JP4746059B2 - 抗酸化物質のスクリーニング方法、及びそれによってスクリーニングされた抗酸化物質 - Google Patents

Description

本発明は、突然変異細菌とクロロフィリドとを用いた抗酸化物質のスクリーニング方法に関する。より詳細には、クロロフィリドが添加されたフィルターディスクまたは培地ブロック中での特定突然変異細菌の成長状態を観察することによって、抗酸化物質を容易に選別するスクリーニング方法及び該スクリーニング方法によってスクリーニングされた抗酸化物質に関する。

一般的に、活性酸素種（ＲＯＳ）及び酸素フリーラジカルは人体内で酸化作用を起こし、それによって細胞膜、ＤＮＡ及び多様な細胞構造物に損傷をもたらし、癌、動脈硬化症、糖尿病、脳卒中、心筋梗塞症、肝炎、腎臓炎、アトピー、パーキンソン病のような多様な疾病に直接的または間接的に関与することが知られている。活性酸素種の一つであるスーパーオキシドは、酸素分子が生体組織の酸素代謝過程で電子を一つ受けとり、スーパーオキシドアニオン（Ｏ_２ ⁻）へと還元されてできており、該スーパーオキシドは、反応性が高いため、核酸、タンパク質、脂質等の生体構成物質を非可逆的に破壊する。特に、スーパーオキシドは、Ｆｅ^３＋イオンが存在する時、Ｆｅ^３＋イオンをＦｅ^２＋イオンに還元し、該還元されたＦｅ^２＋は、過酸化水素との反応を通じてヒドロキシラジカルを形成させる。このように形成されたヒドロキシラジカルは、突然変異の誘発、タンパク質の鉄硫黄中心の破壊、脂質の過酸化の誘発等のような生命体の代謝及び恒常性を阻害するとことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。

従って、スーパーオキシドアニオンラジカルを含む活性酸素種の細胞毒性を減少させるか、直接活性酸素種を不活性化させることができる抗酸化物質を得ることが非常に重要であり、抗酸化物質をスクリーニングするための多様な方法が開発されている。例えば、生体外での酸化還元反応による色または蛍光の変化、ＤＮＡ鎖切断または活性酸素と特異的に反応するスピントラップ試薬等を用いて抗酸化物質を分析及び開発しているが、このような方法を通じて開発された抗酸化物質は、大部分が実際には生体内への吸収や代謝による生体利用効率が低いか、生体への毒性のために使用が制限される。また、上述した方法は、生体での効能、安全性及び抗酸化特異性等の生体外実験を含んでいるため、複数のスクリーニング工程を通じて検証しなければならなかった。

また、高い抗酸化活性を有し、生体膜透過性及び生体利用効率に優れているにもかかわらず、組職吸収及び細胞膜透過性が比較的に優れた脂溶性抗酸化物質は、ほとんどが細胞膜に局在するので、活性酸素種の生成箇所で抗酸化作用を行うことは困難である。脂溶性の前記抗酸化物質は、体内から疎水性化学物質の排出を促進するＲＯＳまたはＲＮＳ（活性窒素種）と反応するため、体内に蓄積され、また、肝臓で親水性形態へと代謝されることも困難である。一方、水溶性抗酸化物質の場合には、酸化された抗酸化物質の体外への排出はよく行われるが、生体膜透過性が低く、細胞膜保護作用や、細胞内小器官へ拡散してしまう問題があった。従って、抗酸化物質の使用目的によって水溶性及び脂溶性の特性をいずれも備え、用途に応じて容易に調製可能な両親媒性抗酸化物質の開発が要求されている。

一方、紅色非硫黄細菌であるロドバクター属（Rhodobacter）の微生物は、光合成細菌の一種であって、藻類や植物の光合成とは異なり、その過程中で酸素を発生させず、多様な代謝条件、すなわち、好気的条件、嫌気暗条件、嫌気光条件のいずれにおいても成長できるという長所を有する。特に、前記光合成細菌であるロドバクター属の微生物は、嫌気光条件では、バクテリオクロロフィル色素が含有する光合成装置を用いて長波長の光を受けると細胞膜関連の一連の電子伝達過程を行う。これを通じて光エネルギーが化学エネルギーに転換され、発生した化学エネルギーは、二酸化炭素の固定等の細胞代謝活動に必要なエネルギーとして用いられる。前記光合成細菌において、バクテリオクロロフィルを合成する代謝過程を媒介する酵素の一つでｂｃｈＸ遺伝子、ｂｃｈＹ遺伝子及びｂｃｈＺ遺伝子の三つの遺伝子の発現によってできる多量体タンパク質は、クロロフィリド還元活性を有することが知られている。

そこで、ロドバクター・スフェロイデス由来のスーパーオキシド生成酵素である多量体タンパク質が知られている（特許文献１参照）。前記多量体タンパク質は、両親媒性基質であるクロロフィリドが存在すれば、生体内外でスーパーオキシドを生成させることができるので、前記多量体タンパク質を発現する細胞を選択的に死滅させることができる。

しかしながら、前記従来の多量体タンパク質は、スーパーオキシド生成試薬としての機能のみが記載されており、これを用いて具体的に抗酸化物質のスクリーニング方法に適用することができないという問題がある。
大韓民国公開特許公報第２００７−５９４８５号 Imlay,J.A.,2003,Ann.Rev.Microbiol.57:395-418 Sistrom,W.R,1962.J.Gen.Microbiol.28:607-616 McCord and Fridovich,1969,J.Biol.Chem.244:6049-6055

本発明は、かかる問題を解消し、容易な方法によって両親媒性抗酸化物質を選択的に大量にスクリーニングすることができる抗酸化物質のスクリーニング方法を提供することを第１の目的とする。

本発明の抗酸化物質のスクリーニング方法は、スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによって、スーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害された突然変異細菌ロドバクター・スフェロイデス２．４．１ＳｏｄＢ１変異菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１１０６９ＢＰ）を寒天平板培地上で培養する段階と、スクリーニングする抗酸化物質候補及びクロロフィリドが添加されたフィルターディスクを該寒天平板培地上に配置する段階と、該突然変異細菌の成長が観察されるフィルターディスクを選別する段階とを含む。

本発明の抗酸化物質のスクリーニング方法は、前記第１の目的を達成するための他の方法であって、細菌培養用の寒天平板培地にクロロフィリドを添加した後、該寒天平板培地をブロック状に切り取ってクロロフィリドが添加された培地ブロックを製造する段階と、該培地ブロックを細菌培養用のペトリ皿上に配置する段階と、スクリーニングしようとする抗酸化物質候補と、スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによってスーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害された突然変異細菌ロドバクター・スフェロイデス２．４．１ＳｏｄＢ１変異菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１１０６９ＢＰ）とを該培地ブロック上に加える段階と、該突然変異細菌が成長する培地ブロックを選別する段階とを含む。

また、本発明の抗酸化物質のスクリーニング方法として、前記突然変異細菌は、酸素雰囲気下でスーパーオキシドアニオン生成を誘導する多量体タンパク質であるクロロフィリド還元酵素を発現することができる。

また、本発明の抗酸化物質のスクリーニング方法に用いる前記突然変異細菌としては、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）２．４．１ＳｏｄＢ１変異菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１１０６９ＢＰ）である。

また、本発明の抗酸化物質のスクリーニング方法に用いる前記突然変異細菌は、酸素雰囲気下でスーパーオキシドアニオン生成を誘導する多量体タンパク質であるクロロフィリド還元酵素を発現するように形質転換されたものであってよい。

また、本発明の抗酸化物質のスクリーニング方法は、前記突然変異が導入される細菌（以下、突然変異対象細菌と記載する）の形質転換は、スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによって、スーパーオキシドジスムターゼ活性が阻害された第１組み換えベクター及び酸素雰囲気下でスーパーオキシドアニオンを過発現させることができる第２組み換え発現ベクターを製造する段階と、該第１組み換えベクターが導入された第１形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び該第２組み換え発現ベクターが導入された第２形質転換大腸菌を製造する段階と、該第１及び第２形質転換大腸菌と該突然変異対象細菌とを接合（conjugation）させることによって、該突然変異細菌を製造する段階とを含むことができる。

また、本発明の抗酸化物質のスクリーニング方法として、前記突然変異細菌は、クロロフィリド存在時、１〜３％の範囲の濃度の酸素条件下で過酸化水素を生成せず、スーパーオキシドアニオン生成活性を有することができる。

また、本発明の抗酸化物質のスクリーニング方法として、本発明の望ましいさらに他の実施形態によれば、前記クロロフィリドは、前記フィルターディスクまたは前記寒天平板培地が０．１〜１００ｍＭの範囲のクロロフィリド濃度となるように添加される。

また、本発明の抗酸化物質のスクリーニング方法として、前記フィルターディスクは、例えば、５〜２０ｍｍの範囲の直径及び０．１〜１ｍｍの範囲の厚さを有し、前記培地ブロックは、１０〜３０ｍｍの範囲の直径及び５〜１５ｍｍの範囲の厚さを有することができる。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明は、クロロフィリド及び突然変異細菌を用いて多様な抗酸化物質候補のうちから抗酸化物質を選択的にスクリーニングするための方法及びそれによりスクリーニングされた抗酸化物質に関するものであって、クロロフィリドが添加されたフィルターディスクまたは培地ブロック中での特定の突然変異細菌の成長状態を観察することによって、抗酸化物質を容易に選別するスクリーニング方法に関する。

本発明では、スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによって、スーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害された突然変異光合成細菌を製造し、これを抗酸化物質のスクリーニングに応用する方法を提供する。

野生型細菌においては、生成したスーパーオキシドアニオンを過酸化水素に変換するスーパーオキシドジスムターゼが発現されるので、スーパーオキシドアニオンに対する細胞毒性が緩和されるが、本発明による突然変異細菌は、前記スーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害されているので、相対的に野生型細菌に比べてスーパーオキシドアニオンによる細胞毒性が大きく表われる。

従って、本発明による突然変異細菌は、クロロフィリドに対する多量体タンパク質の酵素作用の結果として生成されたスーパーオキシドアニオンによって死滅するが、スクリーニングされる候補物質の中で抗酸化物質としての活性を有する特定の物質が存在する場合には、スーパーオキシドアニオンの細胞毒性を阻害するようになる。この結果、突然変異細菌であっても成長可能になるので、突然変異細菌の成長如何によって抗酸化物質としての活性を有する物質を容易に選別することができる。

具体的には、本発明による抗酸化物質のスクリーニング方法は、スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによって、スーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害された突然変異細菌を寒天平板培地上で培養する段階と、スクリーニングする抗酸化物質候補及びクロロフィリドが添加されたフィルターディスクを該寒天平板培地上に配置する段階と、該突然変異細菌の成長が観察されるフィルターディスクを選別する段階とを含む。前記フィルターディスクを使った抗酸化物質のスクリーニング方法の概略図を図１に示す。

前記抗酸化物質のスクリーニング方法は、前記突然変異細菌の培養後、クロロフィリド及び抗酸化物質候補を、フィルターディスクを用いて添加する方法である。

また、前記抗酸化物質のスクリーニング方法は、クロロフィリドが添加された前記培地ブロックを製造した後、突然変異細菌及び抗酸化物質候補を添加する方法であってもよい。すなわち、本発明による、他の抗酸化物質のスクリーニング方法は、細菌培養用の寒天平板培地にクロロフィリドを添加した後、該寒天平板培地をブロック状に切り取ってクロロフィリドが添加された培地ブロックを製造する段階と、該培地ブロックを細菌培養用のペトリ皿上に配置する段階と、スクリーニングしようとする抗酸化物質候補と、スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによってスーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害された突然変異細菌とを該培地ブロック上に加える段階と、該突然変異細菌が成長する培地ブロックを選別する段階とを含む。前記培地ブロックを用いた抗酸化物質のスクリーニング方法の概略図を図２に示す。

特に、本発明による抗酸化物質スクリーニング方法は、水溶性及び脂溶性特性を同時に有する両親媒性抗酸化物質のスクリーニングを容易に行うことができる。すなわち、抗酸化物質候補が水溶性でない場合には、フィルターディスクまたは培地ブロックに対する溶解度が低下し、細胞内拡散性が不十分である。一方、前記抗酸化物質が脂溶性でない場合には、細胞膜透過度が低下して細胞吸収度が低いために、スーパーオキシドアニオンによる毒性を効果的に阻害することができない。従って、本発明による抗酸化物質スクリーニング方法による場合、両親媒性抗酸化物質である抗酸化物質候補が突然変異細菌の成長を効果的に援助する。

本発明による突然変異細菌は、酸素雰囲気下でスーパーオキシドアニオン生成を誘導する多量体タンパク質であるクロロフィリド還元酵素を発現することができる。このような突然変異細菌の具体例としては、これに制限されるものではないが、ロドバクター・スフェロイデス、ロドスピリラム・ルブルム、ロドシュードモナス・パルストリス、アロクロマチウム・ヴィノサム、クロロビウム・テピダムまたはクロロフレクサス・アウランティアクス等の光合成細菌を挙げることができる。

また、本発明による突然変異細菌は、クロロフィリド還元酵素を発現することができないものであるとしても、該クロロフィリド還元酵素を過発現するように形質転換する場合がある。例えば、本発明による突然変異細菌は、配列番号１のｂｃｈＸ遺伝子、配列番号２のｂｃｈＹ遺伝子及び配列番号３のｂｃｈＺ遺伝子、ｒｒｎＢプロモーター及びＮ末端Ｈｉｓ−ｔａｇ等を含む組み換え発現ベクターによって形質転換されることによって、多量体タンパク質を過発現することができ、該多量体タンパク質は、クロロフィリドを基質とする還元酵素として作用し、その結果、スーパーオキシドアニオンを生成することが知られている（例えば、特許文献１参照）。

前記突然変異細菌の形質転換は、スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによって、スーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害された第１組み換えベクター及び酸素雰囲気下でスーパーオキシドアニオン生成を誘導する多量体タンパク質を過発現する第２組み換え発現ベクターを製造する段階と、前記第１組み換えベクター及び第２組み換え発現ベクターのそれぞれを使って第１組み換えベクターが導入された第１形質転換大腸菌及び第２組み換え発現ベクターが導入された第２形質転換大腸菌を製造する段階と、前記第１形質転換大腸菌及び第２形質転換大腸菌と前記突然変異対象細菌とを接合させることによって、前記突然変異細菌を製造する段階とによって行うことができる。

例えば、本発明者は、突然変異対象細菌としてロドバクター・スフェロイデスを選択し、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を破壊するための組み換え発現ベクターを製造した。その後、前記製造された組み換え発現ベクターを使って大腸菌を形質転換させることによって、形質転換大腸菌を製造した。最後に、前記形質転換大腸菌とロドバクター・スフェロイデスとを接合させることによって、突然変異細菌を製造した。前記製造された突然変異細菌は、クロロフィリドを還元する多量体タンパク質を発現しながらも、スーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害されたＳｏｄＢ１変異菌株であって、これをロドバクター・スフェロイデス ２．４．１ ＳｏｄＢ１変異菌株とし、２００７年２月１２日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１０６９ＢＰ）。

本発明によって製造された突然変異細菌は、多量体タンパク質を発現し、該発現された多量体タンパク質はクロロフィリドを還元するため１〜３％の範囲の濃度の酸素条件下では過酸化水素を生成しないが、スーパーオキシドアニオン生成活性を有することができる。従来のスーパーオキシド生成物質であるメチルビオローゲン、プルンバギン、メナジオン等は、結果としてスーパーオキシドだけではなく、過酸化水素も生成する。生成した過酸化水素は、様々な問題を有する。例えば、鉄イオン（Ｆｅ^２＋）と反応してヒドロキシラジカルを生成し、脂肪の変性やＤＮＡ変異を引き起こす。さらに、細胞膜透過性が高くて比較的安定しているため、過酸化水素を生成した細胞以外の正常細胞にも影響を及ぼすという副作用があるために、カタラーゼにより該過酸化水素を分解し、除去しなければならないという問題があった。しかし、本発明によって製造された突然変異細菌が発現する多量体タンパク質は、過酸化水素を生成せず、かつ、スーパーオキシドアニオン生成活性を有するために、従来技術の限界点を克服することができる。

本発明による抗酸化物質スクリーニング方法において、前記フィルターディスクまたは前記平板培地には、クロロフィリド濃度が０．１〜１００ｍＭの範囲になるよう添加することが望ましい。前記クロロフィリド濃度が０．１ｍＭ未満である場合には、感度が低くなり過ぎることがある。一方、前記クロロフィリド濃度が１００ｍＭを超える場合には、細胞毒性を示すことがある。

前記平板培地またはペトリ皿上に配置される、クロロフィリドが添加されたフィルターディスクまたは培地ブロックの大きさは、スクリーニングしようとする候補物質の個数または視覚的観察の容易性等を考慮して多様に調節可能であるが、例えば、前記フィルターディスクは、５〜２０ｍｍの範囲の直径及び０．１〜１ｍｍの範囲の厚さを有し、前記培地ブロックは、１０〜３０ｍｍの範囲の直径及び５〜１５ｍｍの範囲の厚さを有することができる。

また、本発明は、前記第２の目的を達成するために、上述された方法によってスクリーニングされた抗酸化物質を提供する。

例えば、下記実施例に記載したように、本発明によるスクリーニング方法によってスクリーニングされた抗酸化物質の中でＰｃｈ２１２は両親媒性を有し、そのため、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）及び水溶性緩衝溶液の両方に対して優れた溶解度を有する。また、図４の細菌増殖の観察結果から分かるように、本発明によるスクリーニング方法によってスクリーニングされた抗酸化物質は、従来の抗酸化物質である脂溶性ケルセチンまたは脂溶性トコフェロールに比較して優れた抗酸化効能を有することが明らかである。

本発明によれば、前記突然変異細菌及びクロロフィリドを用いて該突然変異細菌の成長状態をモニタリングすることによって、両親媒性抗酸化物質を大量で容易に選択的にスクリーニングすることができる。

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。下記実施例は、本発明の理解を助けるためのものであり、下記実施例によって本発明の範囲が制限されるものではない。

突然変異細菌の製造
１．１ 多量体タンパク質発現突然変異細菌の製造
ｂｃｈＸ遺伝子（配列番号１）、ｂｃｈＹ遺伝子（配列番号２）、ｂｃｈＺ遺伝子（配列番号３）に対してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇまたはＳｔｒｅｐ−ｔａｇを融合させた。前記ＰＣＲは、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を修飾された前方プライマー（forward primer）が使われた。前記修飾された前方プライマーは、前記ｂｃｈＸ遺伝子、ｂｃｈＹ遺伝子及びｂｃｈＺ遺伝子に対して、それぞれ配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載の配列を有するように製作された。また、前記ＰＣＲは、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を有する後方プライマーが使われた。前記後方プライマーは、前記ｂｃｈＸ遺伝子、ｂｃｈＹ遺伝子及びｂｃｈＺ遺伝子に対して、それぞれ配列番号７、配列番号８及び配列番号９に記載の配列を有するように製作された。表１の下線は、制限酵素認識配列を作るために任意に変形させた塩基配列を表わし、太字で表示した塩基配列は、対応する制限酵素の認識配列である。

次に、前記配列番号４〜９に記載の配列を有するプライマーを用いて、前記ｂｃｈＸ遺伝子及びｂｃｈＹ遺伝子に対するＰＣＲで得られた生成物を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの認識配列が開裂したｐＲＳＥＴ―Ｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に連結することで、それぞれｐＲＳＥＴ−ＨｉｓＸベクター、ｐＲＳＥＴ−ＨｉｓＹベクターを製作した。ＤＮＡ断片を得るための切断には、対応する制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ、タカラバイオ株式会社製）を使い、該ＤＮＡ断片の連結のためには、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ株式会社製）を使った。また、ｂｃｈＺ遺伝子のＰＣＲで得られた生成物は、ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの認識配列で切断して、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの認識配列が開裂したｐＲＳＥＴ−Ｃベクターに連結し、ｐＲＳＥＴ−ＨｉｓＺベクターを製作した。前記ｐＲＳＥＴ−ＣベクターのＢａｍＨＩ位置から１４２ｂｐ上位にあるＸｂａＩ認識配列を用いて、前記ｐＲＳＥＴ−ＨｉｓＸベクター、ｐＲＳＥＴ−ＨｉｓＹベクター及びｐＲＳＥＴ−ＨｉｓＺベクターをＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、各ベクターの制限断片を得た。前記制限断片は、ｐＲＫ４１５ベクターにロドバクター・スフェロイデスのｒｒｎＢプロモーターを含むベクターに連結され、ｐＲＫ−ＨｉｓＸベクター、ｐＲＫ−ＨｉｓＹベクター及びｐＲＫ−ＨｉｓＺベクターを製作した。これらのベクターは、細胞内でｒｒｎＢプロモーター（配列番号１０）によって転写されてＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇが融合された所定のタンパク質を発現させるように設計されており、従って、該所定のタンパク質を発現することができる。このような各ベクター構造は大腸菌Ｓ１７−１に形質転換されて、連結法（conjugation process）によりロドバクター・スフェロイデスに可動化された。所定の形質転換体を得るために、ベクタープラスミドを選別できる抗生物質であるテトラサイクリンを添加したシストロム最小培地に塗抹し、抗生物質耐性を有する菌株を確保した。前記ｐＲＫ−ＨｉｓＸベクター、ｐＲＫ−ＨｉｓＹベクター及びｐＲＫ−ＨｉｓＺベクターによる前記ＢｃｈＸタンパク質、ＢｃｈＹタンパク質及びＢｃｈＺタンパク質の発現は、前記Ｈｉｓ−Ｔａｇに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。

前記タンパク質発現の有無を確認するために、前記形質転換された大腸菌に前記ＢｃｈＸタンパク質（配列番号１１）、ＢｃｈＹタンパク質（配列番号１２）及びＢｃｈＺタンパク質（配列番号１３）を過発現させ、該タンパク質各々を分離した。前記ｐＲＫ−ＨｉｓＸベクター、ｐＲＫ−ＨｉｓＹベクター及びｐＲＫ−ＨｉｓＺベクターを含む前記形質転換された大腸菌は、嫌気条件で１Ｌ培養瓶をブチルゴム栓で塞ぎ、雰囲気ガスを窒素ガスに置き換えて培養した。分離過程は、５％水素、５％二酸化炭素、９０％窒素を含む嫌気性チャンバー（ｍｏｄｅｌ１０、ＣＯＹ社製）内で行われた。細胞内にある水溶性の過発現タンパク質を得るために超音波破砕機（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０、Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて４℃、１０分間細胞を破砕して細胞溶解物を得た。次に、前記細胞溶解物を４℃で１２，０００Ｇに遠心分離して水溶性の細胞質画分を得た後、ニッケル親和クロマトグラフイー（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使い、使用説明書に従って分離した。前記細胞質画分をニッケル樹脂に吸着させた後、該細胞質画分のタンパク質のイミダゾールとの親和度の競合を通じて前記ＢｃｈＸタンパク質、ＢｃｈＹタンパク質及びＢｃｈＺタンパク質を得た。得られた前記タンパク質の溶出のために１５０ｍＭのイミダゾールと３００ｍＭ塩化ナトリウムとを含む５０ｍＭリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）緩衝液（ｐＨ７．９）を使った。前記タンパク質はそれぞれ、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によって同定され、前記ＢｃｈＸタンパク質は４０ｋＤａ、前記ＢｃｈＹタンパク質は５８ＫＤａ、前記ＢｃｈＺタンパク質は５７ｋＤａのバンドが確認された（図３）。

図３は、前記ロドバクター・スフェロイデスから前記ＢｃｈＸタンパク質、ＢｃｈＹタンパク質及びＢｃｈＺタンパク質を分離した後、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）写真である。レーン１〜３は、分離したタンパク質を表わし、その大きさを確認するために標準分子量を有するタンパク質をともに電気泳動した。

このようなｂｃｈＸ遺伝子、ｂｘｈＹ遺伝子及びｂｃｈＺ遺伝子を一つのベクター上に位置させてプラスミドを製作し、該プラスミドを接合法により可動化させることによって、前記ＢｃｈＸタンパク質、ＢｃｈＹタンパク質及びＢｃｈＺタンパク質が全て発現されてクロロフィリド還元酵素を発現することができる形質転換突然変異細菌を製造した。

１．２ ＳｏｄＢ１変異菌株の製造
実施例１の１．１で製造された突然変異細菌を使って、下記の方法によりスーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによって、スーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害されたＳｏｄＢ１変異菌株を製造した。

Ｆｅ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｆｅ−ＳＯＤ）を暗号化するｓｏｄＢ遺伝子はｐＬＯ１自殺ベクターを使った相同組み換えの誘導により破壊された。ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む転写ターミネーターまたは翻訳ターミネーターは、前記ｓｏｄＢ遺伝子のＳｔｕＩ位置に挿入され、該挿入された遺伝子構造を、自殺ベクターにクローニングしてｐＬＯ１−Ｂ１ベクターとした。前記ｐＬＯ１−Ｂ１ベクターを使った相同組み換え時において、遺伝子の中間に位置するストレプトマイシン耐性遺伝子及びスペクチノマイシン耐性遺伝子の存在により、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンに対してのみ耐性を有し、該ｐＬＯ１−Ｂ１ベクターによるカナマイシン耐性のない二重交差相同組み換えが起きたコロニーを選別してｓｏｄＢ１欠損変異菌株とした。

前記多量体タンパク質を発現するＳｏｄＢ１変異菌株であるロドバクター・スフェロイデス２．４．１ＳｏｄＢ１変異菌株を２００７年２月１２日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ１１０６９ＢＰ）。

クロロフィリドの分離
実施例１の１．１で製造された突然変異細菌から発現される多量体タンパク質に対する基質であるクロロフィリドを分離するために、前記ロドバクター・スフェロイデスの前記ｂｃｈＺ遺伝子の相同組み換えを誘導する方法を通じて破壊した。前記ｂｃｈＺ遺伝子が欠損された変異株を製作するために、該ｂｃｈＺ遺伝子内にある制限酵素であり、ＢａｍＨＩ認識配列を認識し、開裂するＢａｍＨＩを用いた。ＢａｌＩとＰｓｔＩとを用いてｂｃｈＺ遺伝子領域を得た後、抗生物質であるカナマイシン耐性遺伝子を含む転写ターミネーターまたは翻訳ターミネーターはＢａｍＨＩ領域に挿入され、該挿入された遺伝子構造を、自殺ベクターｐＳＵＰ２Ｏ２にクローニングしてｐＳＵＰ−ＢＺベクターとした。前記ｐＳＵＰ−ＢＺベクターを使った相同組み換え時において、遺伝子の中間に位置するカナマイシン耐性遺伝子の存在により、カナマイシンに対してのみ耐性を有し、該ｐＳＵＰ−ＢＺベクターによるテトラサイクリン耐性のない二重交差相同組み換えが起きたコロニーを選別してｂｃｈＺ欠損変異株を確保した。前記ｂｃｈＺ欠損変異株は、ジメチルスルホキシドを電子移動連鎖の最終電子受容体として使う嫌気暗条件で成長させた場合、緑色クロロフィリドを培地内に蓄積させる。前記緑色クロロフィリドを、分光光度計（ＵＶ−２５５０、株式会社島津製作所製）を用いて吸光度を測定した時、従来報告されていたように、６６３ｎｍの波長に対する吸光度を表わした。前記培地内に蓄積されている緑色クロロフィリドを分離するために、該培地をジエチルエーテルで抽出し、窒素を用いて乾燥させた後、ジメチルスルホキシドに溶かして以下の反応に使った。

抗酸化物質のスクリーニング
図１及び図２に図示されたように、クロロフィリド（０．１〜１００ｍＭ）を添加した寒天平板培地を作った後、該寒天平板培地を非常に小さな培地ブロックに切り取ってブランク寒天平板培地に載せて、該培地ブロックに抗酸化物質候補とＳｏｄＢ１変異菌株とを加えるか、または直接フィルターディスクにクロロフィリド（０．１〜１００ｍＭ）を加えた後、該フィルターディスクに所望する濃度の抗酸化物質候補を加えた後、多量体タンパク質を発現するＳｏｄＢ１変異菌株であるロドバクター・スフェロイデス ２．４．１ ＳｏｄＢ１変異菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１１０６９ＢＰ）をシストロム最小平板培地［２０ｍＭリン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、３．８ｍＭ硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、３４ｍＭコハク酸、０．５９ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、０．３０ｍＭ Ｌ−アスパラギン酸、８．５ｍＭ塩化ナトリウム、１．０５ｍＭニトリロ三酢酸、１．２ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）、０．２３ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ）、２５μＭ硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）、０．１６μＭモリブデン酸アンモニウム（（ＮＨ_４）６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ）、４．７μＭ ＥＤＴＡ、３８μＭ硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）、９．１μＭ硫酸マンガン（ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ）、１．６μＭ硫酸銅（ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ）、０．８５μＭ硝酸コバルト（ＩＩ）（Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ）、１．８μＭホウ酸（Ｈ_３ＢＯ_３）、８．１μＭニコチン酸、１．５μＭチアミン塩酸塩、４１ｎＭビオチン（非特許文献２参照）］に塗抹した。

結果、スクリーニングしようとする抗酸化物質候補に抗酸化活性がある場合には、前記培地ブロック上または前記フィルターディスクの周りにのみ細胞が成長し、赤色の細菌が観察されるのに比べて、抗酸化物質候補に抗酸化活性がない場合には、すべての細胞が死滅して赤色の細胞成長が見られなかった。また、スクリーニングしようとする抗酸化物質候補に抗酸化活性がある場合には、フィルターディスクの周りでも細胞が育ち、赤色の細菌が観察されるのに比べて、抗酸化物質候補に抗酸化活性がない場合には、フィルターディスク周辺の細胞が死滅した（図４）。

多様な細菌の細胞培養物をエタノール、メタノール、ジエチルエーテル、アセトン及びクロロホルムでそれぞれ抽出し、これら抽出物を窒素により乾燥させた。得られた抽出物の抗酸化活性を前述した方法によって観察し、そのうち優れた抗酸化活性を有するものをＰｃｈ２１２と名付けた。前記Ｐｃｈ２１２の抗酸化活性を既存抗酸化物質と比べるために、適当な濃度でエタノールまたはジメチルスルホキシド溶媒に溶解させて抗酸化活性を観察した。観察結果を図５に示す。

図５に示すように、エタノールやジメチルスルホキシド等の陰性対照群では、細胞成長を表わさない一方、強力な抗酸化活性を有する脂溶性ケルセチンや脂溶性トコペロールは部分的な細胞の成長を見せたが、前記Ｐｃｈ２１２が細胞の死滅を最も効果的に防止した。また、前記Ｐｃｈ２１２の両親媒性を確認するために、ＤＭＳＯ及び水溶性緩衝溶液に溶解させて見た結果、両溶媒に対して優れた溶解度を表わした。

Ｐｃｈ２１２のスーパーオキシドアニオンに対する抗酸化効果の確認
本発明による両親媒性抗酸化物質のスクリーニング方法でスクリーニングされた抗酸化物質Ｐｃｈ２１２の抗酸化活性をシトクロム還元方法で確認した。シトクロム還元方法は、既存の方法を応用して行った（非特許文献３参照）。

分析のため、反応緩衝溶液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．４））を準備した。ゴム栓で密閉された５ｍＬのガラス瓶内に前記反応緩衝溶液と１００ｍＭのキサンチン、０．００４Ｕのキサンチン酸化剤及び実施例３でスクリーニングされた抗酸化物質Ｐｃｈ２１２を入れた後、ゴム栓で密封して空気を抜いた。２０μＭのシトクロムｃさらに加えて５５０ｎｍでの吸光度の増加を通じて還元程度を測定し、２１０００Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を用いて数値化した。このとき、スーパーオキシドアニオンを除去する抗酸化活性は、シトクロムの還元程度差を通じて確認できた（図６）。

本発明は、治療用の医薬品だけではなく、各種食品及び化粧品の添加剤として用いられる毒性が少なくて効果的な抗酸化物質をスクリーニングして製品化するのに適用可能である。

本発明において、フィルターディスクを使った抗酸化物質をスクリーニングする方法についての概略図。 本発明において、培地ブロックを使った抗酸化物質をスクリーニングする方法についての概略図。 ＢｃｈＸタンパク質、ＢｃｈＹタンパク質及びＢｃｈＺタンパク質を分離した後、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動写真。 本発明によって培地ブロックを使って抗酸化物質をスクリーニングする場合、抗酸化物質に抗酸化活性がある場合とない場合との細菌増殖観察結果を比較対照した写真。 本発明によってスクリーニングされた抗酸化物質であるＰｃｈ２１２の抗酸化活性を既存の抗酸化物質の抗酸化活性と比べるための細菌増殖観察結果を示す写真。 本発明によってスクリーニングされた抗酸化物質であるＰｃｈ２１２の抗酸化活性をシトクロム還元方法で確認した結果を示すグラフ。

Claims (10)

1. スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによって、スーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害された突然変異細菌ロドバクター・スフェロイデス２．４．１ＳｏｄＢ１変異菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１１０６９ＢＰ）を寒天平板培地上で培養する段階と、
   スクリーニングする抗酸化物質候補及びクロロフィリドが添加されたフィルターディスクを該寒天平板培地上に配置する段階と、
   該突然変異細菌の成長が観察されるフィルターディスクを選別する段階とを含むことを特徴とする抗酸化物質のスクリーニング方法。
2. 細菌培養用の寒天平板培地にクロロフィリドを添加した後、該寒天平板培地をブロック状に切り取ってクロロフィリドが添加された培地ブロックを製造する段階と、
   該培地ブロックを細菌培養用のペトリ皿上に配置する段階と、
   スクリーニングしようとする抗酸化物質候補と、スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによってスーパーオキシドジスムターゼの活性が阻害された突然変異細菌ロドバクター・スフェロイデス２．４．１ＳｏｄＢ１変異菌株（寄託番号：ＫＣＴＣ１１０６９ＢＰ）とを該培地ブロック上に加える段階と、
   該突然変異細菌が成長する培地ブロックを選別する段階とを含むことを特徴とする抗酸化物質のスクリーニング方法。
3. 前記突然変異細菌は、酸素雰囲気下でスーパーオキシドアニオン生成を誘導する多量体タンパク質であるクロロフィリド還元酵素を発現することを特徴とする請求項１または請求項２記載の抗酸化物質のスクリーニング方法。
4. 前記突然変異細菌は、酸素雰囲気下でスーパーオキシドアニオン生成を誘導する多量体タンパク質であるクロロフィリド還元酵素を過発現するように形質転換されたことを特徴とする請求項１または請求項２記載の抗酸化物質のスクリーニング方法。
5. 前記突然変異が導入される細菌（以下、突然変異対象細菌と記載する）の形質転換は、
   スーパーオキシドジスムターゼを暗号化した遺伝子配列に突然変異を組み込むことによって、スーパーオキシドジスムターゼ活性が阻害された第１組み換えベクター及び酸素雰囲気下でスーパーオキシドアニオンを過発現させることができる第２組み換え発現ベクターを製造する段階と、
   該第１組み換えベクターが導入された第１形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び該第２組み換え発現ベクターが導入された第２形質転換大腸菌を製造する段階と、
   第１形質転換大腸菌及び第２形質転換大腸菌と該突然変異対象細菌とを接合させることによって、該突然変異細菌を製造する段階とを含むことを特徴とする請求項４記載の抗酸化物質のスクリーニング方法。
6. 前記突然変異細菌は、クロロフィリド存在時、１〜３％の範囲の濃度の酸素条件下で過酸化水素を生成せず、スーパーオキシドアニオン生成活性を有することを特徴とする請求項１または請求項２記載の抗酸化物質のスクリーニング方法。
7. 前記クロロフィリドは、前記フィルターディスクまたは前記寒天平板培地が０．１〜１００ｍＭの範囲のクロロフィリド濃度となるように添加されることを特徴とする請求項１または請求項２記載の抗酸化物質のスクリーニング方法。
8. 前記フィルターディスクは、５〜２０ｍｍの範囲の直径及び０．１〜１ｍｍの範囲の厚さを有し、前記培地ブロックは、１０〜３０ｍｍの範囲の直径及び５〜１５ｍｍの範囲の厚さを有することを特徴とする請求項１または請求項２記載の抗酸化物質のスクリーニング方法。
9. 請求項２の方法において、寒天平板培地に添加されたクロロフィリドが０．１ｍM〜１００ｍMの範囲内である方法。
10. 請求項２の方法において、培地ブロックが直径１０〜３０ｍｍかつ深さが５〜１５ｍｍである方法。