JP4874549B2 - 骨髄腫骨疾患の分子決定因子およびその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、部分的に、米国立がん研究所助成金CA55819およびCA97513の下に連邦政府からの助成金を用いて開発された。このため、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本出願は、2002年12月5日出願で現在放棄されている米国特許仮出願第60/431,040号の利益を主張する。
多発性骨髄腫(MM)は、米国で年間約15,000人が罹患する、最終分化した形質細胞(PC)の稀でさらに不治の悪性腫瘍であって、二番目に多い造血器悪性腫瘍に当たる。多発性骨髄腫は、白人人口においてリンパ性悪性腫瘍全体の13%に相当し、および黒人人口においてリンパ性悪性腫瘍の31%に相当する。悪性形質細胞は、骨髄へホーミングしおよび骨髄で増殖し、正常造血の消失による貧血および免疫抑制を引き起こす。
Zhan et al.,Global gene expression profiling of multiple myeloma,monoclonal gammopathy of undetermined significance,and normal bone marrow plasma cells.Blood 99: 1745−1757 (2002)。
Wnt遺伝子は、脊椎動物胚発生中に空間的におよび組織限定パターンで発現される分泌型ポリペプチドの大きなファミリーを構成する。マウスでの突然変異分析は、体軸、中枢神経系および四肢のパターン化、および器官形成中の誘導現象の調節といったさまざまな発生段階を調節することにおけるWntの重要性を示している。分泌型増殖因子のWntファミリーは、Frizzled(Fz)受容体およびその共受容体であるLDL受容体関連タンパク質5または6(LPR5またはLRP6)を介して、おそらくWntによって誘導されるFz−LPR5/LRP6複合体形成を通じて、シグナル伝達を開始する。
近年の研究は、Wntシグナル伝達経路が骨芽細胞分化および機能に決定的であることを示している。低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5(LRP5)の遺伝子にターゲッティング破壊を有するマウスは低骨量表現型を発生する。LRP5は骨芽細胞で発現され、および骨芽細胞における最適なWntシグナル伝達に必要である。In vivoおよびin vitro分析は、この表現型は生後に明らかになり、さらにそれはCbfa1非依存的な態様で骨芽細胞増殖および機能の低下に対して二次的なものである。
骨芽細胞機能におけるDKK−1の役割の間接的証拠が、高骨量表現型と連鎖しているLRP−5における機能突然変異の利益の同定によって与えられている。加えて、FRZB(SFRP−3)のホモログである分泌型firzzled関連タンパク質(SFRP−1)のターゲッティング破壊は、骨芽細胞の減少および骨細胞アポトーシスおよび骨梁形成増加に繋がる。
患者
新たに診断された多発性骨髄腫の患者174名、意義不明単クローン性免疫グロブリン血症の患者16名、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症の患者9名、および健常者45名を試験した。米国アーカンソー医科大学の施設内倫理委員会は本研究を承認し、およびすべての被験者はインフォームド・コンセントを書面で提供した。表1は多発性骨髄腫の患者の特性を示す。
骨画像処理
画像は、遺伝子発現データの予備知識無しで、Canon PACS(画像保存およびカタログ化システム)を用いて検査した。MRIスキャンは1.5テスラGE Signaスキャナで実施した。X線は米国放射線医学会(ACR)規格に準拠してフィルムからデジタル化した。MRIスキャンおよびX線はACRのDICOM(医用デジタル画像処理および通信)規格を用いてCanon PACSシステムに接続した。画像処理は取扱説明書に従って実施した。MRI画像は、ガドリニウムT1前および後強調処理およびSTIR(短τ反転回復)強調処理を用いて作成した。
形質細胞単離および遺伝子発現プロファイリング
フィコール・ハイパック勾配遠心分離後に、骨髄から得られた形質細胞を単核細胞画分から、モノクローナルマウス抗ヒトCD138抗体(Miltenyi−Biotec,Auburn,CA)を用いる免疫磁気ビーズ選択によって単離した。CD138+/CD45−およびCD38+/CD45−マーカーを用いた二色フローサイトメトリー、免疫細胞化学法による免疫グロブリン軽鎖の存在、およびライト−ギムザ染色による形態で示された通り、遺伝子発現プロファイリングに使用した細胞の90パーセント超が形質細胞であった。総RNAはRneasyミニキット(Qiagen,Valencia,CA)を用いて単離した。標識化cRNAの調製および約10,000遺伝子を含むU95Av2マイクロアレイ(Affymetrix,Santa Clara,CA)へのハイブリダイゼーションは以前に記載した通りに実施した(Zhan et al.,2002; Zhan et al.,2003)。RNA増幅は不要であった。
免疫組織化学
ヒト総DKK1タンパク質(R&D Systems,Minneapolis,MN)に対して免疫化したヤギに由来する抗体をTris緩衝液で1:200希釈し、およびホルマリン固定してパラフィン包埋された骨髄生検切片に2時間室温にて加えた。隣接する切片をH&Eで染色した。抗原−抗体反応はDAB(ビオチニル化抗ヤギ抗体[Vector Laboratories,Burlingame,CA] [1: 400 希釈]およびストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ[Dako]染色後)を用いて発色させ、およびヘマトキシリン−2を用いて対比染色した。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)
Nunc−Immuno MaxiSorp表面マイクロタイタープレートを、1xリン酸緩衝生理食塩水、pH7.2に溶解した1mg/mlの抗DKK1抗体50mlを用いて4℃にて一夜被覆し、および4パーセントウシ血清アルブミンを用いてブロックした。骨髄形質を希釈緩衝液(1×リン酸緩衝生理食塩水+0.1Tween−20+1パーセントウシ血清アルブミン)で1:50希釈した。ウェル当たり計50μlを負荷し、および4℃にて一夜インキュベートし、洗浄し、および緩衝液で0.2mg/mlに希釈したビオチニル化ヤギ抗ヒトDKK1 IgG(R&D Systems)とインキュベートし、その後ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Vector Laboratories)の1:10,000希釈50μlを加え、すべて取扱説明書に従った。発色はOPD基質系(Dako)を用いて取扱説明書に基づいて達成した。組み換えヒトDKK1(R&D Systems)の連続希釈を用いて標準曲線を作成した。内因性DKK1を発現しない細胞株T293、および安定にトランスフェクションされたDKK1を有するT293(Fedi,et al.,1999)を用いて本ELISA測定法のバリデーションを行った。
骨芽細胞分化測定法
C2C12間葉性前駆細胞(American Type Tissue Culture,Reston,VA)は、10パーセント熱不活化ウシ胎仔血清を添加したDMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中で培養した。C2C12細胞におけるアルカリホスファターゼ活性は記載の通りに測定した(Gallea,et al.,2001;Spinella−Jaegle,et al.,2001)。細胞溶解物はタンパク質含量についてマイクロBCA測定法キット(Pierce,Rockford,IL)を用いて分析した。各実験は3連で実施した。
統計解析
多発性骨髄腫患者における骨疾患は、ロジスティック回帰を用いてモデル化した。考慮した独立変数は、新たに診断された多発性骨髄腫174例からバージョン5.01MAS(Affymetrix,Santa Clara,CA)を用いて測定した最大10,000個の遺伝子(12,625個のプローブセット)からの遺伝子発現強度値(アベレージ・ディファレンス・コール)であった。各プローブセットについて、遺伝子発現の定量尺度である「シグナル」は、ロジスティック回帰モデルおよび順列調整分析への入力前にlog2に変換した。骨髄腫において骨疾患に関連し得る遺伝子については、先行する仮説は無かった。結果として、12,625個のプローブセットのそれぞれについて骨疾患の一変量モデルが用いられた。候補遺伝子は、順列調整された有意水準でのt検定(WestfallおよびYoung,1993)を用いて選別した。ウェストフォールおよびヤングの分析を用いて、複数の単変量仮説検定に合わせて調節した。DKK1シグナルおよびDKK1タンパク質レベルの群差は、ウィルコクソンの順位和検定を用いて検定した。骨疾患の状態による患者の特徴における有意差は、フィッシャーの正確確率検定またはカイ二乗検定のどちらかを用いて検定した。ロジスティック回帰によって同定された遺伝子の発現強度は、Clusterview(Golub,et.al.,1999)を用いて視覚化した。スピアマンの相関係数を用いて、遺伝子発現およびタンパク質レベルの相関を測定した。骨芽細胞分化における対照と各実験条件との間の有意差は、ウィルコクソンの順位和検定を用いて検定した;独自のC2C12実験それぞれについて別個の比較を実施した。両側p値0.05未満を有意とし、および両側p値0.10未満を傾向差とした。
骨髄腫細胞の発現プロファイリング
過剰発現されおよび骨病変の存在に伴っていた遺伝子を同定するために、骨病変を有するかまたは有しない患者に由来するマイクロアレイデータの比較を実施した。MRIで定義される骨の限局性病変は、放射線で同定可能な溶解性病変の前に生じ得るので、骨病変を評価するためにT1強調およびSTIR強調画像処理を用いた。骨病変の無い患者(n=36)およびMRIで定義される限局性病変1個以上(1+)を有する患者(n=137)の骨髄に由来する精製形質細胞中の遺伝子約10,000個の遺伝子発現パターンを、ロジスティック回帰分析によってモデル化した。そのモデルによって、2群の患者で発現に差のあった(P<0.0001)57個の遺伝子が同定された(図1A)。これらの遺伝子57個をさらに、順列調整された有意性でt検定によって分析した(WestfallおよびYoung,1993)。これらの統計検定は、その57個の遺伝子のうち4個が、MRI病変1個以上を有する患者で過剰発現されていたことを示した:ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、プロテアソーム活性化因子サブユニット(PSME2)、CDC28プロテインキナーゼ2(CKS2)、およびdickkopfホモログ1(DKK1)。Wnt/β−カテニンシグナル伝達拮抗因子の遺伝子DKK1が4個のうちで唯一分泌型因子をコードすること、およびWnt/β−カテニンシグナル伝達は骨の生物学に関与することを考慮して、DKK1に関する追加の試験を実施した。骨髄腫の患者173名からの結果の分析は、MRI病変1個以上およびX線病変なしの患者についてのDKK1シグナルは、MRI病変なしおよびX線病変なしの患者と比較して有意に異なるが(中央値シグナル:2,220対285;p<0.001)、MRI病変1個以上およびX線病変1個以上の患者と比較して有意差がない(中央値シグナル:2,220対1,865;p=0.63)ことを示した(図1B、表2)。
全遺伝子発現は、多発性骨髄腫において溶解性骨病変と関連するDKK−1およびFRZBを明らかにする
溶解性骨疾患の分子決定因子をさらに特定するために、骨検査で溶解性病変の放射線的証拠を示さない新たに診断された多発性骨髄腫患者(n=28)に由来するCD138濃縮形質細胞における最大12,000個の遺伝子の発現プロファイルを、3個以上の溶解性病変を有する患者(n=47)と比較した。アブソルート・コール(遺伝子発現の定性尺度)のカイ二乗検定を用いて、疾患の2つの型を区別した遺伝子30個を同定した(P<0.05)。シグナル・コール(遺伝子発現の定量尺度)のウィルコクソンの順位和(WRS)検定は、104個の遺伝子(アップレギュレート49個およびダウンレギュレート55個)が2つの疾患亜型で差があった(P<0.001)ことを明らかにした。
DDK1およびFRZBは無作為の骨髄由来よりも限局性病変由来の形質細胞でより高レベルに発現される傾向がある
溶解性病変に対するDKK−1およびFRZBの関係を考慮して、無作為の腸骨稜の骨髄吸引液由来の形質細胞と、脊椎の限局性病変のCT補助穿刺吸引で得られたものとで、DKK−1およびFRZB発現を比較した。これらの結果は、限局性病変由来の形質細胞における有意に高いレベルでの発現を示した。
DKK−1およびFRZBはワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症由来の形質細胞で発現されていない
ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症は、モノクローナルIgM異常蛋白血症および骨髄、リンパ節および脾臓のリンパ形質細胞浸潤によって特徴づけられる稀な形質細胞疾患である。その臨床症状は、臨床経過がそうであるように非常に変わりやすく、しかし多発性骨髄腫とは異なり骨病変は稀である。ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症10例に由来するCD138濃縮骨髄形質細胞の全遺伝子発現プロファイリングは著しい異常を示したが(Zhanetal.,2002)、これらの細胞は、正常骨髄形質細胞のように、FRZBおよびDKKの発現を欠いた(図20)。
FRZBおよびエンドセリン受容体BはDKK−1と相関する
エンドセリン1は21アミノ酸の血管収縮因子である。エンドセリンの2種類の受容体である受容体AおよびBが同定されている。乳がんおよび前立腺がん細胞はエンドセリン1を産生することができ、および、エンドセリン1およびエンドセリン受容体Aの濃度上昇が骨転移を伴う進行前立腺がんで見出されている。エンドセリン1を産生した乳がん細胞は雌マウスで骨芽細胞転移を生じた。条件付け培地および外因性エンドセリン1はマウス頭頂骨培養において骨芽細胞増殖および新しい骨形成を刺激した(図31)。これらの結果は、エンドセリンが骨形成に関連することを示唆する。
In Vivo薬物治療はDKK−1をアップレギュレートする
DKK−1発現はUV照射およびいくつかの他の遺伝毒性刺激によって大幅にアップレギュレートされることが示されている。多発性骨髄腫形質細胞もまたこの疾患を治療するのに用いられる薬物に反応してその遺伝子をアップレギュレートするかどうか調べるために、多発性骨髄腫形質細胞の遺伝子発現プロファイリングを、サリドマイド(図33)、ImiD(図34)、PS−341(図32)、またはデキサメタゾン(図35)を用いた48時間のin vivo処理の前後に実施した。これらのデータは、DKK−1およびFRZB発現を多くの例で大幅にアップレギュレートすることができ、およびそのようにして多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを誘発することにおけるDKK−1の直接的役割を支持することを示した。最初の予備試験で試験したすべての物質に対して一次性に不応性であった新たに診断された患者がDKK−1の低レベルを示したこと、および薬物治療後にDKK−1またはFRZBの発現増大を示さなかったことに注目するのは興味深く、アポトーシスof多発性骨髄腫形質細胞のアポトーシスを促進することにおけるDKK−1発現の役割を支持する。この概念を支持して、DKK−1およびFRZBは、30例のHMCLおよび数例の髄外疾患で、低レベルから検出不能レベルにて発現されていた(図15)。
破骨細胞との多発性骨髄腫の共培養の結果としてJUN、FOS、およびDKK−1の大幅なダウンレギュレーションが生じる
骨髄腫細胞と破骨細胞の間の密接な関係は、消耗性溶解性骨破壊の多発性骨髄腫との関連によって臨床的に現れている。溶解性骨病変の発生は、骨髄腫形質細胞との直接的および間接的相互作用を介して破骨細胞の活性化によって引き起こされる。骨髄腫細胞の生存および増殖および疾患過程の維持における破骨細胞の決定的役割は、臨床的に調べられており、および原発性ヒト骨髄腫に関するSCID−huモデルといった実験モデルにおいてin vivoで実証されている。
形質細胞によるDKK1タンパク質の合成
多発性骨髄腫65例の骨髄生検由来の連続切片を、DKK1の存在に関して染色した。これらの例中の形質細胞は、遺伝子発現データと一致する形でDKK1を含んだ(図39)。正常ドナー5例由来の生検を用いた同様の実験は、どの細胞にもDKK1を検出できなかった。DKK1陽性骨髄腫には、間質性増殖パターンを伴う軽度の形態(核小体が見えない多量の細胞質)を有する強い傾向があった。この染色は骨に隣接する形質細胞で最も強かった。DKK1陰性骨髄腫は結節状または閉塞性増殖パターンを伴う重度の形態(大型化した核および顕著な核小体)を有する傾向があった。間質性増殖パターンについての生検では、DKK1は存在した(細胞のさまざまな割合で)かまたは存在しなかった。対照的に、より悪性の結節状増殖パターンを有する骨髄腫では一律にDKK1は存在しなかった。重要なことに、間質性および結節状増殖の両方を伴う例では、間質性細胞は陽性でありおよび結節状細胞は陰性であった。
骨髄形質中のDKK1タンパク質
酵素結合免疫吸着測定(ELISA)は、遺伝子発現データもまた利用可能である新たに診断された多発性骨髄腫患者173例のうち107例に由来する骨髄形質中のDKK1タンパク質の濃度は24.02ng/ml(S.D.49.58)であったことを示した。対照的に、DKK1は健常ドナー14例では8.9ng/ml(S.D.4.2)、MGUS14例では7.5ng/ml(S.D.4.5)、およびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症9例では5.5ng/ml(S.D.2.4)であった。DKK1遺伝子発現および骨髄形質中のDKK1のレベルは、骨髄腫107例で正に相関していた(r=0.65、P<0.001)(図40A)。また、骨髄形質および末梢血形質中のDKK1タンパク質レベル間に、両方の標本を同時に採取した骨髄腫41例において強い相関があった(r=0.57、P<0.001)。
in vitro骨芽細胞分化に対する骨髄血清の作用
骨形成タンパク質−2は、運命決定されていない間葉性前駆細胞株C2C12 (Katagiri,et al.,1994)の骨芽細胞への分化を、Wnt/b−カテニンシグナル伝達(Bain,et al.,2003; Roman−Roman,et al.,2002)が関与する経路を介して誘導することができる。骨芽細胞分化の特異的マーカーであるアルカリホスファターゼは、5パーセントウシ胎仔血清中で5日間培養したC2C12細胞において検出不能であった(図41A)。C2C12細胞の、50ng/mlのBMP−2を用いた5日間の処理は、C2C12細胞がアルカリホスファターゼを産生するように誘導したが、一方、アルカリホスファターゼはBMP−2および50ng/ml組み換えヒトDKK1と一緒に培養したC2C12細胞によって産生されなかった。アルカリホスファターゼ産生に対するこのin vitro 作用は、ポリクローナル 抗DKK1 抗体によって中和されたが、非特異的ポリクローナルヤギIgGでは中和されなかった。骨髄腫患者5例に由来する、DKK1濃度が12ng/mlを超える骨髄血清は、BMP−2で処理したC2C12細胞によるアルカリホスファターゼの産生を阻害し、およびこの作用は抗DKK1抗体によって逆転されたが非特異的IgGでは逆転されなかった(図41B)対照的に、50ng/mlBMP−2および正常ドナーの骨髄由来の血清10パーセントで処理したC2C12細胞は、細胞によるアルカリホスファターゼの産生を誘導した(図41B)。
Zhan et al.,Global gene expression profiling of multiple myeloma,monoclonal gammopathy of undetermined significance,and normal bone marrow plasma cells.Blood 99: 1745−1757 (2002).
Zhan et al.,Gene expression profiling of human plasma cell differentiation and classification of multiple myeloma based on similarities to distinct stages of late−stage B−cell development.Blood 101:1128−1140 (2003).
Fedi et al.Isolation and biochemical characterization of the humanDkk−1 homologue,a novel inhibitor of mammalian Wnt signaling.J Biol Chem 274: 19465−72 (1999).
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本明細書中で言及した特許または出版物はいずれも、本発明が関係する分野の当業者のレベルを示す。さらに、これらの特許および出版物は、個々の出版物が参照により本開示に含まれると具体的および個別に示されたのと同等に、参照により本開示に含まれる。
Claims (2)
- 多発性骨髄腫患者において溶解性骨疾患を発症する可能性を判定するシステムであって、
前記システムが、
前記患者から得られる生体外サンプルと、
正常個体から得られる生体外サンプルと、
両前記サンプル中のDickkopf−1(DKK1)のヒトホモログの発現レベルを調べる手段を有し、
前記正常個体から得られた前記サンプルと前記患者から得られた前記サンプルの前記DKK1の発現レベルを比較し、前記患者の前記DKK1の発現増加が前記患者の溶解性骨疾患を発症する可能性を示唆することを特徴とするシステム。 - 前記発現レベルが、核酸レベル又はタンパク質レベルで測定されることを特徴とする請求項1に記載のシステム。
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