JP4874376B2 - Ｄｎａ配列情報解析装置 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子の配列情報を解析するための装置に関する。

従来、遺伝子配列を解析する方法としては、ゲノムＤＮＡを制限酵素などによって断片化し、クローニングしたＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼなどの酵素により蛍光標識塩基を取り込ませたＤＮＡ鎖を作製し、電気泳動によって、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃそれぞれの塩基についての電気泳動パターンを求め塩基配列を解析する方法が広く用いられている。

また、最近では、数多くの既知の配列のオリゴヌクレオチドやｃＤＮＡなどを基板上に固定し、クローニングした試料ＤＮＡを反応させ、特異吸着の起きたことを検知することで、試料ＤＮＡ中に存在する塩基配列を推測するＤＮＡチップと呼ばれる方法も開発されている。

この他、ＤＮＡを解析する技術としては、Fluorescence in situ Hybridization 法によって、試料ＤＮＡに対してプローブＤＮＡが、ハイブリダイズした状態を蛍光顕微鏡で観察することが、試みられている（例えば、非特許文献１参照。）。

Holmes-Davis et al著、「Trends in Plant Science 3(1999)91」、p.91

電気泳動法による遺伝子解析およびＤＮＡチップによる遺伝子解析法における問題点としては、解析操作の複雑さが挙げられる。すなわち、この方法によると、ゲノムＤＮＡを断片化し、いくつもの工程を経てクローニングし、得られた膨大な数のクローンの塩基配列を解析するという作業を行う必要がある。さらに、解析から得られる塩基配列データは染色体上での位置情報を持たないため、目的塩基配列の位置を特定するには、それぞれの塩基配列を基に、様々なアルゴリズムによりクローンをつなぎ合わせていくという処理が必要であり、多くの時間と情報処理能力が要求されていた。

これは、試料ＤＮＡの準備に手間がかかり、損傷ＤＮＡなどのクローニングのできないＤＮＡ試料の解析には適用できないという問題がある。また、解析が複雑になる点も問題としてあげられる。

これに対して、Fluorescence in situ Hybridization 法は、断片化していないＤＮＡ試料の配列情報を解析する方法として、工程も少なく、情報をつなぎ合わせる操作も不要で、きわめて有効な方法である。しかし、これまでの蛍光顕微鏡による観察法では、分解能がせいぜい５００ｎｍ程度であり、１．５ｋｂｐ程度の分解能でしか解析ができないという課題を有している。

遺伝子地図の構築は、遺伝子操作技術において、その対象となる遺伝子部位を特定するという点できわめて重要な部分を占める。したがって、迅速かつ、効率よく、高精度に遺伝子地図を構築する手法の開発が、強く望まれている。

このFluorescence in situ Hybridization 法の課題を解決する方法として、特開2001-165840に開示されているように、測定対象のＤＮＡ鎖に含まれる特定遺伝子配列の位置を求める方法において、測定対象ＤＮＡ鎖およびプローブ分子を用い、ＤＮＡ特異結合操作、固定・伸張操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法 、および、ＤＮＡ固定操作、特異結合操作、伸張操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法、および、ＤＮＡ固定・伸張操作、特異結合操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法によって、分解能と精度の高い遺伝子配列の解析を実現することが可能であるが、さらにこのような遺伝子解析方法において、複数の標識の識別を可能にして、遺伝子の相対的な位置を明確に求める必要がある。

このためには、複数の標識で標識した試料を観察することが必要であるが、ダイクロイックミラーなどを組み合わせた光学フィルターによって蛍光を分離して同時観察を行う場合は、せいぜい２つの波長成分を観察するのが限界である。さらに、複数の波長成分を観察する場合には、フィルターを交換して、何度かに分けて観察する必要があるが、ナノメートルレベルの観察では、同時に観察を行わないと位置ずれの影響が大きく測定精度に影響してしまう。

本発明では、このような遺伝子解析方法において、複数の標識の識別を可能にして、遺伝子の相対的または絶対的な位置を明確に求めるために、蛍光標識したＤＮＡプローブあるいはＰＮＡプローブを結合させた検査対象ＤＮＡを蛍光観察によって、そのＤＮＡプローブあるいはＰＮＡプローブの結合位置を検出し、特定ＤＮＡ配列のマッピングを行う方法において、先端部分に局在した光の場を発生可能な光プローブによって、検査対象ＤＮＡ試料を２次元走査し、光プローブ先端に近接した試料表面からから放射される蛍光を検出し、試料の２次元イメージを取得する際に、前記放射される蛍光を分光器を介してＣＣＤイメージ検出器に投影するとともに、ＣＣＤイメージ検出器上の任意の波長成分をＣＣＤイメージ検出器のゲート時間毎に取得することによって、２次元走査に対応した２次元蛍光イメージを構成し、この２次元蛍光イメージをもとに特定ＤＮＡ配列のマッピングを十〜数十ナノメートルレベルの分解能で行うことを特徴とするＤＮＡ配列情報解析法である。

特に、検査対象ＤＮＡを蛍光波長の異なる複数の蛍光色素で標識する場合には、２次元蛍光イメージの取得の際に、前記ＣＣＤイメージ検出器において、任意の波長成分を少なくとも２つ以上選択し、複数の２次元蛍光イメージを同時に取得して、この複数の２次元蛍光イメージをもとに複数の特定ＤＮＡ配列のマッピングを行う。

また、プローブのＤＮＡ上の絶対位置を検出するため、検査対象ＤＮＡをＤＮＡ全体を染色する蛍光色素で染色し、ＤＮＡ全体の２次元蛍光イメージとＤＮＡプローブあるいはＰＮＡプローブ標識の２次元蛍光イメージを同時に取得することによって、検査対象ＤＮＡ上の前記プローブの絶対位置を検出可能とする。さらに、２次元蛍光イメージと同時に、２次元形状イメージを同時に取得し、検査対象ＤＮＡ上の前記プローブの絶対位置を検出可能とする。

より具体的な手順として、前記ＤＮＡ配列情報解析法の手順を（１）検査対象ＤＮＡの蛍光標識したＤＮＡプローブあるいはＰＮＡプローブによる標識操作、（２）標識した検査対象ＤＮＡを基板に固定する固定操作、（３）先端部分に局在した光の場を発生可能な光プローブによって検査対象ＤＮＡ試料を２次元走査し、光プローブ先端に近接した試料表面からから放射される蛍光を検出し２次元イメージを取得する際に放射される蛍光について、分光器を介してＣＣＤイメージ検出器に投影するとともに、ＣＣＤイメージ検出器上の任意の波長成分をＣＣＤイメージ検出器のゲート時間毎に取得し２次元蛍光イメージを取得する測定操作、（４）２次元蛍光イメージからプローブ間の位置関係またはＤＮＡ全体の中のプローブの位置を取得するデータ処理操作、の順に実施する。

本発明では、複数選択された波長の範囲が、相互に波長範囲を制約せずに設定し、重なり合った波長範囲を選択して、複数の蛍光色素成分を合成した蛍光イメージを同時に表示する画像や個々に表示する画像をそれぞれ同時に取得することによって、蛍光波長の重なり合う色素についても測定イメージの画像処理によって分析を行うことを可能にする。また、複数選択された波長の範囲として、一定間隔の波長範囲を選択することによって、細かな波長範囲ごとの蛍光イメージを取得して、スペクトル情報の評価も可能にする。

遺伝子操作技術において有用となる、迅速かつ、効率よく、高精度に遺伝子地図を構築する手法として、測定対象のＤＮＡ鎖に含まれる特定遺伝子配列の位置を求める方法において、測定対象ＤＮＡ鎖およびプローブ分子を用い、ＤＮＡ特異結合操作、固定・伸張操作、探針による検出操作からなる遺伝子解析方法をさらに発展させ、複数の標識の識別を可能にして、遺伝子の相対的な位置を明確に求めるための装置を提供できるようになる。

本発明のＤＮＡ配列情報解析法の実施手順を示す図である。 本発明のＤＮＡ配列情報解析法の実施手順のうち、検査対象ＤＮＡが染色体の場合の説明図である。 本発明のＤＮＡ配列情報解析法で使用する測定系の構成図である。 本発明のＤＮＡ配列情報解析法を実施した結果として得られた染色体の観察例を示す図である。 本発明のＤＮＡ配列情報解析法を実施した結果として得られた染色体の観察例を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照し説明する。

図１は、本発明のＤＮＡ配列情報解析法の実施の手順を示したものであり、
（ａ）検査対象ＤＮＡの蛍光標識したＤＮＡプローブあるいはＰＮＡプローブによる標識操作、（ｂ）標識した検査対象ＤＮＡを基板に固定する固定操作、（ｃ）先端部分に局在した光の場を発生可能な光プローブによって検査対象ＤＮＡ試料を２次元走査し、光プローブ先端に近接した試料表面からから放射される蛍光を検出し２次元イメージを取得する際に放射される蛍光について、分光器を介してＣＣＤイメージ検出器に投影するとともに、ＣＣＤイメージ検出器上の任意の波長成分をＣＣＤイメージ検出器のゲート時間毎に取得し２次元蛍光イメージを取得する測定操作、（ｄ）２次元蛍光イメージからプローブ間の位置関係またはＤＮＡ全体の中のプローブの位置を取得するデータ処理操作、の順に実施される。

図１で“ａ”で示す標識操作では、蛍光標識したプローブ１０１と検査対象ＤＮＡ１０２を反応させて、蛍光標識したプローブが特異的な位置に結合した検査対象ＤＮＡ１０３を得る。

次に、固定操作“ｂ”によって、基板１０４上に検査対象ＤＮＡを固定するが、検査対象ＤＮＡの拡大図１０５で示すように、ＤＮＡが折り重ならずに望ましくは直線的に固定する。

さらに、測定操作“ｃ”では、先端部分に局在した光の場を有するプローブ１１１を検査対象ＤＮＡを固定した試料１１２に近接させ、表面から放射される光を光学系１１３によって集光し、分光器１１４を介することで、前記試料１１２表面からの光に含まれるスペクトルを２次元イメージセンサ１１５に投影して、任意のスペクトルに対応する光強度をプローブの２次元走査に対応して取得する。これによって、検査対象ＤＮＡの形状イメージ１２１、蛍光イメージ１２２，１２３，１２４を得ることができる。ここで、蛍光イメージ１２２は、検査対象ＤＮＡ全体を染色した蛍光色素のイメージであり、蛍光イメージ１２３，１２４は、プローブに標識した蛍光のイメージである。

このようにして測定したデータをもとに、データ処理操作“ｄ”においては、例えば合成画像１２５を元にして、プローブの検査対象ＤＮＡ中における絶対位置を末端からの距離１２６によって求めたり、プローブ間の相対的な位置を相対距離１２７によって求めたりすることができる。

このように、標識操作において、検査対象ＤＮＡを蛍光波長の異なる複数の蛍光色素で標識することによって、測定操作における２次元蛍光イメージの取得の際に、前記ＣＣＤイメージ検出器において、任意の波長成分を少なくとも２つ以上選択し、複数の２次元蛍光イメージを同時に取得して、この複数の２次元蛍光イメージをもとに複数の特定ＤＮＡ配列のマッピングを行うことができる。

また、図１で示したように、プローブのＤＮＡ上の絶対位置を検出するため、標識操作において検査対象ＤＮＡをＤＮＡ全体を染色する蛍光色素で染色し、測定操作においてＤＮＡ全体の２次元蛍光イメージとＤＮＡプローブあるいはＰＮＡプローブ標識の２次元蛍光イメージを同時に取得することによって、検査対象ＤＮＡ上の前記プローブの絶対位置を検出することができる。

さらに、図１で示したように、測定操作において、２次元蛍光イメージと同時に、２次元形状イメージを同時に取得し、検査対象ＤＮＡ上のプローブの絶対位置を検出することができる。

図２は、検査対象ＤＮＡが、染色体の場合について、標識操作と、測定操作の結果についての説明を示したものである。

標識操作では、検査対象染色体２０１に対して、標識操作“ａ”を施すことによって、標識染色体２０２が得られる。さらに、標識操作“ｂ”を施すことによって、標識染色体２０３が得られる。

次に、このように標識操作を行った検査対象染色体の測定操作の結果では、形状イメージ２０４と蛍光イメージ２０５，２０６を得ることができる。これらのイメージを処理することによって、標識位置を求めることができる。

図３は、本発明のＤＮＡ配列情報解析法で使用する測定系の詳細を示したものである。図３において、先端部分に局在した光の場を有する光学プローブ３１１と、その光学プローブ３１１の先端と試料の間を近接した距離に制御するためのプローブ位置検出手段３１２、微動手段３１３および制御手段３１４と、前記プローブを試料表面上で２次元的に走査する走査手段３１５と、前記局在した光の場を発生するための光源３１６と、プローブ３１１先端に近接した試料３２１表面から放射される光を集光するための集光光学系３１７と、データ収集手段３１８とを有し、さらに、分光器３２２、２次元イメージセンサ３１９および画像信号処理手段３２０を有している。ここで、分光器３２２によって前記試料３２１表面からの光に含まれるスペクトルを２次元イメージセンサ３１９に投影することができ、スペクトルイメージをリアルタイムで取得し、画像信号処理手段３２０により前記２次元イメージの中の任意の波長の光信号を選択して取得することが可能になっている。

このような構成によって、複数選択された波長の範囲が、相互に波長範囲を制約しないで、蛍光イメージを取得することができ、複数の蛍光色素成分を合成した蛍光イメージを同時に表示する画像や個々に表示する画像をそれぞれ同時に取得することができる。同様に、複数選択された波長の範囲として、一定間隔の細かな波長範囲を選択することも可能であり、細分化して２次元画像化してスペクトル情報を評価することも可能である。

検出対象ＤＮＡを、染色体上のバンド構造とすることもできる。図４は、本発明のＤＮＡ配列情報解析法を実施した結果として得られた染色体の観察例である。図４の染色体は、大麦の染色体で、染色体のバンド部分をＹＯＹＯ−１、全体をＣｙ３で染色した試料を観察した結果であり、形状像（図４ａ）と同時に、５２０ｎｍから５５０ｎｍの蛍光イメージ（図４ｂ）、５６０ｎｍから６２０ｎｍの蛍光イメージ（図４ｃ）を示している。それぞれ、ＹＯＹＯ−１、Ｃｙ３の色素に対応した波長であり、複数の色素を同時に識別して観察できることが確認できた。同様に、図５は、形状像（図５ａ）と同時に、５２０ｎｍから６２０ｎｍの蛍光イメージ（図５ｂ）、５２０ｎｍから５５０ｎｍの蛍光イメージ（図５ｃ）、５６０ｎｍから６２０ｎｍの蛍光イメージ（図５ｄ）を示している。ここでは、選択された波長の範囲が、相互に波長範囲を制約せず、独立に設定した例を示したものである。

１１１ プローブ
１１２ 試料
１１３ 光学系
１１４ 分光器
１１５ ２次元イメージセンサ
１２１ 検査対象ＤＮＡの形状イメージ
１２２，１２３，１２４ 蛍光イメージ
１２５ 合成画像
１２６ 末端からの距離
１２７ 相対距離
２０１ 検査対象染色体
２０２、２０３ 標識染色体
２０４ 形状イメージ
２０５，２０６ 蛍光イメージ
３１１ 先端部分に局在した光の場を有する光学プローブ
３１２ 位置検出手段
３１３ 微動手段
３１４ 制御手段
３１５ 走査手段
３１６ 光源
３１７ 集光光学系
３１８ データ収集手段
３１９ ２次元イメージセンサ
３２０ 画像信号処理手段
３２１ 試料
３２２ 分光器

Claims (6)

1. 光源と、
   前記光源から発生した光を導入し、先端部分に局在化した光の場を発生させる光プローブと、
   前記先端部分で、検査対象ＤＮＡと、前記検査対象ＤＮＡに結合させた蛍光標識したＤＮＡプローブあるいはＰＮＡプローブと、からなる試料の表面上を２次元走査する走査手段と、
   前記２次元走査中の前記先端部分の位置を検出するプローブ位置検出手段と、
   前記プローブ位置検出手段により前記先端部分と前記試料との距離を近接した距離に制御する制御手段と、
   前記２次元走査した前記試料の表面から放射される光を集光する集光光学系と、
   前記集光した光を分光する分光器と、
   前記分光された光に含まれるスペクトルを投影させるＣＣＤイメージ検出器と、
   前記スペクトルの中から２次元蛍光イメージを構成するための波長の範囲を選択し、ＣＣＤイメージ検出器のゲート時間を設定することによって、前記波長の範囲の波長成分を前記２次元走査と同時に取得する画像信号処理手段と、
   取得した前記波長の範囲の波長成分のデータを収集するとともに、前記波長成分から前記２次元蛍光イメージを構成するデータ収集手段と、
   を備えることを特徴とするＤＮＡ配列情報解析装置。
2. 前記画像信号処理手段が、前記スペクトルの中から前記２次元蛍光イメージを構成するための波長の範囲を少なくとも２つ以上選択し、前記ＣＣＤイメージ検出器のゲート時間を設定することによって、前記２次元走査と同時に前記ＣＣＤイメージ検出器上の前記少なくとも２つ以上選択した波長の範囲の波長成分を取得するとともに、
   前記データ収集手段が、前記少なくとも２つ以上選択した波長の範囲の波長成分から複数の前記２次元蛍光イメージを同時に構成することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ配列情報解析装置。
3. 前記データ収集手段が、蛍光色素で染色された前記検査対象ＤＮＡ全体の２次元蛍光イメージと、前記ＤＮＡプローブあるいは前記ＰＮＡプローブの標識の２次元蛍光イメージと、を同時に構成することによって、前記ＤＮＡプローブあるいは前記ＰＮＡプローブの絶対位置を検出することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡ配列情報解析装置。
4. 前記データ収集手段が、前記２次元蛍光イメージと同時に、前記先端部分の位置により構成された２次元形状イメージを取得し、前記ＤＮＡプローブあるいは前記ＰＮＡプローブの絶対位置を検出することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡ配列情報解析装置。
5. 前記画像信号処理手段が、前記少なくとも２つ以上選択した波長の範囲を、独立に選択することを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ配列情報解析装置。
6. 前記画像信号処理手段が、前記少なくとも２つ以上選択した波長の範囲を、相互に一定間隔を置いて選択することを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ配列情報解析装置。