JP4779122B2

JP4779122B2 - 動脈閉塞性疾病モデル動物の作製

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Publication number: JP4779122B2
Application number: JP2006535873A
Authority: JP
Inventors: 秀博飯田; 洋一郎大田; 昇寺本; 拓也林
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2004-09-13
Filing date: 2005-09-12
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2025-09-12
Also published as: EP1808071A4; US20080295189A1; WO2006030737A1; EP1808071A1; JPWO2006030737A1

Description

本発明は、動脈閉塞性疾病モデル動物の作製方法、およびそのためのキットまたはシステム、ならびに該方法または該システムにより得られる動脈塞栓動物モデルに関する。詳細には、特定部位の結紮または自家血凝固塊により動脈を閉塞させることを特徴とする、ヒト以外の動脈閉塞性疾病モデル動物の作製方法、およびそのためのキットまたはシステム、ならびに該方法または該システムにより得られる動脈塞栓動物モデルに関する。

従来より、循環器系や臓器移植等の医学研究、あるいは循環器系疾患の医薬品開発において、心筋梗塞などの心疾患モデルが多用されてきた。近年、これらの心疾患モデルが再生医療研究にも利用されるようになってきた。

これまでの心筋梗塞モデル、例えば心筋梗塞モデルの作製法としては、開胸による冠状動脈の結紮法が一般的であるが、従来の結紮法では処置直後に細動を引き起こし、致死に至る確率が極めて高い。そのため、アメロイドリング（体液の吸収でリング状になったカデイン成分が膨張し、２週間程度で血管を緩徐に閉塞する手段）を用いたモデル作製法が比較的多く用いられている。この手法の大きな問題点は、閉塞の程度にバラツキが生じ、非梗塞例や不完全な梗塞例も生じ、安定した病態モデルに欠ける点である。また、比較的短期間のうち（例えば、処置後１ヶ月）の致死率が高いことも問題である。

したがって、循環器系や臓器移植等の医学研究において、あるいは循環器系疾患の医薬品開発において、さらには再生医療研究において、上記のような欠点のない心筋梗塞モデルの開発が待たれていた。

動脈塞栓により種々の疾病・障害が発生するが、これらの疾病・障害に対する治療法は未だ確立されているとはいえない。動脈塞栓により生じる疾病・障害の典型例は心筋梗塞および脳卒中である。脳卒中は、日本を含む先進国における死亡原因の上位を占めるものであり、特に急性期の治療法に関しては血栓溶解剤、神経保護薬などの有効性が期待されるものの、その多くの臨床治験は失敗に終わり、有効性を示した薬剤は非常に少ない。このような現状は、動脈塞栓により生じる他の疾病・障害についてもあてはまる。その１つの原因として、従来の薬剤開発にはラット、マウスなど齧歯類動物が用いられており、薬効の「種差」が大きいためと考えられる。そのためヒトに近い動物である霊長類動物や中・大型哺乳動物において、より臨床病態に近い病態モデルを作製し評価をすることが望まれている。従来までサル、ネコ、イヌ、ブタなど中・大型動物を用いて幾つかの虚血モデルの作製が行われているが、方法として臨床病態のある側面を示すものの実際の臨床に相当すると考えられるものは少ない。特に急性脳虚血の中でも中大脳動脈、内径動脈、椎骨・脳底動脈といった脳主幹動脈が閉塞した病態（急性脳主幹動脈閉塞症）についてはその予後の悪さ（死亡率10-15％）や、中・若年者での発症も多いこと、等から有効かつ合併症率の低い治療戦略が渇望されており疾患動物モデルによる基礎検討が急務である。

従来の動脈閉塞動物モデル、特に脳主幹動脈閉塞動物モデルの作製法は大きく、血管圧迫法、血管内塞栓子法の２法に大別される。前者は開頭手術または眼窩摘出術（非特許文献１等参照）など侵襲的な方法により目的となる主幹動脈をクリップ、結紮などにより閉塞させるもので、中大脳動脈水平部を閉塞する手法が代表的である。中大脳動脈閉塞モデルは中・大型動物の代表的な虚血モデルとして従来から知られるが、多くは障害部位が脳基底核に限られ、臨床で脳機能障害の原因部位として最も問題になる脳皮質の障害を引き起こすことができた例は少ない。実際、これら動物モデルの行動評価で永続的な麻痺の発現が極めて少ないことも知られている。一方、血管塞栓法として、プラスチック、シリコン、凝血塊などを血管内に閉塞するモデル（非特許文献２および３等参照）も知られるが、目標とする脳主幹動脈に的確に注入し確認するための手法や虚血を評価する手法に欠けていたため、脳虚血部位の分布、病態にばらつきがあり、選択的かつ定量的な実験が困難であった。

このように、従来の血管塞栓法には、血管塞栓の確実性および塞栓形成後の虚血の確実性が低く、その程度にもばらつきがあり、定量性に欠けるという欠点があった。そのうえ、動物に対する侵襲性が大きく、動物に対するダメージが大きいという欠点があった。これらの欠点が克服された動物モデルが得られれば、脳卒中を含む動脈塞栓により疾病・障害に関する研究が進み、これらに対する新たな治療方法の発見にもつながると考えられる。また、これらの欠点が克服された動物モデルは、動脈塞栓により生じる疾病・障害の治療や予防用の新規医薬品開発や再生医療研究に非常に有用であると考えられる。
Hudgins WRら, Stroke. 1970 Mar-Apr;1(2):107-11 Watanabe Oら, Stroke 8: 61-70, 1975 Kito Gら, J Neurosci Methods. 2001 Jan 30;105(1):45-53

閉塞の程度のバラツキが少なく、動物の致死率が低い、安定した病態が得られる心筋梗塞モデルの作製方法を開発することが本発明の解決課題であった。さらに、血管塞栓形成およびその後の虚血の確実性が高く、その程度にもばらつきが少ない、選択的かつ定量的な解析が可能な血管塞栓動物モデル作製方法を開発することを課題とした。また、本発明は、動物に対する侵襲性が小さく、動物に対するダメージが小さい血管塞栓動物モデル作製方法を開発することも本発明の解決課題であった。

本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定部位の結紮または自家血凝固塊により動脈を閉塞させたところ、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明者らは、閉塞すべき動脈部位よりも下流の血管を結紮した後、該閉塞すべき部位にて動脈を完全閉塞に至るようにすると、動物の致死率が低下し、しかも安定した心筋梗塞モデルが得られることを見出した。

さらに本発明者らは、凝固剤により凝固した自家血凝固塊を動脈内に送達して塞栓を形成させる際に、脳血管撮影装置を用いることにより、動脈の所望部位にて選択的に凝血塊により閉塞させることができ、上記課題が解決された動脈塞栓動物モデルが得られることを見出した。

すなわち、本発明は：
（１）特定部位の結紮または自家血凝固塊により動脈を閉塞させることを特徴とする、ヒト以外の動脈閉塞性疾病モデル動物の作製方法；
（２）ヒト以外の実験動物において、閉塞すべき心臓の動脈部位の下流の血管を結紮し、次いで、該閉塞すべき部位にて動脈を閉塞させることを特徴とし、心筋梗塞動物モデルを得るものである（１）記載の方法；
（３）実験動物がブタである（２）記載の方法；
（４）結紮が縫合糸またはクリップを用いて行われ、閉塞がアメロイドリングを用いて行われるものである（２）または（３）記載の方法；
（５）動脈閉塞用手段および動脈結紮用手段を必須として含み、（２）〜（４）のいずれかに記載の方法に用いられる、心筋梗塞動物モデル作製用キット；ならびに
（６）（２）〜（４）記載の方法または（５）記載のキットを用いて得られる心筋梗塞動物モデル
を提供するものである。

さらに本発明は：
（７）ヒトを除く動物より採取した自家血に凝固剤を添加して自家血凝固塊を作製し、次いで、自家血凝固塊を目的とする動脈内腔に送達することを特徴とし、さらに、自家血凝固塊を動脈内腔に送達する際に血管撮影装置を用いることを特徴とし、動脈塞栓動物モデルを得るものである（１）記載の方法；
（８）自家血凝固塊が長軸形状である（７）記載の方法；
（９）血管撮影装置がＸ線血管撮影装置である（７）または（８）記載の方法；
（１０）さらに自家血凝固塊をヨード系薬剤に浸漬し、血管造影装置により可視化することを特徴とする（７）ないし（９）のいずれかに記載の方法；
（１１）動脈が脳または心臓の動脈である（７）ないし（１０）のいずれかに記載の方法；
（１２）さらにポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）を用いて血流状態を確認することを特徴とする（７）ないし（１１）のいずれかに記載の方法；
（１３）凝固剤による自家血凝固塊形成手段、自家血凝固塊を動脈内に送達する手段、および血管撮影装置を必須として含む、（７）ないし（１２）のいずれかに記載の方法に用いられる動脈塞栓動物モデル作製システム；
（１４）さらにＰＥＴ装置を含む（１３）記載のシステム；ならびに
（１５）（７）ないし（１２）のいずれかに記載の方法あるいは（１３）または（１４）に記載のシステムを用いて得られる心筋梗塞動物モデル
を提供するものである。

本発明により、主幹動脈の完全閉塞が可能で、動物の致死率の低い、安定した病態が得られる心筋梗塞モデルの作製方法、ならびにそのためのキットが提供される。さらに本発明によれば、血管塞栓の確実性が高く、その程度にもばらつきが少ない、定量的な解析が可能な血管塞栓動物モデル作製方法が提供される。本発明方法を用いると、動物に対する侵襲性が小さく、動物に対するダメージも小さくてすむ。

図１は、本発明の方法による処置部位（左パネル）、ならびに個体の心筋の梗塞状態を示す写真（右パネル）である。左パネルの矢印Ａはアメロイドリング装着部位、矢印Ｂは結紮部位を示し、斜線を含む紙面に垂直な面で切片を切り出した。右パネルの輪で示した部分に繊維化が見られる。右上パネルは処置後の心臓の外観を示す写真であり、右下パネルは１ｃｍごとの心臓切片を示す写真である。図２は、本発明の方法と従来法における、処置後１ヶ月までの動物の生存数（上のパネル）および生存率（下のパネル）を示す図である。図３は、採血後２４時間の血液凝塊を比較した写真（左パネル、上段は対照、中段はＡＤＰ添加系、下段はトロンビン添加系）および血液凝塊をポビドンヨード液に浸漬したものの通常の写真（右パネル上段）とＸ線写真（右パネル下段）を示す。図４は、閉塞前（左パネル）および自家血凝血塊により左中大脳動脈閉塞を行った直後（右パネル）の脳血管Ｘ線撮影像である。図５は、閉塞後の脳血流（上段）、酸素摂取率（中段）、酸素代謝（下段）の経時変化を示すＰＥＴ画像である。左から閉塞後１５、３０、６０、１２０、１８０分後の画像を示す。

本発明は、１の態様において、特定部位の結紮または自家血凝固塊により動脈を閉塞させることを特徴とする、ヒト以外の動脈閉塞性疾病モデル動物の作製方法を提供するものである。

上記態様の１の具体例において、本発明は、ヒト以外の実験動物において、閉塞すべき心臓の動脈部位の下流の血管を結紮し、次いで、該閉塞すべき部位にて動脈を閉塞させることを特徴とする、心筋梗塞動物モデルの作製方法を提供するものである。

本発明に用いられる動物は実験動物（ヒトを除くことはいうまでもない）であればいずれの実験種においても適応可能であるが、実験動物は適宜選択することができる。実験動物の例としては、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。とりわけ、本発明は、近年、汎用されてきている特に側副血管に乏しいブタに有用である。ブタは、１）生理学的、解剖学的所見；２）食性から、消化吸収に関する生理；ならびに３）冠動脈の分布、動脈内皮構造等の特性において、ヒトに類似した面が多く、近年の動物福祉問題の観点からも本発明に適した動物である。なかでもミニブタは遺伝的背景が明確であり、本発明に特に適した動物である。

本発明の方法およびキットを適用する臓器は心臓である。

本明細書において、「閉塞」とは、実施例記載の方法により測定した場合の閉塞率が、通常には約８０％以上、好ましくは約９０％以上であることをいう。

閉塞すべき動脈部位はいずれの部位であってもよく、必要とされる病変の位置、サイズ、程度、ならびに使用動物の種類等の因子に応じて適宜選択することができる。典型的には、閉塞すべき動脈部位は左側冠動脈の分岐直下での前下降枝である。

本発明の心筋梗塞モデルの作製方法は２つの工程を含む。まず、動脈結紮用手段を用いて、閉塞すべき心臓の動脈部位の下流の血管を結紮する。結紮は完全に行うことが望ましい。このような局所的な結紮を行うことで心筋全体に虚血に対する耐性を生じさせることが重要である。動脈結紮用手段としては、縫合糸が代表的であるが、他の手段、例えば、クリップ等も使用可能である。クリップは、金属製の小型のものが好ましい。結紮部位は、閉塞すべき動脈の末梢側であって、完全結紮しても細動を引き起こさず動物を致死に至らしめない部位であればいずれの部位であってもよいが、前下降枝の第二分枝直後であることが好ましい。この結紮の後、一定時間後に動脈閉塞用手段を用いて閉塞すべき動脈部位を閉塞させる。すなわち、心筋全体に虚血に対する耐性が確立されてから閉塞を行う。一般的には、結紮から約３０分経過後を目安に閉塞すべき動脈の閉塞処置を行う。本発明の方法において後述のごとくアメロイドリングを閉塞に用いた場合、結紮してから完全閉塞に至るまで約２週間である。閉塞処置から２４時間後の閉塞率は壁厚にもよるが約６０〜７０％に達する。

次いで、閉塞すべき動脈部位において、動脈閉塞用手段を用いて、閉塞すべき動脈部位を閉塞する。その際、例えばキシロカインゼリーを血管に塗布して血管スパスムを防止することが好ましい。動脈閉塞用手段としては、アメロイドリングが代表的であるが、同様に時間をかけて緩除に血管を締め付けて閉塞を起こさせる手段であれば他の手段であってもよい。閉塞後、閉胸し、処置を終了する。閉胸は常法に従って行うことができる。

さらに本発明は、上記の心筋梗塞モデル作製方法に用いられる、心筋梗塞モデル作製用キットも提供する。該キットは、動脈閉塞用手段および動脈結紮用手段を必須として含む。該キットには、本発明の心筋梗塞モデル作製方法を行うための説明書を添付しておくのが一般的である。

本発明の上記方法またはキットにより得られる心筋梗塞動物モデルは、安定した病態を有し、循環器系や臓器移植等または再生医療等の医学研究、あるいは循環器系疾患の医薬品開発等において非常に有用である。

本発明は、上記態様のさらにもう１つの具体例において、凝固剤を添加して得られた自家血凝固塊を動脈内に送達して塞栓を形成させること、ならびにその送達の際に血管撮影装置を用いることを特徴とする、ヒト以外の動脈塞栓動物モデルの作製方法を提供するものである。

本発明の方法に使用される動物は、ヒトを除く哺乳動物であればいずれの動物であってもよく、例えば、齧歯類動物（ラット、マウスなど）、霊長類動物（アカゲザル、チンパンジーなど）、イヌ、ネコ、ブタなどが好ましい動物として挙げられる。

本発明は動物のいずれの動脈であっても適用することができる。好ましくは、本発明の方法は脳または心臓の動脈に適用される。

本発明の方法は２つの工程を含む。第１工程は自家血凝固塊の作製工程である。あらかじめ対象動物から血液を採取し、凝固剤と混合した後、一定時間インキュベーションして十分に固化した状態の血栓を得る。動物からの採血は常法に従い行うことができる。例えば、齧歯類動物の場合には尾動脈から採血することができる。採血量は、動物の種類や、処置目的などに応じて適宜選択できる。

送達すべき自家血凝固塊の形状は、血管に対して長軸形状であるのが好ましい。長軸形状とすることによって、自家血凝固塊が血管の形状および走行性に沿った形状となり、血管末梢に流れやすく、広範囲の血管領域に血栓を作製することができる。長軸形状の自家血凝固塊を得るためには、例えば、自家血を凝固剤と混合しインキュベーションする際に、処置に使用するカテーテル内径よりも細い容器、例えば適当なチューブ内に充填してインキュベーションする。このインキュベーション用の容器は血液凝固に悪影響を及ぼさない材質のものであればよく、例えばポリエチレン製であってもよい。インキュベーション時間および温度は十分な固化が得られるよう選択すべきであるが、動物の種類、自家血の状態、所望血栓の特性、塞栓を発生させるべき動脈の種類や部位、所望疾病の程度などにより適宜変更されうる。一般的には、対象動物の体温付近の温度にて１日程度インキュベーションする。これらのインキュベーション条件および装置は、当業者が容易に変更・選択できるものである。ここに凝固剤とは、所望の塞栓を引き起こすに十分な程度に自家血を凝固させる薬剤をいい、種々のものが知られている。例えば、血小板凝集効果を有するＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、フィブリン形成と血栓形成を促進するトロンビンなどが挙げられる。凝固剤の種類および濃度は当業者が目的に応じて適宜選択・決定することができる。例えば、３０μｇ／ｍｌないし１００μｇ／ｍｌのＡＤＰおよび０．５％（ｗ／ｖ）ないし１０％（ｗ／ｖ）のトロンビンとともに３７℃で２４時間微温槽またはインキュベーター内に保つことにより、自家血を凝固させてもよい。

本発明の方法の第２工程は、上記のごとく作製した自家血凝固塊を所望血管部位に送達して塞栓を形成させる工程である。自家血凝固塊の送達手段は特に限定されるものではないが、カテーテルを用いて行うのが一般的である、常法に従って、塞栓を形成させるべき動脈内径に合わせたカテーテルを用い、留置したシースよりより挿入して目的とする血管にカテーテルを留置することができる。カテーテルは各種のものが知られており、適宜選択して用いることができるが、血管撮影用カテーテルが好ましい。シースは大腿動脈に留置するのが一般的である。カテーテル留置を行うにあたり、血管撮影装置を用いることにより、カテーテルを正確に所望部位へと誘導することが重要である。このようにして塞栓部位を正確に定めることによって、得られるモデルにおいて選択的かつ定量的な病態の評価を行うことができる。血管撮影装置は現在種々のものが用いられており、使用動物、使用目的などに応じて適宜選択することができる。Ｘ線血管撮影装置が一般的である。なかでも高解像度のものが好ましい。Ｘ線血管撮影装置の場合の造影剤はイオン性、非イオン性など種々のものが知られており、適宜選択して用いることができる。目的の塞栓形成部位までカテーテルを誘導した後、上記のごとく作製した自家血凝固塊をカテーテルより流す。その際、例えば、血栓が固化している細チューブに直接注射針と生理食塩水を満たした注射筒を接続し、注射筒により生理食塩水を押し出すようにすることで、チューブ内の血栓を排出させることができる。また、例えば、予めチューブの先をカテーテル入り口に入れておくことにより、血栓をスムーズに導入することができる。血栓が目標とする血管を閉塞したかどうかは、脳血管撮影装置により、例えば造影剤を用いたＸ線脳血管撮影により把握することができる。また必要に応じて、作製しておいた血栓を予めヨード系薬剤を含有する液に浸しておくことによりＸ線脳血管撮影時に血栓の残存を確認することが可能である。

また、上記工程により血管を閉塞しただけでは実際に閉塞により虚血を生じているかどうか不明なため、ＰＥＴを用いて血流、酸素摂取能、酸素代謝能などの血流状態を確認することにより、処置後の虚血の様子、例えば虚血の分布・程度などを調べることができる。ＰＥＴ装置は現在種々のものが用いられており、適宜選択して用いることができる。虚血確認のための測定項目は当業者が適宜選択することができ、ＰＥＴを用いてこれらを測定する方法も公知である。

さらに本発明は、凝固剤による自家血凝固塊形成手段、自家血凝固塊を動脈内に送達する手段、および血管撮影装置を必須として含む、ヒトを除く動物の動脈塞栓モデル作製システムを提供する。該システムは本発明の動脈塞栓動物モデルの作製方法に用いられるものである。凝固剤による自家血凝固塊形成手段は、例えば、凝固剤、インキュベーション用容器を含むものであってもよい。自家血凝固塊を動脈内に送達する手段は、例えば、血管撮影用カテーテルを含むものであってもよい。血管撮影装置は高解像度Ｘ線血管撮影装置であってもよい。該システムはさらに、処置後の血流状態を確認するためのＰＥＴ装置を含むものであってもよい。

本発明の上記方法またはシステムにより得られる動脈塞栓動物モデルは、血管塞栓の程度にばらつきが少ないので、定量的な解析が可能である。したがって、本発明により得られる動脈塞栓動物モデルは、動脈塞栓により生じる疾病・障害の治療や予防の方法、これらの疾病に対する新規医薬品開発、あるいは再生医療研究等に非常に有用である。

以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。

実施例１：ブタ慢性期心筋梗塞モデルの作製
ブタ雄性２０〜２５ｋｇを用い、麻酔後、左胸部を上にして横臥位固定し、抗血液凝固剤ヘパリンを１００ＩＵ／ｋｇ投与した後、第３・４肋間を切開し、開胸を施した。次いで、左前下降枝の第二分枝以降を露出させ、縫合糸にて完全結紮を行った（図１左パネル矢印Ｂ参照）。（この部位での完全結紮は細動を引き起こさず致死に至らしめない。この局所的な虚血処置を行うことで心筋全体に虚血に対する耐性を引き起こさせる。）その後、回旋枝と前下降枝の分岐部近位の前下降枝を露出し、キシロカインゼリーを血管に塗布し処置に伴う血管スパスムを防ぎアメロイドリング（Ameroid Constrictorともいう、RESEARCH INSTRUMENTS SW社製、Ｉ．Ｄ．サイズ２．５ｍｍ）を装着した（図１左パネル矢印Ａ参照）。そして、定法に従って閉胸し、処置を終了した。対照処置として、あらかじめ完全結紮を行わない従来法（アメロイドリングによる閉塞のみを行う）を用いて、上記と同様にして同一動脈部位に閉塞処置を施した。

上記のごとく本発明による処置を行ってから３ヶ月後に動物の心臓の様子を調べた。個体の心臓の心尖部領域に顕著な繊維化が見られ、１ｃｍごとの心臓切片においても心筋内部の顕著な繊維化が見られた（図１右パネル）。このような繊維化は確実な梗塞の発生を示すものである。本発明による処置では、５匹のブタすべての心筋に同様の梗塞が見られ、本発明の方法の安定性・確実性が示された。本発明による処置の場合の各個体の閉塞率はいずれも９０％以上でバラツキが小さかった。これに対し、対照処置を行った場合は梗塞の発生は不安定・不確実であり、５匹のブタのうち１匹のブタの心筋においてのみ、図１右パネルのような梗塞が観察された。対照処置の場合の各個体の閉塞率は６９．８％〜１００％でバラツキが大きかった。なお、閉塞率は、処置後３ヶ月日目に、アメロイドリング装着部前血管内腔面積およびアメロイドリング装着部血管内腔面積を測定し、次式に従って算出した：

（リング装着部前血管内腔面積−リング装着部血管内腔面積）ｘ１００（％）
リング装着部前血管内腔面積

より多くのブタに対して上と同様にして本発明の方法による処置と対照処置を行って処置後の生存率を調べた。本発明による処置を行った場合、処置後１ヶ月までに１３例中１２例が生存し、生存率は９０％を超えていた（図２）。一方、対照処置を行った場合、処置後１ヶ月までに１９例中６例しか生存せず、生存率は約３０％（図２）と低かった。

このように、本発明によれば、従来の結紮法やアメロイドリングでの閉塞のみを行う方法の欠点である、閉塞のバラツキの大きいこと、致死率の高さ、不安定な病態などが解消されることがわかった。

実施例２：血液凝固剤および凝固条件等の検討
血液凝固剤としてＡＤＰおよびトロンビンを用いて凝固の程度につき検討した。ＡＤＰ濃度を３０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ（いずれもトロンビン無添加）、トロンビン濃度を０．５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）（いずれもＡＤＰ無添加）とした。カニクイザルの腹側尾動脈から採血し、凝固剤を添加して、あるいは凝固剤を添加せずに血液をカテーテル中に入れ、３７℃で２４時間インキュベーションし、その後押し出して凝固の様子を観察した。対照は凝固剤無添加（血液のみを凝固させたもの）である。結果を図３の左パネルに示す。ＡＤＰ濃度が高いほどよく凝固することがわかった。トロンビンについては０．５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）ともに同程度の凝固であった。次に、ＡＤＰ１００μｇ、トロンビン１０％として３７℃で２４時間インキュベーションして得られた血液凝塊をポビドンヨ−ド液に浸漬したものをＸ線撮影した。図３の右パネルに示すように、血液凝塊に対応する影が認められ、Ｘ線撮影装置により血液凝塊の位置確認が可能であることがわかった。

実施例３：急性脳主幹動脈塞栓モデルの作製
対象動物として雄性カニクイザル（体重約６ｋｇ）を用いた。予め凝固剤としてＡＤＰ（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）およびトロンビン（最終濃度１０％（ｗ／ｖ））を含んだ注射筒で動物の腹側尾動脈から血液を十分量（１ｍｌ）採血し、直ちにポリエチレン性のチューブ（外径：０．９６５ｍｍ、内径：０．５８ｍｍ）に血液を満たした。血液および凝固剤の混合物をチューブ内に３７℃、２４時間放置することで十分に固化した状態の血栓が形成された。次いで、動脈径に合わせた極細の脳血管撮影用カテーテル（３フレンチ）を用い、大腿動脈に留置したシースより挿入し目的とする脳血管（左中大脳動脈）にまずカテーテルを留置した。その際、高解像度Ｘ線脳血管撮影装置（GE Yokogawa Medical Systems社製、Mobile C-Arm SERIES 9800^TM）を用い造影剤（オムニパーク３５０）を使用しながらカテーテルを誘導した。目的部位までカテーテルを誘導した後、上述のごとく作製した自家血凝固塊をカテーテルより流した。その際、血栓が固化している細チューブに直接注射針と生理食塩水を満たした注射筒を接続し、注射筒により生理食塩水を押し出すようにすることで、チューブ内の血栓を排出させた。予め細チューブの先をカテーテル入り口に入れておくことで血栓をスムーズに導入することが可能であった。血栓が目標とする血管を閉塞したかどうかは、造影剤を用いたＸ線脳血管撮影により把握した。中大脳動脈を閉塞した結果を図４に示す。矢印で示す閉塞部位から下流の血管に血液が流れていないことがわかる（図４右パネル）。また実際に脳血管を閉塞しただけでは脳虚血を生じているかどうか不明なため、同時にＰＥＴ（シーメンス社製、型番：ECAT EXACT 47）により脳血流、酸素摂取率および酸素代謝を測定し、虚血の分布・程度を測定した（図５）。左中大脳動脈領域に一致して脳血流の低下が見られるが、酸素代謝は少しではあるが保たれる傾向にあり、重度の虚血状態にあることがわかった。

このように、本発明によれば、確実に所望部位において選択的に血管を閉塞させ、所望の虚血状態を作り出すことができる。また、こうして作り出された虚血状態を定量的に解析し、確認することもできる。さらに、本発明によれば、対象動物に対して侵襲性が低いのでダメージも少ないという利点も生じる。

本発明の心筋梗塞モデル作製法およびそのためのキット、ならびに該方法または該キットにより得られる心筋梗塞動物モデルは、動脈閉塞性疾病に関する研究、臓器移植等の医学的研究、あるいは動脈閉塞性疾病の医薬品開発に、さらには再生医療に関する研究に利用することができる。

Claims

特定部位の結紮または自家血凝固塊により動脈を閉塞させることを特徴とする、ヒト以外の動脈閉塞性疾病モデル動物の作製方法であって、ヒト以外の実験動物において、前下降枝の第二分枝直後の部位を結紮し、次いで、左側冠動脈の分岐直下での前下降枝にて動脈を閉塞させることを特徴とし、心筋梗塞動物モデルを得るものである方法。
実験動物がブタである請求項１記載の方法。
結紮が完全結紮である請求項１または２記載の方法。
閉塞が９０％以上である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
結紮が縫合糸またはクリップを用いて行われ、閉塞がアメロイドリングを用いて行われるものである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
動脈閉塞用手段および動脈結紮用手段を必須として含み、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法に用いられる、心筋梗塞動物モデル作製用キット。
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法または請求項６記載のキットを用いて得られる心筋梗塞動物モデル。
ヒトを除く動物より採取した自家血に凝固剤を添加して自家血凝固塊を作製し、次いで、自家血凝固塊を目的とする動脈内腔に送達することを特徴とし、さらに、自家血凝固塊を動脈内腔に送達する際にＸ線血管撮影装置および造影剤を用いることを特徴とし、さらに、自家血凝固塊が長軸形状であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
さらに自家血凝固塊をヨード系薬剤に浸漬し、Ｘ線血管造影装置により可視化することを特徴とする請求項８記載の方法。
動脈が脳または心臓の動脈である請求項８または９項記載の方法。
さらにポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）を用いて血流状態を確認することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
凝固剤による自家血凝固塊形成手段、自家血凝固塊を動脈内に送達する手段、および血管撮影装置を必須として含む、請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法に用いられる動脈塞栓動物モデル作製システム。
さらにＰＥＴ装置を含む請求項１２記載のシステム。
請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法あるいは請求項１２または１３に記載のシステムを用いて得られる動脈塞栓動物モデル。