arranged in the cryopreservation container body, and the cryopreservation container body can be sealed. Means sealing. Further, “at least the sample mounting portion is stored in the cryopreservation container” means that the handle part provided in the device of the present invention has a structure that fits or is screwed to the cryopreservation container body as described later. In such a case, only the sample mounting part of the device of the present invention is stored in the cryopreservation container, and the handle part functions as a cap for sealing the cryopreservation container. This is because it may not be stored in the cryopreservation container.
In addition, “putting a biological sample” means a state in which the biological sample is in contact with the sample mounting portion of the device, and preferably the biological sample is not dropped from the sample mounting portion. State. For example, it includes dropping a sample solution or placing a sample containing a tissue to attach the tissue.
本発明において「生物学的試料」とは、生体から採取した細胞、培養細胞、生体由来組織、培養組織等の生物学的な検体を含むものをいう。本明細書において検体とは、上記生物学的な検体であって、希少な検体や微少な検体であることで取り扱いが困難な検体や、検体の性質上取り扱いが困難な検体をいう。例えば、検体が細胞である場合は、具体的には特に胚、卵子細胞、精子細胞及び幹細胞等が挙げられる。このような細胞の由来は特に限定されないが、ヒト由来の細胞が好ましい。また、例えば、検体が組織の場合には、膜組織が挙げられ、例えば粘膜上皮組織、角膜上皮組織、培養角膜組織等が挙げられる。これらは、何れも非常に薄い膜厚を有し、膜そのものを有効活用しようとしても取り扱いが困難である。本発明の膜組織の例として、角膜が挙げられ、角膜移植用の角膜の凍結保存にも適用することができる。 In the present invention, “biological sample” refers to a sample containing a biological specimen such as a cell collected from a living body, a cultured cell, a living body-derived tissue, or a cultured tissue. In this specification, the sample refers to the above-described biological sample, which is a rare sample or a very small sample, which is difficult to handle or a sample that is difficult to handle due to the nature of the sample. For example, when the specimen is a cell, specifically, an embryo, an ovum cell, a sperm cell, a stem cell and the like can be specifically mentioned. The origin of such cells is not particularly limited, but human-derived cells are preferred. In addition, for example, when the specimen is a tissue, examples thereof include membrane tissue, and examples thereof include mucosal epithelial tissue, corneal epithelial tissue, cultured corneal tissue, and the like. All of these have a very thin film thickness and are difficult to handle even if the film itself is used effectively. An example of the membrane tissue of the present invention is the cornea, which can also be applied to cryopreservation of the cornea for corneal transplantation.
本発明において「凍結保存容器」とは、上記の生物学的試料、例えば細胞の凍結保存に通常使用される容器であれば良く特に限定されないが、好適には樹脂製の細胞保存用のバイアル又はバッグなどを利用することができる。バイアルの例として、細胞などを保存可能な市販のポリプロピレン製のクライオバイアルを挙げることができる。バッグの例として、特開平08-173505号公報などで開示されている超高分子量ポリエチレンフィルムと前記超高分子量ポリエチレンと相溶性のある樹脂フィルムとのラミネートフィルムからなる凍結保存用バッグを挙げることができる。 In the present invention, the “cryopreservation container” is not particularly limited as long as it is a container usually used for cryopreservation of the above biological sample, for example, cells. Bags can be used. Examples of the vial include a commercially available polypropylene cryovial capable of storing cells and the like. Examples of the bag include a cryopreservation bag comprising a laminate film of an ultrahigh molecular weight polyethylene film disclosed in JP-A-08-173505 and the like and a resin film compatible with the ultrahigh molecular weight polyethylene. it can.
本発明において「試料載置部」とは、上記生物学的試料を置くための部分をいう。試料載置部の形状は、フィルム状又はプレート状とすることができる。試料載置部は、該試料載置部上において生物学的試料が脱落するのを防止する素材又は構造であることが好ましい。試料載置部の素材として、例えば純水接触角が約６０〜９０度であるものを選択したり、試料載置部の形状として、凹部を設けることなどが挙げられる。凹部の深さは、生物学的試料が脱落せず、デバイスが凍結保存容器に収納しうる大きさを考慮すると、１〜４ｍｍ程度が好ましい。 In the present invention, the “sample placement part” refers to a part for placing the biological sample. The shape of the sample mounting portion can be a film shape or a plate shape. The sample mounting portion is preferably a material or a structure that prevents the biological sample from dropping off on the sample mounting portion. For example, a material having a pure water contact angle of about 60 to 90 degrees may be selected as the material for the sample mounting portion, or a recess may be provided as the shape of the sample mounting portion. The depth of the recess is preferably about 1 to 4 mm in consideration of the size that the biological sample does not fall off and the device can be stored in the cryopreservation container.
さらに、試料載置部の先端にはテーパー部を設けることが好ましい。該テーパー部を設けることで、例えば卵子細胞を解凍する際、ミネラルオイルにデバイスを浸して急速解凍する際に、表面張力の大きいミネラルオイルがデバイス凹部上に存在する細胞などに接触しやすくなる。 Furthermore, it is preferable to provide a tapered portion at the tip of the sample mounting portion. By providing the tapered portion, for example, when thawing an ovum cell, when the device is immersed in mineral oil and rapidly thawed, the mineral oil having a large surface tension can easily come into contact with the cells present on the device recess.
本発明の試料載置部の素材は、凍結保存に耐えうる素材であることが好ましいが、凍結保存容器内の環境がマイルドであるために、上記凍結保存容器のような耐寒性がある程度低い材料であっても使用可能である。また、試料載置部の素材は、稀少な細胞をのせることを考慮すると、医療用具の安全性試験に合格し、滅菌可能であり、耐寒性があることが好適である。これらの条件を満足する素材は、例えば、ポリエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリイミドおよびポリアミドから選択することができる。中でも製造が容易である観点から、ポリエチレンテレフタレートが好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。 The material for the sample mounting portion of the present invention is preferably a material that can withstand cryopreservation. However, since the environment in the cryopreservation container is mild, the material having a low cold resistance to a certain extent, such as the cryopreservation container. Even it can be used. In addition, considering that a rare cell is placed on the material of the sample mounting portion, it is preferable that the material passes the safety test of the medical device, can be sterilized, and has cold resistance. The material satisfying these conditions can be selected from, for example, polyethylene, polyester, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, polyimide, and polyamide. Among these, polyethylene terephthalate is preferable from the viewpoint of easy production, but the present invention is not limited thereto.
また、本発明の試料載置部の素材は、顕微鏡での観察を可能にする観点から、非晶性高分子であることが好ましい。本発明における非晶性高分子とは結晶化度が約３０％以下、好ましくは約１５％以下、特に好ましくは約５％以下の材料をいい、成型品の可視光（３８０〜７８０ｎｍ）領域の少なくとも一部の領域の透過率が約８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であるものをいう。これらの結晶化度及び透過率は成型条件などにより当業者が適宜制御できるものである。 Moreover, it is preferable that the raw material of the sample mounting part of this invention is an amorphous polymer from a viewpoint which enables observation with a microscope. The amorphous polymer in the present invention refers to a material having a crystallinity of about 30% or less, preferably about 15% or less, particularly preferably about 5% or less, and is in the visible light (380 to 780 nm) region of a molded product. The transmittance of at least a part of the region is about 80% or more, preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more. Those skilled in the art can appropriately control the crystallinity and transmittance according to molding conditions and the like.
本発明において「取手部」とは、上記生物学的試料を置いた試料載置部に直接触れることなく本発明のデバイスを取り扱うことができる部分をいい、例えば人差し指と親指又はピンセットなどで挟持することを可能とする構造であるものをいう。また、取手部の形状は、デバイスの取り扱いを容易とする観点から上記試料載置部よりも小さいことが好ましい。例えば、試料載置部を形成する材料に対する取手部を形成する材料の体積比で約０．００１〜０．７５、好ましくは約０．０１〜０．５、特に好ましくは約０．１〜０．３程度であるが、本発明はこれらに限定するものではない。
本発明のデバイスの取手部は、さらに凍結保存容器本体と嵌合若しくは螺合する構造を有することができる。かかる構造を有することにより、凍結保存容器を密封するためのキャップ構造を含むこととなり、取手部は凍結保存容器のキャップと一体化させることができる（図４参照）。In the present invention, the “handle portion” refers to a portion where the device of the present invention can be handled without directly touching the sample placement portion on which the biological sample is placed, and is sandwiched between, for example, an index finger and a thumb or tweezers. A structure that makes it possible. Moreover, it is preferable that the shape of a handle part is smaller than the said sample mounting part from a viewpoint which makes handling of a device easy. For example, the volume ratio of the material forming the handle portion to the material forming the sample placement portion is about 0.001 to 0.75, preferably about 0.01 to 0.5, and particularly preferably about 0.1 to 0. However, the present invention is not limited to these.
The handle portion of the device of the present invention may further have a structure that fits or is screwed with the cryopreservation container body. By having such a structure, a cap structure for sealing the cryopreservation container is included, and the handle portion can be integrated with the cap of the cryopreservation container (see FIG. 4).
上記試料載置部及び取手部は、特段の事情がない限り、同一の素材により一体成型することが好ましい。本発明のデバイスの成型方法は、押出成型、溶融成型、射出成型、圧縮成型および真空成型などが挙げられる。中でも成型が容易である観点から射出成型および真空成型が好ましいが、これに限定されるものではない。 The sample placement part and the handle part are preferably integrally formed of the same material unless there are special circumstances. Examples of the device molding method of the present invention include extrusion molding, melt molding, injection molding, compression molding, and vacuum molding. Of these, injection molding and vacuum molding are preferable from the viewpoint of easy molding, but are not limited thereto.
本発明のデバイスは、凍結保存容器と組み合わせることにより、「生物学的試料保存用デバイスセット」として提供することができる。
例えば、凍結保存容器がバイアルの場合には、生物学的試料保存用デバイス及び凍結保存容器（凍結保存容器本体及びキャップ）をセットとすることができる。他の態様として、上記デバイスの取手部に凍結保存容器本体と嵌合若しくは螺合する構造を設け、凍結保存容器のキャップと一体化させたもの、即ち試料載置部とキャップ構造を含む取手部が一体形成された生物学的試料保存用デバイス及び凍結保存容器本体をセットとすることができる。これにより、デバイスの試料載置部を凍結保存容器に容易に収納することができる。The device of the present invention can be provided as a “biological sample storage device set” by combining with a cryopreservation container.
For example, when the cryopreservation container is a vial, a biological sample storage device and a cryopreservation container (a cryopreservation container body and a cap) can be used as a set. As another embodiment, the handle portion of the device is provided with a structure for fitting or screwing with the cryopreservation container main body and integrated with the cap of the cryopreservation container, that is, the handle portion including the sample mounting portion and the cap structure A biological sample storage device and a cryopreservation container body in which are integrally formed can be used as a set. Thereby, the sample mounting part of a device can be easily accommodated in a cryopreservation container.
さらに、本発明は生物学的試料の凍結保存方法にも及ぶ。生物学的試料の凍結保存方法は、生物学的試料を置くための試料載置部と、前記試料載置部に付設された取手部とを備えてなる本発明のデバイスを用いて、少なくとも以下の工程を含む方法による。
１）生物学的試料を試料載置部に置く工程；
２）生物学的試料を置いた試料載置部を凍結保存容器に収納する工程；
３）凍結保存容器内の生物学的試料を０℃以下で保存する工程。Furthermore, the present invention extends to a method for cryopreserving biological samples. A biological sample cryopreservation method uses a device according to the present invention comprising a sample placement unit for placing a biological sample and a handle attached to the sample placement unit, and at least the following: According to a method including the following steps.
1) A step of placing a biological sample on the sample mounting part;
2) A step of storing the sample placement part on which the biological sample is placed in a cryopreservation container;
3) A step of storing a biological sample in a cryopreservation container at 0 ° C. or lower.
上記「１）生物学的試料を試料載置部に置く工程」とは、本発明の生物学的試料保存デバイスの試料載置部に生物学的試料を接触させ、好ましくは該試料載置部から生物学的試料が脱落しないように処理する工程をいう。生物学的試料に含有される検体が、例えば細胞である場合、該工程は、該細胞を懸濁した溶液を試料載置部に滴下することにより達成される。また、生物学的試料に含有される検体が膜組織である場合、該工程は、該膜組織を試料載置部に載せたり、巻き付けることなどにより達成される。 The above-mentioned “1) the step of placing a biological sample on the sample mounting part” refers to bringing the biological sample into contact with the sample mounting part of the biological sample storage device of the present invention, preferably the sample mounting part. The process which processes so that a biological sample may not fall out. When the specimen contained in the biological sample is, for example, a cell, this step is achieved by dropping a solution in which the cell is suspended onto the sample mounting portion. In addition, when the specimen contained in the biological sample is a membrane tissue, the step is achieved by placing the membrane tissue on a sample placement unit, winding it, or the like.
上記「２）生物学的試料を置いた試料載置部を凍結保存容器に収納する工程」とは、例えば凍結保存容器がバイアルの場合には、生物学的試料を置いた試料載置部を凍結保存容器本体内に挿入・配置させ、凍結保存容器本体と嵌合しうる構造を有するキャップにより密封することをいう。試料載置部を収納するとき、生物学的試料が試料載置部から脱落しないよう注意して挿入することが重要である。デバイスの構造により、試料載置部及び取手とともに凍結保存容器に収納することもできる。 The above-mentioned “2) the step of storing the sample placing part on which the biological sample is placed in the cryopreservation container” means, for example, when the cryopreservation container is a vial, the sample placing part on which the biological sample is placed. It is inserted and arranged in the cryopreservation container body and sealed with a cap having a structure that can be fitted to the cryopreservation container body. When storing the sample mounting part, it is important to insert it carefully so that the biological sample does not fall out of the sample mounting part. Depending on the structure of the device, it can be housed in a cryopreservation container together with the sample placement section and the handle.
上記「３）凍結保存容器を０℃以下で保存する工程」において、保存温度の好ましい態様としては、約−２０℃以下、好ましくは約−８０℃以下、特に好ましくは約−１９６℃である。これらの温度条件の設定は、例えば、市販のディープフリーザー、液体窒素およびドライアイスなどで達成される。中でも長期の保存を可能とする液体窒素下での保存、つまり約−１９６℃における保存が好ましい。 In the above-mentioned “3) step of storing the cryopreservation container at 0 ° C. or lower”, a preferable embodiment of the storage temperature is about −20 ° C. or lower, preferably about −80 ° C. or lower, particularly preferably about −196 ° C. The setting of these temperature conditions is achieved by, for example, a commercially available deep freezer, liquid nitrogen and dry ice. Among these, storage under liquid nitrogen that enables long-term storage, that is, storage at about -196 ° C is preferable.
以下に本発明の具体的な生物学的試料の保存方法について説明するが、詳細な条件などは当業者により適宜設定できるものであり、本発明は以下の説明に限定されるものはない。 Although the specific biological sample storage method of the present invention will be described below, detailed conditions and the like can be appropriately set by those skilled in the art, and the present invention is not limited to the following description.
例えば、生物学的試料に含有される検体が細胞の場合は、以下の工程を含む方法により細胞を凍結保存することができる。
１）細胞を採取する工程；
２）凍結保存液に前記細胞を懸濁し、細胞含有溶液である生物学的試料を調製する工程；
３）試料載置部上に前記生物学的試料を滴下する工程；
４）前記生物学的試料が滴下された試料載置部を凍結保存容器に収納する工程；
５）凍結保存容器内の生物学的試料を凍結保存する工程。For example, when the specimen contained in the biological sample is a cell, the cell can be cryopreserved by a method including the following steps.
1) collecting cells;
2) suspending the cells in a cryopreservation solution and preparing a biological sample which is a cell-containing solution;
3) A step of dripping the biological sample onto the sample mounting portion;
4) The process of storing the sample mounting part by which the said biological sample was dripped in a cryopreservation container;
5) A step of cryopreserving the biological sample in the cryopreservation container.
上記「１）細胞を採取する工程」において、細胞は生体から採取しても良いし、又は培養細胞から採取しても良い。 In the “1) step of collecting cells”, the cells may be collected from a living body or collected from cultured cells.
上記「２）凍結保存液に前記細胞を懸濁し、細胞含有溶液である生物学的試料を調製する工程」において、細胞懸濁溶液中の細胞数は特に限定されないが、例えば細胞が精子細胞である場合は約２×１０７〜２０×１０７ cells/mlであり、卵子細胞である場合は１００〜２００ cells/mlである。これらの濃度範囲は、個体差等によりその範囲から逸脱していてもよい。凍結保存液は、細胞の種類により異なり、一律に述べることはできないが、公知の細胞用培地、或いは今後開発される細胞用培地を用いることができる。例えば保護成分として１０％程度のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）及び５〜１０％のアルブミンを添加した培地等が例示される。In the above “2) step of suspending the cells in a cryopreservation solution and preparing a biological sample that is a cell-containing solution”, the number of cells in the cell suspension solution is not particularly limited. For example, the cells are sperm cells. In some cases, it is about 2 × 10 7 to 20 × 10 7 cells / ml, and in the case of an oocyte, it is 100 to 200 cells / ml. These concentration ranges may deviate from the range due to individual differences or the like. The cryopreservation solution varies depending on the cell type and cannot be described uniformly, but a known cell culture medium or a cell culture medium developed in the future can be used. For example, a medium supplemented with about 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 5-10% albumin as a protective component is exemplified.
また、上記「５）生物学的試料を凍結保存する工程」において、細胞は、公知の方法、例えば液体窒素で温度をコントロールできるプログラム凍結装置などを用いて凍結保存することができる。本発明のデバイスを用いると生物学的試料である細胞懸濁液量を、微量な状態で従来の凍結保存容器中で保存するため、特に上記のようなプログラム凍結装置を使用しなくても、液体窒素に浸しても空気層を介して緩慢な条件で凍結することができ、細胞の損傷を防止することができる。
また、上記の工程を含むものであれば、上記の工程の他、必要な工程を組み込むことができる。In the above-mentioned “5) Step of cryopreserving a biological sample”, the cells can be cryopreserved using a known method, for example, a program freezing apparatus capable of controlling the temperature with liquid nitrogen. Using the device of the present invention, the amount of a cell suspension, which is a biological sample, is stored in a conventional cryopreservation container in a small amount, so that even without using a program freezing apparatus as described above, Even if immersed in liquid nitrogen, it can be frozen under a slow condition through an air layer, and cell damage can be prevented.
In addition, if the above steps are included, necessary steps can be incorporated in addition to the above steps.
他の例として、生物学的試料に含有される検体が角膜の場合は、以下の工程を含む方法により膜組織を凍結保存することができる。
１）角膜を採取する工程；
２）凍結保存用溶液に前記角膜を浸潤し、生物学的試料を調製する工程；
３）試料載置部に前記生物学的試料を置き、角膜をデバイス上に広げる工程；
４）前記生物学的試料を置いた試料載置部を凍結保存容器に収納する工程；
５）凍結保存容器内の生物学的試料を凍結保存する工程。As another example, when the specimen contained in the biological sample is the cornea, the membrane tissue can be cryopreserved by a method including the following steps.
1) step of collecting cornea;
2) Infiltrating the cornea into a cryopreservation solution to prepare a biological sample;
3) A step of placing the biological sample on the sample mounting portion and spreading the cornea on the device;
4) The process of storing the sample mounting part which put the said biological sample in a cryopreservation container;
5) A step of cryopreserving the biological sample in the cryopreservation container.
上記「１）角膜を採取する工程」において、角膜は、眼球から切開により切り出し、不要な組織を除去して得ることができる。 In the “1) Step of collecting cornea”, the cornea can be obtained by cutting out from the eyeball by incision and removing unnecessary tissue.
上記「２）凍結保存用溶液に前記角膜を浸潤し、生物学的試料を調製する工程」において、角膜の湿潤に用いる溶媒は、主に生理食塩水が挙げられるが、これに限定されるものではない。 In the above “2) Step of infiltrating the cornea into a cryopreservation solution to prepare a biological sample”, the solvent used for wetting the cornea mainly includes physiological saline, but is not limited thereto. is not.
上記「５）生物学的試料を凍結保存する工程」において、角膜は、公知の方法、例えば液体窒素で温度をコントロールできるプログラム凍結装置などを用いて凍結保存することができる。本発明のデバイスを用いると微量な状態で従来公知の凍結保存容器中で保存するため、空気層を介して緩慢な条件で凍結することができ、角膜の損傷を防止することができる。
また、上記の工程を含むものであれば、上記の工程の他、必要な工程を組み込むことができる。In the above-mentioned “5) Step of cryopreserving a biological sample”, the cornea can be cryopreserved using a known method, for example, a program freezing apparatus capable of controlling the temperature with liquid nitrogen. When the device of the present invention is used, it is stored in a conventionally known cryopreservation container in a very small amount, so that it can be frozen under a slow condition via an air layer, and damage to the cornea can be prevented.
In addition, if the above steps are included, necessary steps can be incorporated in addition to the above steps.
また、本発明のデバイスを用いて生物学的試料を凍結保存すると、凍結保存された試料が微量であるため、容易に解凍することができる。ここで本発明の生物学的試料の保存方法には、凍結保存された試料を解凍する方法も含む。具体的には、ミネラルオイルや培地などを入れたスピッツに凍結保存した試料を載せたデバイスをそのまま浸漬させることにより解凍することができる。 In addition, when a biological sample is cryopreserved using the device of the present invention, the amount of the cryopreserved sample is very small and can be easily thawed. Here, the biological sample storage method of the present invention also includes a method of thawing a cryopreserved sample. Specifically, it can be thawed by immersing a device on which a cryopreserved sample is placed in a Spitz containing mineral oil or a medium.
本発明の理解を助けるために、以下に実施例として添付図面を参照しながら説明する。なお、図中同一符号は同一又は対応する部分を示すものとする。本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 In order to help the understanding of the present invention, the following description will be given by way of example with reference to the accompanying drawings. In the drawings, the same reference numerals indicate the same or corresponding parts. The present invention is not limited to these examples.
（実施例１）生物学的試料保存用デバイス１
図１は本発明のデバイス(1)を示す図である。本実施例のデバイスは、先端側に試料載置部(11)及び基部側に取手部(12)を設け、試料載置部(11)及び取手部(12)は一体となっている。また、試料載置部(11)には、凹部(111)が設けられている。このデバイスは、ポリエチレンテレフタレートフィルムを射出成型又は真空成型により製造することができる。Example 1 Biological
FIG. 1 shows a device (1) of the present invention. In the device of this example, a sample mounting portion (11) is provided on the distal end side and a handle portion (12) is provided on the base side, and the sample mounting portion (11) and the handle portion (12) are integrated. In addition, the sample mounting portion (11) is provided with a recess (111). In this device, a polyethylene terephthalate film can be manufactured by injection molding or vacuum molding.
（実施例２）生物学的試料保存用デバイス２
図２は本発明のデバイス(1)の他の実施態様を示す図である。本実施例のデバイスは、実施例１のデバイスと同様に先端側に試料載置部(11)及び基部側に取手部(12)を設け、さらに試料載置部(11)の先端にテーパー部(112)を有する形態である。デバイスの材料及びデバイスの製造方法などは、実施例１と同様である。Example 2 Biological
FIG. 2 is a diagram showing another embodiment of the device (1) of the present invention. Similar to the device of the first embodiment, the device of this embodiment is provided with a sample mounting portion (11) on the tip side and a handle portion (12) on the base side, and a tapered portion at the tip of the sample mounting portion (11). (112). Device materials, device manufacturing methods, and the like are the same as in the first embodiment.
（実施例３）生物学的試料保存用セット１
図３は本発明の生物学的試料保存用セットを示す図である。図３に示す生物学的試料保存用セットは、実施例１のデバイス(1)と凍結保存容器(2)であるポリプロピレン製のクライオバイアルを含む。本実施例では、凍結保存容器(2)は、凍結保存容器本体(21)及びキャップ(22)より構成される。
本実施例の生物学的試料保存用セットを用いた細胞の保存方法は次のとおりである。
デバイスの試料載置部(11)に、生物学的試料(A)を置く。次にデバイスの取手部(12)をピンセットなどでつまみ、細胞保存容器本体(21)にデバイス(1)を挿入する。凍結保存容器本体(21)にキャップ(22)をして凍結保存容器(2)を密封した後、液体窒素に浸漬し、極低温下（約−１９６℃）で凍結保存する。(Example 3) Biological
FIG. 3 is a diagram showing a biological sample storage set according to the present invention. The biological sample storage set shown in FIG. 3 includes the cryovial made of polypropylene, which is the device (1) of Example 1 and the cryopreservation container (2). In this embodiment, the cryopreservation container (2) is composed of a cryopreservation container body (21) and a cap (22).
The cell storage method using the biological sample storage set of this example is as follows.
The biological sample (A) is placed on the sample mounting part (11) of the device. Next, the handle (12) of the device is pinched with tweezers or the like, and the device (1) is inserted into the cell storage container body (21). The cryopreservation container body (21) is capped (22) and the cryopreservation container (2) is sealed, then immersed in liquid nitrogen and stored frozen at a cryogenic temperature (about -196 ° C).
（実施例４）生物学的試料保存用セット２
図４は本発明の生物学的試料保存用セットの他の実施態様を示す図である。図４に示す生物学的試料保存用セットは、押出成型により作製されたポリプロピレン製のプレートによる試料載置部(11)及びこれに付設され、細胞保存容器のキャップ構造を含む取手部(12)とからなるデバイス(1)と、細胞保存容器本体(21)により構成される。本実施例の生物学的試料保存用セットにおいては、デバイスの取手部(12)と細胞保存容器のキャップ(22)が一体となっている。
本実施例の生物学的試料保存用セットを用いた細胞の保存方法は次のとおりである。
デバイスの試料載置部(11)に、生物学的試料(A)を置く。次に細胞保存容器のキャップ(22)でありかつデバイスの取手部(12)でもある部分をつまみ、細胞保存容器本体(21)に試料載置部(11)を挿入する。前記キャップ(22)で密封した後、凍結保存容器(2)を液体窒素に浸漬し、極低温下（約−１９６℃）で凍結保存する。(Example 4) Biological
FIG. 4 is a diagram showing another embodiment of the biological sample storage set of the present invention. The biological sample storage set shown in FIG. 4 includes a sample placement part (11) by a polypropylene plate produced by extrusion molding, and a handle part (12) attached thereto and including a cap structure of a cell storage container. And a cell storage container body (21). In the biological sample storage set of this embodiment, the device handle (12) and the cell storage container cap (22) are integrated.
The cell storage method using the biological sample storage set of this example is as follows.
The biological sample (A) is placed on the sample mounting part (11) of the device. Next, the part which is the cap (22) of the cell storage container and also the handle part (12) of the device is pinched, and the sample mounting part (11) is inserted into the cell storage container body (21). After sealing with the cap (22), the cryopreservation container (2) is immersed in liquid nitrogen and stored frozen at an extremely low temperature (about -196 ° C).
（実施例５）凍結した生物学的試料の解凍例１
図５は実施例１の生物学的試料保存デバイス(1)を用いて生物学的試料を凍結したものを、該デバイスを凍結保存容器(2)から取り出し、スピッツ内の凍結解凍用の培地(31)に浸すことによる解凍方法を示す図である。スピッツ内の凍結解凍用の培地(31)の温度は、２０〜３０℃程度に調節すればよい。Example 5 Example 1 of Thawing a Frozen Biological Sample
FIG. 5 shows a sample obtained by freezing a biological sample using the biological sample storage device (1) of Example 1 and removing the device from the cryopreservation container (2). It is a figure which shows the thawing | decompression method by immersing in 31). What is necessary is just to adjust the temperature of the culture medium (31) for freezing and thawing in Spitz to about 20-30 degreeC.
（実施例６）凍結した生物学的試料の解凍例２
図６は実施例２の生物学的試料保存デバイス(1)を用いて生物学的試料を凍結したものを、該デバイスを凍結保存容器(2)から取り出し、ミネラルオイル(32)に浸すことによる解凍方法を示す図である。ミネラルオイル(32)の温度は、約１０〜４０℃程度に調節すればよい。Example 6 Thawing Example 2 of Frozen Biological Sample
FIG. 6 shows the result of freezing a biological sample using the biological sample storage device (1) of Example 2 from the cryopreservation container (2) and immersing it in mineral oil (32). It is a figure which shows the thawing | decompression method. What is necessary is just to adjust the temperature of mineral oil (32) to about 10-40 degreeC.
以上説明したように、本発明の生物学的試料保存用デバイスを使用すると、希少な検体を含む試料や取り扱いが困難な試料の凍結保存が可能となり、該凍結した試料の解凍も容易に行うことができる。本発明のデバイスは、既存の凍結保存容器に収納することもできることから、簡便かつ安価に凍結保存及び解凍をすることができる。
さらに本発明のデバイスを使用すると、取り扱いが困難な検体、例えば角膜等の検体を損傷することなく凍結保存でき、さらに容易に解凍することができる。As described above, when the biological sample storage device of the present invention is used, a sample containing a rare specimen or a sample that is difficult to handle can be cryopreserved, and the frozen sample can be easily thawed. Can do. Since the device of the present invention can be housed in an existing cryopreservation container, it can be cryopreserved and thawed easily and inexpensively.
Furthermore, when the device of the present invention is used, a specimen that is difficult to handle, for example, a specimen such as a cornea can be frozen and stored without damage, and can be thawed more easily.
Claims (7)
前記デバイスは、生物学的試料を置くための試料載置部と、前記試料載置部に付設された取手部とを備え、
前記試料載置部は、該試料載置部上において生物学的試料が脱落するのを防止する構造であり、
該試料載置部上において生物学的試料が脱落するのを防止する構造として、前記試料載置部の形状が凹状であり、
前記試料載置部の先端側にテーパー部を設けてなり、
前記デバイスの少なくとも試料載置部が前記凍結保存容器に収納しうる構造からなる
生物学的試料保存用デバイス。A device for storing a biological sample in a cryopreservation container,
The device includes a sample placement unit for placing a biological sample, and a handle attached to the sample placement unit,
The sample mounting part is a structure for preventing a biological sample from dropping on the sample mounting part ,
As a structure for preventing the biological sample from dropping on the sample mounting part, the shape of the sample mounting part is concave,
A tapered portion is provided on the tip side of the sample mounting portion,
A biological sample storage device having a structure in which at least a sample mounting portion of the device can be stored in the cryopreservation container.
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