JP4842817B2 - 神経保護二環式化合物およびその使用方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

（関連出願）
本出願は、参考として本明細書に全体的に合体させる“Neuroprotective Bicyclic Compounds and Methods for Their Use”と題した発明者 Margaret Ann Brimble, Jian GuanおよびFrank Siegの2003年9月3日に出願された米国仮特許出願第60/499,956号(Attorney Docket番号：NRNZ 1050 US0 DBB)に対する優先権を主張する。

（技術分野）
本発明は、ジケトピペラジンと構造的に関連する新規な二環式化合物およびその治療上の使用方法に関する。詳細には、本発明は、そのような化合物の神経保護活性に関する。さらに詳細には、本発明は、これら化合物およびその製薬組成物の神経変性および/または死に特徴を有する疾患および症状の治療における使用に関する。

（背景技術）
神経系における細胞の退化および/または死は、多くの疾患および医療症状における主要要因である、そのような疾患および症状としては、外傷性脳および脊髄損傷、卒中、心臓動脈バイパス移植術(CABG)に続発する神経潅流、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症および他の神経変性疾患がある。そのような細胞死および退化を阻止しまたは低減させることは重要である。
ある種の化合物が神経保護薬として有用である。１つのそのような化合物は、インスリン様成長因子1 (IGF-1)である(Scheepens等、WO 00/13650号)。IGF-1は、自然産生ペプチドであり、ニューロンのグルタメートレセプターへのグルタメートの結合を低下させ得る(Bourguinon、米国特許第5,804,550号)。また、IGF-1は、損傷および疾患によって生じた神経変性も減少させる。IGF-1は、生体内タンパク質分解により開裂されてdes_1-3 IGF-1およびN-末端トリペプチドGly-Pro-Glu (GPE)を生じる。GPEおよびアナログ類は、神経保護性であることが判明している(Gluckman等、米国特許第6,187,906号、本明細書に参考として合体させる)。
しかしながら、そのようなペプチドは、とりわけ生体内で急速に代謝されるので、神経細胞死および退化の治療においては理想からは程遠い。神経保護または神経再生特性を与え且つとりわけプロテアーゼに対する抵抗性に関して代謝的により安定性である化合物が求められている。
GPEの誘導体；環状Pro-Gly (“cPG”)、ジケトピペラジンは、神経保護性および神経再生性であることが証明されている。cPGは、毒性神経変性および細胞死を阻止し且つニューロン内の神経突起産生を促進させることが判明している(Guan等、PCT/US02/36235号、本明細書に参考として合体させる)。チロトロピン放出性ホルモン(TRH)のジケトピペラジンアナログ類は、神経保護性であることが知られている(Kozikowski等、WO 99/40931号)。

（発明の開示）
本発明の各実施態様は、cPGと構造的に関連する新規なジケトピペラジン類を含む。
本発明の１つの実施態様は、以下で説明する構造式と置換基を有する新規な環状化合物を提供する。





式１：

ある実施態様においては、式１の化合物は、下記の置換基を含む：
X¹は、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
X²は、CH₂、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
R¹、R²、R³、R⁴ およびR⁵は、個々に、-H、-OR'、-SR'、-NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R⁴およびR⁵は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)であり；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)である；
但し、R¹= メチルであり、R²=R³=R⁴=Hである場合、R⁵ ≠ ベンジルであり；R¹ = Hである場合、R²およびR³の少なくとも１つは ≠ Hであることを条件とする。

式２：

他の実施態様においては、式２の化合物は、下記の置換基を含む：
X¹は、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
X²は、CH₂、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
R¹、R²およびR³は、個々に、-H、-OR'、-SR'、-NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)である；
但し、Rの少なくとも１つは ≠ Hであることを条件とする。

式３：

さらなる実施態様においては、式３の化合物は、下記の置換基を含む：
X¹は、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
X²は、CH₂、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
R¹、R²およびR³は、個々に、-H、-OR'、-SR'、-NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)である。

式４：

さらなる実施態様においては、式４の化合物は、下記の置換基を含む：
式中、X¹、X³およびX⁴は、個々に、O、SおよびNHからなる群から選ばれ；
X²は、S、O、CH₂およびNHからなる群から選ばれ；
R¹、R²、R³、R⁴およびR⁵は、個々に、-H、-OR'、-SR', -NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R⁴およびR⁵は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)であり；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)である；
但し、Rの少なくとも１つは ≠ Hであり、X³およびX⁴の双方は ≠ Oであることを条件とする。

式５：

さらに、他の実施態様においては、式５の化合物は、下記の置換基を含む：
式中、R¹およびR²は、個々に、-H、-OR'、-SR', -NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R¹およびR²は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)である。

式６：

他の実施態様においては、式６の化合物は、下記の置換基を含む：
式中、R¹、R²およびR³は、個々に、-H、-OR'、-SR'、-NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)である。

式７：

さらに他の実施態様においては、式７の化合物は、下記の置換基を含む：
Rは、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれる。

本発明の他の実施態様は、式１〜７で記載した化合物の製薬上許容し得る塩を提供する。
さらに他の実施態様においては、本発明は、製薬上許容し得る賦形剤と治療上有効量の本発明の少なくとも１種の化合物とを含む製薬組成物を提供する。これらの組成物は、抗アポトーシス剤および抗壊死剤としての、また、神経変性または損傷に関連する他の症状における用途を見出している。
さらなる実施態様においては、式１〜７の適切な化合物の投与によって治療し得る疾患または損傷を有する動物に本発明の少なくとも１種の化合物を投与して損傷または疾患によって生じた神経変性を低減させることを特徴とする、その動物の治療方法を提供する。ある種の他の実施態様においては、本発明は、治療する疾患用の少なくとも１種の他の通常の治療薬と併用しての式１〜７の任意のジケトピペラジンによる動物の治療方法を含む。
さらなる実施態様においては、治療する動物は、ヒトである。
さらなる実施態様においては、本発明は、本発明の式１〜７の化合物を含む製薬組成物の合成、調合および製造方法を提供する。
以下、本発明を、本発明の特定の実施態様を参照して説明する。本発明の他の実施態様は、添付図面を参照して理解し得るであろう。

（発明を実施するための最良の形態）
定義
“アルケニル”とは、少なくとも１個の炭素-炭素二重結合を有する不飽和の枝分れ、直鎖または環状炭化水素基を称する。この基は、二重結合(１個以上)についてシスまたはトランス構造のいずれかであり得る。アルケニル基の例としては、アリル、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、シクロペンテニル等がある。ある実施態様においては、アルケニル基は(C₂〜C₆)アルケニルであり、他の実施態様においては、アリルがとりわけ有用であり得る。
“アルキル”とは、飽和の枝分れ、直鎖または環状炭化水素基を称する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピル、tert-ブチル、シクロプロピルメチル、ヘキシル等がある。ある実施態様においては、アルキル基は、(C₁〜C₆)アルキルである。
“アルキニル”とは、少なくとも１個の炭素-炭素三重結合を有する不飽和の枝分れ、直鎖または環状炭化水素基を称する。アルケニル基の例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、イソブチニル等がある。ある実施態様においては、アルキニル基は、(C₂〜C₆)アルキニルである。
“アリール”とは、共役π電子系を有する不飽和環状炭化水素基を称する。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル等がある。ある実施態様においては、アリール基は、(C₅〜C₂₀)アリールである。
“アリールアルキル”とは、末端炭素に結合した水素原子の１つをアリール基で置換した直鎖のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を称する。アリールアルキルの例としては、ベンジル、ナフチルメチル、ベンジリデン等がある。
“成長因子”とは、細胞を刺激して細胞上のレセプターとの相互作用により成長または増殖する細胞外活性ポリペプチドである。

“ヘテロアルキル”とは、１個以上の炭素原子をN、P、O、S 等のような他の原子で置換したアルキル成分を称する。ヘテロアルキル基の例としては、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、テトラヒドロフラン、(C₁〜C₁₀)置換アミン類、(C₂〜C₆)チオエーテル類等がある。
“ヘテロアリール”とは、１個以上の炭素原子をN、P、O、S 等のような他の原子で置換したアリール成分を称する。ヘテロアリール基の例としては、カルバゾール、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、イソキノリン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピロール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール等がある。

“損傷”は、神経系内の細胞の退化または死をもたらす動物のあらゆる急性または慢性損傷を含む。そのような細胞としては、ニューロン細胞および非ニューロン細胞がある。損傷としては、卒中；非出血性卒中；外傷性脳損傷；剥離、索閉塞後のような胎児仮死に関連するまたは子宮内発育遅延に関連する周産期呼吸停止；適切な蘇生法または呼吸の欠如に関連する周産期呼吸停止；溺死寸前、乳幼児突然死寸前、一酸化炭素吸入、アンモニアまたは他のガス中毒、心停止、昏眠、髄膜炎、低血糖症およびてんかん重積症、冠状動脈バイパス術に関連する脳仮死発作、低血圧発作および高血圧性クリーゼに関連する重篤なCNS発作；および脳外傷がある。上記の例は、単なる例示のためであり、本発明の化合物および方法によって治療し得る損傷の完全な目録を意図するものではないことを理解すべきある。

“製薬上許容し得る賦形剤”とは、一般に安全で、無毒で、望ましい製薬組成物を製造するのに有用である賦形剤を称し、獣医用途並びにヒトの医薬用途において許容し得る賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固形、液体、半固形、またはガス状のエアゾール組成物の形であり得る。
“製薬上許容し得る塩”とは、製薬上許容し得且つ所望の薬理特性を有する塩を称する。そのような塩としては、前記化合物中に存在する酸性プロトン無機または有機塩基と反応し得て形成され得る塩類がある。適切な無機塩としては、アルカリ金属、例えば、ナトリウムおよびカリウム；マグネシウム、カルシウムおよびアルミニウムによって形成される塩類がある。適切な有機塩としては、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミン等のような有機塩基によって形成される塩類がある。また、そのような塩としては、無機酸(例えば、塩酸および臭化水素酸)および有機酸(例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、並びにメタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸のようなアルカン-およびアレーン-スルホン酸)によって形成される酸付加塩もある。２個の酸基が存在する場合、製薬上許容し得る塩はモノ酸モノ塩またはジ酸塩であり得、同様に、３個以上の酸基が存在する場合、そのような基の幾つかまたは全てが塩として存在し得る。

“保護基”は、有機合成においてこの基と通常関係する意味を有し、即ち、多官能性化合物中の１つ以上の反応部位を選択的に遮断して、化学反応を他の保護されていない反応部位において選択的に実施するように且つ選択的反応を終えた後でその基を容易に除去し得るようにする基である。
“置換”とは、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキル基上の１個以上の水素原子を他の置換基で個々に置換することを称する。置換基としては、-R'、-OR'、-SR'、-NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、-NR'-C(NR')-OR'、-NR'-C(NR')-SR'、NR'-C(NR')-NR'R'、トリハロメチルおよびハロゲンがあり、R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルである。

“治療上有効量”は、疾患の治療のために動物に投与したとき、疾患または損傷に対する治療を行なうのに十分である量を意味する。“治療上有効量”とは、有害な症状または診断を軽減し、望ましい症状または診断を促進させ、および/または基礎障害を治療し、および/または治効性である量を意味する。
疾患の“処置”または“治療”は、疾病に罹患し易いがまだその疾病の症状を患っていないまたは示していない動物における疾病の発症を防御すること(予防的治療)、疾病を抑制すること(その発症を遅延させまたは阻止すること)、疾病の症状または副作用を軽減させること(緩和治療を含む)、および疾病を軽減すること(疾病の退行を起こさせること)を含む。
内在水素原子(ピロール環上の水素等のような)は、明確化のため、各式から省略しているが、存在するものと理解すべきである。

本発明の化合物
本発明のある種の実施態様は、式１〜７において下記で説明するような構造を有するcPGの新規な誘導体を含む。











式１：

ある実施態様においては、式１の化合物は、下記の置換基を含む：
X¹は、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
X²は、CH₂、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
R¹、R²、R³、R⁴ およびR⁵は、個々に、-H、-OR'、-SR'、-NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R⁴およびR⁵は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)であり；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)である；
但し、R¹= メチルであり、R²=R³=R⁴=Hである場合、R⁵ ≠ ベンジルであり；R¹ = Hである場合、R²およびR³の少なくとも１つは ≠ Hであることを条件とする。

さらなる実施態様においては、式１の化合物は、下記の置換基を含む：
R¹=メチル、R²=R³=R⁴=R⁵= H、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=アリル、R²=R³=R⁴=R⁵=H、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=R² =R³=H、R⁴=R⁵=メチル、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=R⁴=R⁵ =H、R²=R³=メチル、X¹=NH、X²=CH₂
本発明の他の実施態様においては、式１の化合物は、下記の置換基を含む：
R⁴およびR⁵は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂-であり、且つ、R¹=メチル、R²=R³=H、n=0、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=メチル、R²=R³=H、n=2、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=アリル、R²=R³=H、n=0、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=アリル、R²=R³=H、n=2、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=メチル、R²=R³=H、n=3、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=アリル、R²=R³=H、n=3、X¹=NH、X²=CH₂

本発明のさらに他の実施態様においては、式１の化合物は、R¹=メチルまたはアリル、R²=R³=R⁴=Hである置換基を含み、R⁵は、アミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ノルバリン、ノルロイシン、シトルリン、オルニチン、ホモシステイン、ホモセリン、アロイソロイシン、イソバリン、サルコシン等の側鎖からなる群から選ばれる。
本発明のさらなる実施態様においては、式１の化合物は、下記の置換基を含む：
R¹=メチル、R²=R³=メチル、R⁴=R⁵=H、X¹=NHおよび X²=S；
R¹=アリル、R²=R³=メチル、R⁴=R⁵=H、X¹=NHおよびX²=S

式２：

他の実施態様においては、式２の化合物は、下記の置換基を含む：
X¹は、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
X²は、CH₂、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
R¹、R²およびR³は、個々に、-H、-OR'、-SR'、-NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)である；
但し、Rの少なくとも１つは ≠ Hであることを条件とする。
さらに他の実施例においては、式２の化合物は、下記の置換基を含む：
R¹=メチル、R²=R³= H、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=アリル、R²=R³=H、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=エチル、R²=R³=H、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=H、R²=R³=メチル、X¹=NH、X²=CH₂
もう１つの群の実施例においては、式２の化合物は、下記の置換基を含む：
R¹=メチル、R²=R³=メチル、X¹=NHおよびX²=S；
R¹=アリル、R²=R³=メチル、X¹=NHおよびX²=S。

式３：

他の実施態様においては、式３の化合物は、下記の置換基を含む：
X¹は、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
X²は、CH₂、NR'、OおよびSからなる群から選ばれ；
R¹、R²およびR³は、個々に、-H、-OR'、-SR'、-NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂- (nは0〜6の整数である)である。
さらに他の実施例においては、式３の化合物は、下記の置換基を含む：
R¹=メチル、R²=R³= H、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=アリル、R²=R³=H、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=エチル、R²=R³=H、X¹=NH、X²=CH₂；
R¹=H、R²=R³=メチル、X¹=NH、X²=CH₂
さらなる実施例においては、式３の化合物は、下記の置換基を含む：
R¹=メチル、R²=R³=メチル、X¹=NHおよびX²=S；
R¹=アリル、R²=R³=メチル、X¹=NHおよびX²=S。

式４：

さらなる実施態様においては、式４の化合物は、下記の置換基を含む：
X¹、X³およびX⁴は、個々に、O、SおよびNHからなる群から選ばれ；
X²は、S、O、CH₂およびNHからなる群から選ばれ；
R¹、R²、R³、R⁴およびR⁵は、個々に、-H、-OR'、-SR', -NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R⁴およびR⁵は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂-であり、nは0〜6の整数であり；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂-であり、nは0〜6の整数である；
但し、Rの少なくとも１つは ≠ Hであり、X³およびX⁴の双方は ≠ Oであることを条件とする。

式５：

さらなる実施例においては、式５の化合物は、下記の置換基を含む：
R¹およびR²は、個々に、-H、-OR'、-SR', -NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R¹およびR²は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂-であり、nは0〜6の整数である。

式６：

他の実施態様においては、式６の化合物は、下記の置換基を含む：
R¹、R²およびR³は、個々に、-H、-OR'、-SR'、-NR'R'、-NO₂、-CN、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R'、-C(NR')NR'R'、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；R'の各々は、個々に、-H、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれ；
或いは、R²およびR³は、一緒になって、-CH₂-(CH₂)_n-CH₂-であり、nは0〜6の整数である。
さらに他の実施態様においては、式６の化合物は、R¹がメチルまたはアリルである置換基を含む。

式７：

さらに他の実施態様においては、式７の化合物は、下記の置換基を含む：
Rは、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選ばれる。
当業者であれば、上記の構造式はキラル中心を含有し得、その数は種々の置換基に依存していることを認識されたい。キラリティーは、各中心においてRまたはSのいずれかであり得る。上記構造式は、可能性ある互変異性の配座異性または鏡像異性形の１つのみを示し得るが、本発明は、本明細書において説明する生物学的または薬理学的活性を示すあらゆる互変異性の配座異性または鏡像異性形を包含することを理解すべきである。

薬理および有用性
本発明のある種の実施態様は、哺乳類の損傷または疾患に応答しての細胞の損傷、退化および/または死の治療または予防における本発明の化合物の使用を含む。ある実施態様は、神経変性、ある場合には、アポトーシスおよび壊死性細胞死に関連する症状を患っている動物に本発明の化合物を含有する組成物を伝達することを含む。ある実施態様においては、組成物は、脳細胞に影響を及ぼすまたは影響を及ぼしがちなCNSの損傷または疾患を治療するのに望まれ得る。また、神経再生を促進し、細胞退化または死を軽減し、且つ神経保護性である１種以上の他の薬剤を含む組成物も提供する。
そのような他の薬剤は、例えば、成長因子および関連誘導体、例えば、インスリン様成長因子-I [IGF-I]、インスリン様成長因子-II [IGF-II]、トリペプチド GPE、形質転換成長因子-β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合性タンパク質、および/またはIGF結合性タンパク質からなる群から選択し得る。

本発明の他の実施態様は、軸索の攣縮を促進させる組成物および方法を含む。神経束の形成を促進させることによって、本発明の化合物は、神経過程(軸索および/または樹枝状体)が、急激力損傷、局所領域の壊死もしくは疾患または他の神経過程への局在損傷におけるように、重篤になった症状の治療において有用であり得る。
さらに他の実施態様においては、CNS損傷および疾患のような損傷および疾患に応答しての細胞の損傷および死を治療または予防する組成物および方法は、発作後、治療量の本発明の化合物単独または他の薬剤と併用して投与することを含む。これらの実施態様は、心停止、自動車事故によって生じた頭部損傷のような外傷、頭部切傷等におけるような予期し得ない損傷の場合にとりわけ望ましい。

さらなる実施態様においては、本発明の化合物は、単独または他の薬剤と組合せて、計画的な脳損傷の有害作用を予防するのに使用し得る。そのような状態としては、CABG、または脳手術、血管手術もしくは神経系の潅流低下をもたらし得る他の介入術のような他の計画的手術がある。手術前および/または同時および/または後に、人間のような動物を治療することによって、有害な神経学的作用は軽減させ得る。
上述したように、本発明は、本発明の化合物が、細胞、とりわけ神経細胞を、損傷、神経突起の喪失、および/またはアポトーシスまたは壊死性細胞死に対して防御し得るという本出願人の知見に広く基づいている。

本明細書において、本発明の化合物が細胞培養および神経変性疾患の動物モデルの双方において神経保護性を示し、従って、神経変性の通常の治療法に対する有効な追加または代替法であり得ることを実証する。
上記保護作用のメカニズムは未知であるが、１つの可能性あるメカニズムは、細胞をアポトーシスおよび壊死性細胞死から保護することを含む。しかしながら、作用メカニズムの如何にかかわらず、本発明の化合物は、低酸素症、虚血および神経毒誘発性神経損傷のような種々の神経疾患における有効な治療として使用し得る。さらにまた、本発明の化合物は、何ら特定の神経学的欠損の無い場合も、神経突起成長および神経の攣縮を促進させるのに使用し得る。即ち、細胞死が神経学的障害(例えば、脊髄損傷によって生じるような軸索損傷)に必ずしも関連しない場合も、本発明の化合物の投与は、神経突起再生を促進させる有効な方法であり得る。

治療用途
本発明の組成物および方法は、神経損傷または疾患を患っているヒト患者のような動物の治療における用途を見出している。さらに一般的には、本発明の組成物および方法は、損傷または疾患により、神経損傷または潜在的なアポトーシスおよび/または壊死性細胞死を患っているヒト患者のような哺乳類の治療における用途を見出している。
神経変性、アポトーシスおよび/または壊死に特徴を有する特定の症状および疾患としては、限定するものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、末梢性ニューロパシー、クロイツフェルト・ヤコブ病、エイズ痴呆、進行性核上麻痺、広汎性中枢髄鞘障害(myelinopathia centralis diffusa) (消退性白質疾患)、慢性神経変性疾患、ハンチントン病、卒中、虚血性損傷、低酸素障害、再灌流障害、頭部損傷、CNS外傷、てんかん、脳虚血、緑内障、網膜障害、視神経症、視神経炎、ダウン症候群、脳脊髄炎、髄膜炎、汎脳炎、神経芽細胞腫、総合失調症およびうつ病がある。上記症状の各々は、グルタメート毒性と関連した神経毒性によって擬態される病理学的診断および症状を示す。
さらに一般的には、本発明は、外傷、毒物暴露、呼吸停止または低酸素性虚血の形での発作後の神経束形成の誘発における用途を有する。さらに、本発明は、ガン、ウィルス感染症、自己免疫疾患、神経疾患および損傷、並びに心臓血管疾患の形の損傷または疾患に応答してのアポトーシスの治療または予防における用途も有する。
治療は、損傷前、例えば、予定手術前に行い得る。適切な予定処方の例としては、脳葉の退縮が脳浮腫に至り得る神経手術、または不可避の小塞栓が75%相当の症例において脳機能の検出可能な障害に至ると言われている弁置換術のような心臓手術がある。

有効性の判定
細胞死に対する本発明の化合物の抗アポトーシスおよび抗壊死活性は、Klempt等の方法 (Klempt et al, 1992, Molecular Brain Research: 13: 93-101)、即ち、チオニン/フクシン等で染色した形態、生存および死亡ニューロン細胞数の顕微鏡検査のような当業者にとって公知の方法による細胞計数を使用して、生体内測定が可能である。また、本発明の化合物は、当該技術において公知の質量分光分析、免疫学的方法またはクロマトグラフィー法を使用して、生体外測定も可能である。
CNS損傷は、例えば、永久的な神経学的欠損認識機能の程度、および/または発作性疾患性向により臨床的に判定し得る。本明細書においては、生体内作用を判定するのに適する組織学的方法を開示する。
化合物の治療可能比は、(1)有害副作用を生じる平均投与量対(2)望ましい治療作用を生じる平均投与量の比と理解されたい。即ち、比較的低投与量での治療作用と高投与量での望ましくない副作用を有する化合物においては、治療可能比は >1である。治療可能比は、例えば、ラットまたはマウスのような適切な生体内動物種中で抗アポトーシスおよび抗壊死活性を生じる投与量で割った有意の体重減少(または他の観測し得る副作用)を生じる投与量を比較することによって決定し得る。本発明の化合物の治療作用を判定するのに有用な適切な動物系としては、低酸素-虚血性損傷(Sirimanne et al, 1994 Journal of Neuroscience Methods: 55: 7-14)、実験用免疫脳脊髄炎 (Mendel et al., 1995 Eur. J. Immunol.: 25: 1951-1959)、およびグルタメート毒性がある。

製薬組成物および投与
本発明の化合物は、医薬品の１部または調合製剤として投与し得る。このことは、本発明の化合物を任意の製薬上適切な担体、アジュバントまたは賦形剤と混合することを含む。担体、アジュバントまたは賦形剤の選択は、勿論、使用する投与経路に通常依存する。
一般に、本発明の化合物は、単独または治療する疾患用の他の通常の治療薬と併用して、当該技術において公知の任意の通常の方式により治療上有効な量で投与する。治療上有効な量は、疾病または損傷、その重篤度、治療する動物の年齢および相対的健康性、化合物(１種以上)の効能、および他の要因によって広く変動し得る。抗アポトーシスおよび抗壊死剤としては、本発明の化合物の治療上有効な量は、動物のkg体重当り0.001〜100ミリグラムの範囲であり得、0.001〜0.1 mg/kgの低めの投与量は脳室内投与によるような脳脊髄液を介しての投与に適しており、1〜100 mg/kgのような高めの投与量は経口、全身(例えば、経皮)または非経口(例えば、静脈内)投与のような方法による投与に適している。当業者であれば、その技量および本開示を考慮すると、不必要な実験を行なうことなく、所定の疾患または損傷における本発明の化合物の治療上有効な量を決定し得るであろう。
本発明の化合物は、当該技術において公知の任意の末梢経路により末梢投与し得る。これらの経路としては、非経口経路、例えば、末梢循環系への注入、皮下、眼窩内、点眼、髄腔内、嚢内(intracisternal)、局所、輸注(例えば、遅延放出装置、浸透圧ポンプのようなミニポンプまたは皮膚パッチを使用して)、インプラント、エアゾール、吸入、種皮処理、腹腔内、被膜内(intracapsular)、筋肉内、鼻腔内、経口、口腔、経皮、肺、直腸または腟内がある。組成物は、治療上有効な量(例えば、患者の病理状態を排除または軽減する量)でヒトまたは他の哺乳類への非経口投与用に調製して、上述の神経疾患の治療法を提供する。

望ましくは、可能であれば、抗アポトーシスおよび抗壊死剤として投与する場合、本発明の化合物は、経口投与する。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物のタイプ、単位投与量サイズ、賦形剤の種類および当業者にとって周知の他の要因によって広く変動し得る。一般に、最終組成物は、0.0001質量％〜10質量％、好ましくは0.01質量％〜1質量％の本発明の化合物を含み、残りが賦形剤(１種以上)である。
他の好都合な投与経路としては、皮下注射(例えば、0.9%塩化ナトリウムのような生理学的に適合し得る担体中に溶解して)またはCNSへの直接投与がある。定位固定装置および動物CNSの正確なマップを使用して、化合物を神経損傷部位に直接注入する。そのような投与経路は、その位置の潅流が血管潅流の低下またはその領域への脳脊髄液(CSF)流の低下のいずれかによって危うくなっている場合にとりわけ望ましくあり得る。例としては、患者の脳の側脳室注入によるまたは術的に挿入した短絡を介しての側脳室への投与、静脈内、所望位置への直接注入、または他の経路がある。
CNS中の化合物の有効量は、本発明の化合物と担体を含み、該担体を、患者内で開裂または消化されやすい結合により、本発明の化合物に結合させているプロドラッグ剤形の化合物を投与するよって増大させ得る。投与後開裂または消化される任意の適切な結合を使用し得る。
しかしながら、出願人は、他の投与形を除外するつもりはない。

本発明のさらなる実施態様においては、動物における神経機能の再生法は、治療量の本発明の化合物を、例えば、成長因子および関連誘導体(インスリン様成長因子-I [IGF-I]、インスリン様成長因子-II [IGF-II]、形質転換成長因子-β1、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、IGF結合性タンパク質[とりわけ、IGFBP-3]、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、hst/Kfgk遺伝子産生物、FGF-3、FGF-4、FGF-6、ケラチノサイト成長因子、アンドロゲン誘発性増殖因子)から選ばれた他の神経保護剤と組合せて投与すること含み得る。FGF群のさらなるメンバーとしては、例えば、int-2、線維芽細胞成長因子相同性因子-1 (FHF-1)、FHF-2、FHF-3およびFHF-4、ケラチノサイト成長因子2、グリア活性化因子、FGF-10およびFGF-16、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、骨形成タンパク質2 [BMP-2]、グリア細胞系由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンM、インターロイキン)、α-、β-、γ-またはコンセンサスインターフェロン、およびTNF-αがある。他の形の神経保護治療薬としては、例えば、クロメチアゾール；キヌレン酸、セマックス(Semax)、タクロリムス、L-スレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノール、アドレノコルチコトロピン-(4〜9)アナログ [ORG 2766]、ジゾルシピン [MK-801]、セレギリン；NPS1506、GV1505260、MK-801、GV150526のようなグルタメート拮抗薬；2,3-ジヒドロキシ-6-ニトロ-7-スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン (NBQX)、LY303070およびLY300164のようなAMPA拮抗薬；抗-MAdCAM-1mAb MECA-367 (ATCC受託番号 HB-9478)のような、アドレスシンMAdCAM-1および/またはそのインテグリンα4レセプター(α4β1およびα4β7)に対して特異性の抗炎症薬がある。

化合物は、持続放出系により、適切に投与される。適切な例の持続放出組成物は、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形の半透過性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスは、ポリラクチド類(米国特許第3,773,919号；EP 第58,481号)、L-グルタミン酸とガンマ-エチル-L-グルタメートとのコポリマー (Sidman et al., 1983, Biopolymers: 22: 547-56)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15: 267)、エチレン酢酸ビニル (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15: 267)、またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸 (EP 第133,988号)を含む。また、持続放出組成物は、リポソームに内包された化合物を含む。化合物含有リポソームは、それ自体公知の方法によって調製する：DE 第3,218,121号、EP 第52,322号、EP 第36,676号、EP 第88,046号、EP 第143,949号、EP 第142,641号、日本特許出願第83-118008号、米国特許第4,485,045号および第4,544,545号、並びにEP 第102,324号。通常、リポソームは、脂質分が約30モル%よりも多いコレステロールであり、使用割合を最有効治療用に調整した小さい(約200〜800オングストローム)単層タイプを有する。

非経口投与においては、１つの実施態様において、化合物を、一般に、単位投与量の注射可能な剤形(溶液、懸濁液またはエマルジョン)中に、製薬上または非経口的に許容し得る担体、即ち、使用する投与量および濃度で受容者にとって無毒であり且つ製剤の他の成分と適合性である担体と各々所望の純度で混合することによって調合する。
一般に、製剤は、化合物と液体担体もしくは微分割固形担体またはその双方と均一且つ緊密に接触させることによって調製する。その後、必要に応じて、生成物を所望製剤に成形する。担体は、好ましくは非経口担体、より好ましくは受容者の血液と等張性の溶液である。そのような担体ビヒクルの例としては、水、塩水、リンゲル溶液、緩衝溶液、およびデキストロース溶液がある。固定油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルも本発明において有用である。

担体は、適切には、少量の等張性および化学安定性を高める物質のような添加剤を含有する。そのような物質は、使用する投与量および濃度で受容者に対し無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはその塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような酸化防止剤；低分子量(約10個未満の残基)ポリペプチド類、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド類；血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンまたはアルギニンのようなアミノ酸類；単糖類、二糖類、およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロースまたはデキストリンのような他の炭水化物；EDTAのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール類；ナトリウムのような対向イオン；ポリソルベート、ポロキサマーまたはポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン界面活性剤；および/または中性塩、例えば、NaCl、KCl、MgCl₂、CaCl₂等を含む。
化合物は、典型的には、そのようなビヒクル中で、約4.5〜8のpHで調合する。ある種の上記賦形剤、担体または安定剤の使用は化合物の塩の形成をもたらすことを理解されたい。最終製剤は、安定な液体または凍結乾燥固形物であり得る。

また、製薬組成物中の化合物製剤は、アジュバントも含み得る。錠剤、カプセル剤等中に混入させ得る典型的なアジュバントは、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；微結晶性セルロースのような賦形剤；コーンスターチまたはアルギン酸のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；スクロースまたはラクトースのような甘味化剤；ペパーミント、ウィンター・グリーンまたはサクランボのような風味剤である。投与量剤形がカプセルである場合、上記物質以外に、カプセルは、脂肪油のような液体担体も含有し得る。種々のタイプの他の物質も、コーティング剤としてまたは投与量単位の物理的剤形の改良剤として使用し得る。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、スクロースのような甘味化剤、プロピルパラベンのような防腐剤、着色剤およびサクランボのような風味剤を含有し得る。注射用滅菌組成物は、通常の製薬実務に従って調合し得る。例えば、水；ゴマ油、ピーナツ油または綿実油のような天然産植物油またはオレイン酸エチル等のような合成脂肪ビヒクルのようなビヒクル中での活性化合物の溶解または懸濁が望まれ得る。緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤等は、許容し得る製薬実務に従い混入させ得る。

注射、脳室内投与および他の侵略的投与経路においては、使用する化合物は、滅菌しなければならない。滅菌は、当該技術における公知の任意の方法、例えば、滅菌濾過膜(例えば、0.2ミクロン膜)による濾過によって達成し得る。治療用組成物は、通常、滅菌受入れ端子を有する容器、例えば、皮下注射針により刺し通す得るストッパーを有する静注溶液バッグまたはバイアル中に入れる。
調合製剤は、通常、単位または複数回投与量容器中、例えば、密閉アンプルまたはバイアル中で、水溶液としてまたは再構成用の凍結乾燥製剤として保存する。凍結乾燥製剤の例としては、10 mLバイアルを5 mLの化合物滅菌濾過1%(質量/容量)水溶液で満たし、得られた混合物を凍結乾燥する。輸注溶液は、滅菌注射用水を使用して凍結乾燥化合物を再構成することによって調製する。他の投与量剤形および製剤タイプを使用し得ることは、容易に認識し得ることであり、全て本発明の１部とみなす。

化合物の調製
これらの化合物を調製するのに使用する出発物質および試薬類は、Aldrich Chemical Company社 (ウィスコンシン州ミルウォーキー)、Bachem社 (カリフォルニア州トランス)、Sigma社 (ミズーリ州セントルイス)のような商業的供給業者から入手し得るか、或いはFieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, vols 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991；Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989；Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991；March J; Advanced Organic Chemistry, 4^th ed. John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992；およびLarock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989のような文献に記載されている手順に従う当業者にとって周知の方法により調製する。殆どの場合、アミノ酸およびそのエステルまたはアミド類、並びに保護アミノ酸は、広く商業的に入手可能であり；修飾アミノ酸およびそのアミドまたはエステル類の調製は、化学および生化学文献に広く記載されており、従って、当業者にとって周知である。

出発物質、中間体および本発明の化合物は、濾過、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー等のような通常の方法を使用して、単離し精製し得る。これらは、物理定数およびスペクトルデータのような通常の方法を使用して特性決定し得る。
本発明の化合物は、以下で説明し、下記の実施例において示すような方法によって調製し得る。
本発明の化合物は、一般に、環状ジペプチド(二環式2,5-ジケトピペラジン)またはそのアナログである。一般に、これらの化合物は、本明細書を補う図式に示す反応式に従い、ペプチドおよび修飾ペプチド合成技術における当業者にとって既に周知であるような方法により、ペプチドおよびアナログ類の合成技術における当業者にとって周知の他の方法に従うことにより調製し得る。例えば、Bodanzsky: Principles of Peptide Synthesis, Berlin, New York: Springer-Verlag 1993を参照されたい。

本発明のジケトピペラジン化合物の合成は、下記の実施例に説明している溶液相合成によるか、またはMerrifield et al. 1963 J. Amer. Chem. Soc.: 85, 2149-2156に例示されている固相合成法により得る。固相合成は、Applied Biosystems Model 430Aのような市販のペプチドシンセサイザーを使用し、該装置用に確立されたプロトコールを使用して実施し得る。
ジケトピペラジン合成の特定の例は、下記の実施例において、さらに、例えば、Fischer, 2003, J. Peptide Science: 9: 9-35およびその中の引用文献において見出し得る。当業者であれば、その利用し得る技量および知識並びに本開示を考慮すると、本発明の化合物の１つまたはそれ以上の適切な合成方法を開発するのは難しいことではないであろう。
選択した方法(固相または溶液相)における適切な保護基および固相合成を使用する場合の適切な基質の選択は、当業者の技量の範囲内である。ペプチド合成における適切な保護基としては、t-ブチロキシカルボニル(Boc)、フルオレニルメチロキシカルボニル(Fmoc)、ベンジル(Bzl)、t-アミロキシカルボニル(Aoc)、トシル(Tos)、ベンジロキシカルボニル(ZまたはCbz)、o-ブロモ-ベンジロキシカルボニル(BrZ)等がある。さらなる保護基は、上記で引用したMerrifield、およびMcOmie JFW: Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973に特定されている。
選択した方法におけるカップリング剤の選択も当業者の技量の範囲内である。適切なカップリング剤としては、DCC (N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド)、Bop (ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)、PyBop (ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)、BocCl (ビス(2-オキソ-3-アキサゾリジニル)ホスフィニッククロライド)、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート(CIP)等がある。
例えば、化合物は、下記の各方法により合成し得る。

反応式１：

試薬、条件および収率：
(i) LDA、THF、-78 ℃、イオドメタン、-78℃〜>-50 ℃、2時間 (63%)；
(ii) SOCl₂、CH₃OH、還流、N₂、2.5時間 (98%)；
(iii) Et₃N、BoPCl、CH₂Cl₂、RT、N₂、20.5時間 (78%)；
(iv) 10% Pd/C、CH₃OH、RT、15時間 (98%)。

オキサゾリジノン(８)は、クロラルとプロリンとの反応により合成し得る。その後、このオキサゾリジノンは、リチウムジイソプロピルアミド(LDA)を使用して還元し得、次いで、イオドメタンを使用してメチル基の付加を行い、オキサゾリジノン(９)を生成させ得る。塩化チオニルまたは塩化アセチルを使用し、上記反応式１におけるように、2-メチルプロリンのメチルエステルを生成させ得る。当業者にとっては、イオドメタンを適切なハロゲン化合物と置換えて炭素2位置で修飾した種々のアナログを生成させ得ることは明白であろう。例えば、イオドエタンの使用は2-エチルプロリンを生成させ；臭化アリルの使用は2-アリルプロリンを生成させ；臭化ベンジルの使用は2-ベンジルプロリンを生成させる。

その後、C-末端で保護したプロリンを、Cbz、BocまたはFmocのような適切な保護基によりN-末端で保護したアミノ酸にカップリングさせ得る。この手順における適切なカップリング剤は、当業者にとって自明であり、ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィニッククロライド(BoPCl)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート(CIP)のような試薬がある(Babu and Ananda, 2001, Indian J. Chem. Sect. B.,: 40B(1): 70；Akaji and Aimoto 2001, Tetrahedron, 57(9), 1749)。その後、そのようにして形成させたジペプチドを、例えば、水素化を使用してN-末端で選択的に脱保護してCbz基およびトリフルオロ酢酸(TFA)を除去してBoc基を除去し得る。その後、分子は、メチルエステルのメトキシ基の削除により環状化してジケトピペラジンを得る。
反応式１において使用するアミノ酸は、R⁴=R⁵=Hである式１の化合物を生じるグリシンである。グリシンを他のアミノ酸類で置換えると、R⁴=Hであり、R⁵がそれぞれのアミノ酸の側鎖と等価である式１の化合物を生じるであろう。

反応式２：

試薬、条件および収率：
(i) BnO₂CCl、Na₂CO₃、H₂O-ジオキサン(3：1)、19時間、96%；
(ii) Et₃N、HOAt、CIP、1,2-ジクロロエタン、還流、N₂、19時間 (23%)；
(iii) 10% Pd/C、CH₃OH、RT、17時間 (65%)。

1-アミノシクロヘキサンカルボン酸(１３) (Fluka社)は、Cbzのような保護基を使用して、N-末端で保護し得る。その後、この化合物は、反応式２におけるように、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート(CIP)のような適切なカップリング剤を使用し、C-末端で適切に保護されたプロリン誘導体にカップリングさせ得る。その後、そのようにして形成させたジペプチドを、例えば、水素化によりN-末端で選択的に脱保護し得、結果としてのメチルエステルのメトキシ基の除去によりジケトピペラジンを生成させる。当業者にとって、上記1-アミノシクロヘキサンカルボン酸を1-アミノシクロペンタンカルボン酸または1-アミノシクロプロパンカルボン酸のようなアナログ化合物で置換えることが可能であることは明白であろう。また、プロリンのC-2 (反応式２における炭素中心8a)位置のメチル基を上述したようなエチル、アリルおよびベンジルのような他の基で置換え得ることも明白であろう。
本明細書全体に亘って引用した全ての特許および文献は、その全体を参考として本明細書に明白に合体させる。

（実施例）
本発明を、以下の実施例によりさらに具体的に説明する。これらの実施例は、単に例示としてのみに提示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
一般的方法
フラッシュクロマトグラフィーは、Scharlau 60 (40〜60μmメッシュ)シリカゲルを使用して実施した。分析用薄層クロマトグラフィーは、0.20 mmの事前コーティングシリカゲルプレート(ALUGRAM^R SIL G/UV₂₅₄)において実施し、化合物は、UV蛍光を使用して或いは過マンガン酸カリウム中に浸漬したプレートをアルカリ溶液中で加熱して可視化した。
摂氏(℃)での融点は、Electrothermal^R 融点装置で測定し、補正はしなかった。
旋光度は、Perkin Elmer 341偏光計で、10 cm道程セルを使用して20℃で測定し、10^-1degcm²g^-1の単位で得た。サンプルは、特定濃度に指示された溶媒中で調製した(g/100cm³で測定した)。IRスペクトルは、Perkin Elmer Spectrum One FT-IR分光計において記録した。サンプルは、塩化ナトリウムディスク上の薄膜としてまたは臭化カリウムディスク内の固形物として調製した。広いシグナルは、brで示した。吸収極大としての周波数(υ)は、波数(cm^-1)で示す。

NMRスペクトルは、Bruker AVANCE DRX400 (¹H、400 MHz；¹³C、100 MHz)またはBruker AVANCE 300 (¹H、300 MHz；¹³C、75 MHz)分光計において、周囲温度で記録した。¹H NMRデータにおいては、化学シフトをSiMe₄からの百万分率ダウンフィールドで表し、位置(δ_H)、相対整数、多重度(s = 一重項、d = 二重項、t = 三重項、dd = 二重項のうちの二重項、m = 多重項、br = 広い)、結合定数(J/Hz)および帰属(assignment)として連続的に報告する。¹³C NMRデータにおいては、化学シフトは、CDCl₃に対して百万分率で表し、位置(δ_C)、DEPT試験により測定したときのハイブリッド化度、および帰属として連続的に報告する。¹H NMRスペクトルは、SiMe₄ (δ 0.00)またはCDCl₃ (δ7.26)を使用して内部参照させた。¹³C NMRスペクトルは、CDCl₃ (δ 77.0)を使用して内部参照させた。NMRスペクトルにおいてグリシン-プロリンアミド結合の周りの異なる配座に基づき２組のピークが生じたときは、少量シス配座異性体における化学シフトを星印(*)でマークした。
精確な質量測定は、VG-70SE質量分光計において記録した。
ヘキサンとジクロロメタンは、使用前に蒸留した。メタノールは、マグネシウム屑およびヨウ素を使用して乾燥させ、窒素下に蒸留した。トリエチルアミンは、水素化カルシウム上で乾燥させ、窒素下に蒸留した。

実施例１
(8aS)-メチル-ヘキサヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-1,4-ジオン (環状G-2MeP)の合成
構造式、および反応式１：

試薬、条件および収率：
(i) LDA、THF、-78 ℃、イオドメタン、-78℃〜>-50 ℃、2時間 (63%)；
(ii) SOCl₂、CH₃OH、還流、N₂、2.5時間 (98%)；
(iii) Et₃N、BoPCl、CH₂Cl₂、RT、N₂、20.5時間 (78%)；
(iv) 10% Pd/C、CH₃OH、RT、15時間 (98%)。

(2R,5S)-4-メチル-2-トリクロロメチル-1-アザ-3-オキサビシクロ[3.3.0]オクタン-4-オン(９)
n-BuLi (1.31 M、4.68 cm³、6.14ミリモル)を、窒素雰囲気下に、−78℃の乾燥テトラヒドロフラン(10 cm³)中ジイソプロピルアミン(0.86 cm³、6.14ミリモル)の撹拌溶液に滴下により添加した。溶液を5分間撹拌し、0℃に温め、15分間撹拌した。その後、溶液を、−78℃の乾燥テトラヒドロフラン(20 cm³)中オキサゾリジノン(８) (1.00 g、4.09ミリモル)の溶液に20分間に亘って滴下により添加し(暗褐色に変った)、さらに30分間撹拌し、その後、イオドメタン(0.76 cm³、12.3ミリモル)を5分間に亘って滴下により添加した。溶液を2時間に亘って−50℃に温めた。水(15 cm³)を添加し、溶液を室温に温め、クロロホルム(3×40 cm³)で抽出した。寄せ合せた有機抽出物を乾燥させ(MgSO₄)、濾過し、真空中で蒸発乾固させて暗褐色半固形物を得た。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(15%酢酸エチル-ヘキサン)により精製して、オキサゾリジノン(９) (0.67 g、63%)を黄白色固形物として得た：mp 55〜57℃ (文献値、57〜60℃)；δ_H (300 MHz、CDCl₃) 1.53 (3H、s、CH₃)、1.72〜2.02 (3H、m、Proβ-H and Proγ-H₂)、2.18〜2.26 (1H、m、Proβ-H)、3.15〜3.22 (1H、m、Proδ-H), 3.35〜3.44 (1H、m、Proδ-H)および4.99 (1H、s、NCH)。

メチル-L-2メチルプロリネートヒドロクロライド(１０)
a) 塩化アセチルの使用
オキサゾリジノン(９) (0.60 g、2.33ミリモル)を、窒素雰囲気下に、乾燥メタノール(15 cm³)中に溶解し、塩化アセチル(0.33 cm³、4.66ミリモル)を氷冷溶液に滴下により添加した。溶液を還流下に4.5時間加熱し、次いで、溶媒を減圧下に除去して褐色油状物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(10%CH₃OH-CH₂Cl₂)により精製して上記ヒドロクロライド(１０) (0.2g、48%)をフレーク状白色固形物として得た：mp 107〜109℃ (文献値、106〜108℃)；δ_H (300 MHz、CDCl₃) 1.81 (3H、s、CH₃)、1.93〜2.14 (3H、m、Proβ-H_AH_BおよびProγ-H₂)、2.33〜2.39 (1H、m、Proβ-H_AH_B)、3.52〜3.56 (2H、m、Proδ-H₂)および3.82 (3H、s、CO₂CH₃)。
b) 塩化チオニルの使用
乾燥メタノール(1 cm³)中オキサゾリジノン(９) (53 mg、0.21ミリモル)の氷冷溶液を塩化チオニル(0.045 cm³、0.62ミリモル)で滴下により処理した。溶液を還流下に2.5時間加熱し、冷却し、溶媒を減圧下に除去して褐色油状物を得た。油状物をトルエン(5 cm³)中に溶解し、濃縮乾固して残留塩化チオニルおよびメタノールを除去し、次いで、フラッシュカラムクロマトグラフィー(10%CH₃OH-CH₂Cl₂)により精製して上記ヒドロクロライド(１０) (16 mg、43%)をフレーク状白色固形物として得た。¹H NMR帰属は、上述の帰属と一致していた。

メチル-N-ベンジロキシカルボニル-グリシル-L-2-メチルプロリネート(１２)
乾燥トリエチルアミン(0.27 cm³、1.96ミリモル)を、乾燥ジクロロメタン(35 cm³)中のヒドロクロライド(１０) (0.11 g、0.61ミリモル)およびN-ベンジロキシカルボニル-グリシン(１１) (98.5%) (0.17 g、0.79ミリモル)の溶液に、窒素雰囲気下に室温で滴下により添加し、反応混合物を10分間撹拌した。ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィニッククロライド(BoPCl、97%) (0.196 g、0.77ミリモル)を添加し、得られた無色溶液を20.5時間撹拌した。溶液を10%希塩酸(30 cm³)および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(30 cm³)で連続洗浄し、乾燥させ(MgSO₄)、濾過し、真空中で蒸発乾固させた。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(50〜80%酢酸エチル-ヘキサン；勾配溶出)により精製して、ジペプチド(１２) (0.18 g、92%)を無色油状物として得た。アミド(１２)は、¹³C NMR分析により配座異性体の98：2のトランス：シス混合物として存在していることが証明された(上記の比は、少量および大量配座異性体それぞれのProγ-C原子に帰属するδ20.8および23.5での相対的共鳴強度から推定した)：[α]_D -33.0 (MeOH中のc 1.0)；ν_max (フィルム)/cm^-1 3406、2952、1732、1651、1521、1434、1373、1329、1310、1284、1257、1220、1195、1172、1135、1107、1082、1052、1029、986、965、907、876、829、775、738および699；δ_H (300 MHz、CDCl₃) 1.49 (3H、s、CH₃)、1.77〜2.11 (4H、m、Proβ-H₂およびProγ-H₂)、3.43〜3.48 (2H、m、Proδ-H₂)、3.61 (3H、s、OCH₃)、3.85〜3.89 (2H、m、Glyα-H₂)、5.04 (2H、s、PhCH₂)、5.76 (1H、br s、N-H)および7.21〜7.28 (5H、s、ArH)；δ_C (75 MHz、CDCl₃) 13.8* (CH₃、Proα-CH₃)、21.1 (CH₃、Proα-CH₃)、20.8* (CH₂、Proγ-C)、23.5 (CH₂、Proγ-C)、38.0 (CH₂、Proβ-C)、40.8* (CH₂、Proβ-C)、43.3 (CH₂、Glyα-C)、45.5* (CH₂、Glyα-C)、46.6 (CH₂、Proδ-C)、48.7* (CH₂、Proδ-C)、51.9* (CH₃、OCH₃)、52.1 (CH₃、OCH₃)、60.0* (四重項.、Proα-C)、66.0 (四重項、Proα-C)、66.3 (CH₂, PhCH₂)、68.6* (CH₂、PhCH₂)、127.5 (CH、Ph)、127.6 (CH、Ph)、127.9* (CH、Ph)、128.1 (CH、Ph)、128.3* (CH、Ph)、136.2 (四重項、Ph)、155.9 (四重項、NCO₂)、166.0 (四重項、Gly-CON)、169.4* (四重項、Gly-CON)および173.6 (四重項、CO₂CH₃)；m/z (EI+) 334.1535 (M⁺. C₁₇H₂₂N₂O₅は334.1529を必要とする)。

(8aS)-メチル-ヘキサヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-1,4-ジオン (環状G-2MeP)
メタノール(8.0 cm³)中のジペプチド(１２) (0.167 g、0.51ミリモル)の溶液に、活性炭上の10%Pd(8.1 mg、0.076ミリモル)を添加し、容器を水素ガスでフラッシングした。得られた懸濁液を水素雰囲気下に15時間激しく撹拌した。その後、混合物をセライト(Celite)パッド次いでメタノールを含むシリカゲルのショートプラグにより濾過し、溶媒を減圧下に除去して環状G-2MeP (83 mg、98%)を黄色固形物として生成させた：mp 133〜135℃；[α]_D -128.1 (MeOH中のc 0.52)；δ_H (300 MHz、CDCl₃) 1.36 (3H、s、CH₃)、1.87〜2.01 (3H、m、Proβ-H_AH_BおよびProγ-H₂)、2.07〜2.21 (1H、m、Proβ- H_AH_B)、3.45〜3.64 (2H、m、Proδ-H₂), 3.82 (1H、dd、J 17.1および4.1、CH_AH_BNH)、3.99 (1H、d、J 17.1、CH_AH_BNH)および7.66 (1H、br s、N-H)；δ_C (75 MHz、CDCl₃) 20.2 (CH₂、Proγ-C)、23.2 (CH₃, Proα-CH₃)、35.0 (CH₂、Proβ-C)、44.7 (CH₂、Proδ-C)、45.9 (CH₂、CH₂NH)、63.8 (四重項、Proα-C)、163.3 (四重項、NCO)および173.3 (四重項、CONH)；m/z (EI+) 168.08986 (M⁺. C₈H₁₂N₂O₂は168.08988を必要とする)。

実施例２
(8aS)-メチル-スピロ[シクロヘキサン-1,3(4H)-テトラヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン]-1,4(2H)-ジオン (環状シクロヘキシルG-2MeP)の合成
構造式、および反応式２：

試薬、条件および収率：
(i) BnO₂CCl、Na₂CO₃、H₂O-ジオキサン(3：1)、19時間、96%；
(ii) Et₃N、HOAt、CIP、1,2-ジクロロエタン、還流、N₂、19時間 (23%)；
(iii) 10% Pd/C、CH₃OH、RT、17時間 (65%)。

N-ベンジロキシカルボニル-1-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸(１４)
水-ジオキサン(21 cm³、3：1)中に溶解させた1-アミノシクロヘキサンカルボン酸(13) (0.72 g、5.02ミリモル)と炭酸ナトリウム(1.6 g、15.1ミリモル)の懸濁液に、ベンジルクロロホルメート(0.79 cm³、5.52ミリモル)を滴下により添加し、溶液を室温で19.5時間撹拌した。水性層をジエチルエーテル(60 cm³)で洗浄し、2 M HClで酸性化し、酢酸エチル(2×60 cm³)で抽出した。有機層を寄せ合わせ、乾燥させ(MgSO₄)、濾過し、減圧下に蒸発させて無色油状物を生成させた。これは、放置時に、白色固形物として粗カルバメート(１４) (1.23 g、88%)に固化した：mp 152〜154℃ (文献値、148〜150℃)；δ_H (400 MHz、CDCl₃) 1.27〜1.56 (3H、m、3×シクロヘキシル-H)、1.59〜1.73 (3H、m、3×シクロヘキシル-H)、1.85〜1.91 (2H、m、2×シクロペンチル-H)、2.05〜2.09 (2H、m、2×シクロペンチル-H)、5.02 (1H、br s、N-H)、5.12 (2H、s、OCH₂Ph)および7.27〜7.36 (5H、s、Ph)；δ_C (100 MHz、CDCl₃) 21.1 (CH₂、2×シクロヘキシル-C)、25.1 (CH₂、2×シクロヘキシル-C)、32.3 (CH₂、シクロヘキシル-C)、59.0 (四重項、1-C)、67.1 (CH₂、OCH₂Ph)、128.1 (CH、Ph)、128.2 (CH、Ph)、128.5 (CH、Ph)、136.1 (四重項、Ph)、155.7 (四重項、NCO₂)および178.7 (四重項、CO₂H)。

メチル-N-ベンジロキシカルボニル-シクロヘキシル-グリシル-L-2-メチルプロリネート(１５)
乾燥トリエチルアミン(0.21 cm³、1.5ミリモル)を、乾燥1,2-ジクロロエタン(26 cm³)中のヒドロクロライド(１０) (84.0 mg、0.47ミリモル)、カルボン酸(１４) (0.17 g、0.61ミリモル)および1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(16 mg、0.12ミリモル)の溶液に、窒素雰囲気下に室温で滴下により添加し、反応混合物を10分間撹拌した。2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート(0.13 g、0.47ミリモル)を添加し、得られた溶液を還流下に21時間加熱し、その後、10%希塩酸(30 cm³)および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(30 cm³)で連続洗浄し、乾燥させ(MgSO₄)、濾過し、真空下に蒸発乾固させた。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(40〜50酢酸エチル-ヘキサン；勾配溶出)により精製してアミド(１５) (16 mg、9%)を白色固形物として得た。アミド(１５)は、¹³C NMR分析により配座異性体の11：1のトランス：シス混合物として存在していることが証明された(上記の比は、少量および大量配座異性体それぞれのProδ-C原子に帰属するδ41.3および48.2での相対的共鳴強度から推定した)：mp 219〜222℃；[α]_D -44.9 (CH₂Cl₂中のc 1.31)；ν_max (フィルム)/cm^-1 3239、2927、1736、1707、1617、1530、1450、1403、1371、1281、1241、1208、1194、1165、1150、1132、1089、1071、1028、984、912、796、749、739および699；δ_H (400 MHz、CDCl₃) 1.24〜2.10 (17H、m、Proα-CH₃、Proβ-H₂、Proγ-H₂および5×シクロヘキシル-H₂)、3.25〜3.48 (1H、br m、Proδ-H_AH_B)、3.61〜3.87 (4H、br m、OCH₃およびProδ-H_AH_B)、4.92〜5.19 (3H、m、N-HおよびOCH₂Ph)および7.35〜7.37 (5H、s、Ph)；δ_C(100 MHz、CDCl₃) 21.26 (CH₂、シクロヘキシル-C)、21.33 (CH₂、シクロヘキシル-C)、21.7 (CH₃、Proα-CH₃)、24.8 (CH₂、シクロヘキシル-C)、25.0 (CH₂、Proγ-C)、29.4* (CH₂、シクロヘキシル-C)、29.7* (CH₂、シクロヘキシル-C)、31.1 (CH₂、シクロヘキシル-C)、31.6 (CH₂、シクロヘキシル-C)、31.9* (CH₂、シクロヘキシル-C)、32.2* (CH₂、シクロヘキシル-C)、32.8* (CH₂、シクロヘキシル-C)、37.3 (CH₂、Proβ-C)、41.4* (CH₂、Proδ-C)、48.2 (CH₂、Proδ-C), 52.1 (CH₃、OCH₃)、59.1 (四重項、Glyα-C)、66.7 (CH₂、OCH₂Ph)、67.3* (CH₂、OCH₂Ph)、67.4 (四重項、Proα-C)、128.0* (CH、Ph)、128.1* (CH、Ph)、128.3 (CH、Ph)、128.5 (CH、Ph)、128.7 (CH、Ph)、136.6 (四重項、Ph)、153.7 (四重項、NCO₂)、171.0 (四重項、Gly-CO)および174.8 (四重項、CO₂CH₃)；m/z (EI+) 402.2151 (M⁺. C₂₂H₃₀N₂O₅は402.2155を必要とする)。

(8aS)-メチル-スピロ[シクロヘキサン-1,3(4H)-テトラヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン]-1,4(2H)-ジオン (環状シクロヘキシルG-2MeP)
メタノール(3.3 cm³)中のアミド(１５) (40 mg、0.01ミリモル)の溶液に、活性炭上の10%Pd(1.6 mg、0.015ミリモル)を添加し、容器を水素ガスでフラッシングした。得られた懸濁液を水素雰囲気下に61.5時間激しく撹拌し、次いで、メタノール(15 cm³)を含むセライト(Celite^TM)パッドにより濾過した。濾液を減圧下に濃縮乾固させて黄色半固形物を生成させた。これを逆相C18フラッシュカラムクロマトグラフィー(0〜10% CH₃CN/H₂O；勾配溶出)により精製して白色固形物として環状シクロヘキシルG-2MeP (19 mg、81%)を生成させた：mp 174〜177℃；[α]_D -63.8 (CH₂Cl₂中のc 1.13)；ν_max (フィルム)/cm^-1 3215、2925、2854、1667、1646、1463、1427、1276、1232、1171、1085、1014、900、868、818、783、726および715；δ_H (400 MHz、CDCl₃) 1.31〜1.89 (12H、m、9×シクロヘキシル-Hおよび8a-CH₃)、1.94〜2.15 (4H、m、7-H₂および8-H₂)、2.26 (1H、td、J 13.7および4.5、1×シクロヘキシル-H)、3.44〜3.51 (1H、m、6-H_AH_B)、3.79〜3.86 (1H、m、6-H_AH_B)および6.40 (1H、br s、N-H)；δ_C (100 MHz、CDCl₃) 19.5 (CH₂、7-C)、20.6 (CH₂、シクロヘキシル-C)、20.8 (CH₂、シクロヘキシル-C)、24.5 (CH₂、シクロヘキシル-C)、25.0 (CH₃、8a-CH₃)、33.7 (CH₂、シクロヘキシル-C)、36.3 (CH₂、8-C)、36.5 (CH₂、シクロヘキシル-C)、44.7 (CH₂、6-C)、59.5 (四重項、8a-C)、64.0 (四重項、3-C)、168.1 (四重項、4-C)および171.6 (四重項、1-C)；m/z (EI+) 236.15246 (M⁺. C₁₃H₂₀N₂O₂は236.15248を必要とする)。

実施例３
(8aS)-アリル-ヘキサヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-1,4-ジオン (環状G-2アリルP)の合成
構造式、および反応式３：

試薬、条件および収率：
(i) LDA、THF、-78℃、臭化アリル、-78℃〜> -30℃、N₂、4時間 (60%)；
(ii) 塩化アセチル、CH₃OH、還流、N₂、24時間 (63%)；
(iii) Et₃N、BoPCl、CH₂Cl₂、RT、N₂、19.5時間 (45%)；
(iv) TFA、CH₂Cl₂、1時間、その後、Et₃N、CH₂Cl₂、23時間 (37%)。

(2R,5S)-4-アリル-2-トリクロロメチル-1-アザ-3-オキサビシクロ[3.3.0]オクタン-4-オン(１７)
n-BuLi (1.31 M、9.93 cm³、13.0ミリモル)を、窒素雰囲気下に、−78℃の乾燥テトラヒドロフラン(20 cm³)中ジイソプロピルアミン(1.82 cm³、13.0ミリモル)の撹拌溶液に滴下により添加した。溶液を5分間撹拌し、0℃に温め、15分間撹拌し、その後、−78℃の乾燥テトラヒドロフラン(40 cm³)中プロ-オキサゾリジノン(１６) (2.12 g、8.68ミリモル)の溶液に20分間に亘って滴下により添加し、反応混合物をさらに30分間撹拌し、次いで、臭化アリル(2.25 cm³、26.0ミリモル)を5分間に亘って滴下により添加した。溶液を4時間に亘って−30℃にゆっくり温め、H₂O (30 cm³)で急冷し、混合物を室温に温め、クロロホルム(3×80 cm³)で抽出した。寄せ合せた有機抽出物を乾燥させ(MgSO₄)、濾過し、真空下に蒸発乾固させて暗褐色半固形物を生成させ、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(10〜20%酢酸エチル-ヘキサン；勾配溶出)により精製してアキサゾリジノン(１７) (1.48 g、60%)をオレンジ色油状物として生成させた。これは0℃で固化し、NMRデータは、文献において報告されているデータと一致していた：δ_H (400 MHz、CDCl₃) 1.58〜1.92 (2H、m、Proγ-H₂)、1.96〜2.14 (2H、m、Proβ-H₂)、2.50〜2.63 (2H、m、Proδ-H₂)、3.12〜3.23 (2H、m、CH ₂-CH=CH₂)、4.97 (1H、s、NCH)、5.13〜5.18 (2H、m、CH=CH₂)および5.82〜5.92 (1H、m、CH=CH₂)；δ_C (100 MHz、CDCl₃) 25.1 (CH₂、Proγ-C)、35.1 (CH₂、Proβ-C)、41.5 (CH₂、Proδ-C)、58.3 (CH₂、CH₂CH=CH₂)、71.2 (四重項、Proα-C)、100.4 (四重項、CCl₃)、102.3 (CH、NCH)、119.8 (CH₂、CH₂CH=CH₂)、131.9 (CH、CH₂CH=CH₂)および176.1 (四重項、C=O)；m/z (CI+) 284.0009 [(M+H)⁺. C₁₀H₁₃ ³⁵Cl₃NO₂は284.0012を必要とする]、285.9980 [(M+H)⁺. C₁₀H₁₃ ³⁵Cl₂ ³⁷ClNO₂は285.9982を必要とする]、287.9951 [(M+H)⁺. C₁₀H₁₃ ³⁵Cl³⁷Cl₂NO₂は287.9953を必要とする]および289.9932 [(M+H)⁺. C₁₀H₁₃ ³⁷Cl₃NO₂は289.9923を必要とする]。

メチルL-2-アリルプロリネートヒドロクロライド(１８)
乾燥メタノール(15 cm³)中のオキサゾリジノン(１７) (0.64 g、2.24ミリモル)の氷冷溶液を、メタノール(5 cm³)中の塩化アセチル(0.36 cm³、5.0ミリモル)の溶液で滴下により処理した。溶液を還流下に4時間加熱し、その後、冷却し、溶媒を減圧下に除去した。得られた褐色油状物をトルエン(40 cm³)中に溶解し、濃縮乾固して残留塩化チオニルおよびメタノールを除去し、次いで、フラッシュカラムクロマトグラフィー(5〜10%CH₃OH-CH₂Cl₂；勾配溶出)により精製してヒドロクロライド(１８) (0.29 g、63%)を緑色固形物として得た。NMRデータは、文献において報告されているデータと一致していた：δ_H (300 MHz、CDCl₃) 1.72〜2.25 (3H、m、Proβ-H_AH_BおよびProγ-H₂)、2.32〜2.52 (1H、m、Proβ-H_AH_B)、2.72〜3.10 (2H、m、Proδ-H₂)、3.31〜3.78 (2H、m、CH₂CH=CH₂)、3.84 (3H、s、CO₂CH₃)、5.20〜5.33 (2H、m、CH=CH₂)、5.75〜5.98 (1H、m、CH=CH₂)および8.06 (1H、br s、N-H)；m/z (CI+) 170.1183 [(M+H)⁺. C₉H₁₆NO₂は170.1181を必要とする]。

メチル-N-tert-ブチロキシカルボニル-グリシル-L-2-アリルプロリネート(２０)
乾燥トリエチルアミン(0.28 cm³、2.02ミリモル)を、乾燥ジクロロメタン(35 cm³)中のヒドロクロライド(１８) (0.13 g、0.63ミリモル)およびN-tert-ブチロキシカルボニル-グリシン(１９) (0.14 g、0.82ミリモル)の溶液に、窒素雰囲気下に室温で滴下により添加し、反応混合物を10分間撹拌した。ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィニッククロライド(BoPCl、97%) (0.20 g、0.80ミリモル)を添加し、溶液を19.5時間撹拌し、その後、10%希塩酸(35 cm³)および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(35 cm³)で連続洗浄し、乾燥させ(MgSO₄)、濾過し、真空中で蒸発乾固させた。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(40%酢酸エチル-ヘキサン)により精製して、ジペプチド(２０) (0.09 g、45%)を淡黄色油状物として得た：[α]_D +33.8 (CH₂Cl₂中のc 0.83)；ν_max (フィルム)/cm^-1 3419、3075、2977、2930、2874、1739、1715、1656、1499、1434、1392、1366、1332、1268、1248、1212、1168、1122、1051、1026、1003、943、919、867、830、779、739、699および679；δ_H (300 MHz、CDCl₃) 1.42 [9H、s、C(CH₃)₃]、1.93〜2.08 (4H、m、Proβ-H₂およびProγ-H₂)、2.59〜2.67 (1H、m、CH_AH_BCH=CH₂)、3.09〜3.16 (1H、m、CH_AH_BCH=CH₂)、3.35〜3.44 (1H、m、Proδ-H_AH_B)、3.56〜3.62 (1H、m、Proδ-H_AH_B)、3.70 (3H、s、OCH₃)、3.89 (2H、d、J 4.2、Glyα-H₂)、5.06〜5.11 (2H、m、CH=CH₂)、5.42 (1H、br s、Gly-NH)および5.58〜5.72 (1H、m、CH=CH₂)；δ_C (75 MHz、CDCl₃) 23.7 (CH₂、Proγ-C)、28.3 [CH₃、C(CH₃)₃]、35.0 (CH₂、Proβ-C)、37.6 (CH₂、CH₂CH=CH₂)、43.3 (CH₂、Glyα-C)、47.5 (CH₂、Proδ-C)、52.5 (CH₃、OCH₃)、68.8 (四重項、Proα-C)、79.5 [四重項、C(CH₃)₃]、119.4 (CH₂、CH=CH₂)、132.9 (CH、CH=CH₂)、155.7 (四重項、NCO₂)、166.9 (四重項、Gly-CON)および173.8 (四重項、CO₂CH₃)；m/z (EI+) 326.1845 (M⁺. C₁₆H₂₆N₂O₅は326.1842を必要とする)。

(8aS)-アリル-ヘキサヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-1,4-ジオン (環状G-2アリルP)
室温のジクロロメタン(9 cm³)中のジペプチド(２０) (0.09 g、0.28ミリモル)の溶液中に、トリフルオロ酢酸(1 cm³、0.013ミリモル)を滴下により添加し、反応混合物を窒素雰囲気下に1時間撹拌した。溶液を減圧下に蒸発させて無色油状物を得、これをジクロロメタン(10 cm³)中に溶解し、乾燥トリエチルアミン(0.096 cm³、0.69ミリモル)を添加し、反応混合物を4.5時間撹拌し、その後、さらにトリエチルアミン(0.096 cm³、0.69ミリモル)を添加した。反応混合物を１夜撹拌し、濃縮乾固させて緑色油状物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(10%CH₃OH-CH₂Cl₂)により精製して環状G-2アリルP (20 mg、37%)を灰白色固形物として生成させた：mp 106〜109℃；[α]_D -102.7 (c 0.95 in CH₂Cl₂中のc 0.95)；ν_max (CH₂Cl₂)/cm^-1 3456、3226、2920、1666、1454、1325、1306、1299、1210、1133、1109、1028、1010、949、928、882、793、761および733；δ_H (400 MHz、CDCl₃) 1.92〜2.01 (2H、m、Proγ-H₂)、2.09〜2.16 (2H、m、Proβ-H₂)；2.39〜2.56 (2H、m、CH₂CH₂=CH₂)、3.46〜3.53 (1H、m、Proδ-H_AH_B)、3.78〜3.87 (2H、m、Proδ-H_AH_BおよびGlyα-H_AH_B)、4.09 (1H、d、J 17.2、Glyα-H_AH_B)、5.16〜5.20 (2H、m、CH=CH ₂)、5.73〜5.84 (1H、m、CH=CH₂)および7.17 (1H、br s、N-H)；δ_C (100 MHz、CDCl₃) 20.1 (CH₂、Proγ-C)、34.1 (CH₂、Proβ-C)、41.7 (CH₂、CH₂CH₂=CH₂)、44.9 (CH₂、Proδ-C)、46.4 (CH₂、Glyα-C)、67.2 (四重項、Proα-C)、120.9 (CH₂、CH=CH₂)、131.0 (CH、CH=CH₂)、163.4 (四重項、NCO)および171.7 (四重項、CONH)；m/z (EI+) 195.1132 (M⁺. C₁₀H₁₅N₂O₂は195.1134を必要とする)。

実施例４
(8aS)-メチル-スピロ[シクロペンタン-1,3(4H)-テトラヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン]-1,4(2H)-ジオン (環状シクロペンチル-G-2MeP)の合成
構造式、および反応式４：

試薬、条件および収率：
(i) Et₃N、HOAt、CIP、1,2-ジクロロエタン、83℃、N₂、19時間 (23%)；
(ii) 10% Pd/C、CH₃OH、RT、17時間 (65%)。

N-ベンジロキシカルボニル-1-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸(２１)
ジオキサン(2.5 cm³)中のベンジルクロロホルメート(0.290 g、1.1ミリモル)を、0℃の水(5 cm³)中の1-アミノシクロペンタンカルボン酸(Fluka社) (0.2 g、1.54ミリモル)および炭酸ナトリウム(0.490 g、4.64ミリモル)の溶液に滴下により添加した。撹拌を室温で１夜続行し、反応混合物をエーテルで洗浄した。水性層を2M塩酸で酸性化し、酢酸エチルで抽出し、乾燥させ(Na₂SO₄)、濾過し、溶媒を除去して、カルバメート(２１) (0.253 g、62%)を、放置時に固化する油状物として得た。カルバメート(２１)は、¹H NMR分析により配座異性体の70：30混合物であることが証明された(上記の比は、少量および大量配座異性体それぞれのN-Hプロトンに帰属するδ5.31および7.29〜7.40での共鳴の一体化から推定した)：mp 70〜80℃ (文献値¹ 82〜86℃、酢酸エチル、石油エーテル)；δ_H (400 MHz、CDCl₃、Me₄Si) 1.83 (4H、br s、2×シクロペンチル-H₂)、2.04 (2H、br s、シクロペンチル-H₂)、2.20〜2.40 (2H、m、シクロペンチル-H₂)、5.13 (2H、br s、OCH₂Ph)、5.31 (0.7H、br s、N-H)および7.29〜7.40 (5.3H、m, PhおよびN-H^*)；δ_C (100 MHz、CDCl₃) 24.6 (CH₂、シクロペンチル-C)、37.5 (CH₂、シクロペンチル-C)、66.0 (四重項、シクロペンチル-C)、66.8 (CH₂、OCH₂Ph)、128.0 (CH、Ph)、128.1 (CH、Ph)、128.4 (CH、Ph)、136.1 (四重項、Ph)、155.8 (四重項、NCO₂)および179.5 (四重項、CO₂H)。

メチル-N-ベンジロキシカルボニルシクロペンチル-グリシル-L-2-メチルピロリネート(２２)
乾燥トリエチルアミン(0.19 cm³、1.4ミリモル)を、乾燥1,2-ジクロロエタン(24 cm³)中のヒドロクロライド(１０) (78 mg、0.43ミリモル)、カルボン酸(２１) (0.15 g、0.56ミリモル)および1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(Acros社) (15 mg、0.11ミリモル)の溶液に、窒素雰囲気下に室温で滴下により添加し、反応混合物を10分間撹拌した。2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート(CIP) (Acros社) (0.12 g、0.43ミリモル)を添加し、得られた溶液を還流下に19時間加熱し、その後、10%希塩酸(30 cm³)および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(30 cm³)で連続洗浄し、乾燥させ(MgSO₄)、濾過し、真空中で蒸発乾固させた。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(60%酢酸エチル-ヘキサン)により精製して、アミド(２２) (39 mg、23%)を白色固形物として得た。¹³C NMR分析によりカルバメート配座異性体の3：1 トランス：シス混合物として存在していることが証明された(上記の比は、少量および大量配座異性体それぞれのカルバメートカルボニル-C原子に帰属するδ154.1および155.7での相対共鳴強度から推定した)：mp 200〜203℃；[α]_D -54.5 (CH₂Cl₂中のc 1.52)；ν_max (フィルム)/cm^-1 3432, 3239, 3042, 2953, 1736, 1712, 1627, 1540, 1455, 1417, 1439, 1374, 1282, 1256, 1216, 1194, 1171, 1156, 1136, 1100, 1081, 1042, 1020, 107, 953, 917, 876, 756および701；δ_H (400 MHz, CDCl₃) 1.33〜1.53 (3H, br m, Proα-CH₃)、1.62〜2.20 (11H, m, Proβ-H₂, Proγ-H₂および7×シクロペンチル-H)、2.59〜2.71 (1H, br m, 1×シクロペンチル-H)、3.31〜3.42 (1H, br m, Proδ-H_AH_B)、3.58〜3.79 (4H, br m, OCH₃およびProδ-H_AH_B)、4.92〜5.17 (3H, m, N-HおよびOCH₂Ph)および7.27〜7.42 (5H, s, Ph)；δ_C (100 MHz, CDCl₃) 21.7 (CH₃, Proα-CH₃)、24.1^* (CH₂, シクロペンチル-C)、24.2 (CH₂, シクロペンチル-C)、24.4 (CH₂, Proγ-C)、24.5 (CH₂, シクロペンチル-C)、36.4 (CH₂, シクロペンチル-C)、37.1 (CH₂, シクロペンチル-C)、37.2* (CH₂, シクロペンチル-C)、37.7 (CH₂, Proβ-C)、38.2* (CH₂, シクロペンチル-C)、48.5 (CH₂, Proδ-C)、52.1 (CH₃, OCH₃)、66.6 (CH₂, OCH₂Ph)、66.9 (四重項、Proα-C)、67.2 (四重項、Glyα-C)、127.8 (CH, Ph)、128.2 (CH, Ph)、128.4 (CH, Ph)、136.6 (四重項、Ph)、154.1 (四重項、NCO₂)、155.7* (四重項、NCO₂)、170.5 (四重項、Gly-CO)および174.7 (四重項、CO₂CH₃)；m/z (EI+) 388.1991 (M⁺. C₂₁H₂₈N₂O₅は388.1998を必要とする)。
*少量配座異性体に帰属する共鳴を示す。

(8aS)-メチル-スピロ[シクロペンタン-1,3(4H)-テトラヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン]-1,4(2H)-ジオン (環状シクロペンチル-G-2MeP)
メタノール(4.6 cm³)中のアミド(２２) (54 mg、0.14ミリモル)の溶液に、活性炭上の10%Pd(2.2 mg、0.021ミリモル)を添加し、容器を水素ガスでフラッシングした。得られた懸濁液を水素雰囲気下に17時間激しく撹拌し、次いで、メタノール(15 cm³)を含むセライト(Celite^TM)パッドにより濾過した。濾液を減圧下に濃縮乾固させて黄色半固形物を生成させた。これを逆相C18フラッシュカラムクロマトグラフィー(0〜10%CH₃CN/H₂O；勾配溶出)により精製して白色固形物として環状シクロペンチルG-2MeP (20 mg、65%)を生成させた：mp 160〜163℃；[α]_D -97.9 (CH₂Cl₂中のc 1.61)；ν_max (フィルム)/cm^-1 3429, 2956, 2928, 2856, 1667, 1643, 1463, 1432, 1373, 1339, 1254, 1224, 1175, 1086, 1048, 976, 835, 774および730；δ_H (300 MHz, CDCl₃) 1.47 (3H, br s, 8a-CH₃)、1.56〜2.19 (11H, m, 8-H₂, 7-H₂および7×シクロペンチル)、2.58〜2.67 (1H, br m, 1 ×シクロペンチル)、3.48〜3.56 (1H, m, 6-H_AH_B)、3.72〜3.82 (1H, m, 6-H_AH_B)および6.56 (1H, br s, N-H)；δ_C (75 MHz, CDCl₃) 19.9 (CH₂, 7-C)、24.6 (CH₂、シクロペンチル)、24.92 (CH₃, 8a-CH₃)、24.93 (CH₂、シクロペンチル)、36.0 (CH₂, 8-C)、38.7 (CH₂、シクロペンチル)、41.9 (CH₂、シクロペンチル)、44.8 (CH₂, 6-C)、64.3 (四重項、8a-C), 66.8 (四重項、3-C), 168.3 (四重項、4-C)および172.2 (四重項、1-C)；m/z (EI+) 222.1369 (M⁺. C₁₂H₁₈N₂O₂は222.1368を必要とする)。

生体外および生体内試験
以下、薬理試験により、本発明の神経保護特性を実証する。これらの試験は限定を意図するものではなく、本発明の他の組成物および方法も不必要な試験を行なうことなく開発し得ることである。これらの組成物および方法は、全て本発明の１部とみなす。以下の試験は、全て、University of Auckland Animal Ethics Committeeにより承認されたガイドラインに沿って開発されたプロトコールを使用して実施した。

実施例５
小脳細胞外植片に対する環状G-2アリルPおよび環状シクロペンチル-G-2MePの効果
生体外ニューロン細胞に対するcG-2アリルPおよび環状シクロペンチル-G-2MePの効果を判定するために、１連の試験を、成獣ラット由来の小脳外植片を使用して実施した。生体外系は、ニューロン増殖、神経突起増殖、神経束形成および神経細胞に対する毒素作用、即ち、生体内で観測される作用に匹敵する作用を試験するのに適している。即ち、生体外小脳外植片を使用する試験の結果は、生体内介入効果を予測させる。
第１群の試験においては、小脳外植片に対するグルタメートの作用を測定した。生理濃度においては、グルタメートは、ヒトを含む哺乳類のCNSにおける神経伝達物質である。しかしながら、十分に高い濃度においては、グルタメートは、神経毒性であり、ニューロン細胞死をもたらす。グルタメートはヒトを含む哺乳類のCNS内の自然産生神経伝達物質であり、また、グルタメート神経毒性は一般的で且つ細胞死および退化を含む神経毒性の反映体として当該技術において認識されていることから、グルタメートは、神経変性および神経細胞死の治療において有効な薬剤を同定し且つ特性決定するのに有用な価値ある手段である。

材料および方法
カバースリップを大ペトリ皿に入れ、70%アルコール中で5分間洗浄し、次いで、ミリポア(Millipore) H₂Oで洗浄した。これらのカバースリップを風乾させ、ポリ-D-リシン (PBS中1 mg/ml原溶液、90〜100μl)で2時間34℃にてコーティングした。

小脳組織の抽出
出生後8日のウィスターラットを本試験において使用した。ラットを屠殺し、氷内に1分間入れ、首切りし、小脳を取出し、氷上に置いた。小脳組織を、大ペトリ皿内の1 mlの0.65%グルコース補給PBS (10μlストックD(+)グルコース/1ml PBS)に入れ、小片に切り刻み、1 mlインスリンシリンジで23 G (0.4mm)針により粉末化し、その後、上記大ペトリ皿内のグルコース溶液中に噴出させて戻した。組織を篩分けし(125μm孔径ガーゼ)、２回遠心分離し(60gで2分間)、培地を無血清BSA補給START V培地(Biochrom社、ドイツ)に交換した。２回目の遠心分離工程は、1mlのSTART V培地により実施した。微細外植片を500μlのSTART V培地中に再構成し、氷上に置いた。

小脳細胞の培養
PDLコーティングの2時間後、スライドをミリポアH₂Oで洗浄し、風乾させた。各スライドを小ペトリ皿(直径：35mm)に入れ、40μlのSTART V/細胞懸濁液を加えた。組織を34℃で2時間インキュベートした(沈降期間)。その後、START V培地(1ml)をペトリ皿に加え、34℃で、空気中5%CO₂の存在下に100%湿度で48時間培養した。

薬物適用
本試験においては、一定量の外植片培養物をビヒクル(PBS)のみに暴露させた。第１試験(試験１)においては、10μlの毒素１(ミリポア水中L-グルタメート、100mM；最終濃度：1mM)および10μlの毒素２(ミリポア水中3-ニトロプロピオン酸、50mM、pH 7；最終濃度：0.5mM)を、試験すべき薬物(PBS中で調製し、最終濃度 1〜100nMに希釈した10mM原溶液)と同時に適用した。各場合において、薬物は、外植片と試験期間中接触せしめた。

薬物効果の判定方法
外植片を試験期間中薬物に暴露させたのち、細胞をPBS中で洗浄し、次いで、増分濃度のパラホルムアルデヒド中で固定した(500μlの0.4%PFA、次いで1.2%PFA、その後3%PFA、最後に4%PFAを適用した；各固定工程：2〜3分間)。最後に、微細外植片をPBS中で洗浄した。
その後、外植片中のニューロンを、形態(神経突起の存在)について評価し、顕微鏡視野当りの生存細胞として計数した。最高の細胞密度を示す４つの視野をカバースリップ当りで計数し、データを平均±平均の平均標準誤差(SEM)として表した；各々n=4。統計的有意性は、非対応スチューデントt-検定を使用して評価した。

結果
環状G-2-アリルP
試験結果を図１に示す。グルタメート処理(1 mM；黒棒)は、ビヒクル処理対照(白棒)と比較して、神経突起を有する小脳ニューロンのおよそ85%の喪失をもたらしていた。対照的に、cG-2アリルPは、グルタメートと同時に投与したとき、投与量依存性の形で神経突起を有する細胞数を有意に増大させていた(陰影棒)。低投与量のcG-2-アリルP (100 pM〜10 nM)による処理は、グルタメート誘発神経毒性の有意の低下を示していた。
環状シクロペンチル-G-2MeP
試験結果を図２に示す。環状シクロペンチル-G-2MePは、グルタメートと同時に投与したとき、神経突起を有する細胞数を有意に増大させていた(明陰影棒)。低投与量の環状シクロペンチル-G-2MePにより処理は、グルタメート誘発神経毒性の有意の低下を示していた。
結論
cG-2-アリルPおよび環状シクロペンチル-G-2MePの双方は、個々に、グルタメート誘発神経毒性を低下させまたは阻止しており、双方の薬物が神経保護性であり、神経変性または細胞死を抑制するのに使用し得ることを示唆していた。

実施例６
低酸素-虚血性損傷に対するcG-2-アリルPの効果 I
cG-2-アリルPが卒中、心臓動脈バイパス移植術(CABG)または他の低酸素発作に応答してのニューロン損傷を予防し得るかどうかを判定するために、１連の試験を低酸素-虚血性損傷(HI)に供したラットにおいて実施した。成獣ラット(ウィスター、280〜310g、雄)を使用した。修正レビン(Levine)モデル調製手順および試験手順を使用した(Rice et al, 1981, Ann. Neurol. :9: 131-141；Guan et al J., 1993, Cereb. Blood Flow Metab.: 13(4): 609-16)。
これらの手順は、要するに、片側頸動脈結紮およびその後の埋込み側脳室カニューレによる動物の吸入呼吸停止によって誘発させたHI損傷からなる。ガイドカニューレを、硬膜上に、ハロタン麻酔下、中央線の右に1.5mmおよび両耳間ゼロ面の前方7.5mmで定位固定した。右頸動脈を、カニューレ挿入の2日後二重結紮した。麻酔からの回復1時間後、ラットの各々を、湿度(90±5%)および温度(31±0.5℃)に制御したインキュベーター内にさらに1時間入れ、その後、10分間低酸素(6%酸素)に暴露した。各動物を治療前にさらに2時間インキュベーター内に保った。
９対のラットを、低酸素性虚血発作の2時間後、cG-2-アリルPまたはそのビヒクル(生理食塩水)のいずれかによって脳室内(icv)治療した。各群のラットに、発作2時間後、軽い麻酔(1.5%ハロタン)下にcG-2-アリルPまたはそのビヒクルを同時に輸注した。20μlの総容量をマイクロ輸注ポンプにより20分間に亘って輸注(icv)した。
組織学検査を低酸素性-虚血性損傷の5日後に各ラットにおいて実施した。ラットを過投与量のナトリウムペントバルビタールにより屠殺し、生理食塩水次いで10%ホルマリンを心臓経由で潅流させた。脳を、標準のパラフィン埋込み処方を使用して加工する前に、最低2日間同じ固定剤中に保った。

厚さ8μmの冠状断面を、線条体、大脳皮質および海馬から切取り、チオニンおよび酸フクシンにより染色した。組織学結果を３つのレベルで評価した：(1) 線条体の中位レベル、(2) 完成海馬が最初に出現するレベル、および(3) 海馬の前角が正しく出現するレベル。組織損傷の重篤度を、線条体、皮質、並びに海馬のCA1-3、CA3、CA4および歯状回において点数付けした。組織損傷は、ニューロン喪失(好酸性(赤色)細胞質および収縮核心)、汎壊死(pan-necrosis)および細胞反応と同一であった。組織損傷は、以下の採点方式を使用して点数付けした。0：組織損傷を示さなかった組織、1：<5%の組織が損傷、2：<5%の組織が損傷、3：>50%の組織が損傷、4：>95%の組織が損傷。

結果および結論
この試験の結果を図３に示す。図３は、低酸素性-虚血性損傷(各組の左の棒)が試験した脳領域の各々において有意の損傷点数をもたらしていたことを示している。また、図３は、比較的低投与量のcG-2-アリルPの中枢投与(各組の右の棒；2 ng)が、ビヒクル治療群に比較して、試験した各脳領域における組織損傷を有意に軽減していたことも示している(p<0.001)。
cG-2-アリルPが、低酸素性-虚血性損傷後の投与した場合でさえも、低酸素性-虚血性損傷によって生じる神経損傷に対し神経保護性であり得ることが理解できる。この驚くべき知見は、cG-2-アリルPが神経変性または細胞死に特徴を有する種々の症状を治療する有用な薬剤であることを示唆している。

実施例７
低酸素-虚血性損傷に対するcG-2-アリルPの効果 II
材料および方法
実施例６で説明した材料および方法を使用し、治療群の数を増加させた。ラットを、低酸素性-虚血性発作の2時間後、４通りの投与量のcG-2-アリルPの１つまたはそのビヒクル(生理食塩水)によって脳室内(icv)治療した５つの治療群に分けた(1：n=10、2ng；2：n=9、4 ng；3：n=9、20 ng；4：n=10、100 ng；5：n=9、ビヒクル)。
図４は、低酸素が、単独で(ビヒクル)試験した脳の全ての領域においてニューロン損傷点数を発生させていることを示している。cG-2-アリルPで治療した動物においては、低酸素は、薬剤を低酸素性/虚血性損傷後に投与したとしても、低い作用しか有していなかった。神経保護効果は、線条体に投与した最高投与量(100 ng)を除いて、cG-2-アリルPの全ての投与量において観察された。しかしながら、全ての他の部位および全ての他の投与量において、cG-2-アリルPは、低酸素性/虚血性の神経損傷作用を低下させていた。さらにまた、cG-2-アリルPは、アポトーシスに関連した損傷のような遅延性細胞死に関連した進行性損傷を発症した脳領域において上昇した有効性を有していた。HI損傷に対しより抵抗性である歯状回および大脳皮質のような脳領域においては、損傷の進行は、線条体並びに海馬のCA1-2、CA3およびCA4下位領域のようなHI損傷に対しより感受性である脳領域におけるよりも遅く且つ重篤であることが知られている。この結果は、cG-2-アリルPが慢性神経疾患の治療において有益であることを示している。

本明細書において提供した説明および実施例は、例示のみを目的としている。本発明の範囲を説明した実施例に限定するつもりはない。本発明の要素を組入れる他の実施態様は、当業者であれば、不必要な実験なしで、実施し得ることである。従って、そのような実施態様は、全て本発明の１部とみなす。本明細書において引用した全ての文献は、本明細書に参考として全体的に合体させる。

興奮毒性酸化ストレス後の動物におけるニューロン生存に対する環状G-2アリルPの効果を示すグラフである。 興奮毒性酸化ストレス後の動物におけるニューロン生存に対する環状シクロペンチルG-2MePの効果を示すグラフである。 広域脳虚血に供した動物における環状G-2アリルPの神経保護効果を示すグラフである。 広域脳虚血に供した動物における神経保護に対する種々の投与量の環状G-2アリルPの効果を示すグラフである。

Claims (6)

1. 下記の式を有する化合物、またはその製薬上許容し得る塩もしくはその水和物：
   

   

   （式中、
   R ¹ = アリルであり、R ² = R ³ = R ⁴ = R ⁵ = Hであり、X ¹ = NHであり、X ² = CH ₂ であるか、
   R ¹ = メチルであり、R ² = R ³ = Hであり、R ⁴ およびR ⁵ は、一緒になって、-CH ₂ -(CH ₂ ) ₃ -CH ₂ -であり、X ¹ = NHであり、X ² = CH ₂ であるか、または
   R ¹ = メチルであり、R ² = R ³ = Hであり、R ⁴ およびR ⁵ は、一緒になって、-CH ₂ -(CH ₂ ) ₂ -CH ₂ -であり、X ¹ = NHであり、X ² = CH ₂ である。)。
2. R¹ = メチルまたはアリルである、請求項１記載の化合物。
3. 請求項１または２に記載の化合物と、製薬上許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の１種以上の化合物の、損傷または疾患の結果として退化または死に至り得るニューロンを保護するための薬剤の製造における使用。
5. 前記疾患が、アポトーシス神経細胞死、壊死性神経細胞死、若しくは神経細胞退化に特徴を有するか、または
   前記損傷が、壊死性神経細胞死、アポトーシス神経細胞死、若しくは神経細胞退化をもたらす、請求項４記載の使用。
6. 前記化合物が、環状G-2アリルP((8aS)-アリル-ヘキサヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン-1,4-ジオン)、環状シクロヘキシル-G-2MeP((8aS)-メチル-スピロ[シクロヘキサン-1,3(4H)-テトラヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン]-1,4(2H)-ジオン )、または環状シクロペンチル-G-2MeP((8aS)-メチル-スピロ[シクロペンタン-1,3(4H)-テトラヒドロピロロ[1,2-a]ピラジン]-1,4(2H)-ジオン)である、請求項４または５記載の使用。

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