JP4772652B2

JP4772652B2 - シンチレーション近接アッセイ法

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Publication number: JP4772652B2
Application number: JP2006330130A
Authority: JP
Inventors: キン−フェンガン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2006-12-07
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2026-12-07
Also published as: CA2569239C; EP1847833A2; SG133515A1; US20070134707A1; DE602006009220D1; ES2331019T3; CN1979141B; CA2569239A1; EP1847833B1; ATE443261T1; US7851156B2; JP2007159578A; EP1847833A3; CN1979141A

Description

本発明は、ポリメラーゼ酵素用の生物学的アッセイに関し、より詳細には、RNAポリメラーゼ酵素およびDNAポリメラーゼ酵素の活性測定用のシンチレーション近接アッセイに関する。

C型肝炎ウイルスは世界中の慢性肝疾患の主な原因である（非特許文献1）。HCVに感染した患者は、肝硬変の発生およびその後の肝細胞癌の危険性があり、それゆえにHCVは肝移植の主要な適応症である。

HCVはフラビウイルス属、ペスチウイルス属、およびC型肝炎ウイルスを含むヘパシウイルス属を含むフラビウイルス（Flaviviridae）科ウイルスの一員に分類されている（非特許文献2）。HCVは約9.4kbのポジティブセンス一本鎖RNAゲノムを含むエンベロープウイルスである。ウイルスゲノムは、5’非翻訳領域（UTR）、約3011アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする長いオープンリーディングフレーム、および短い3’UTRからなる。5’UTRは、HCVゲノムの最も高度に保存された部分であり、ポリタンパク質翻訳の開始および制御に重要である。非構造タンパク質5、NS5B、のカルボキシル側半分はRNA依存性RNAポリメラーゼを含む。

HCV感染症の治療に現在利用できる承認を受けた療法は、今のところ数が限られている。HCVの治療およびHCV NS5Bポリメラーゼの阻害に対する新規および既存の治療的アプローチが概説されている:非特許文献3、非特許文献4、非特許文献5、、非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8。

インビトロにおいて、HCV NS5Bのポリメラーゼ活性はRNA鋳型依存的であり、RNAプライマーまたはDNAプライマーを必要とする。HCV NS5Bポリメラーゼの活性を測定するための様々なインビトロアッセイが開発されてきた。一般に、標準的な反応混合物は、緩衝液、塩、二価陽イオン、還元剤、ならびにヌクレオシド三リン酸、RNA鋳型、およびプライマーからなる。最も一般に用いられる鋳型およびプライマーは、ポリアデノシン一リン酸: オリゴウリジン一リン酸（ポリA: オリゴU; 例えば、非特許文献9参照）のような合成ホモポリマーの鋳型／プライマーである。

しかし、HCVゲノム由来の配列を含むヘテロポリマー配列のRNA鋳型が用いられる場合には、NS5Bはプライマー非依存的な方法でインビトロRNA合成を開始することもできる。これらの配列は、HCVゲノムの5’非翻訳領域に位置する内部リボソーム侵入部位（HCV IRES、非特許文献10）および3’非翻訳領域（HCV 3’-UTR、非特許文献11）を含む。この場合、鋳型の3’末端がプライマーとして用いられ、スナップバック（snap-back）機構によって伸長がヘアピンループから進行し、鋳型と産物が共有結合した二本鎖の分子が生じる。

シンチレーション近接アッセイ（SPA）は、ある種の電子エミッターの限られた路程を利用する（非特許文献12;Hart、特許文献1および特許文献2;ならびにBertoglio-Matte、特許文献3）。例示的なSPAは、溶液中の分析物、電子に触れた時に光を放つプラスチックビーズ、およびビーズに結合した、溶液中の分析物に特異的な（抗体のような）特定の結合パートナーからなる。分析物がトリチウムのような比較的短い路程の電子を放出する放射性標識を取り込む場合、分析物が結合パートナーと特異的に結合し、その結果ビーズの表面近くに局在化した際、プラスチックビーズは放射性分析物とともに溶液中に懸濁された時に限って光を放つ。

SPAは様々な分析目的のために開発および利用されてきた。SPAはラジオイムノアッセイ、競合アッセイ、酵素のカイネティックアッセイ、リガンド／レセプターおよび抗原／抗体の相互作用の研究、ならびに細胞プロセスの研究に利用されてきた（非特許文献13;およびCook、特許文献4参照）。現在までに記載されているSPAはすべて、抗体-抗原相互作用、リガンド-レセプター相互作用、ストレプトアビジンコーティングしたビーズに結合するビオチン化試薬、対象となる種類のキレート錯体形成、または結合パートナーの正確かつ特異的な構造的補完性に依存するその他の相互作用などの、特定の結合相互作用に依存する。これにより、SPAには対象となる分析物に対する高い特異性が与えられる一方で、試薬の調製における余分な工程、ならびに対象となる反応に特異的な結合パートナーシステムを開発する時間および経費も必要とされる。またこれにより、特異的な結合パートナーが発見できるまたは開発できるシステムに、その利用が限定される。例えば、抗原-抗体のアッセイには特異的抗体が必要であり、リガンド-レセプターのアッセイには特異的レセプターが必要であり、キレートリガンドは一緒にキレート錯体を形成するイオンの配置と一致しなければならない。基質の検出のために抗体またはレセプターが利用できない場合は、ビオチン-ストレプトアビジンのような結合ペアの一方で分析物を特異的に修飾する必要がある。

米国特許第4,271,139号米国特許第4,382,074号米国特許第4,568,649号米国特許第5,665,562号 Boyer, N. et al. J. Hepatol. 2000 32: 98-112 Rice, C. M., Flaviviridae: The viruses and their replication. In: Fields Virology, Editors: B. N. Fields, D. M. Knipe and P. M. Howley, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa., Chapter 30, 931−959, 1996 R. G. Gish, Sem. Liver. Dis., 1999 19: 5; Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. R., Scientific American, October: 1999 80-85 G. Lake-Bakaar, Current and Future Therapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease, Curr. Drug Targ. Infect Dis. 2003 3 (3): 247-253 P. Hoffmann et al., Recent patents on experimental therapy for hepatitis C virus infection (1999-2002), Exp. Opin. Ther. Patents 2003 13 (11): 1707-1723 M. P. Walker et al., Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C, Exp. Opin. Investing. Drugs 2003 12 (8): 1269-1280 S. L. Tan et al., Hepatitis C Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Rev. Drug Discov. 2002 1: 867-881 J. Z. Wu and Z. Hong, Targeting NS5B RNA-Dependent RNA polymerase for Anti-HCV Chemotherapy, Curr. Drug Targ. Infect. Dis. 2003 3 (3): 207-219 S. E. Behrens et al., EMBO J. 1996 15 (1): 12-22, V. Lohmann et al., J. Virol. 1997 71 (11): 8416-8428 Kieft et al., RNA 2001 7: 194-206 Pellerin et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 2002 295: 682-688 Hart et al., Molecular Immunology 1979 16: 265-267 Cook, Drug Discovery Today 1996 1: 287-294

したがって、HCV NS5Bポリメラーゼを含む、任意のポリメラーゼ酵素の活性を測定するための標準的SPAアッセイを利用するためには、オリゴUのような合成プライマーがアフィニティータグ分子（例えば、ビオチン）で修飾され、適切なホモポリマーの鋳型（この場合、ポリA）にアニールし、タグ分子と結合できる分子（例えば、ストレプトアビジン）でコーティングされたSPAビーズと反応しなければならない。しかし、ポリメラーゼ酵素の活性を測定するために、SPAアッセイにおいて、プライマーなしでまたは非修飾プライマーと共にヘテロポリマーの鋳型を利用できるシステムの開発は、実用的であり、また費用対効果が高いと考えられる。

発明の説明
本発明は、ポリメラーゼから生成される産物とSPA支持構造物（例えば、ビーズ）を酸性pH下で接触させることによって、プライマーなしでまたは非修飾プライマーを用いて、ポリメラーゼ酵素の活性を測定するためにSPAアッセイを行なうことができるという発見に基づく。アフィニティータグ分子と結合した修飾プライマーを使用する必要性を排除すること（それ自体、費用対効果が高い）によって、所与のポリメラーゼ酵素にとってネイティブなヌクレオチド配列、またはその他のヘテロポリマー配列を鋳型として、ポリメラーゼの活性を測定するためのより正確な条件を表すSPAアッセイを行なうことができる。

本発明（１）は、ポリメラーゼ酵素の活性をアッセイする方法であって、以下の工程を含む方法である：
（a）標識転写産物を提供するために、ポリメラーゼ酵素、適切な鋳型、ならびに適切に放射性標識されたおよび放射性標識されていない複数のヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を、非修飾プライマーとともにまたは非修飾プライマーなしで、インキュベートする工程；
（b）標識転写産物をpH約2.0〜pH約4.5でシンチレーション近接アッセイ（SPA）支持構造物と接触させる工程；および
（c）シンチレーションのレベルがポリメラーゼ酵素の活性と相関するシンチレーションのレベルを計測する工程。
本発明（２）は、ポリメラーゼ酵素がHCV NS5Bポリメラーゼである、本発明(1)の方法である。
本発明（３）は、適切な鋳型がヘテロポリマーの鋳型である、本発明(1)の方法である。
本発明（４）は、ヘテロポリマーの鋳型がHCV IRESおよびHCV 3’-UTRからなる群より選択される、本発明(3)の方法である。
本発明（５）は、適切な鋳型がホモポリマーの鋳型である、本発明(1)の方法である。
本発明（６）は、ポリメラーゼ酵素の活性を測定する方法であって、以下の工程を含む方法である：
（a）標識転写産物を提供するために、ポリメラーゼ酵素、適切な鋳型、ならびに適切に放射性標識されたおよび放射性標識されていない複数のヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を、ポリメラーゼ酵素の活性を調節する一つまたは複数の化合物の存在下で、非修飾プライマーと共にまたは非修飾プライマーなしで、インキュベートする工程；
（b）標識転写産物をpH約2.0〜pH約4.5でシンチレーション近接アッセイ（SPA）支持構造物と接触させる工程；ならびに
（c）シンチレーションのレベルがポリメラーゼ酵素の活性と相関するシンチレーションのレベルを計測する工程。
本発明（７）は、ポリメラーゼ酵素がHCV NS5Bポリメラーゼである、本発明(6)の方法である。
本発明（８）は、適切な鋳型がヘテロポリマーの鋳型である、本発明(6)の方法である。
本発明（９）は、ヘテロポリマーの鋳型がc-IRESおよび3’ UTRからなる群より選択される、本発明(8)の方法である。
本発明（１０）は、適切な鋳型がホモポリマーの鋳型である、本発明(6)の方法である。

本発明により、アフィニティータグで修飾されたプライマーを必要とせずに、シンチレーション近接アッセイ（SPA）を用いて、ポリメラーゼ酵素の活性をアッセイする方法が提供された。

本発明は、標識転写産物を供給するために、ポリメラーゼ酵素、適切な鋳型、ならびに適切に放射性標識されたおよび放射性標識されていない複数のヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を、非修飾プライマーと共にまたは非修飾プライマーなしで、インキュベートする工程；pH約2.0〜pH約4.5で、標識転写産物をSPA支持構造物の懸濁液と接触させる工程；およびポリメラーゼ酵素の活性と相関するシンチレーションのレベルを計測する工程により、ポリメラーゼ酵素の活性をアッセイするための方法を提供する。別の態様において、反応混合物はポリメラーゼ酵素の活性を調節する化合物の存在下でインキュベートされる。好ましい態様において、ポリメラーゼ酵素はHCV NS5Bポリメラーゼである。

本発明の、前述のおよびその他の利点および特長、ならびに同様のことが達成される様式は、例示的な態様を例証する付随する実施例とともに、本発明の下記の詳細な説明を考慮すると、より容易に明らかになるであろう。

定義
「ポリメラーゼ」および「ポリメラーゼ酵素」という用語は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素（すなわち、ポリメラーゼ活性）を指す。一般に、その酵素はポリヌクレオチドの鋳型配列にアニールしたプライマーの3’末端で合成を開始し、鋳型鎖の5’末端方向に進行する。「RNAポリメラーゼ」はリボヌクレオチドの重合を触媒し、「DNAポリメラーゼ」はデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。「DNAポリメラーゼ」は、DNA鎖を産生するための鋳型としてDNAを利用する「DNA依存性DNAポリメラーゼ」だけでなく、DNA鎖を産生するための鋳型としてRNAを利用する「RNA依存性DNAポリメラーゼ」（例えば、逆転写酵素）を含んでもよい。

「ウイルスポリメラーゼ」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドの重合を触媒し、ウイルスの複製を可能にする、ウイルスのゲノム中に含まれるポリメラーゼ酵素を指す。

「NS5B」という用語は、「NS5Bタンパク質」、「NS5Bポリペプチド」、「NS5Bポリメラーゼ」と呼ばれるタンパク質をコードする領域を特定するウイルスゲノムの3’末端付近に位置するHCVゲノムの部分、または本明細書において互換的に用いられるこれらの用語の組み合わせを指す。自然な状態にあるNS5BはRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）として機能する。NS5Bタンパク質をコードする核酸領域は「NS5B遺伝子」と呼ばれることもある。したがって、「NS5B」という用語は、その用語が使われる文脈に応じて、NS5Bポリペプチドをコードする核酸、NS5B遺伝子もしくはNS5Bポリペプチド、またはそれらの任意の部分を指すことがある。NS5Bはさらに、NS5B核酸配列またはNS5Bポリペプチドの自然の対立遺伝子変異体、突然変異体、および誘導体を指すことがある。NS5B核酸、NS5B遺伝子、またはNS5Bタンパク質が指すのは、機能的ポリメラーゼ、または適当な鋳型に依然として結合する非機能的ポリメラーゼである。

「シンチレーション近接アッセイ（SPA）」という用語は、アッセイ溶媒中の放射性標識された産物の量に関連するレベルで、定量化可能な光エネルギーを発生させるホモジニアスアッセイ法を指す。光エネルギーは、支持構造物（アッセイ過程で使用可能なビーズまたはその他の固体面）に含まれている、またはその一部をなしている、シンチラント（scintillant）によって発生する。支持構造物は捕捉分子でコーティングされていてもよいが、捕捉分子は本発明の実施に必須ではない。直接アッセイにおいて、放射性標識された産物を含む試料は、シンチラント支持構造物を含む水溶液中で混合される。放射性標識された産物はシンチラント含有支持構造物に結合する。シンチラントは光を放出しながら活性化し、その光は従来通りシンチレーションカウンターを用いて検出できる。発生する光の量は、支持構造物の表面に結合する反応物の量に正比例する。SPAで使用されるビーズは、直径約5μmのミクロスフェアでもよいし、ポリアクリルアミド、アクリルアミド、アガロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、およびポリビニルトルエンなどの、しかしそれらに限定されない、疎水性のポリマーでできていてもよいし、またはイットリウムシリケートなどの無機シンチレーターでできていてもよい。ビーズの中心は、ビーズの疎水性を低下させるポリヒドロキシフィルムでコーティングされていてもよい。一つの態様において、SPAビーズは、イットリウムシリケート、またはジフェニルオキサゾルなどの有機シンチラントを含むポリビニルトルエンでできており、Amersham Biosciences（Piscataway, N. J.）から市販されている。

「適切に放射性標識された」分子の同位体とは、例えば、トリチウムまたはヨード125オージェ電子などの、比較的低エネルギーのベータ線を放出する同位体を指す。シンチラント含有支持構造物に結合する、またはそのごく近傍に存在する試料の部分のみが計数可能なシンチレーション現象を生じさせる。結合しなかった放射性標識分子は、シンチラントの表面からはあまりにも遠く離れているので、シンチレーションを発生することができず、ベータ崩壊のエネルギーは液体の水性溶媒中に散逸する。

本明細書において使用する場合、「アフィニティータグ」という用語は、「レセプター」に対する強いアフィニティーを、リガンドが結合した物質を溶液から抽出するために利用することができる（プライマーに付加された）リガンドを指す。そのようなリガンドの例として、ビオチンもしくはその誘導体、ヒスチジンポリペプチド、アミロースの糖部分、または特異的抗体で認識されうる特定のエピトープが含まれる。そのような「アフィニティータグ」は好ましくは溶液中でプライマーに結合し、固体支持体に結合した好適な「レセプター」部分によって捕捉される。

本明細書において使用する場合、「プライマー」という用語は、適当な環境に置かれた場合に、鋳型依存的核酸合成の開始剤として機能的に作用することができるオリゴヌクレオチドを指し、そのオリゴヌクレオチドは、RNAまたはDNAのいずれか、一本鎖または二本鎖のいずれかであり、生物学的システムに由来するか、制限酵素消化で生成されるか、または合成で産生されるかのいずれかである。適切な核酸の鋳型、核酸の好適なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、好適な補因子、ならびに好適な温度およびpHなどの条件が提示された場合、プライマーはポリメラーゼまたは同様の活性の作用によるヌクレオチドの付加によって、その3’末端で伸長（延長）し、プライマー伸長（延長）産物を生じ得る。プライマーは、特定の条件および適用の要件に応じて、長さが変わってもよい。例えば、本発明の方法において、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には1〜24ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。プライマーは、所望の伸長産物の合成を開始するように、すなわち、同様の酵素に適切に並んだプライマーの3’水酸基部分を供給するのに十分な様式で所望の鋳型鎖とアニールすることができるように、望ましい鋳型に対して十分に相補的でなければならない。プライマー配列が望ましい鋳型の正確な相補性を表す必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列が別の相補的なプライマーの5’末端に結合していてもよい。または、プライマー配列が所望の鋳型鎖配列と十分な相補性を有し、伸長産物の合成のためのプライマー-鋳型複合体を機能的に与えることができるならば、非相補的な塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列の内部に散在してもよい。

本明細書において使用する場合、「非修飾プライマー」という用語は、修飾されていない、または「アフィニティータグ」分子が結合していないプライマーを指す。

「RNA合成」および「転写」という用語は互換的に用いられ、RNAポリメラーゼによってなされる特定の工程によって定義される：その工程とは、鋳型の開始部位を認識し、その部分に結合する工程；最初の相補的ヌクレオチドを取り込むことにより反応を開始する工程；および相補的ヌクレオチドを連続的に付加し、新生RNA鎖を伸長する工程である。

「鋳型」という用語は、ポリメラーゼの基質の一つとしての役目を果たす、少なくとも長さが50ヌクレオチドのDNA、または好ましくはRNAのオリゴヌクレオチドを指す。鋳型の配列は、転写の間にポリメラーゼによって産生される配列に相補的である。ポリメラーゼの「適切な」鋳型とは、所与のポリメラーゼの基質としての役目を果たすことができる鋳型のことである。「ホモポリマーの鋳型」という用語は、全配列がポリアデノシンまたはポリグアニジンのような一つのヌクレオチドで構成されている鋳型のことを指す。「ヘテロポリマーの鋳型」という用語は、「ホモポリマー」ではなく、配列が複数のヌクレオチドで構成されている鋳型のことを指す。

本発明は、シンチレーション近接アッセイ（SPA）を利用することにより、ポリメラーゼ酵素の活性をアッセイする方法を提供する。SPAは放射性標識された分子を支持構造物のシンチラントのごく近傍に運び、光の放出を刺激することで機能する。本発明の第一の態様において、ポリメラーゼ酵素の活性をアッセイする方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：（a）標識転写産物を提供するために、該ポリメラーゼ酵素、適切な鋳型、ならびに適切に放射性標識されたおよび放射性標識されていない複数のヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を、非修飾プライマーと共にまたは非修飾プライマーなしで、インキュベートする工程；（b）該標識転写産物を、pH約2.0〜pH約4.5で、シンチレーション近接アッセイ（SPA）支持構造物と接触させる工程；およびｃ）該シンチレーションのレベルが該ポリメラーゼ酵素の活性と相関するシンチレーションのレベルを計測する工程。

本発明の第一の態様の一つの態様において、ポリメラーゼ酵素はHCV NS5Bポリメラーゼである。このアッセイにおいて、NS5Bは、プライマーと共にまたはプライマーなしで一本鎖RNA鋳型に結合し、ds（二本鎖）RNAのデノボ合成を開始する。鋳型は、相補的プライマー（例えば、ポリA-オリゴU）を必要とするホモポリマー、または相補的プライマーを必要とするもしくは必要としなくてもよいヘテロポリマーであることができる。プライマーを必要としないNS5BのRNA鋳型は、HCVゲノムの5’非翻訳領域に位置する内部リボソーム侵入部位（HCV IRES）および3’非翻訳領域（HCV 3’-UTR）を含む。放射線標識されたUTP、ならびに標識されていないCTP、GTP、およびATPは、ポリメラーゼ-鋳型の結合時に、二本鎖らせんに取り込まれる。産物（dsRNA）の検出は、dsRNAと結合し、反応がさらに進むのを停止する、一定量のプロテインAポリビニルトルエン（PVT）SPAビーズを（低いpHで）加えることで測定される。取り込まれた放射性標識UTPにビーズがすぐそばに近接することによって、光子が放出され、検出器に捕捉される。シグナル（光子）の不在により、酵素／化合物の阻止を介したdsRNA形成の欠如が示される。

本発明の第二の様態において、ポリメラーゼ酵素の活性をアッセイする方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：（a）標識転写産物を提供するために、ポリメラーゼ酵素、適切な鋳型、ならびに適切に放射性標識されたおよび放射性標識されていない複数のヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を、ポリメラーゼ酵素の活性を調節する一つまたは複数の化合物の存在下で、非修飾プライマーと共にまたは非修飾プライマーなしで、インキュベートする工程；（b）標識転写産物を、pH約2.0〜pH約4.5で、シンチレーション近接アッセイ（SPA）支持構造物と接触させる工程；および（c）シンチレーションのレベルがポリメラーゼ酵素の活性と相関するシンチレーションのレベルを計測する工程。本発明の第二の態様の好ましい態様において、ポリメラーゼ酵素はHCV NS5Bポリメラーゼである。

本発明の方法は、任意の数のRNAポリメラーゼ酵素およびDNAポリメラーゼ酵素で実施されてもよい。なぜならば、ポリメラーゼによって産生された標識産物（すなわち、dsRNAまたはDNA）は、シンチレーションのレベルがポリメラーゼの活性と相関するような形で、酸性pH条件下でSPA支持構造物の近傍に運ばれうるからである。本発明は、RNAウイルスおよびDNAウイルス由来のRNAポリメラーゼおよびDNAポリメラーゼだけでなく、原核生物および真核生物種由来のRNAポリメラーゼおよびDNAポリメラーゼにも適用される。DNAポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼ、またはヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素（HIV-RT）などのRNA依存性DNAポリメラーゼを含むことができる。

下記の調製および実施例は、当業者が本発明をより明らかに理解し、実施することができるように提供される。これらは、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではなく、単にその実例および典型であると考えられるべきである。

実施例1
HCV NS5B RNAポリメラーゼアッセイ
N末端にヒスチジンタグを付加した、遺伝子型1bのHCV BK株に由来するHCVポリメラーゼ（NS5B570n-BK）は、全長HCVポリメラーゼと比較してC末端に21アミノ酸の欠失を含み、大腸菌（E. coli）株M15から精製する。Taqプロモーター発現カセットの下流にあるHCV BK株のアミノ酸残基2421-2999（GenBankアクセッション番号M58335）のコーディング配列を含むコンストラクトはプラスミドコンストラクトに挿入した。プラスミドコンストラクトを大腸菌に形質転換し、コロニーを100μg/mlのアンピシリンを添加した10Lのテリフィック培地（Terrific broth）（TartoffおよびHobbs）に植菌し、37℃で終夜培養した。吸光度がOD₆₀₀値1.5〜3.5の間に達した際に、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によってタンパク質発現を誘導し、その後、培養液を22℃で16〜18時間インキュベートした。NS5B570n-BKは、その後のNi-NTA、SP-Sepharose HPおよびSuperdex 75樹脂を用いたカラムクロマトグラフィを含む三段階のプロトコールを用いて、均一になるまで精製した。

NS5Bポリメラーゼを様々な濃度で384ウェルプレートに加え、濃度0.26μg/ウェルの、GenBankアクセッション番号AF356827に由来するHCV 5’非翻訳領域のヌクレオチド残基21〜371を含む377ヌクレオチドのHCV IRES鋳型配列（配列番号：1）、ならびに1μM CTP、GTP、ATPおよび1μCi ³H-UTP（Amersham TRK412、1mCi/ml）とともに、40mM Tris（pH 8.0）、4mM 酢酸マグネシウム、および4mM DTTを含む緩衝液中でインキュベートした。幾つかの例においては、濃度10μMの試験化合物も加えた。30℃で3時間インキュベートした後、100mM 酢酸ナトリウム（pH 3.0）および2.3mg/ml プロテインA-PVT SPAビーズを含む溶液を各ウェルに加えた。試料は室温で12時間、静置しておいた。SPAビーズに含まれるシンチラントから放出される光の量は、トップカウントプレートリーダー（Perkin-Elmer）でカウント／分（CPM）に変換した。図1は異なる濃度のNS5Bポリメラーゼを用いて行なったアッセイの結果を示している。図2は幾つかの公知のNS5Bポリメラーゼ阻害剤の用量反応曲線の形で、アッセイの結果を示している。

実施例2
HIV-1逆転写酵素アッセイ
HIV−1株由来の組換え逆転写酵素（RNA指向性DNAポリメラーゼ）は、Mizrahi et al., Arch. Biochem. Biophys. 1989 273: 347-358に記載の通りに、大腸菌で発現させ、精製することができる。逆転写酵素をマイクロタイタープレートに加え、2.5μg/mlのオリゴ(dT)₁₆プライマーと予めアニールした5μg/mlのポリ（rA）鋳型、ならびに1μM dATP、dCTP、dGTP、および1μCi [メチル-1’2 ’-³H]dTTP（Amersham TRK-576）とともに、40mM Tris（pH 8.0）、4mM 酢酸マグネシウム、および4mM DTTからなる緩衝液中で混合する。反応は37℃で30分間行なう。インキュベーション後、100mM 酢酸ナトリウム（pH 3.0）および2.3mg/ml プロテインA-PVT SPAビーズを含む溶液を各ウェルに加え、実施例1に記載の通りに、試料を処理し、シンチレーションを検出する。

実施例3
大腸菌DNAポリメラーゼI（クレノー）アッセイ
市販されている大腸菌DNAポリメラーゼI大（クレノー）断片（例えば、Invitrogen カタログ番号18012-021）のポリメラーゼ活性は、実施例2に記載の方法、しかし遊離の3’-水酸基末端（例えば、DNaseI消化で生じる）を有する二本鎖DNAを鋳型として用いプライマーを用いない、または一本鎖DNAを鋳型として用い特異的プライマーもしくはランダムプライマーを用いるいずれかの方法を利用して、アッセイ可能である。

NS5Bポリメラーゼ濃度の効果を示す。濃度0〜160nMのNS5Bが入った384ウェルプレート中で実験を行なった。0.26μg/ウェルのHCV IRES鋳型、1μMのCTP、GTP、ATP、および1μCiの³H-UTPが、40mM Tris（pH 8.0）、4mM 酢酸マグネシウム、および4mM DTTを含む緩衝液中に存在した。100mM 酢酸ナトリウム（pH 3.0）および2.3mg/ml プロテインA-PVT SPAビーズを含む溶液で、30℃で2.5時間インキュベートした後、反応を停止した。

既知のNS5B阻害剤の用量反応曲線：濃度0.23μg/20μlのNS5Bが入った384ウェルプレート中で実験を行なった。0.26μg/20μlのHCV IRES鋳型、1μMのCTP、GTP、ATP、および1μCi ³H-UTPが、40mM Tris（pH 8.0）、4mM 酢酸マグネシウム、4mM DTT、および10％DMSOを含む緩衝液中に存在した。100mM 酢酸ナトリウム（pH 3.0）および2.3mg/ml プロテインA-PVT SPAビーズを含む溶液で、30℃で2.5時間インキュベートした後、反応を停止した。

Claims

HCV NS5Bポリメラーゼ酵素の活性をアッセイする方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）標識転写産物を提供するために、該ポリメラーゼ酵素、ヘテロポリマーの鋳型、ならびに適切に放射性標識されたおよび放射性標識されていない複数のヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を、プライマーを必要とせずに、インキュベートする工程；
（b）標識転写産物をpH2.0〜pH4.5でシンチレーション近接アッセイ（SPA）支持構造物と接触させる工程；および
（c）シンチレーションのレベルが該ポリメラーゼ酵素の活性と相関するシンチレーションのレベルを計測する工程。
ヘテロポリマーの鋳型がHCVゲノムの5’非翻訳領域に位置する内部リボソーム侵入部位（HCV IRES）およびHCVゲノムの3'非翻訳領域（HCV 3’-UTR）からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
HCV NS5Bポリメラーゼ酵素の活性を測定する方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）標識転写産物を提供するために、該ポリメラーゼ酵素、ヘテロポリマーの鋳型、ならびに適切に放射性標識されたおよび放射性標識されていない複数のヌクレオチド三リン酸を含む反応混合物を、該ポリメラーゼ酵素の活性を調節する一つまたは複数の化合物の存在下で、プライマーを必要とせずに、インキュベートする工程；
（b）標識転写産物をpH2.0〜pH4.5でシンチレーション近接アッセイ（SPA）支持構造物と接触させる工程；ならびに
（c）シンチレーションのレベルが該ポリメラーゼ酵素の活性と相関するシンチレーションのレベルを計測する工程。
ヘテロポリマーの鋳型がHCVゲノムの5’非翻訳領域に位置する内部リボソーム侵入部位（HCV-IRES）およびHCVゲノムの3'非翻訳領域（HCV 3’ UTR）からなる群より選択される、請求項3記載の方法。