JP5011810B2 - Cryopreservation container and cryopreservation method - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a container for freeze preservation without getting the invasion of liquid nitrogen, sundry bacteria or viruses into the inside of the container and suitable for the injection, preservation and thawing of a small volume bio-specimen. <P>SOLUTION: This container for the freeze preservation is equipped with concretely a container main body consisting of a flexible resin, an opening part communicating with the inside of the container main body and sealable by welding, and a seal-opening part communicating with the inside of the container main body by opening the seal. The method of freeze-preserving by using the above container is also provided. By using the container for freeze preservation, it is possible to perform the preservation of rare bio-specimens safely and easily. Further in detail, since the container for freeze preservation is hardy invaded by the liquid nitrogen, sundry bacteria or viruses to the inside of the container, the bio-specimen preserved at the inside of the container can not be contaminated. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&amp;INPIT

Description

本発明は、生体試料の凍結保存容器に関する。さらに、本発明は前記凍結保存容器を用いた凍結保存方法に関する。   The present invention relates to a cryopreservation container for biological samples. Furthermore, the present invention relates to a cryopreservation method using the cryopreservation container.

近年、再生医療、細胞含有医薬及び不妊治療などの細胞医療分野がめざましい発展を遂げている。これらの細胞医療分野において、生物試料を凍結保存する技術は全ての当業者が実施する必要不可欠な技術である。   In recent years, the field of cell medicine such as regenerative medicine, cell-containing medicine and infertility treatment has made remarkable progress. In these cell medical fields, a technique for cryopreserving a biological sample is an indispensable technique to be carried out by all persons skilled in the art.

細胞を凍結保存するための容器として、本出願人は超高分子量ポリエチレン層と低密度ポリエチレン層との積層フィルムにより形成したバッグの発明が開示されている（特許文献１）。この発明の実施品は、近年のわが国における臍帯血バンクの発展に貢献している。また、前記凍結保存バッグ以外にも、ポリイミドフィルムとフッ素化エチレンプロピレン重合体フィルムとの積層フィルムからなるもの（特許文献２）や、テトラフルオロエチレンとエチレンの共重合体フィルムからなるもの（特許文献３）等が提案されている。さらに、特許文献４には、電子線照射し２軸延伸されたエチレン−酢酸ビニル共重合体のフィルムで成形された凍結保存バイアルが開示されている。特許文献５には、２軸延伸された架橋ポリエチレンフィルムで成形された凍結保存バイアルが開示されている。   As a container for cryopreserving cells, the present applicant has disclosed an invention of a bag formed by a laminated film of an ultrahigh molecular weight polyethylene layer and a low density polyethylene layer (Patent Document 1). The product of the present invention has contributed to the development of the cord blood bank in Japan in recent years. In addition to the cryopreservation bag, a film made of a laminated film of a polyimide film and a fluorinated ethylene propylene polymer film (Patent Document 2), or a film made of a copolymer film of tetrafluoroethylene and ethylene (Patent Document) 3) etc. have been proposed. Furthermore, Patent Document 4 discloses a cryopreservation vial formed of a film of an ethylene-vinyl acetate copolymer that has been irradiated with an electron beam and biaxially stretched. Patent Document 5 discloses a cryopreservation vial formed of a biaxially stretched crosslinked polyethylene film.

係るバッグを用いて浮遊系細胞を凍結保存するには、まず細胞を懸濁した液を調製し、バッグに備えたポート又はポートに結合されたチューブから前記懸濁液を注入する。次に、バッグに備えたポート又はポートに結合されたチューブを溶着することにより封をする。そして、浮遊系細胞を収容したバッグを液体窒素内に浸漬させる。   In order to cryopreserve floating cells using such a bag, first, a solution in which the cells are suspended is prepared, and the suspension is injected from a port provided in the bag or a tube connected to the port. Next, it seals by welding the port with which the bag was equipped, or the tube couple | bonded with the port. Then, the bag containing the floating cells is immersed in liquid nitrogen.

ところで、実験室レベルにおける生物試料の凍結保存には、ポリプロピレン製のクライオバイアルが一般的に使用されている。クライオバイアルは、図３に示すようにバイアル開口に蓋を螺合する典型的なバイアルである。係るクライオバイアルの使用方法は、容器内に生物試料を収容後、開口に蓋を螺合・装着し、そのまま液体窒素に浸漬して保存する。   By the way, polypropylene cryovials are generally used for cryopreservation of biological samples at the laboratory level. A cryovial is a typical vial in which a lid is screwed into a vial opening as shown in FIG. The cryovial is used by storing a biological sample in a container, screwing and attaching a lid to the opening, and immersing it in liquid nitrogen for storage.

しかしながら、生物試料を収容したクライオバイアルを液体窒素内で保存する際、クライオバイアルの容器本体と蓋との隙間から液体窒素又は当該液体窒素に存在する雑菌（主にマイコプラズマ）が容器内部に侵入するおそれがある。隙間は、容器本体と蓋の成形の際における樹脂の熱収縮に起因して生じるものである。係る隙間が生じないように成形すると、製造コストが非常に高価となるばかりではなく、蓋と容器本体との摩擦により樹脂が削れるおれもある。   However, when a cryovial containing a biological sample is stored in liquid nitrogen, liquid nitrogen or various germs (mainly mycoplasma) present in the liquid nitrogen enter the inside of the container from the gap between the container body and the lid of the cryovial. There is a fear. The gap is caused by the heat shrinkage of the resin during the molding of the container body and the lid. If molding is performed so that such a gap does not occur, not only the manufacturing cost becomes very expensive, but also the resin may be scraped off due to friction between the lid and the container body.

さらに、容器内に液体窒素が侵入した状態でバイアルを液体窒素タンクから取り出すと、容器内の温度の上昇により液体窒素が急激に膨張する。その結果、バイアルが破裂する又は蓋が発射され、作業者が怪我をするという事故が発生するおそれがある。もし、このような事故で作業者が怪我をしてしまえば、作業者の傷口から液体窒素の雑菌が侵入し、バイオハザードに発展するおそれがある。   Further, when the vial is taken out from the liquid nitrogen tank in a state where liquid nitrogen has entered the container, the liquid nitrogen rapidly expands due to a rise in the temperature in the container. As a result, the vial may burst or the lid may be fired, resulting in an accident in which the operator is injured. If an operator is injured in such an accident, liquid nitrogen bacteria may enter from the operator's wound and develop into a biohazard.

さらに、前記液体窒素内の雑菌に限らず、ヒト由来の生体試料中に肝炎やエイズウイルスなどを含む場合も、凍結中にウイルスを持った細胞を凍結した容器から、他の生体試料へ感染するおそれもある。   Furthermore, not only the germs in the liquid nitrogen, but also when a human-derived biological sample contains hepatitis, AIDS virus, etc., it infects other biological samples from a container in which cells with viruses are frozen during freezing. There is also a fear.

係る課題を解決する手段として、前記特許文献１〜５のバッグを用いることが考えられる。しかしながら、特許文献１〜５のバッグは容量が大きいために、小容量の生物試料を保存するのには必ずしも適していない。何故ならば、当該バッグには生体試料の分散液を導入するためのポートを備える必要があり、その分バッグの内容積を大きくする必要があるためである。すると、バッグに十分収容する程度の容量にするために、保存液などにより生物試料を希釈する必要がある。この結果、凍結保存後に当該試料を使用する際に、濃縮という煩雑な作業を行う必要がある。   As means for solving such problems, it is conceivable to use the bags of Patent Documents 1 to 5. However, since the bags of Patent Documents 1 to 5 have a large volume, they are not necessarily suitable for storing a small volume of biological sample. This is because the bag needs to have a port for introducing the dispersion liquid of the biological sample, and the inner volume of the bag needs to be increased accordingly. Then, it is necessary to dilute the biological sample with a storage solution or the like in order to make the capacity enough to be stored in the bag. As a result, when using the sample after cryopreservation, it is necessary to perform a complicated operation of concentration.

また、他の解決手段として、市販の熱可塑性チューブを用いる方法がある。具体的には、当該熱可塑性チューブにクライオバイアルを挿入した後、熱により収縮することにより、液体窒素の混入を防止するものである。しかしながら、熱収縮チューブをヒートガンなどで１００℃近くまでチューブを加熱することから、容器内の細胞が熱により死滅する恐れがある。またチューブの開口部はヒートガンで加熱したピンセットでチューブをつまんで封止するが、この際にチューブが破損するケースが多い。このため、これらの製品はあまり普及していない。   Another solution is to use a commercially available thermoplastic tube. Specifically, after the cryovial is inserted into the thermoplastic tube, it is shrunk by heat to prevent liquid nitrogen from being mixed. However, since the heat-shrinkable tube is heated to near 100 ° C. with a heat gun or the like, the cells in the container may be killed by heat. The tube opening is pinched and sealed with tweezers heated with a heat gun, and the tube is often damaged at this time. For this reason, these products are not very popular.

さらに、他の解決手段として、液体窒素の気層中や超低温フリーザーで保存する方法も考えられる。しかし、長期間に細胞を保存する場合には、気層でフリーザーやタンクの蓋を開閉するたびに、温度変化が発生するため、信頼性に問題がある。   Furthermore, as another solution, a method of storing in an air layer of liquid nitrogen or an ultra-low temperature freezer can be considered. However, when cells are stored for a long period of time, each time the freezer or tank lid is opened and closed in the air layer, a temperature change occurs, which causes a problem in reliability.

特許第２８７６５８８号公報Japanese Patent No. 2876588 特公昭４９−８０７９号公報Japanese Patent Publication No.49-8079 実公昭５５−５５０６９号公報Japanese Utility Model Publication No. 55-55069 特公昭５５−４４９７７号公報Japanese Patent Publication No. 55-44977 特公昭６２−５７３５１号公報Japanese Patent Publication No. 62-57351

本発明の課題は、液体窒素、雑菌又はウイルスが容器内部に侵入することがなく、少容量の生物試料の注入、保存及び取り出しに適した凍結保存容器を提供することである。   An object of the present invention is to provide a cryopreservation container suitable for injecting, storing, and taking out a small-volume biological sample without liquid nitrogen, bacteria, or viruses entering the container.

本発明は、
［１］ 生物試料を凍結保存するための容器であって、
容器本体と、
前記容器本体内部と連通し、溶着により封止可能な開口部と、
開封することにより前記容器本体内部と連通する開封部
とを備えた凍結保存容器、
［２］ 前記開口部は、注入用具と接続が可能であり、且つ、容器本体内部の空気を排気可能な構造である［１］に記載の凍結保存容器、
［３］ 開封部が、ねじりにより破断するくびれ部構造である［１］に記載の凍結保存容器、
［４］ 凍結保存容器を用いて生物試料を凍結保存するための方法であって、
前記凍結保存容器は、容器本体と、
前記容器本体内部と連通し、溶着により封止することが可能な開口部と、
開封することにより前記容器本体内部と連通する開封部を備え、
前記開口部から生物試料を導入し、前記生物試料を容器本体内に収容するステップと、
前記開口部を溶着により封止するステップと、
前記容器に収容された生体試料を極低温下で保存するステップ
とを含む凍結保存方法、並びに、
［５］ さらに、収容した生物試料を解凍するステップと、
開封部を開封することにより生体試料を取り出すステップと、
及び、前記収容した生物試料を取り出すステップ
とを含む［４］に記載の凍結保存方法に関する。 The present invention
[1] A container for cryopreserving a biological sample,
A container body;
An opening that communicates with the interior of the container body and can be sealed by welding;
A cryopreservation container having an opening portion communicating with the inside of the container body by opening the container,
[2] The cryopreservation container according to [1], wherein the opening is connectable to an injection tool and has a structure capable of exhausting air inside the container body.
[3] The cryopreservation container according to [1], wherein the opening part has a constricted part structure that is broken by twisting
[4] A method for cryopreserving a biological sample using a cryopreservation container,
The cryopreservation container includes a container body,
An opening that communicates with the interior of the container body and can be sealed by welding;
Comprising an opening that communicates with the interior of the container body by opening the container;
Introducing a biological sample from the opening, and storing the biological sample in a container body;
Sealing the opening by welding;
A cryopreservation method comprising a step of storing the biological sample contained in the container at a cryogenic temperature, and
[5] Furthermore, a step of thawing the stored biological sample;
Removing the biological sample by opening the opening;
And a step of taking out the stored biological sample.

本発明の凍結保存容器によれば、稀少な生物試料の保存を安全且つ容易に行うことができる。より詳しくは、凍結保存容器は、液体窒素、雑菌又はウイルスが容器内部に侵入しにくいために、容器内部に保存した生物試料が汚染されることがない。そして、液体窒素による自己を防止することができるため、作業者が怪我をするおそれがない。   According to the cryopreservation container of the present invention, a rare biological sample can be stored safely and easily. More specifically, in a cryopreservation container, liquid nitrogen, bacteria, or viruses do not easily enter the container, so that biological samples stored in the container are not contaminated. And since self by liquid nitrogen can be prevented, there is no possibility that an operator may be injured.

以下、本発明について図面を用いて説明する。   The present invention will be described below with reference to the drawings.

図１は本発明の凍結保存容器を示す図である。「凍結保存容器」とは、生物試料を収容しうる容器をいい、少なくとも０度以下の環境下に物理的強度に耐えうる材料で構成された容器をいう。さらに、凍結保存時に液体窒素、雑菌又はウイルスが容器内部に侵入しにくい容器をいう。本発明の凍結保存容器の構成は、可撓性樹脂からなる容器本体１と、前記容器本体内部と連通し、封止可能な開口部２、及び、開封することにより前記容器本体内部と連通可能な開封部３を備える。   FIG. 1 shows a cryopreservation container according to the present invention. “Cryopreservation container” refers to a container that can contain a biological sample, and is a container that is made of a material that can withstand physical strength in an environment of at least 0 degrees or less. Furthermore, it refers to a container in which liquid nitrogen, germs or viruses do not easily enter the container during cryopreservation. The structure of the cryopreservation container according to the present invention can be communicated with the container body 1 made of a flexible resin, the inside of the container body, the sealable opening 2, and the inside of the container body by opening the container. The opening part 3 is provided.

「生物試料」とは、生体由来のものであれば、特に限定されるものではなく、動物組織や微生物が含まれる。例えば、
ｉ）全血、赤血球、白血球、血漿、血小板及び多血小板血漿などの血液成分
ｉｉ）骨骸単核細胞、造血幹細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞、精子細胞及び卵子細胞などの希少な細胞、
ｉｉｉ）薬剤耐性結核菌などの微生物変異体などを含む微生物
ｉｖ）精子及び卵子
などが挙げられる。これら生物試料の中でも、保存する量が少量である観点から、ｉｉ）希少な細胞、並びに、ｉｖ）精子及び卵子であり、特に好ましくは、ｉｖ）精子及び卵子である。 The “biological sample” is not particularly limited as long as it is derived from a living body, and includes animal tissues and microorganisms. For example,
i) blood components such as whole blood, red blood cells, white blood cells, plasma, platelets and platelet-rich plasma; ii) rare cells such as bone skeleton mononuclear cells, hematopoietic stem cells, ES cells, mesenchymal stem cells, sperm cells and egg cells;
iii) Microorganisms including microbial mutants such as drug-resistant Mycobacterium tuberculosis iv) Sperm and eggs. Among these biological samples, ii) rare cells and iv) sperm and ovum, particularly preferably iv) sperm and ovum, from the viewpoint of storing a small amount.

「凍結保存」とは、０度以下での環境下で保存することをいうが、長期にわたって保存できる観点から、好ましくは−２０度以下（極低温下）、さらに好ましくは−８０度以下、特に好ましくは−１９６度（液体窒素温度）の環境下で保存することをいう。凍結保存を行う方法としては、例えば、市販のディープフリーザーなどの装置を用いて行う方法、及び、ドライアイス、液体窒素及び液体ヘリウムなどの冷却物質を用いて行う方法などが挙げられる。これらの凍結保存方法の中でも長期にわたって保存できる観点から、液体窒素が好ましい。   “Frozen storage” means storage in an environment at 0 ° C. or less, but from the viewpoint of storage over a long period of time, it is preferably −20 ° C. (under cryogenic temperature), more preferably −80 ° C. or less. Preferably, it means storing in an environment of -196 degrees (liquid nitrogen temperature). Examples of the cryopreservation method include a method using a commercially available deep freezer and the like, and a method using a cooling substance such as dry ice, liquid nitrogen, and liquid helium. Among these cryopreservation methods, liquid nitrogen is preferable from the viewpoint of storage over a long period of time.

「容器本体」とは、生物試料を収容するための空間（ハウジング）を備えた汎用的な容器の形状を有するものをいう。   The “container main body” refers to a container having a general-purpose container shape having a space (housing) for accommodating a biological sample.

容器本体１には、開口部２を設ける。「開口部」とは、容器本体１の内部と連通する構造であって、生体試料を容器本体１の内部に導入することができ、溶着による封止作業により容器本体１の内部の密封を達成できる部分をいう。その上面図は、例えば、図２のような扁平的な瞳形状を有する。つまり、本発明の開口部２は、凍結保存容器における封止用の蓋の役割を果たす。開口部２は溶着することで封止するため、液体窒素などが容器本体内部に侵入することがない。   The container body 1 is provided with an opening 2. The “opening” is a structure that communicates with the inside of the container body 1, and a biological sample can be introduced into the container body 1, and the inside of the container body 1 is sealed by a sealing operation by welding. The part that can be done. The top view has, for example, a flat pupil shape as shown in FIG. That is, the opening 2 of the present invention serves as a sealing lid in the cryopreservation container. Since the opening 2 is sealed by welding, liquid nitrogen or the like does not enter the container body.

開口部２は、容器本体内への生物試料の導入が容易となる様に、シリンジやピペットなどの注入用具と接続が可能であり、さらには、生物試料の注入と同時に容器本体内部の空気を排気する構造であることが好ましい。例えば、図３に示すような略円形状でシリンジの先端が接続可能な構造（注入用具接続構造２１）とし、当該注入用具接続構造の周囲に設けた連通構造２２により、容器本体内部の空気を排気することができる。   The opening 2 can be connected to an injection tool such as a syringe or pipette so that the biological sample can be easily introduced into the container body. A structure for exhausting is preferable. For example, as shown in FIG. 3, a structure (injection tool connection structure 21) having a substantially circular shape that can be connected to the tip of a syringe is used, and the communication structure 22 provided around the injection tool connection structure allows air inside the container body to be Can be exhausted.

生体試料を収納した容器本体１は注入用具を抜き出した後、開口部２を封止する。封止する方法に関しては後述する。   The container body 1 containing the biological sample seals the opening 2 after extracting the injection tool. The method for sealing will be described later.

さらに、容器本体１には、開封部３を設ける。本発明における「開封部」とは、破断、剪断、溶断及び切断、好ましくは人的な力による破断により除去しうる部分をいう。さらに、除去することにより容器本体１の内部を開放し、容器本体１の内部に収容された生体試料を取り出すことができる部分をいう。開封部３は、容器本体内に収容した生体試料を使用する際に取り出すための開封用の蓋の役割を果たす。例えば、ねじりにより破断するくびれ部３１（図４）、切り欠きにより破断する切欠部３３（図５）などが挙げられる。特に人的な力により容易に破断できる観点から、図４のような取手部３２などを設けることが好ましい。   Further, the container body 1 is provided with an opening portion 3. The “opening portion” in the present invention refers to a portion that can be removed by breaking, shearing, fusing and cutting, preferably by human force. Furthermore, the part which can open | release the inside of the container main body 1 by removing and can take out the biological sample accommodated in the inside of the container main body 1 is said. The opening part 3 plays the role of a lid for opening for taking out the biological sample accommodated in the container body. For example, the constricted part 31 (FIG. 4) fractured | ruptured by torsion, the notch part 33 (FIG. 5) fractured | ruptured by a notch, etc. are mentioned. In particular, it is preferable to provide a handle portion 32 as shown in FIG.

また、開封部３を設ける位置は、開口部２から容器本体１の内部への生物試料の導入の妨げとならなければ特に限定されないが、容器本体１を隔てて開口部２と対をなす位置に設けることが好ましい。   Further, the position where the opening part 3 is provided is not particularly limited as long as it does not hinder the introduction of the biological sample from the opening part 2 into the container body 1, but the position where the opening part 2 is paired with the container body 1. It is preferable to provide in.

容器本体１、開口部２及び開封部３は、可撓性樹脂で一体的に構成される。言い換えれば、本発明の凍結保存容器を構成する素材は可撓性樹脂で構成される。本発明における「可撓性樹脂」は、少なくとも開口部の熱溶着による封止が可能な程度に可撓性を有するものをいう。このような樹脂としては例えば、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン及びエチレン−酢酸ビニル共重合体などが挙げられる。   The container main body 1, the opening part 2, and the opening part 3 are integrally comprised with flexible resin. In other words, the material constituting the cryopreservation container of the present invention is made of a flexible resin. The “flexible resin” in the present invention refers to a resin that is flexible enough to at least seal the opening by thermal welding. Examples of such a resin include polypropylene, polyethylene terephthalate, polyethylene, and ethylene-vinyl acetate copolymer.

さらに、
・極低温下での物理的強度に優れるもの
・凍結保存時に容器本体内部への熱伝導を阻害しない断熱性の低いもの
・ねじりよる応力集中により破断が可能もの
の少なくとも１の要件を満足する材料であることが好ましい。これらの要件を満足する材料としては、例えば、ポリエチレン及びエチレン−酢酸ビニル共重合体などがあるが、これらに限定するものではない。 further,
・ Excellent physical strength at cryogenic temperatures ・ Low thermal insulation that does not impede heat conduction into the container body during cryopreservation ・ Material that satisfies at least one of the requirements of being able to break due to stress concentration due to torsion Preferably there is. Examples of materials that satisfy these requirements include, but are not limited to, polyethylene and ethylene-vinyl acetate copolymers.

本発明の凍結保存容器の形状などは、凍結保存の容易性や可撓性樹脂の性質などにより当業者が適宜設定できるものであり特に限定されるものではない。例えば、容器本体１の形状は、円柱状、角柱状、円錐状及び角錐状などが挙げられる。さらには、ハンドリング性を向上させるために、例えば、容器本体１の周囲に滑り止めの効果を奏する凹凸構造を設けてもよい。これらの形状の中でも製造が容易であり、クライオバイアルと形状が類似し、当該クライオバイアルを取り付けるためのケーンなどの付属品に適応できる観点から円柱状であることが好ましい。この時の容器本体１の外径は約１〜５０ｍｍ、好ましくは約１０〜１５ｍｍであるが、本発明はこれに限定されるものではない。   The shape of the cryopreservation container of the present invention is not particularly limited and can be appropriately set by those skilled in the art depending on the ease of cryopreservation and the nature of the flexible resin. For example, examples of the shape of the container body 1 include a columnar shape, a prismatic shape, a conical shape, and a pyramid shape. Furthermore, in order to improve the handling properties, for example, a concavo-convex structure that exhibits an anti-slip effect may be provided around the container body 1. Among these shapes, manufacturing is easy, the shape is similar to that of the cryovial, and a columnar shape is preferable from the viewpoint of adapting to accessories such as a cane for attaching the cryovial. The outer diameter of the container body 1 at this time is about 1 to 50 mm, preferably about 10 to 15 mm, but the present invention is not limited to this.

また、容器本体１の内容積も特に限定されるものではないが、当業者が取り扱いに慣れているクライオバイアルと形状が類似し、当該クライオバイアルを取り付けるためのケーンなどの付属品に適応できる観点から、約０．５〜５．０ｍｌ、好ましくは約１．０〜２．０ｍｌであるが、これに限定されるものではない。また、容器本体１の厚さも凍結保存における熱伝導を阻害しない程度の厚さであれば特に限定されるものではなく、例えば、約０．３〜２ｍｍ、好ましくは約０．４〜１ｍｍである。   Further, the internal volume of the container body 1 is not particularly limited, but the shape is similar to that of a cryovial that is used to those skilled in the art, and a viewpoint that can be applied to accessories such as a cane for attaching the cryovial. To about 0.5 to 5.0 ml, preferably about 1.0 to 2.0 ml, but is not limited thereto. Further, the thickness of the container body 1 is not particularly limited as long as it does not hinder heat conduction in cryopreservation, and is, for example, about 0.3 to 2 mm, preferably about 0.4 to 1 mm. .

加えて、開封部３を破断することにより開封した際、容器本体１の内部に収容した生体試料が飛散せず、残液が残らないように、容器本体内部の形状は、開封部３に向かってテーパー状に収束するテーパー部１１を設けることが好ましい。ここで収束した端部の幅は、容器本体内部に収容した生体試料が飛散することなく、安全に取り出す点を考慮すると、約０．１〜５ｍｍ、好ましくは約１〜３ｍｍであるが、本発明はこれに限定されるものではない。   In addition, the shape inside the container body faces the opening part 3 so that when opened by breaking the opening part 3, the biological sample contained in the container body 1 is not scattered and no residual liquid remains. It is preferable to provide a tapered portion 11 that converges in a tapered shape. The width of the converged end portion is about 0.1 to 5 mm, preferably about 1 to 3 mm, considering that the biological sample accommodated inside the container body can be safely taken out without scattering. The invention is not limited to this.

本発明の凍結保存容器の製造方法は、容器本体１、開口部２及び開封部３が、可撓性樹脂で一体的に構成されるために、非常に容易に実施できる。例えば、射出成形、押出成型、ブロー成型などが挙げられる、これらの製造方法の中でも、製造が容易であり、コストも安価である観点からブロー成型が好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。   The method for producing a cryopreservation container according to the present invention can be implemented very easily because the container body 1, the opening 2 and the opening 3 are integrally formed of a flexible resin. For example, injection molding, extrusion molding, blow molding and the like can be mentioned. Among these manufacturing methods, blow molding is preferable from the viewpoint of easy production and low cost, but the present invention is limited to this. is not.

本発明はさらに本発明の凍結保存容器を用いた生物試料の凍結保存方法にまで及ぶ。具体的には、
１）開口部２から生物試料を導入し、前記生物試料を容器本体１の内部に収容するステップ
２）開口部２を溶着により封止するステップ
３）容器本体１の内部に収容された生体試料を極低温下で保存するステップ
を含む。 The present invention further extends to a method for cryopreserving biological samples using the cryopreservation container of the present invention. In particular,
1) A biological sample is introduced from the opening 2 and the biological sample is accommodated in the container body 1 Step 2) The opening 2 is sealed by welding 3) A biological sample accommodated in the container body 1 Storing at a cryogenic temperature.

まず、１）開口部２から生物試料を導入し、前記生物試料を容器本体１の内部に収容する。生物試料を容器本体１の内部に収容するための方法は、保存する生物試料の種類により当業者が適宜選択して行うことができる。例えば、卵子、精子及びＥＳ細胞などの細胞若しくは薬剤耐性変異結核菌などの微生物を保存する場合、凍結保存を可能とする培地又は細胞保存液に細胞を懸濁することで細胞懸濁液を調製した後、容器本体１の内部に収容することができる。ここで、収容は、シリンジ及びピペットなどの注入用具を用いて行うことができる。また、図３に示すような開口部２の構造がシリンジと接続が可能であり、且つ、容器本体内部の空気を排気な構造である場合、その作業が容易となるため好ましい。   First, 1) a biological sample is introduced from the opening 2 and the biological sample is accommodated in the container body 1. The method for accommodating the biological sample in the container body 1 can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of biological sample to be stored. For example, when storing cells such as eggs, sperm and ES cells, or microorganisms such as drug-resistant M. tuberculosis, prepare the cell suspension by suspending the cells in a medium or cell storage solution that enables cryopreservation. After that, the container body 1 can be accommodated. Here, the accommodation can be performed using an injection tool such as a syringe and a pipette. In addition, it is preferable that the structure of the opening 2 as shown in FIG. 3 can be connected to the syringe and that the air inside the container main body is exhausted because the work becomes easy.

ここで、細胞懸濁溶液中の細胞濃度は、細胞の種類によって当業者が適宜決定することができ、特に限定されるものではないが、例えば細胞が精子である場合約２×１０７〜２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌであり、卵子である場合は１〜１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。また、細胞懸濁液には凍害保護成分として、例えば、１０％程度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び５〜１０％のアルブミンを添加してもよい。 Here, cell concentration of the cell suspension solution, those skilled in the art depending on the type of cells can be determined appropriately, but not particularly limited, for example, about 2 × 10 7 to 2 if cells are sperm × 10 8 cells / ml, and 1 to 10 cells / ml for an egg. In addition, for example, about 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 5 to 10% albumin may be added to the cell suspension as frost damage protection components.

次に、２）開口部２を熱溶着により封止する。溶着は、例えば、インパルス式のシーラーなどを用いて熱溶着を行う。溶着の温度は、可撓性樹脂の種類により当業者が適宜設定できる。例えば、可撓性樹脂がポリエチレンテレフタレートである場合、溶着強度の観点から約１５０〜３００℃、好ましくは約１９０〜２５０℃である。また、例えば、可撓性樹脂がポリエチレンである場合、溶着強度の観点から約１００〜２５０℃、好ましくは約１５０〜２００℃である。このように熱溶着によって封止した開口部２は、もはや液体窒素、雑菌又はウイルスが容器本体内に侵入することがない。   Next, 2) the opening 2 is sealed by heat welding. For the welding, for example, thermal welding is performed using an impulse sealer or the like. The temperature of welding can be appropriately set by those skilled in the art depending on the type of flexible resin. For example, when the flexible resin is polyethylene terephthalate, it is about 150 to 300 ° C., preferably about 190 to 250 ° C. from the viewpoint of welding strength. For example, when the flexible resin is polyethylene, the temperature is about 100 to 250 ° C., preferably about 150 to 200 ° C. from the viewpoint of welding strength. Thus, the opening 2 sealed by heat welding no longer allows liquid nitrogen, germs or viruses to enter the container body.

そして、３）容器本体１の内部に収容された生体試料を凍結保存する。凍結保存の際の温度条件は上述したとおり、０度以下での環境下で保存することをいうが、長期にわたって保存できる観点から、好ましくは−２０度以下（極低温下）、さらに好ましくは−８０度以下、特に好ましくは−１９６度（液体窒素温度）の環境下である。凍結保存を行う方法としては、市販のディープフリーザーなどの装置を用いて行う方法、並びに、ドライアイス、液体窒素及び液体ヘリウムなどの冷却物質を用いて行う方法などが挙げられる。これらの凍結保存方法の中でも長期にわたって保存できる観点から、液体窒素が好ましい。   3) The biological sample housed in the container body 1 is stored frozen. As described above, the temperature condition at the time of cryopreservation refers to storage in an environment of 0 ° C. or less, but from the viewpoint of storage over a long period of time, it is preferably −20 ° C. or less (very low temperature), more preferably − It is in an environment of 80 degrees or less, particularly preferably -196 degrees (liquid nitrogen temperature). Examples of the cryopreservation method include a method using a commercially available device such as a deep freezer, and a method using a cooling substance such as dry ice, liquid nitrogen, and liquid helium. Among these cryopreservation methods, liquid nitrogen is preferable from the viewpoint of storage over a long period of time.

さらに本発明の凍結保存方法は、
４）収容した生物試料を解凍するステップ
５）開封部３を開封することにより、内部の生物試料を取り出すステップ
６）前記収容した生物試料を取り出すステップ
を含む。 Furthermore, the cryopreservation method of the present invention comprises:
4) Thawing the stored biological sample 5) Opening the unsealed portion 3 to extract the internal biological sample 6) Extracting the stored biological sample.

凍結保存した生体試料を用いる際、まず４）収容した生物試料を解凍する。解凍の方法は、当業者が適宜選択することができるものであり、特に限定されるものではないが、例えば、約３７℃の温浴により解凍することができる。この際、開口部が十分に封止されていることにより、容器本体内に液体窒素が存在しないため、急激な液体窒素の膨張による容器の破損がなく、それに伴い作業者が怪我をするおそれがない。さらに、生体試料によるバイオハザードの危険もない。   When using a cryopreserved biological sample, first 4) thaw the stored biological sample. The method of thawing can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited. For example, the thawing can be performed by a warm bath at about 37 ° C. At this time, since the opening is sufficiently sealed, there is no liquid nitrogen in the container body, so there is no damage to the container due to rapid expansion of liquid nitrogen, and the operator may be injured accordingly. Absent. Furthermore, there is no risk of biohazards due to biological samples.

次に、細胞の取りだした容器は３７℃の温浴で、生体試料を解凍する。この時クライオバイアルと異なり、当該発明品は完全に密閉状態であるため、温浴中の水が容器内に入ることなく、解凍できる。生物試料を解凍した後、容器の周囲を消毒液で清拭した後、５）開封部３を開封することにより細胞を取り出すことができる。開封は、開封部３の構造により当業者が適宜選択することができる。例えば、開封部３がねじ切りにより破断可能な構造３１である場合は、ねじ切ることによる破断より開封が達成される。また、開封部３が切欠部３３を備えた構造である場合は、切欠きによる破断により開封が達成される。このように人的な力による破断により容易に開封することが好ましいが、補助的に、鋏による剪断、熱やレーザーによる溶断により開封してもよい。   Next, the biological sample is thawed in a container with the cells taken out in a 37 ° C. warm bath. At this time, unlike the cryovial, the product of the present invention is completely sealed, so that the water in the warm bath can be thawed without entering the container. After thawing the biological sample, the surroundings of the container are wiped with a disinfectant solution, and 5) the cells can be taken out by opening the opening 3. The opening can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the structure of the opening 3. For example, when the opening portion 3 has a structure 31 that can be broken by threading, the opening is achieved by breaking by threading. Moreover, when the opening part 3 is a structure provided with the notch part 33, opening is achieved by the fracture | rupture by a notch. As described above, it is preferable to easily open by breaking by human force, but it may be opened by auxiliary shearing, fusing by heat or laser.

最後に６）解凍された生物試料を取り出す。取り出す作業は当業者により適宜選択できるものであり特に限定されるものではないが、例えば、容器本体が可撓性を有するので、容器本体を押圧することにより、スポイトのように収容した生物試料を取り出すことができる。また、例えば、容器本体２における開封部３を設けた箇所に対する他端付近を鋏などにより剪断することで空気孔を設けてもよい。   Finally 6) Remove the thawed biological sample. The removal operation can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited. For example, since the container main body has flexibility, the biological sample accommodated like a dropper is pressed by pressing the container main body. It can be taken out. Further, for example, the air hole may be provided by shearing the vicinity of the other end of the container main body 2 with respect to the place where the opening portion 3 is provided with a scissors or the like.

以下に本発明の実施例についてが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.

図１に本発明の凍結保存容器を示す。図１の凍結保存容器は、容器本体１と、前記容器本体１の内部と連通し、熱溶着により封止することが可能な開口部２、及び、開封することにより前記容器本体１の内部と連通する開封部３を備える。容器本体１、開口部２及び開封部３は、全てエチレン−酢酸ビニル共重合体のブロー成型により製造される。ここで、容器本体１の内部の形状は、開封部３に向かってテーパー状に収束するテーパー部１１を設けている。また、開口部２の断面図は、瞳形を有する（図２）する。さらに、開封部３は、図５に示すようにくびれ部３１であり、作業者は取手部３２をねじることにより、開封部３（くびれ部３１及び取手部３２）を破断・除去することができる。   FIG. 1 shows a cryopreservation container of the present invention. The cryopreservation container of FIG. 1 includes a container main body 1, an opening 2 that communicates with the inside of the container main body 1 and can be sealed by heat welding, and the inside of the container main body 1 by opening the container. The opening part 3 which connects is provided. The container body 1, the opening 2 and the opening 3 are all manufactured by blow molding of an ethylene-vinyl acetate copolymer. Here, the internal shape of the container body 1 is provided with a tapered portion 11 that converges in a tapered shape toward the opening portion 3. Further, the sectional view of the opening 2 has a pupil shape (FIG. 2). Furthermore, the opening part 3 is the constriction part 31, as shown in FIG. 5, and the operator can break and remove the opening part 3 (the constriction part 31 and the handle part 32) by twisting the handle part 32. .

図３は、開口部２上面の変形例である。図３の開口部２は、注入用具接続構造２１及び連通構造２２を設けている。破線は、注入用具接続構造２１を示している。   FIG. 3 is a modification of the upper surface of the opening 2. The opening 2 in FIG. 3 is provided with an injection tool connection structure 21 and a communication structure 22. The broken line shows the injection tool connection structure 21.

図５は、開封部３の変形例である。図５の開封部３は切欠部３３を有し、切欠により破断・除去することができる。   FIG. 5 is a modification of the opening part 3. The unsealing part 3 of FIG. 5 has a notch 33, and can be broken and removed by the notch.

本発明の凍結保存容器によれは、稀少な生物試料の保存を安全且つ容易に行うことができる。より詳しくは、凍結保存容器は、液体窒素、雑菌又はウイルスが容器本体１の内部に侵入しにくいために、保存した生物試料が汚染されることがない。また、液体窒素が容器内部に侵入した状態で、解凍作業などを行った場合、液体窒素が急激に膨張し、容器の破損などを防止し、作業者が怪我をするおそれがない。したがって、微生物又は細胞を保存するためのバンク、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターなどで用いることができる。   According to the cryopreservation container of the present invention, a rare biological sample can be stored safely and easily. More specifically, in the cryopreservation container, liquid nitrogen, various bacteria or viruses are unlikely to enter the inside of the container body 1, so that the stored biological sample is not contaminated. Further, when a thawing operation or the like is performed in a state where liquid nitrogen has entered the inside of the container, the liquid nitrogen rapidly expands to prevent the container from being damaged and the operator is not injured. Therefore, it can be used in banks for storing microorganisms or cells, for example, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary.

本発明の凍結保存容器を示す図である。It is a figure which shows the cryopreservation container of this invention. 図１の開口部２の上面拡大図である。It is an upper surface enlarged view of the opening part 2 of FIG. 開口部２の変形例を示す上面拡大図である。破線は、注入用具接続構造２１を示している。FIG. 6 is an enlarged top view showing a modified example of the opening 2. The broken line shows the injection tool connection structure 21. 図１の開封部３の拡大図である。破線は、容器本体内部のテーパー部１１を示している。It is an enlarged view of the opening part 3 of FIG. The broken line shows the tapered portion 11 inside the container body. 開封部３の変形例を示す図である。破線は、容器本体内部のテーパー部１１を示している。It is a figure which shows the modification of the opening part. The broken line shows the tapered portion 11 inside the container body. 従来の凍結保存容器を示す図であるIt is a figure which shows the conventional cryopreservation container.

符号の説明Explanation of symbols

１ 容器本体
１１ テーパー部
２ 開口部
２１ 注入用具接続構造
２２ 連通構造
３ 開封部
３１ くびれ部
３２ 取手部
３３ 切欠部
４ 螺合構造

DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Container body 11 Taper part 2 Opening part 21 Injection tool connection structure 22 Communication structure 3 Opening part 31 Constriction part 32 Handle part 33 Notch part 4 Screwing structure

Claims (4)

生物試料を凍結保存するための容器であって、
可撓性の容器本体と、
前記容器本体内部と連通し、溶着により封止可能な開口部と、
開封することにより前記容器本体内部と連通する開封部
とを備え、
前記開口部は、注入用具と接続が可能な略円形状の注入用具接続構造を有し、且つ、容器本体内部の空気を排気可能な連通構造を有する
凍結保存容器。 A container for cryopreserving a biological sample,
A flexible container body;
An opening that communicates with the interior of the container body and can be sealed by welding;
An unsealing part communicating with the inside of the container main body by unsealing ,
The cryopreservation container , wherein the opening has a substantially circular injection device connection structure that can be connected to an injection device, and has a communication structure that can exhaust air inside the container body . 開封部が、ねじりにより破断するくびれ部構造である請求項１に記載の凍結保存容器。   The cryopreservation container according to claim 1, wherein the opening portion has a constricted portion structure that is broken by twisting. 凍結保存容器を用いて生物試料を凍結保存するための方法であって、
前記凍結保存容器は、可撓性の容器本体と、
前記容器本体内部と連通し、溶着により封止することが可能な開口部と、
開封することにより前記容器本体内部と連通する開封部を備え、
前記開口部は、注入用具と接続が可能な略円形状の注入用具接続構造を有し、且つ、容器本体内部の空気を排気可能な連通構造を有し、
前記開口部から生物試料を導入し、前記生物試料を容器本体内に収容するステップと、
前記開口部を溶着により封止するステップと、
前記容器に収容された生体試料を極低温下で保存するステップ
とを含む凍結保存方法。 A method for cryopreserving a biological sample using a cryopreservation container, comprising:
The cryopreservation container includes a flexible container body,
An opening that communicates with the interior of the container body and can be sealed by welding;
Comprising an opening that communicates with the interior of the container body by opening the container;
The opening has a substantially circular injection device connection structure that can be connected to an injection device, and has a communication structure that can exhaust air inside the container body,
Introducing a biological sample from the opening, and storing the biological sample in a container body;
Sealing the opening by welding;
A cryopreservation method comprising: storing a biological sample contained in the container at a cryogenic temperature. さらに、収容した生物試料を解凍するステップと、
開封部を開封することにより生体試料を取り出すステップと、
及び、前記収容した生物試料を取り出すステップ
とを含む請求項３に記載の凍結保存方法。 A step of thawing the stored biological sample;
Removing the biological sample by opening the opening;
And taking out the stored biological sample. The cryopreservation method according to claim 3 .
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