JP4713261B2

JP4713261B2 - 細胞培養装置

Info

Publication number: JP4713261B2
Application number: JP2005209495A
Authority: JP
Inventors: 義広小森
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2005-07-20
Filing date: 2005-07-20
Publication date: 2011-06-29
Anticipated expiration: 2025-07-20
Also published as: JP2007020507A

Description

本発明は、接着性の細胞を培養する培養装置において、継代、培養終了のタイミングを画像処理により決定する細胞培養装置に関する。

画像処理により継代、培養終了の判定を行うには、培養中に細胞の増殖を検出する必要がある。従来、細胞数、細胞濃度、細胞占有面積を用いて細胞の増殖を検出する方法が提案されている(例えば、特許文献1)。あるいは細胞の増殖曲線(成長曲線)から増殖率の変化を検出し、増殖率が鈍化した時点で継代、培養終了の処置がなされている。コロニーを形成したまま長時間放置すると細胞の増殖が鈍ったり、分化したりするので、コロニーが形成されたら速やかに継代、培養終了の処理を講ずる必要がある。従来、コロニーの検出に関しては低倍率の対物レンズを用い、培養器を広範囲に撮影、その画像データの濃淡分布からコロニーの形成を検出している。
特開2001-275659号公報

継代、培養終了のタイミングを判定するためには、細胞の増殖に相関するパラメータを用いて閾値判定する必要がある。細胞数、細胞濃度、細胞占有面積は細胞の増殖に相関のあるパラメータではあるが、隣り合う細胞がどれくらい接近して存在するかを直接的に表現していない。したがって、細胞数、細胞濃度、細胞占有面積よりも直接的に細胞の分散を表現するパラメータを導入し、培養中の細胞密度を管理することが望ましい。増殖曲線を得るためには一定時間ごとにデータを蓄積しなければならないが、データ欠損あるいはデータ消失が発生すると増殖率が鈍化した時刻を認識できなくなる。このことから、経時的な変化に依存しないアルゴリズムで細胞の分散を算出することが必要である。コロニー形成を検出するために低倍率対物レンズを用意することは、装置の大型化、部品点数の増加につながることから、1個の対物レンズで細胞の分散測定とコロニー検出をすることが必要となる。

上記課題を解決するために、以下の構成を提供する。本発明の細胞培養装置は、細胞培養中に培養器内の細胞を撮影する撮影手段と、該撮影された細胞画像情報に基づいて隣り合う細胞の間隔を計測する計測手段と、を備え、前記計測手段は、前記細胞画像情報に、計測ラインを設定し、前記計測ラインに沿って隣り合う前記細胞の間隔を計測する。
細胞間隔を算出するには、いくつかの処理が必要である。まず、撮影した細胞画像に対して細胞抽出処理を行う。次に、細胞部分のみを白色、細胞以外の部分を黒色とする二値化処理を行う。二値化処理は後の画像処理を簡単にするために行うものであって、必須ではない。次に細線化処理を行う。これは、二値化後の細胞部分の中心を通る線のみ抽出する処理である。抽出アルゴリズムによっては細胞部分が実際よりも太く抽出されたり、細く抽出されたりするので、中心を通る線で後述の細胞間隔を測定することにより、抽出アルゴリズムの誤差を少なくすることができるとともに、抽出アルゴリズムを簡略化できる利点がある。一方、抽出アルゴリズムの精度が高い場合や、細胞の大きさにばらつきがある場合は細線化処理を行わずに、二値化画像そのものから細胞間隔を計測する方が細胞の状態を正確に反映したものとなる。最後に細胞間隔計測処理を行う。これは、画像上に任意の方向を持つラインを設定し、そのライン上である細胞とその細胞と隣り合う細胞のピクセル数を計測する。任意の方向のラインとは画像のＸ方向、Ｙ方向あるいは細胞に対する法線方向などである。細胞間隔の計測は１本のライン上で計測してもよいが、複数のラインを設定し計測する方が望ましい。

また、前記細胞培養中に取得した細胞の疎密情報により、コロニーの形成を検出する手段を備える。コロニーが形成されると、1枚の画像の中で細胞が疎な部分と密な部分が発生することを利用する。前述の細胞抽出処理、二値化処理、細線化処理を実行した後、画像データを複数の領域に分割する。領域ごとに前述の細胞間隔計測処理を実行し、それぞれの領域での細胞間隔を比較することによりコロニー形成の検出を実現する。コロニー検出は細胞の密度を測定するのと同時に行われるため、処理時間の短縮にも貢献することができる。

隣り合う細胞の間隔を計測することができ、継代、培養終了のタイミングを判定することが可能となる。さらに細胞の分散を捉える対物レンズでコロニーの形成を検出することが可能となり、コロニー形成による細胞への影響を抑えることができる。

以下、この発明の実施形態を図面に基づいて説明する。図1に模式的に示すように細胞培養装置11は、細胞培養に最適な温度、CO2濃度を提供する恒温槽10と細胞を培養する培養器17と、細胞を撮影するための対物レンズ16と、対物レンズ16のデータを電子化するカメラ15と、カメラ15から得られる画像データを操作端末19に転送するためのコンバータ18と、カメラ15を移動するためのカメラ駆動装置13と、培養器17を移動するための培養器駆動装置14、カメラ駆動装置13と培養器駆動装置14を制御するモータコントローラ12から構成されている。操作端末19からモータコントローラ12に移動命令を出すことにより、カメラ駆動装置13及び培養器駆動装置14がそれぞれX，Y方向へ作動し、培養器内の任意の位置の細胞をカメラ15で撮影することが可能である。

図2は制御端末19を詳細に示した図である。制御端末19にはデータバス21を介して演算処理を行うCPU28と、CPU28が一時記憶領域として使用する主メモリ23と、画像データ、位置情報を格納する外部記憶装置24と、モータコントローラ12と通信するための通信ポート27と、操作画面を表示するモニタ22、ユーザの入力を受け付けるキーボード26とマウス25が設けられている。

図3は図1に示す恒温槽10の斜視図である。図4は細胞間隔計測処理のフローチャートである。本図を用いて処理を詳細に説明する。細胞画像処理開始61により細胞間隔計測のための処理を開始する。画像データ取り込み62では、カメラ駆動装置13、培養器駆動装置14により決定された撮影位置の画像データをカメラ15、コンバータ18、データバス21を介して主メモリ23に転送する。細胞抽出処理63では、CPU28により閾値処理、差分処理などを行い、細胞部分を抽出し、主メモリ23に保存する。細胞部分の抽出は細胞の抽出ができればどのようなアルゴリズムでも構わない。次に二値化処理64を行う。これは、細胞抽出処理63で細胞部分と認識された画素の画素値を1に、それ以外の画素値を0にするものである。二値化処理64は必須ではないが、後述の処理が簡略化できるので実行するのが望ましい。細線化処理65は一つの細胞部分の画素を細胞の左右から削除して、細胞の中心を通る1画素の線にする処理である。細線化処理65は細胞の大きさのばらつき、細胞抽出処理63の精度により実行してもよいし、実行しなくともよい。つぎに領域分割処理66を実行する。これは1枚の画像をm×nの領域に分割するもので、図6は領域を2×2に分割した時の図である。各領域は同じ面積である必要はなく、コロニーの形成を検出しない場合は、分割しなくともよい。分割した個々の領域に対して細胞間隔計測処理67を実行する。

細胞間隔計測処理67では図5に示すように画像上に計測ライン52を設定し、計測ライン52に沿って隣り合う細胞の間隔、細胞間隔51を計測する。図5ではX方向の計測ラインを用いているが、任意の傾きを持つ直線あるいは曲線を計測ラインとして用いてもよく、複数の計測ラインを用いることが精度向上のために望ましい。さらに細胞画像処理61を培養器上の複数の点で実行し、複数の点で細胞間隔が指定した値を下回ったときに継代・回収するのが望ましい。

図6はコロニーが形成されたときの画像で、分割領域の左上、右上、左下、右下の細胞間隔はそれぞれ49、21、42、13ピクセルとなり、画像の右半分、特に右下の領域がコロニーを形成していることを示している。

図7は培養中の細胞間隔の変化をグラフにしたものであり、細胞の増殖は細胞間隔と相関関係があり、増殖曲線のように経時的にデータを収集しなくても、継代、培養終了の判定が可能であることを示している。

本発明の細胞培養装置を示す模式図。本発明の操作端末のブロック図。本発明の恒温槽を示す斜視図。本発明の処理フローチャート。本発明の細胞間隔計測図。本発明のコロニー形成の画像。本発明の培養日数と細胞間隔のグラフ。

符号の説明

１１細胞培養装置、１２モータコントローラ、１３カメラ駆動装置、１４培養器駆動装置、１５カメラ、１６対物レンズ、１７培養器

Claims

細胞培養中に培養器内の細胞を撮影する撮影手段と、該撮影された細胞画像情報に基づいて隣り合う細胞の間隔を計測する計測手段と、を備え、
前記計測手段は、前記細胞画像情報に、計測ラインを設定し、前記計測ラインに沿って隣り合う前記細胞の間隔を計測する細胞培養装置。
前記細胞画像情報に対して、二値化処理を行う二値化処理手段と、
前記細胞画像情報にて、前記細胞部分の画素を部分的に削除して、前記細胞の中心を通る１画素の線を生成する細線化処理を行う細線化処理手段と、
を備えることを特徴とする請求項１記載の細胞培養装置。
前記細胞培養中に取得した細胞の疎密情報により、コロニーの形成を検出する手段を備えることを特徴とする請求項１または２記載の細胞培養装置。
前記検出手段は、前記細胞画像情報を分割し、分割された細胞画像情報毎に計測される前記細胞の間隔から、コロニーの形成を検出することを特徴とする請求項３記載の細胞培養装置。
前記検出手段は、コロニーの形成を検出する場合、分割された細胞画像情報毎に計測される前記細胞の間隔が、指定した値を下回るか否かを判別することで行う請求項４記載の細胞培養装置。