JP4851831B2 - 微小熱量測定装置および微小熱量測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物や細胞の代謝熱等の微小熱量を測定する微小熱量測定装置および微小熱量測定方法に関する。

従来、微生物や細胞の代謝熱のような微小熱量を測定する微小熱量測定では、多数の微生物や生体細胞による平均的総和的な発熱を長時間測定している（例えば、非特許文献１乃至６参照。）。例えば、大腸菌の増殖活性を測定する場合、１０^４個以上の細胞数に対する発熱の２０時間におよぶ測定が必要になる。このような微生物や細胞の活動にともなう代謝熱を測定する方法は、微生物や細胞にダメージを与えない非破壊測定法であり、微生物や細胞の活動状況の判定、増殖速度の計測、薬剤の抗微生物効果、殺菌効果の評価、食品等の腐敗のモニター、環境汚染物質の生態学的評価などに利用できる。
古賀邦正，"微生物のコロニー増殖と熱測定"，Netsu Sokutei 31(3),(2004) P117-124 高橋克忠，"8.6細胞・微生物の熱測定"，第5版 実験化学講座６ 温度・熱，圧力，（2005） P321-326 J. Higuera-Guisset, J. Rodriguez-Viejo, M. Chacon, F. J. Munoz, N. Vigues, J. Mas, "Calorimetry of microbial growth using a thermopile based microreactor", thermochimica acta, 427, (2005)P187-191 Yuyan Zhang, Srinivas Tadigadapa, Calorimetric biosensors with integrated microfluidicchannels, Biosensors & Bioelectronics, 19, (2004) P1733-1743 (Pennsylvania State Univ. USA) V. Baier, R Fodisch, A. Ihring, E. Kessler, J. Lerchner, G. Wolf, J.M. Kohler, M. Nietzsch, M. Krugel, Highly sensitive thermopile heat power sensor for micro-fluid calorimetryof biochemical processes, Sensor and Actuators A, 123-124 (2005) P354-359 J. Lerchner, A. Wolf, G. Wolf, V. Baier, E. Kessler, M. Nietzsch, M. Krugel, "A new micro-fluid chip calorimeter for biochemical applications", thermochimica acta, xxx,(2005) xxx-xxx (in press)

従来の代謝熱の測定では、測定に必要な細胞数が多く、また、測定に長い時間がかかり、多数の細胞の平均的な代謝挙動を測っていた。これは、微生物や細胞の１細胞当りの代謝熱が極微小であり、代謝熱を高感度に測定できないことによると考えられた。すなわち、代謝熱の熱量を測定する際に、ノイズが大きく熱量計測の分解能が低いので、微小熱量が測定できず、大きな熱量を測定しなければならないので多くの細胞を必要としていた。また、大きなノイズの影響を低減するために、熱量計測信号の時間平均を取る必要があり、計測に長い時間を必要としていた。さらに、多くの細胞の代謝熱の総和は、細胞の増殖、成長、定常活動等の異なる過程の発熱を全て含んでおり、長時間の計測からは平均的、統計的な代謝量や増殖活性しか得られず、細胞の個別、詳細な活動を調べるには至っていない。

そこで、本発明では、前記した問題を解決し、微小熱量を短時間で測定可能な、微小熱量測定装置と微小熱量測定方法とを提供することを目的とする。

前記課題を解決するため、本発明では、基板と、前記基板に固定された温度測定部とを備える微小熱量測定装置であって、前記基板の開口部に架けられ、前記温度測定部に接するブリッジ流路と、前記ブリッジ流路で被測定物を含んだ流体を一定周期で往復させるポンプと、前記温度測定部から出力される発熱量に応じた温度計測信号から前記一定周期と同じ周期の信号成分を抽出するロックインアンプと、前記温度計測信号にローパスフィルタをかけるとともに前記温度計測信号を増幅する低雑音増幅器とを有することを特徴とする。ブリッジ流路には、測定対象の微生物や細胞を含む培養液を流すことができ、細胞等をブリッジ流路内に配置することができる。ブリッジ流路は、基板の開口部に架けられているので、ブリッジ流路内での細胞等の発熱により発生した熱は周囲へ放散しにくく、発熱量は微小でもブリッジ流路の温度を大きく上昇させる。ブリッジ流路は温度測定部に接しているので、上昇したブリッジ流路の温度を測定することができ、細胞等の発熱量に応じた温度計測信号を測定することができる。ブリッジ流路の温度上昇を大きくできるので、相対的にノイズが小さくなり熱量の分解能が高くなり、微小熱量が測定でき、細胞の数が少なくても代謝熱の測定をすることができる。また、相対的に小さくなったノイズをキャンセルするためには、温度計測信号の短い時間の平均操作で充分であるので、短時間で測定を完了することができる。
微小熱量測定装置が、前記ブリッジ流路で被測定物を含んだ流体を一定周期で往復させるポンプと、前記温度測定部から出力される温度計測信号から前記一定周期と同じ周期の信号成分を抽出するロックインアンプとをさらに有することにより、被測定物である生体細胞等を含んだ培養液のような流体は、ポンプにより、吐出されたり吸引されたりすると、ブリッジ流路を順方向と逆方向とに流すことができる。順方向と逆方向との流れにより流体を一定周期で往復運動するように流すことができる。流体が往復運動することにより、生体細胞等もその一定周期と同じ周期でブリッジ流路内を順方向と逆方向に往復運動する。発熱している生体細胞等が温度測定部に対してその一定周期と同じ周期で繰り返し移動することになるので、温度測定部に測定された測温値はその一定周期と同じ周期で変動する。そこで、ロックインアンプにより、この測温値として温度測定部から出力される温度計測信号から、前記一定周期と同じ周期の信号成分を抽出すれば、生体細胞等の発熱に起因する信号を取得することができ、逆に、ノイズはこれらの周期で発生していない限り抽出されないので、ノイズを減らすことができる。ノイズを減らせるので、熱量の計測分解能が高くでき、また、熱量計測の時間分解能も高くなり、少数細胞の詳細な代謝の様子を測定することができる。
微小熱量測定装置が、前記温度測定部から出力される温度計測信号から、低周波数成分のみを抽出するローパスフィルタをさらに有することにより、生体細胞等の代謝熱が発熱の際に高周波成分を有することはないので、高周波成分をカットしても測定には支障はなく、高周波のノイズを除去することができる。このことによっても、ノイズを減らせるので、熱量の分解能を高くでき、時間分解能も高くすることができる。

なお、ブリッジ流路は、管の形状であることが好ましい。生体細胞等を含んだ培養液を管の中に配置することができるので、ブリッジ流路上から培養液や生成物質等が蒸発せず、蒸発に伴う温度変化が避けられるため、微小な代謝熱の計測が可能となり、また、生体細胞の置かれる環境が変化することがない。

微小熱量測定装置が、ブリッジ流路の両端がそれぞれ接続し二股に分岐している分岐路を、さらに有することが好ましい。ブリッジ流路の一端に、培養液をブリッジ流路に導入する導入路と、ブリッジ流路から培養液や代謝物質を廃棄する廃棄路とに分岐している分岐路を設けることができる。さらに、ブリッジ流路の他端にも、培養液をブリッジ流路に導入する導入路と、ブリッジ流路から培養液を廃棄する廃棄路とに分岐している分岐路を設けることができる。そして、ブリッジ流路の一端側の導入路からブリッジ流路を経由して他端側の廃棄路への順方向に培養液を流すとともに細胞等も順方向に移動させることができる。同様に、ブリッジ流路の他端側の導入路からブリッジ流路を経由して一端側の廃棄路への逆方向に培養液を流すとともに生体細胞等も逆方向に移動させることができる。ここで、培養液を順方向と逆方向とに交互に流して、細胞等がブリッジ流路内に留まって順方向と逆方向に移動する往復運動をすると、細胞に対して順方向と逆方向にある培養液を新鮮な培養液に交換することができる。そして、細胞等を生きた状態で安定して維持することができる。また、ブリッジ流路一端側の導入路から廃棄路へ試薬等を含む培養液を流すことで、ブリッジ流路内の細胞は移動させず、拡散により試薬等を細胞へ輸送することができる。そして、試薬に対する細胞の代謝活動の応答を調べることができる。

微小熱量測定装置が、前記基板、前記温度測定部とブリッジ流路を収納し低熱伝導率ガスを封入可能なチャンバを、さらに有することが好ましい。前記温度測定部とブリッジ流路の周辺の雰囲気を低熱伝導率ガスにすることができるので、生体細胞等により発熱した熱が、前記温度測定部とブリッジ流路から周辺の雰囲気のガスの対流により外部に逃げるのを抑制することができる。

前記温度測定部は、前記ブリッジ流路の中央の近傍に測温接点が設けられ、前記基板上に基準接点が設けられている熱電対を有することが好ましい。ブリッジ流路の中央は、ブリッジ流路の中で基板に架かる両端より最も離れているので、ブリッジ流路の中でも最も熱伝導しにくく、温度が上昇しやすいので、その中央に細胞等と測温接点とをおいて測定することにより、最も高い温度差を測定することができる。同じ熱量の発熱であっても中央で測定することで高い温度差が得られるので、熱量の測定の分解能を高めることができる。一方、基板上は熱伝導しやすく温度が安定して一定になるので、基準接点をおいて測定することによりノイズを除去することができる。

そして、以上で説明してきた微量熱量測定装置を用いて熱量測定を行う微小熱量測定方法によれば微小熱量を短時間で測定できる。

このように本発明によれば、微小熱量を短時間で測定可能な、微小熱量測定装置と微小熱量測定方法とを提供することができる。そして、細胞研究、薬効検査、毒性試験、アレルギー試験，食品の腐敗試験等を迅速かつ高感度に実施可能になることが期待される。

次に、本発明の実施形態について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
本発明の実施形態に係る微小熱量測定装置では、１個〜１００個の少数の生体細胞の代謝熱のような微小熱量を、１０秒〜１０００秒の短時間で測定することが要求されると考えられた。種々の細胞は代謝によりおよそ平均的に０．１〜６０ｐＷ／ｃｅｌｌの極微小な発熱を行うので、上記の要求を満たすためには、微小熱量の測定の分解能を１０ｐＷレベルに高めればよいことがわかった。

１０ｐＷレベルの微小熱量を測定するには、生体細胞等の被測定物と熱が逃げる先となる環境との間の熱抵抗が非常に大きく被測定物と環境との間に発生する僅かな温度差に起因する微小な温度計測信号を高感度に検出するセンサと、この微小な温度計測信号をノイズの中から抽出する測定システムとが必要である。微小熱量測定装置１では、図１に示すように、センサ１２と、測定システムとして、ポンプ７、８と、低雑音増幅器４と、ロックインアンプ３と、流動監視カメラ９と、制御部２とを有する。

センサ１２は、半導体微細加工技術を利用して作製され、後記する微小で熱抵抗が高いブリッジ流路と、熱電対を多数集積した高感度サーモパイル等の高感度な温度測定部とを集積している。

センサ１２は、真鍮製の台座２７の上に配置されている。センサ１２と台座２７とは、アルミニウム製の内側チャンバ１７の中に収められている。台座２７は内側チャンバ１７の底の上に配置されている。内側チャンバ１７はペルチェ装置２１の上に配置されている。内側チャンバ１７とペルチェ装置２１とは、アルミニウム製の中間チャンバ１８の中に収められている。ペルチェ装置２１は中間チャンバ１８の底の上に配置されている。中間チャンバ１８はアルミブロック２２の上に配置されている。中間チャンバ１８とアルミブロック２２とは、ステンレス製の外側チャンバ１９の中に収められている。アルミブロック２２は外側チャンバ１９の底の上に配置されている。外側チャンバ１９はホットプレート２３の上に配置されている。これらによりセンサ１２の温度を一定に安定して維持することができる。なお、センサ１２の下は中空３０になっている。これは代謝熱が台座２７を伝導して逃げるのを抑えるためである。また、内側チャンバ１７には内側窓２６が設けられ、中間チャンバ１８には中間窓２５が設けられ、外側チャンバ１９には外側窓２４が設けられており、センサ１２にセットされた細胞等の往復運動を、流動監視カメラ９から窓２４、２５、２６を介して監視することができる。

内側チャンバ１７には、低熱伝導率ガス１１を導入するガス導入管１４が接続されている。また、内側チャンバ１７には、内部のガスを排気する排気管１５が接続されている。ガス導入管１４と排気管１５には、内側チャンバ１７に低熱伝導率ガス１１を封入するためのバルブ１３と１６が設けられている。センサ１２の周囲の雰囲気を低熱伝導率ガス１１の雰囲気にすることができる。センサ１２と、外界の環境との間の熱抵抗を高めることができるので、センサ１２における温度上昇量を大きくすることができる。

測定システムについて、低雑音増幅器４はローパスフィルタ５と電圧計Ｖとを有している。センサ１２によって検出された代謝熱に起因する微小な温度計測信号は、細胞等の代謝熱が発熱する際に高周波成分を有することはないので、高周波成分をカットしても測定には支障はなく、ローパスフィルタ５によって、高周波のノイズを除去することができる。そして、電圧計Ｖは、ノイズを除去した温度計測信号に対して電圧を測定することができる。

ポンプ７は、導入パイプＩＮ２によりセンサ１２に接続されている。ポンプ７は、導入パイプＩＮ２を介してセンサ１２に細胞等を含んだ培養液を供給する。また、ポンプ７は、いったん供給した培養液を導入パイプＩＮ２を介して吸引することにより回収することができる。

同様に、ポンプ８は、導入パイプＩＮ１によりセンサ１２に接続されている。ポンプ８は、導入パイプＩＮ１を介してセンサ１２に生体細胞等を含んだ培養液を供給する。また、ポンプ８は、いったん供給した培養液を導入パイプＩＮ１を介して吸引することにより回収することができる。センサ１２は、廃棄パイプＯＵＴ１とＯＵＴ２とに接続している。ポンプ７と８から新鮮な培養液がセンサ１２に供給されると、古くなった培養液は、新鮮な培養液に押されて廃棄パイプＯＵＴ１とＯＵＴ２を通り外部に放出される。ポンプ７と８は、センサ１２内で生体細胞等を含んだ培養液を一定周期で往復させることにより、センサ１２によって検出される微小な温度計測信号を特定周波数の一定周期で振動する交流信号とすることができる。ロックインアンプ３は、特定周波数の信号成分のみを抽出する。特定周波数で発生していないノイズは抽出されないので、ノイズを減らすことができる。代謝熱に対応した電圧信号を計測することができる。

ヒータ電源Ｅは、センサ１２内に設けられたヒータを発熱させるための電源であり、センサ１２によって検出される微小な温度計測信号の強度と、発熱量との相関関係の較正をするために用いる。

図２に示すように、センサ１２は、シリコン（Ｓｉ）の基板３１と、基板３１に固定された温度測定部３５、３６と、基板３１の開口部３１ａに架けられ温度測定部３５、３６に接するブリッジ流路３２とを有する。ブリッジ流路３２は管の形状をしており、ブリッジ流路３２の中には細胞４９を含む培養液６５が入れられて、培養液６５で満たされる。ブリッジ流路３２は、開口部３１ａに架けられているので、基板３１などの周囲の環境とブリッジ流路３２との間の熱抵抗を高めることができ、代謝熱等の僅かな発熱でもブリッジ流路３２の温度上昇量を大きくすることができる。

センサ１２は、ブリッジ流路３２の両端がそれぞれ接続し、二股に分岐している分岐路３４、３３をさらに有する。ブリッジ流路３２の一端に分岐路３３が接続している。図２と図３に示すように、分岐路３３は、導入パイプＩＮ２に連結し培養液６５をブリッジ流路３２に導入する導入路と、廃棄パイプＯＵＴ２に連結しブリッジ流路３２から培養液６５を廃棄する廃棄路とに分岐している。図２のブリッジ流路３２の他端に、分岐路３４が接続している。分岐路３４は、導入パイプＩＮ１に連結し培養液６５をブリッジ流路３２に導入する導入路と、廃棄パイプＯＵＴ１に連結しブリッジ流路３２から培養液６５を廃棄する廃棄路とに分岐している。分岐路３３、３４も管の形状をしており、分岐路３３、３４とブリッジ流路３２との中には細胞４９を含む培養液６５が入れられて、培養液６５で満たされる。

基板３１の上には酸化シリコン（ＳｉＯ_２）の下層膜５１が形成され、下層膜５１の上には酸化シリコンの上層膜５２が形成されている。この積層された下層膜５１と上層膜５２とにより、管の形状のブリッジ流路３２と、分岐路３３、３４とが形成されている。

温度測定部３５、３６はブリッジ流路３２の両側に設けられている。温度測定部３５、３６も、ブリッジ流路３２と同様に、基板３１の開口部３１ａに架けられている。温度測定部３５、３６は、直列接続した複数の熱電対で構成されている。ブリッジ流路３２の中央の近傍に複数の熱電対それぞれの測温接点が集中して設けられている。また、基板３１上に複数の熱電対それぞれの基準接点が設けられている。温度測定部３５は、配線５７、５８に電気的に接続している。温測用パッド４７、４８は、配線５７、５８を介して温度測定部３５に電気的に接続している。温度測定部３６は、配線５５、５６に電気的に接続している。温測用パッド４５、４６は、配線５５、５６を介して温度測定部３６に電気的に接続している。温測用パッド４６と温測用パッド４７とは、配線５９により電気的に接続しているので、温度測定部３５と温度測定部３６とは直列に接続される。温測用パッド４５と温測用パッド４８とは、電圧計Ｖに接続され、温度測定部３５で検出された温度計測信号の強度と、温度測定部３６で検出された温度計測信号の強度とが足された信号強度が電圧として測定される。

較正用ヒータ４１は、ブリッジ流路３２内で、ブリッジ流路３２の中央に配置される。較正用ヒータ４１は、配線５３、５４に電気的に接続している。ヒータ用パッド４２、４３は、配線５４、５３を介して較正用ヒータ４１に電気的に接続している。ヒータ用パッド４３、４２は、ヒータ電源Ｅに接続され、ヒータ電源Ｅに印加された電力に応じた熱量だけ較正用ヒータ４１は発熱する。

図３に示すように、配線５５乃至５８は、下層膜５１と上層膜５２とで挟まれるように配置されている。同様に、温度測定部３５、３６の熱電対と配線５３、５４も、下層膜５１と上層膜５２とで挟まれるように配置されている。

図４と図５に示すように、温度測定部３５と３６とはそれぞれ、第１材料線６１と、第１材料線６１と第１測温接点３７で接続する第２材料線６２とを有する第１熱電対を有している。なお、図５は図４におけるＶ−Ｖ線断面図である。第１測温接点３７は、ブリッジ流路３２の中央の近傍に配置されている。第１材料線６１の一端は基板３１の上方に配置され基準接点３９になる。第２材料線６２の一端は基板３１の上方に配置され基準接点３８になる。また、温度測定部３５と３６とはそれぞれ、第１材料線６１と同じ材料からなる第１材料線６３と、第２材料線６２と同じ材料からなり第１材料線６３と第２測温接点３７で接続する第２材料線６４とを有する第２熱電対を有している。第２測温接点３７は、ブリッジ流路３７の中央の近傍に配置されている。第１材料線６３の一端は基板３１の上方に配置され基準接点３８になる。第２材料線６４の一端は基板３１の上方に配置され基準接点３９になる。温度測定部３５では、複数、例えば図４では５本の第１熱電対と、複数の例えば５本の第２熱電対とを交互に直列に接続している。直列接続するためには、第１熱電対の基準接点３８と第２の熱電対の基準接点３８とを接続するか、あるいは、第１熱電対の基準接点３９と第２の熱電対の基準接点３９とを接続すればよい。第１材料線６１、６３としては、ニッケル（Ｎｉ）を用いることができ、第２材料線６２、６４としては、クロム（Ｃｒ）を用いることができる。また、第１材料線６１、６３としてシリコン（Ｓｉ）を用い、第２材料線６２、６４として金（Ａｕ）を用いることにより、ニッケルとクロムに比べて計測感度で３〜５倍の向上が期待される。以上説明してきたように、温度測定装置３５、３６はそれぞれ、高感度薄膜サーモパイルを構成している。この高感度薄膜サーモパイルを用いて、ブリッジ流路３２の温度上昇を高い変換率で電圧信号（温度計測信号）へ変換することになる。

次に、センサ１２の製造方法を説明する。
まず、図６（ａ）と図７（ａ）に示すように、シリコンの基板３１に、ブリッジ流路３２と分岐路３３と３４になる溝をフォトリソグラフィ法とエッチング法により形成する。

次に、膜厚５μｍの酸化シリコン膜を、下層膜５１として、溝の内部も含めシリコンの基板３１上に等方的に成膜する。成膜方法としては化学気相成長（ＣＶＤ）法やスパッタ法を用いることができる。

図６（ｂ）と図７（ｂ）に示すように、ポリシリコン（ｐｏｌｙ−Ｓｉ）膜を、犠牲層６９として、ブリッジ流路３２と分岐路３３、３４とに埋め込むように、下層膜５１上に成膜する。成膜方法としてはＣＶＤ法を用いることができる。そして、ブリッジ流路３２と分岐路３３、３４の内部以外に成膜した下層膜５１上の犠牲層６９をエッチバック法により除去する。このことにより、ブリッジ流路３２と分岐路３３、３４の内部にのみ犠牲層６９を残すことができる。較正用ヒータ４１を犠牲層６９上に、ＣＶＤ法やスパッタ法と、フォトリソグラフィ法とエッチング法により形成する。また、第１材料線６１、６３と第２材料線６２、６４とを、下層膜５１上に、ＣＶＤ法やスパッタ法と、フォトリソグラフィ法とエッチング法により形成する。図２と図７（ｂ）の配線５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９とヒータ用パッド４２、４３と温測用パッド４５、４６、４７、４８とを、スパッタ法とフォトリソグラフィ法とエッチング法により形成する。

図６（ｃ）と図７（ｃ）に示すように、膜厚５μｍの酸化シリコン膜を、上層膜５２として、下層膜５１と犠牲層６９との上に等方的に成膜する。この成膜においては、較正用ヒータ４１の側面と上面にも上層膜５２は成膜されるので、較正用ヒータ４１は上層膜５２に固定される。同様に、図２の配線５３、５４の側面と上面にも上層膜５２は成膜されるので、配線５３、５４は上層膜５２に固定される。上層膜５２の成膜方法としてはＣＶＤ法やスパッタ法を用いることができる。

図２と図７（ｃ）に示すように、分岐路３３、３４の導入路と廃棄路とのそれぞれの端部の上層膜５２を、フォトリソグラフィ法とエッチング法により除去する。このことにより、分岐路３３、３４内の犠牲層６９が露出する。

図２と図６（ｄ）と図７（ｄ）に示すように、開口部３１ａにある基板３１と、分岐路３３、３４とブリッジ流路３２内の犠牲層６９を除去する。この除去はドライ犠牲層エッチング法により行うことができる。ドライ犠牲層エッチング法によれば、下層膜５１と上層膜５２に対して選択的に基板３１と犠牲層６９とをエッチングすることができる。開口部３１ａにある基板３１を除去することにより、ブリッジ流路３２と温度測定部３５、３６とにおける下層膜５１の下の基板３１も除去される。なお、分岐路３３、３４との中の犠牲層６９は導入路と廃棄路とのそれぞれの端部からエッチングされ除去され、さらにはブリッジ流路３２内の中の犠牲層６９もエッチングされる。

最後に、図２と図５に示すように、開口部３１ａの下層膜５１と上層膜５２とを除去する。このことにより、開口部３１ａは貫通し、ブリッジ流路３２と温度測定部３５、３６とは開口部３１ａに架けられることになる。この除去の際に、ヒータ用パッド４２、４３と温測用パッド４５、４８の上の上層膜５２も除去し、ヒータ用パッド４２、４３と温測用パッド４５、４８とを露出させる。以上でセンサ１２が完成する。

次に、微小熱量測定装置１を用いて熱量測定を行う微小熱量測定方法について説明する。種々の細胞は代謝によりおよそ０．１〜６０ｐＷ／ｃｅｌｌの極微小な発熱を行う。この代謝熱を細胞４９を含む培養液６５の僅かな温度上昇として測定するため、以下の（１）〜（３）を組み合わせた総合的な微小熱量測定方法を行う。

（１）微小なブリッジ流路３２と低熱伝導率ガス１１（図１参照）の雰囲気とを用い、発熱により温度が上昇するブリッジ流路３２と環境との間の熱抵抗を高め、発熱により温度が上昇するブリッジ流路３２の温度上昇量を大きくする。

（２）温度測定部３５、３６に高感度薄膜サーモパイルを用いて、発熱により温度が上昇するブリッジ流路３２の温度上昇を高い変換率で温度計測信号（電圧信号）へ変換する。

（３）低雑音増幅器４が有するローパスフィルタ５と電圧計Ｖを用いてノイズの低減と温度計測信号の測定を行う。Ｓ／Ｎ比が低くノイズが大きい場合、低雑音増幅器４が有するローパスフィルタ５、ロックインアンプ３とポンプ７、８を用いて、細胞４９を周期的にブリッジ流路３２へ出し入れし同周期の信号成分のみを抽出するロックイン法でさらにノイズを低減し、発熱に対応した温度計測信号を計測する。

（１）〜（３）のそれぞれについてさらに詳細に説明する。
まず、（１）の実現には、熱抵抗を大きくし、細胞の代謝熱を測定するための構造として、ブリッジ流路３２を用い、ブリッジ流路３２の周囲の雰囲気を低熱伝導性ガス１１、例えばキセノン（Ｘｅ）で置換する。

ブリッジ流路３２は、図４と図５に示すように、微小な管が両端で基板３１に支えられ空中に橋渡しされた構造である。ブリッジ流路３２は、下層膜５１と上層膜５２とからなり、長さ２ｍｍ、流路断面は縦横３０μｍの正方形、流路壁の厚さは５μｍ、材質は酸化シリコン（ＳｉＯ_２）である。ブリッジ流路３２の両側には、下層膜５１による厚さ５μｍ、幅５０μｍ、長さ２ｍｍの酸化シリコン板があり、この板の上にサーモパイルが配置されている。また、ブリッジ流路３２の中央に、微小な薄膜の電気抵抗を較正用ヒータ４１として形成してある。代謝熱の測定に先立って、較正用ヒータ４１の発熱量とサーモパイル３５、３６の出力電圧の関係を予め調べておく。この関係により、代謝熱の測定において、サーモパイル３５、３６の出力電圧から代謝熱の発熱量を求めることができる。

ブリッジ流路３２に連結した分岐路３３、３４と導入パイプＩＮ１、ＩＮ２を通して内部に細胞４９を含む培養液６５や試薬等をいれる。図１の流動監視カメラ９により、ブリッジ流路３２内の細胞４９を監視しながらブリッジ流路３２の中央に細胞４９を配置する。

ブリッジ流路３２の中央に配置された細胞４９の発熱が周囲環境へ伝わる経路としては、ブリッジ流路３２の管壁と、ブリッジ流路３２内の培養液６５と、併設された温度測定部３５、３６のサーモパイルの第１材料線６１、６３と第２材料線６２、６４との金属薄膜とを通り管軸方向に伝わる経路があり、また、ブリッジ流路３２の周囲の気体を介して主に管軸の法線方向に伝わる経路がある。管軸方向に伝わる経路の熱抵抗を大きくするためには、ブリッジ流路３２を長く、ブリッジ流路３２の径を小さく、ブリッジ流路３２の管壁を薄くする必要がある。ブリッジ流路３２の周囲の気体を通しての熱抵抗を大きくするには、低熱伝導性ガス１１、例えば、キセノンで周囲の雰囲気を置換することが有効である。

例えば、現在の半導体装置の製造方法に適したシリコンを基板３１に選定し、シリコンと共に半導体装置によく用いられ、熱伝導率の小さな酸化シリコン（ＳｉＯ_２）を用いてブリッジ流路３２を作る。ブリッジ流路３２は、内径３０μｍ、管壁の厚さ５μｍ、長さ２ｍｍの管とする。ブリッジ流路３２の周囲をキセノンガスで置換することで、後述する温度測定部３５、３６のサーモパイルにおける熱抵抗の影響を含め、ブリッジ流路３２の中央から周囲環境までの熱抵抗を５００００Ｋ／Ｗ以上にできる。１０ｐＷの発熱により、ブリッジ流路３２の中央の温度上昇は約０．５μＫとなる。

（２）のブリッジ流路３２の中央の温度上昇を温度計測信号に変換する温度測定部３５、３６には、高い熱起電力が得られることと、熱抵抗が高いことと、ノイズを発生させる電気抵抗が小さいこととが求められる。

例えば、第１材料線６１、６３がニッケルであり第２材料線６２、６４がクロムの組み合わせの熱電対を用いるとする。第１材料線６１、６３の形状と、第２材料線６２、６４の形状とを共に、膜厚０．５μｍ、線幅２．５μｍ、長さ１ｍｍとする。温度測定部３５、３６のそれぞれにおいて、この熱電対を１０対直列に接続したサーモパイルは、ブリッジ流路３２の右側と左側とに沿って接するように設けられた厚さ５μｍ、幅５０μｍ、長さ２ｍｍの酸化シリコン膜の下層膜５１上に形成されている。これらのことから、温度測定部３５と３６の２つを合わせた熱抵抗は５００００Ｋ／Ｗになり、熱起電力は８００μＶ／Ｋになり、電気抵抗は３５２０Ωになる。この条件下で、細胞が１０ｐＷの発熱をすると、温度測定部３５と３６とを合わせた起電力は約４００ｐＶになる。

（３）の信号計測では、微小な温度計測信号を温度計測部３５、３６や測定系で発生するノイズと分離するため、測定するバンド幅を狭めノイズを低減する測定方法が必要である。
信号計測では、温度測定部３５、３６の電気抵抗３５２０Ωにより発生するサーマルノイズ（(４ｋＴＲＢ)^０．５、ｋ：ボルツマン定数、Ｔ：温度、Ｒ：抵抗、Ｂ：バンド幅)と、ロックインアンプ３や低雑音増幅器４等の電気計測系の入力換算ノイズを合わせたものが、ノイズとなる。ノイズは計測バンド幅Ｂ[Hz]の平方根に比例するため、バンド幅を狭めるとノイズが低減されＳ／Ｎ比が改善される。温度測定部３５、３６の電気抵抗は３５２０Ωであるので、サーマルノイズに起因する熱雑音電圧密度は７．６ｎＶｒｍｓ（Ｈｚ）^１／２となり、低雑音増幅器４の入力換算ノイズに起因する入力換算雑音電圧密度は３ｎＶｒｍｓ（Ｈｚ）^１／２となる。

０．１Ｈｚ以上のバンド幅で温度計測信号がノイズと分離できる場合、温度計測信号を低雑音増幅器４の低雑音直流増幅器により増幅し、ローパスフィルタ５で計測バンド幅を狭めてノイズを低減することで、一般的な電圧計Ｖで温度計測信号を測定させることができる。

温度計測信号とノイズの分離に０．１Ｈｚ以下の狭いバンド幅が必要な場合、ブリッジ流路３２中の細胞４９を含む培養液６５を、微小熱量測定装置１の熱応答周波数以下の周波数で往復駆動し、測温接点３７の温度を周期的に変動させ、温度計測信号から同周波数の信号のみをロックインアンプ３で抽出するロックイン法が有効である。例えば０．１Ｈｚ程度で往復させ、ロックインアンプ３の時定数を２５０秒とすることで、バンド幅を０．００１Ｈｚとした低ノイズ計測ができる。電気抵抗が３２５０Ωの温度測定部３５と３６が発生する熱雑音電圧密度７．６ｎＶｒｍｓ（Ｈｚ）^１／２のサーマルノイズと、入力換算雑音電圧密度３ｎＶ（Ｈｚ）^１／２の性能を持つロックインアンプ３と低雑音増幅器４を用いた場合、バンド幅０．００１Ｈｚでノイズは約４００ｐＶになる。ノイズが約４００ｐＶであるので、（２）より、温度測定部３５、３６でノイズと等しい約４００ｐＶの起電力が得られる細胞４９の発熱１０ｐＷが検出限界になる。

このように、（１）〜（３）の実現により、１０ｐＷ以上の細胞４９の代謝熱を測定可能である。代謝熱が６０ｐＷ／ｃｅｌｌ程度のガン細胞であれば1個の代謝熱が直接測定できることになる。代謝熱が０．１〜１０ｐＷ／ｃｅｌｌ程度の細胞４９では１０００〜１０個程度の細胞群の代謝が直接測定できる。そして、逆に、バンド幅の逆数の時間が、測定可能な時間分解能になる。例えば、バンド幅が０．００１Ｈｚであれば、時間分解能は１０００秒になる。バンド幅が０．１Ｈｚであれば、時間分解能は１０秒になる。

次に、測定において、細胞４９を往復駆動させる方法を含め、細胞４９と培養液６５を移動させるさまざまな方法について説明する。

まず、図８（ａ）に示すように、導入パイプＩＮ１から培養液６５、試薬等と共に細胞４９をブリッジ流路３２の中央まで送る。細胞４９の位置は流動監視カメラ９で取得することができる。細胞４９に先行する培養液６５は廃棄パイプＯＵＴ２へ送られる。

ブリッジ流路３２の中央にある細胞４９へ新鮮な培養液６５や試薬を供給するには、まず、廃棄パイプＯＵＴ２と導入パイプＩＮ２とを閉じるなどして培養液６５が流れないようにする。そして、導入パイプＩＮ１から廃棄パイプＯＵＴ１へ培養液６５や試薬を流し、新鮮な培養液６５が分岐路３４に入ったとこで流れを止める。同様に、廃棄パイプＯＵＴ１と導入パイプＩＮ１とを閉じるなどして培養液６５が流れないようにする。そして、導入パイプＩＮ２から廃棄パイプＯＵＴ２へ培養液６５や試薬を流し、新鮮な培養液６５が分岐路３３に入ったとこで流れを止める。図８（ｂ）に示すように、廃棄パイプＯＵＴ１と導入パイプＩＮ２とを閉じるなどして培養液６５が流れないようにする。そして、導入パイプＩＮ１から培養液６５や試薬を入れ、細胞４９を分岐路３３の分岐手前の基準接点３９の近傍に移動させる。細胞４９の右側にあった古い培養液６５は廃棄パイプＯＵＴ２へ送り出される。図８（ｃ）に示すように、廃棄パイプＯＵＴ２と導入パイプＩＮ１とを閉じるなどして培養液６５が流れないようにする。そして、導入パイプＩＮ２から培養液６５や試薬を入れ、細胞４９を分岐路３４の分岐手前の基準接点３８の近傍に移動させる。細胞４９の左側にあった古い培養液６５は廃棄パイプＯＵＴ１へ送り出される。再び、 図８（ａ）に示すように、廃棄パイプＯＵＴ１と導入パイプＩＮ２を閉じて導入パイプＩＮ１から培養液６５や試薬を入れ、細胞４９をブリッジ流路３２の中央へ移動させる。以上により新鮮な培養液６５や所望の試薬に囲まれた細胞４９がブリッジ流路３２の中央に位置することになる。

また、定常的な細胞４９の代謝熱を測定するために、細胞４９を移動させずに測定するには、新鮮な培養液６５や所望の試薬を、定常的に、導入パイプＩＮ１から廃棄パイプＯＵＴ１へ流し、同時に、導入パイプＩＮ２から廃棄パイプＯＵＴ２へも定常的に流す。この操作により、ブリッジ流路３２両端は新鮮な培養液６５に維持され、新鮮な培養液６５中の化学種がブリッジ流路３２の両端から細胞４９まで拡散により輸送される。細胞４９を移動させることなく、与えた環境に対する定常的な細胞４９の代謝熱測定を行うことができる。

細胞（群）４９の発熱が十分大きい場合は、細胞４９をブリッジ流路３２の中央に配置した状態で、温度計測信号を低雑音増幅器４で増幅し、電圧計Ｖで計測する。

発熱が小さく温度計測信号が小さい場合、ブリッジ流路３２内の細胞４９を培養液６５と共にポンプ８により、図８（ａ）のブリッジ流路３２の中央から図８（ｂ）の右の周辺部へ、また、図８（ａ）の中央に戻り、図８（ｃ）の左の周辺部へ、そして、図８（ａ）の中央に戻るという往復運動を一定の周波数で行う。具体的には、廃棄パイプＯＵＴ１と導入パイプＩＮ２を閉じ、導入パイプＩＮ１と廃棄パイプＯＵＴ２とは開けて移動可能にして、培養液６５と細胞４９が周期的に移動するようにポンプ８で培養液６５の吐出と吸入を交互に繰り返すポンプ動作を一定の周期で行う。このとき、温度計測信号には発熱した細胞４９の移動に伴う周期的な温度計測信号が含まれ、ロックインアンプ３により細胞４９の移動と同じ周波数成分のみを抽出して計測する。

微小熱量測定装置１によれば、単一細胞から１０００個程度の細胞群４９の代謝熱を１０〜１０００秒程度の時間分解能で計測可能である。これにより、微生物や生体細胞の詳細な活動特性を細胞４９にダメージを与えずに観察することが可能となる。また、細胞４９の活動が高い時間分解能で計測できるため、細胞４９の形態変化と代謝の関係を調べる等、従来行われていない細胞研究用の装置となる。ガン細胞への薬剤の効果を調べる検査、アレルギー検査などが単一または少数細胞で行えるため、細胞培養にかかる時間を短縮できる。活性の高い細胞４９の選別、薬剤耐性による細胞４９の選別など、細胞４９の個体差を正常活動範囲内で見分けることが出来る新しい計測装置が出来る。

実施例１では、微小熱量測定装置１と等価の装置を用いて、微小熱量測定装置１の効果（実現性）を確認した。

図９（ａ）に示すように、微小熱量測定装置１と等価の装置は、内側チャンバ１７と、内側チャンバ１７に入れられた較正用ヒータ４１と、内側チャンバ１７に入れられ測温接点３７が接着剤６６で較正用ヒータ４１に接着された温度測定部（熱電対）３５と、較正用ヒータ４１に発熱用に電力を供給しその電力が一定周期で発振するヒータ電源Ｅを有し温度計測信号から一定周期に同期する成分信号を抽出するロックインアンプ３と、温度測定部３５からの温度計測信号にローパスフィルタをかけまた温度計測信号を増幅する低雑音増幅器４とを有している。また、温度測定部３５の基準接点３８、３９は内側チャンバ１７の近傍に設けられている。

図９（ｂ）に示すように、ヒータ電源Ｅから較正用ヒータ４１に印加したヒータ電圧に対して、温度測定部３５から出力された温度計測信号の電圧を測定した。なお、菱形印は、低雑音増幅器４の使用を省略し、ロックインアンプ３を使用し較正用ヒータ４１を２．１Ｈｚの一定周期で加熱した場合である。四角印は、菱形印と同じ条件であり、再現性を確認するためのものである。三角印は、低雑音増幅器４の使用を省略し、ロックインアンプ３を使用し較正用ヒータ４１を６．１Ｈｚの一定周期で加熱した場合である。丸印は、低雑音増幅器４とロックインアンプ３とを使用し較正用ヒータ４１を６．１Ｈｚの一定周期で加熱した場合である。測定では、設定したヒータ電圧に対して複数回温度計測信号の電圧を測定した。ヒータ４１の発熱量の低下に対応した測定値の低下が見られず、ノイズが温度計測信号より大きくなるときを測定限界と定めた。

菱形印、四角印、三角印によれば、ロックインアンプ３を使うことにより、測定限界は１７ｎＶｒｍｓまで低減できることがわかる。

また、丸印によれば、低雑音増幅器４とロックインアンプ３とを使うことにより、測定限界は３００ｐＶまで低減できることがわかった。細胞４９の代謝熱の１０ｐＷを測定するためには、４００ｐＶの温度計測信号が測定できればよいので、低雑音増幅器４とロックインアンプ３とを使うことにより、１０ｐＷの代謝熱が測定できることがわかる。

実施例２でも、微小熱量測定装置１と等価の装置を用いて、微小熱量測定装置１の効果を確認した。

図１０（ａ）に示すように、実施例２の微小熱量測定装置１と等価の装置は、図９（ａ）の実施例１の微小熱量測定装置１と等価の装置と比較して、低雑音増幅器４に接続するフーリエ変換解析器６７をさらに有する点が異なっている。

図１０（ｂ）に示すように、温度測定部３５から出力された温度計測信号の電圧密度の周波数スペクトル（パワースペクトル）を測定した。なお、６本の点線の群は、低雑音増幅器４の使用を省略し、ロックインアンプ３を使用し較正用ヒータ４１に１．０Ｈｚの一定周波数の電圧を印加することにより較正用ヒータ４１を２．０Ｈｚの一定周期で加熱した場合である。較正用ヒータ４１には、それぞれ、３．０Ｖ、１．５Ｖ、０．８Ｖ、０．４Ｖ、０．２Ｖ、０．１Ｖを印加した。実線は、低雑音増幅器４とロックインアンプ３とを使用し較正用ヒータ４１に３．０５Ｈｚの一定周波数の電圧を印加することにより較正用ヒータ４１を６．１Ｈｚの一定周期で加熱した場合である。較正用ヒータ４１には、０．５Ｖを印加した。

実線を点線群と比較すると、ノイズのレベル、いわゆるベースラインが、実線の方が点線群より低くなっていることがわかる。具体的には、周波数１Ｈｚにおいて、ノイズレベルが１０分の１に低減できている。また、周波数０．１Ｈｚにおいて、ノイズレベルを４０分の１に低減できている。このように、ロックインアンプ３と合わせて低雑音増幅器４を用いることにより、ノイズレベルを低減できることがわかった。低雑音増幅器４とロックインアンプ３とを使うことにより、ノイズレベルを低減できるので、１０ｐＷのような微小熱量の測定に有効であると考えられる。

実施形態に係る微小熱量測定装置の構成図である。 実施形態に係る微小熱量測定装置のセンサの平面図である。 図２のIII−III方向の断面図である。 センサのブリッジ流路とその周辺の平面図である。 図４のＶ−Ｖ方向の断面図である。 実施形態に係る微小熱量測定装置の製造途中の図４のＶ−Ｖ方向の断面図である。 実施形態に係る微小熱量測定装置の製造途中の図２のIII−III方向の断面図である。 ブリッジ流路内の細胞の移動方法を説明するための図である。 （ａ）は実施例１の微小熱量測定装置と等価の装置の構成図であり、（ｂ）はローパスフィルタを含む低雑音増幅器の有無による抵抗に印加される交流のヒータ電圧に対する熱電対から出力される出力電圧（温度計測信号）の依存性を示すグラフである。 （ａ）は実施例２の微小熱量測定装置と等価の装置の構成図であり、（ｂ）はローパスフィルタを含む低雑音増幅器の有無による抵抗に印加される交流電圧毎の熱電対から出力される電圧の周波数スペクトルである。

符号の説明

１ 微小熱量測定装置
２ 制御部
３ ロックインアンプ
４ 低雑音増幅器
５ ローパスフィルタ
７、８ ポンプ
９ 流動監視カメラ
１１ 低熱伝導率ガス
１２ センサ
１７ 内側チャンバ
１８ 中間チャンバ
１９ 外側チャンバ
２７ 台座
３１ 基板
３１ａ 開口部
３２ ブリッジ流路
３３、３４ 分岐路
３５、３６ 温度測定部
３７ 測温接点
３８、３９ 基準接点
４１ 較正用ヒータ
４２、４３ ヒータ用パッド
４５、４６、４７、４８ 温測用パッド
４９ 細胞
５１ 下層膜
５２ 上層膜
５３、５４、５５、５６、５７、５８、５８ 配線
６１、６３ 第１材料線
６２、６４ 第２材料線
６５ 培養液
６６ 接着剤
６７ フーリエ変換解析器
６９ 犠牲層

Claims (6)

1. 基板と、前記基板に固定された温度測定部とを備える微小熱量測定装置であって、
   前記基板の開口部に架けられ、前記温度測定部に接するブリッジ流路と、
   前記ブリッジ流路で被測定物を含んだ流体を一定周期で往復させるポンプと、
   前記温度測定部から出力される発熱量に応じた温度計測信号から前記一定周期と同じ周期の信号成分を抽出するロックインアンプと、
   前記温度計測信号にローパスフィルタをかけるとともに前記温度計測信号を増幅する低雑音増幅器とを有することを特徴とする微小熱量測定装置。
2. 前記ブリッジ流路は、管の形状であることを特徴とする請求項１に記載の微小熱量測定装置。
3. 前記ブリッジ流路の両端がそれぞれ接続し、二股に分岐している分岐路をさらに有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の微小熱量測定装置。
4. 前記基板、前記温度測定部とブリッジ流路を収納し、低熱伝導率ガスを封入可能なチャンバをさらに有することを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の微小熱量測定装置。
5. 前記温度測定部は、前記ブリッジ流路の中央の近傍に測温接点が設けられ、前記基板上に基準接点が設けられている熱電対を有することを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の微小熱量測定装置。
6. 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の微量熱量測定装置を用いて熱量測定を行う微小熱量測定方法。

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