JP4700345B2 - 分子で被覆された電極のアレイとその製造 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、数本の異なる電極上に、被覆を形成することにより、数種類の異なる被覆分子を有するアレイ製造方法に関する。これらの方法により製造される分子のアレイにも関する。

発明の背景
分子を基礎とするナノテクノロジーの進展に直面する数多くの挑戦では、個々の分子対象物を直接組織化すること、ならびに制御して巨視的構造体に組み込むことが基本である。ある種の分子に特徴的で固有な、選択的自己組織化特性（例えば、相補的なＤＮＡ１本鎖の間で生じるワトソン−クリック固有塩基対形成）は、これらの挑戦に取り組むために活用される特性である。例えば、金のナノ粒子の規則的懸濁液は、まず短いＤＮＡオリゴヌクレオチドでナノ粒子を機能化し、次いで個々の粒子を連結するために相補的ＤＮＡを導入することで、分子鎖ハイブリッド化のように組織化した（Ｍｉｒｋｉｎ他、「Ａ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎｔｏ ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ナノ粒子を巨視的材料に合理的に組織化するＤＮＡを基礎とする方法）」、Ｎａｔｕｒｅ ３８２、６０７−６０９（１９９６））。この概念は主として、金属電極のアレイなど巨視的基材へのナノスケール要素の組込みに、取り掛かるのに利用される。特異的配列のアンカーオリゴヌクレオチドで各電極を機能化した場合、ナノスケールの要素を相補的オリゴヌクレオチドで機能化するなら、適切に組織化するであろう。

実際、高い空間分解能をもち、十分制御された方法での、異種分子単分子膜による表面の局所的パターン化能力は、分子エレクトロニクスおよびバイオテクノロジーへの応用（高密度ＤＮＡ発現分析および遺伝子解析を含む）、ならびにナノエンジニアリングにとって重要である。

しかし、適切なアンカー分子による電極アレイの選択的多層被覆は、電極がサブミクロンメートル隔てられている構造体上では未だ実証されておらず、この操作のナノスケール組織化への適用性を制限している。

オリゴヌクレオチドまたは他のアンカー分子を、表面へ局所的に導入するためには、いくつかの技術を利用できるが、分解能、速度、および相異なる電極を特異的に被覆する能力の条件を同時に満たすものは、これらにない。マイクロドロップ分配システムは、電極アレイの制御された多層被覆化に対する簡単な取り組み方法を提供するが、１０μｍより大きな空間分解能に限定される。マイクロマシンやマイクロコンタクトプリンティングは、数百ナノメートルの空間分解能を提供するが、多重被覆を行う能力に欠ける。超高分解能（１０分の数ナノメートル）がナノグラフティングで得られるが、この技術は速度が遅く、多重被覆を可能にする簡単な拡張性を欠き、複雑で高額な生産基盤を必要とする。最近、ナノグラフティング技術の変化したもの、ディップペン・ナノリソグラフィが報告されている。この技術は、アンカー分子で覆ったＡＦＭ（原子間力顕微鏡）のチップを、表面に描くペンのように使用する。この被覆技術の分解能はナノメートルスケールであるが、アンカー分子の高レベルの安定性と溶解性が求められる。

関心のあるチオール分子を含む水溶液に表面を浸すことにより、チオール化合物の単分子膜を金表面に形成できることが知られている。この自然の化学吸着プロセスの最中に形成する金−イオウ結合は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して約−１Ｖで還元的開裂を行い、電気化学的に脱着する。異なる官能基をもつ化合物も、金表面に単分子膜を形成し、電気化学的脱着を行う。同様にして、別の官能基をもつ分子の単分子膜を、別の表面上で組織化でき、そこからの電気化学的脱着もまた可能である。

電気化学的脱着は、「Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｌｏｃａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ（自己組織化単分子膜の局所性電気化学的脱着で形成される機能性タンパク質のパターン）」、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．，ｖｏｌ４７，Ｎｏ．１，２００１／Ｓｅｐ，ｐ．２７５−２８１にあるように、Ｗｉｌｈｅｌｍらによって応用されてきた。この著者らは、走査型電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）を使い、アルカンチオレート単分子膜を金電極上に形成し、巨視的なＳＡＭ被覆金電極の約５μｍ上方に配置した直径１０μｍの超ミクロ電極（ＵＭＥ）により、アルカンチオレート単分子膜の規定領域で、局所性電気化学的脱着を引き起こした。露出領域には、次に、ω位を機能化したチオールまたはシスタミンなどのジスルフィドを化学吸着できる。次いで機能性タンパク質を、単分子膜の変性領域にあるアミノ基と結合できる。この方法は、電極の上方にあるＵＭＥを使用した、１本の大きい電極の複数領域からの脱着に依存するので、分解能に制限があり、実際、空間分解能は約１０μｍに制限される。それはこのシステムでは、脱着を意図する領域の近接領域で、脱着が起きないように制御することが困難でありうることを意味する。

「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｎｔｏ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｒｒａｙｓ ｏｆ ｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｌａｓｅｒ ａｂｌａｔｉｏｎ（レ−ザーアブレーションによって作成される微視的金電極アレイ上への自己組織化単分子膜の電気化学的パターン化）」、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９９６，１２，ｐ．５５１５−５５１８に、Ｔｅｎｄｅｒらが別の技術を記述している。このグループは、独立してアドレスを呼び出せる金の微小電極アレイの使用を記述している。１つの技法には、全ての電極上に、（１−メルカプトウンデシ−１１−イル）ヘキサ（エチレングリコール）（ＥＧ_６ＳＨ）の単分子膜を吸着させることが含まれる。次に、脱着が必要な電極の電位を制御することで、交互するバンド電極から電気化学的脱着が起きる。このように露出したバンド上では、ヘキサデカンチオール（Ｃ_１６ＳＨ）の膜吸着が可能になる。こうしてＣ_１６ＳとＥＧ_６Ｓの単分子膜が交互するバンドが得られる。ＢＳＡ抗体のＣ_１６Ｓバンドへの非特異的吸着を行うと、ＢＳＡはその抗体に特異的に結合する。

ｎ個の独立してアドレスを呼び出せる微視的金エレメント上に、ｎ個の異なるω置換アルカンチオールのＳＡＭをパターン化するため、ＳＡＭの電気化学的脱着の拡張が「容易であるべき」とする記述もある。しかし、われわれは、このグループのこの分野での更なる刊行物を知らない。さらに、Ｔｅｎｄｅｒらが記述した方法を使って、示唆されたように、異なるエレメントからＥＧ_６ＳのＳＡＭを続けて取り除き、新しいアルカンチオールに曝すことは、後から導入するアルカンチオールにより、前のパターン化膜を汚染することになるであろうと考える。

したがって、２種類またはそれ以上の異なる分子のアレイを形成する方法であって、ナノスケールの分解能（異なる分子で被覆された領域間距離）を示し、個々にパターン化された領域で高純度を示す方法を提案することは、望ましいであろう。高速で都合よく実施できるこのような方法を提案することも、望ましいであろう。

発明の概要
本発明により、少なくとも２本の電極上に少なくとも２種類の異なる被覆分子を被覆形成する方法を提供するもので、この方法は、
（ａ）独立してアドレスを呼び出せる少なくとも２本の電極のアレイを準備し、
（ｂ）全ての電極上にマスキング分子膜を吸着させ、
（ｃ）全てではないが、少なくとも１本の電極からマスキング分子の脱着を電気化学的に起こして、第１組の露出電極を曝し、
（ｄ）第１被覆分子を、第１組の露出電極上に吸着させ、
（ｅ）マスキング分子に全ての電極を曝して、マスキング分子を全ての電極上に吸着させ、
（ｆ）第２組の電極からマスキング分子の脱着を電気化学的に起こして、第２組の露出電極を曝し、
（ｇ）第２被覆分子を第２組の露出電極上に吸着させることを含む。

われわれは、このプロセスが、ナノスケールの分解能で、高純度で多数の相異なる被覆分子による被覆アレイの形成を可能にする特長をもつことを見出した。特に、われわれは独立してアドレスを呼び出せる電極アレイを使用すると、（一つの電極の異なる領域から脱着を起こす）Ｗｉｌｈｅｌｍらが記述した方法より分解能がより高く、不要な脱着を回避するために電極の隣接領域への影響を制御できるという、著しい有利性をもつことを見出した。

ステップ（ｅ）は、本発明で特に重要である。これは、マスキング分子膜をもつ電極および被覆分子の吸着があった電極を含め、全ての電極上でマスキング分子の吸着が起きうる再保護化のステップである。われわれは、Ｔｅｎｄｅｒらが使わず示唆もしていないこのステップが、後のステップで既に被覆された電極上に、後の被覆分子が吸着するのを阻止し、汚染を最小化することを見出した。これによって異なる被覆分子による、高純度の多数被覆の提供を可能にする。

われわれは、異なる被覆分子で被覆され、ナノスケールの間隔を持つ電極アレイを、本発明により初めて製造できることを見出した。したがって、第２の態様では、少なくとも３組、好ましくは少なくとも５組、より好ましくは少なくとも１０組の独立してアドレスを呼び出せる電極で、各組にはそこに吸着する異なる被覆分子があり、電極間の最小間隔が９００ナノメートル以下、好ましくは１００ナノメートル以下、より好ましくは５０ナノメートル以下のものを提供する。

図面の簡単な説明
図１は、清浄化電極、被覆電極および露出電極のＣＶトレースを示す。
図２は、マスキング分子が選択的に脱着した電極アレイを示す。
図３は、本発明の方法による２本の電極間領域のＳＥＭ画像である。
図４は、本発明の方法により被覆された、さらに２枚の電極アレイを示す。

好ましい実施の形態の詳細な説明
本発明の方法は、少なくとも２本の独立してアドレスを呼び出せる電極のアレイの使用を必要とする。このようなアレイは知られていて、既知の方法で製作できる。１つの方法を以下に記述する。このアレイは、少なくとも１０本の、より好ましくは少なくとも２０本の、特に好ましくは少なくとも５０本の、独立してアドレスを呼び出せる電極を含む。

本発明の方法は、任意のスケールの電極に適用できるが、小さい、特に直径（最大寸法）がミクロン範囲（例えば５０μｍ未満）、好ましくはナノスケール、すなわちナノメートルの分解能をもつ電極の、アレイを提供するのに特に有用である。したがって、電極が９００ナノメートル以下、好ましくは５００ナノメートル以下、より好ましくは１００ナノメートル以下の直径を有するのが好ましい。

本発明の特に有用なことは、それが空間的に接近する電極の被覆を可能にしているという事実である。隣接電極間の最小間隔は、８０μｍ未満、好ましくは３０μｍ未満、さらには１０μｍ未満にすることができる。隣接電極間の最小間隔は、９００ナノメートル以下が好ましく、より好ましくは５００ナノメートル以下、さらにより好ましくは１００ナノメートル以下、最も好ましくは５０ナノメートル以下である。本発明の方法は、電極間の隔たりが２５ナノメートル未満の場合にも適用できる。この隔たりが、全ての隣接電極間の最小距離にあてはまることが好ましい。

電極は、電導性材料で形成される。金属性が好ましいが、たとえば炭素電極やシリコン電極など非金属性でもよい。金、銀、白金、銅およびアルミニウム、特に金が好ましい。
一般的には、全ての電極が同じ材料から形成されるが、本発明では、一部の電極を１つの材料で形成し、追加する１組または複数組の電極を異なる材料で形成することも可能である。

この方法のステップ（ｂ）では、マスキング分子膜が電極全てに吸着するが、標準的な方法で電極を洗浄した後が好ましい。１つの適当な洗浄方法を以下に記述する。

マスキング分子は電極の表面に吸着する。すなわちそれは、電極を形成する材料による形成表面への吸着が可能でなければならない。その分子は、マスキング分子単分子膜を形成するために、電極表面と結合形成できる官能基をもつのが好ましい。電極形成材料が、それと結合形成できる分子が存在するものであるように、電極を選択すべきことは当然のことである。

多様な表面と結合形成する多様な分子型が知られている。マスキング分子の例には、金および銀および他の金属の表面と、ならびにシリコン表面と結合形成ができ、このために吸着できる、チオール化分子がある。特に好ましい組み合わせは、金電極とチオール化マスキング分子である。適切なチオール化マスキング分子が知られていて、置換もしくは非置換のアルカンチオールが挙げられる。適切な置換基にはヒドロキシ基が含まれる。他のマスキング分子は、シリコン電極に吸着できるアルキル基を含むものである。

選択したマスキング分子は、電極が作られた材料と共同して、電気化学的に活性でなければならない。それは、この方法で使用する被覆分子の性質も考慮して、都合のよい条件下で吸着でき、電気化学的に脱着できなければならない。それは、適切な電位、特にこの方法で使用する、被覆分子に損傷を与えるほど高くない電位で、電気化学的に脱着するよう選択しなければならない。例えば、好ましいマスキング分子は、−１０Ｖ〜＋１０Ｖ、好ましくは−５Ｖ〜＋５Ｖ、より好ましくは−２Ｖ〜＋２Ｖの範囲の電位で、選択された電極から電気化学的に脱着する。負電位で電気化学的な脱着を行うマスキング分子が好ましい。

一般的にマスキング分子は、例えば５００未満、とりわけ２００もしくは１５０未満の比較的小さい分子量をもつ。さらに小さいマスキング分子は、後に論じる再保護ステップ（ｅ）での再保護化に、より効果的であるために好まれる。これらは密度の高い単分子膜を形成して、有利である。

マスキング分子は一般的に溶液、好ましくは水溶液で供給される。濃度は都合のよいように選択できるが、例えば０．１ミリモル〜１０ミリモル、好ましくは０．５ミリモル以上の範囲にある。

電極は、電極表面への分子の吸着を可能にする時間、マスキング分子と接触させる。その時間は、詳細な条件に依存することになるが、一般的には１８０分以内、好ましくは９０分以内である。

吸着ステップ（ｂ）の後では、電極全てにマスキング分子の単分子膜を形成する。
この方法のステップ（ｃ）では、予め決めた１組の電極から、マスキング分子を電気化学的に脱着することを含めることが欠かせない。これは、既知の方法によって、関係する電極の電位を制御することで行う。

第１組の電極を、第１マスキング分子を脱着させるために選択する。電極の全てではないが、少なくとも１つをこのように処理する。それらは、第１組の露出電極となる。

電気化学的脱着を要しない電極は、一般的には開放回路に保たれる。しかし、脱着を必要とする電極の及す作用を打ち消すために、それら他の電極の一部分または全ての、特に隣接電極である場合、その電位を制御できる。電極間の最小距離が２０ｎｍ以下の場合、特に有用である。

脱着は、希望する全分子の脱着を可能にする、適当な任意の時間実施できる。脱着時間は３００秒以内が好ましく、より好ましくは２４０秒以内である。

脱着を、ＡＣ電圧またはＤＣ電圧を作用させながら行うことができる。もしＡＣ電圧を選択する場合、電気化学的脱着が起きるのに十分な時間、吸着マスキング分子が電気化学的脱着電位を受けるのを確実にするように振幅と周波数が選ばれる。

ステップ（ｄ）では、第１組の露出電極に第１被覆分子が吸着する。これは、例えば分子量が５００以下の小分子でよい。しかしこの場合、被覆ステップ後に、ポリペプチドのような高分子を結合できる分子が好ましい。例えば、タンパク質と結合できるアミノ末端分子でもよい。

しかし、被覆分子は高分子であるのが好ましい。即ち、少なくとも８００の分子量を有するのが好ましく、より好ましくは少なくとも１０００、さらに好ましくは少なくとも１５００、最も好ましくは少なくとも３０００である。

高分子の好ましい種類は、オリゴヌクレオチド（例えば、５〜１５０塩基）である。これらは、例えば遺伝子スクリーニングのための、あるいは、分子エレクトロニクスに使用するなど、相補オリゴヌクレオチドで機能化されたナノスケール要素を指図通り組織化するアンカーヌクレオチドとして使用するための、多数の異なるＤＮＡストランドをもつアレイ（ＤＮＡチップ）を形成するのに使用できる。

別の高分子は、酵素などのタンパク質を含むポリペプチドである。これらは、例えばバイオセンサー応用分野で使用できる。たんぱく質およびオリゴペプチドは、ナノスケールの組織化応用分野で使用できる。

被覆分子は、電極が形成されている材料の上に吸着できる。したがって、電極は吸着性官能基で機能化できる。電極材料に適合するならば、適切な任意の官能基を使用できる。例えば、電極が金または銀、特に金の場合、チオール化被覆分子が好ましい。

第１被覆分子は、一般に溶液、好ましくは水溶液で供給される。濃度は適当に選択できるが、通常１〜１００ミクロモル、好ましくは５〜５０ミクロモルの範囲内にある。
吸着時間は、通常、第１マスキング分子の吸着に対して示した上記範囲内にある。

ある場合には、適当な配向を起こすために、吸着ステップ（ｄ）の最中にオリゴヌクレオチドおよびその他の被覆分子に電場を印加するのが好ましいこともある。ＤＮＡ誘起双極子と電場の相互作用の結果、ＤＮＡ分子が不均一電場で、電気泳動力および配向トルクを受けることが示されている。トルクおよび電気泳動力は、印加電場の大きさと周波数の関数である。本発明では、この効果を、吸着プロセスを補助し促進するのに使用できる。適切な電場が印加された場合、分子は電極に引き寄せられ、吸着に適する空間方位に配向する。この適用される場は、ＡＣ場またはＤＣ場である。ＡＣ場が好ましい。

このプロセスはまた、電気化学的脱着ステップの最中でも利用できる。配向を起こさせるために印加する電場は、電気化学的脱着を起こすための印加電圧に重ね合わすことができる。

ある実施形態では受動吸着を行うのが好ましいが、ある実施形態では、電極に吸着プロセスを加速するために電気化学的な電位（ＡＣまたはＤＣ）を印加するのが好ましい（すなわち、能動吸着）。吸着速度は、ある場合には、電気化学的電位を全く印加しない吸着である受動吸着の場合より２桁も高くなりうる。使用する場合、この種の電気化学的支援は、ステップ（ｄ）、すなわち、第１（およびその後の）被覆分子の電極への吸着に適用しても好ましいが、マスキング分子の吸着にも適用できる。

電気化学的脱着ステップ（ｃ）および吸着ステップ（ｄ）は、順番に実施するのが好ましく、つまり脱着を完了させてから、露出電極に被覆分子を接触させる。しかし、一部の応用分野では、電極が被覆分子と接触しているときに、マスキング分子の電気化学的脱着を含め、結果として二つのステップが同時に起きるのが好ましい。

本発明方法のステップ（ｅ）は、再保護化ステップである。全ての電極を第２マスキング分子に曝し、その結果第２マスキング分子が全ての電極に吸着する。この第２マスキング分子は、マスキング分子に付いて上記で論じたもののいずれから選択してもよいが、ステップ（ｂ）で使用したのと同じ分子が好ましい。この吸着ステップの条件は、ステップ（ｂ）に関連して、上記で論じたものから選択できる。

このステップの最中、マスキング分子は、被覆されたばかりの電極上で被覆分子の間に吸着すると考えられる。一般に、被覆分子の単分子膜は電極を完全には覆っていないし、被覆分子の単分子膜は幾分非連続的である。したがって、マスキング分子はこれらの電極を保護し、後のステップで異なる被覆分子が電極に吸着するのを阻止する。

第２組の電極と第２組の被覆分子に対するステップ（ｆ）と（ｇ）は、本質的にはステップ（ｃ）と（ｄ）の繰り返しで構成される。

第２被覆分子は、第１被覆分子に対して上記で論じた分子と同じ部類から選択するのが好ましい。それは、第１被覆分子とは異なる分子である。

次に、さらに別の組の露出電極を形成し、これらの組をさらに別のマスキング分子に曝すために、ステップ（ｃ）から（ｅ）が希望通りに繰り返す。

こうして、本発明の方法は、任意の組数の露出電極で、同数の異なる被覆分子をもつものを提供するために使用できる。ある場合には、全ての電極を異なる被覆分子で被覆したアレイも製造できる。

実施例
以下に記述するように、一連の向かい合ったサブ５０ｎｍ間隔の金電極を、既知のＵＶリソグラフィ／リフトオフ技術を使って、Ｓｉ／ＳｉＯ_２ウエハ上に作製した。このウエハを「ピラニア・エッチ」（Ｈ_２Ｏ_２３０％、Ｈ_２ＳＯ_４７０％）で１時間洗い、次いで脱イオン水、エタノール、再度脱イオン水中で完全にすすいだ。次に、６−メルカプト−１−ヘキサノール（ＭＣＨ）保護単分子膜による電極アレイ全体の被覆は、ウエハをＭＣＨの１ｍＭ水溶液に６０分浸漬して行った。図１で、被覆電極のＣＶトレース（実線）を、被覆前の清浄電極のＣＶトレース（点線）と比較する。被覆電極に対して約−１Ｖで観察された還元的脱着の特徴は、ＭＣＨ単分子膜の除去を示す。あらゆる電気化学的測定を、標準的な３電極構成を使い、１００ｍＭリン酸塩緩衝液中、ｐＨ１０、６２ｍＶ／秒の速度で行った。高純度白金線を対電極として使用した。全ての電気化学電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して記録されている。

特定の電極からＭＣＨ単分子膜の完全脱着を得るために、ほかの全ての電極を開放回路にして、電極にＡｇ／ＡｇＣｌに対して−１．４Ｖの電気化学的電位を２分間印加した。図１は、この操作の後のＣＶトレース（点線）を示すが、清浄表面のトレースと比べると、この特定電極上の単分子膜が、除去されたことを実証する。他の電極は、この脱着ステップの最中は開放回路に保たれて、影響を受けず、そのＣＶトレースは図１の実線に類似したままであった（表示していない）。すべてのトレースで観察された−１．２Ｖ未満での電流の大きな増加は、水素放出と関連する。
ＭＣＨ単分子膜が分子マスクとして働くことを実証するために、電極２、４、６からＭＣＨを選択的に脱着した電極アレイを図２に示す。配列がＣＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡ−チオールのチオール化オリゴヌクレオチドＸ（チオールは炭素Ｃ_６リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合する）を、ｐＨ８のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭおよびＮａＣｌ１Ｍ溶液に溶解して、最終濃度１０μＭにした。それから、ＭＣＨ分子マスクが電極１、３、５のみを覆っているこのアレイを、その水溶液に６０分間浸漬して、オリゴヌクレオチドを露出電極に化学吸着させた。

結合したオリゴヌクレオチドを検出するために、ならびにそれらが選択的な自己組織化特性をもつことを示すために、配列がＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧ−ビオチンであるビオチン化オリゴヌクレオチドＸの溶液（Ｘに相補的である）を電極アレイに９０分間作用させて、ビオチン化オリゴヌクレオチドを、表面に結合するオリゴヌクレオチド単分子膜とハイブリッド化させた。以下に記述する抗ビオチン抗体検出法を使い、ビオチン標識（および、それゆえにチオール化オリゴヌクレオチド）の存在が、色の局所的黒ずみにより検出された。このようなことが、ＭＣＨ単分子膜が除かれた電極２、４、６上で起きていることを図２が示す。われわれは、向かい合う電極間の間隙が図２の光学顕微鏡で解明するには余りに小さいが、その存在は、電極の着色ならびに間隙の設計位置を横切る色の急激な変化から推量できることに注目している。電極１および４の間の領域のＳＥＭ写真を図３に示すが、電極間の最も狭い距離は５０ｎｍよりかなり下回る。他の電極対も、似た寸法の間隙で乖離している（図示せず）。

図４は、電極１、３、５がチオール化オリゴヌクレオチドＹ（ＡＧＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣ−チオール）で被覆され、そのオリゴヌクレオチド単分子膜の保護能力を強化するためにＭＣＨ１ｍＭに６０分間浸漬された２枚の電極アレイを示す。次に、双方のアレイの電極２、４、６の上に残るＭＣＨを脱着して、チオール化オリゴヌクレオチドＸを被覆した。類似長さの二種類のチオール化オリゴヌクレオチドは、その内の片方が金表面に結合していて、交換速度は極めて小さいと予想されるので、この被覆ステップは、存在するＭＣＨ−オリゴヌクレオチド単分子膜に顕著な影響を与えない。続いて、双方のアレイを再びＭＣＨ１ｍＭに６０分間浸漬するが、これは、既に混合オリゴヌクレオチド単分子膜で被覆された電極上のオリゴヌクレオチド密度には、顕著な影響を及ぼさない。このアレイに、異なるビオチン化オリゴヌクレオチドを９０分間処理した。図４（ａ）のアレイはビオチン化オリゴヌクレオチドＹで処理したもの（Ｙに相補的な配列ＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴである）が、図４（ｂ）のアレイがビオチン化オリゴヌクレオチドＸで処理したものである。その後の抗ビオチン抗体法による検出で得られる色変化から、チオール化オリゴヌクレオチドＸおよびＹが希望する電極に結合することを確認でき、異なるオリゴヌクレオチドを選択的にサブ５０ｎｍ分離電極上に堆積させるのに、この技術を使用できることを実証している。われわれは、抗ビオチン抗体検出が、必要な被覆を達成していることを示すばかりでなく、結合したチオール化オリゴヌクレオチドがナノアセンブリ応用分野でアンカー分子として働くことができ、そのまま残して、相補的な相手とさらにハイブリッド化できることを示すことにも注目している。

電極アレイの作製
２段階のシャドー蒸発技法（Ｐｈｉｌｉｐｐ，Ｇ．，Ｗｅｉｍａｎｎ，Ｔ．，Ｈｉｎｚｅ，Ｐ．，Ｂｕｒｇｈａｒｄ，Ｍ．＆Ｗｅｉｓ，Ｊ．，“Ｓｈａｄｏｗ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂ １０ ｎｍ ｇａｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ（金属電極間にサブ１０ｎｍの間隙を作成するシャドー蒸発法）”，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．Ｅｎｇ．４６，１５７−１６０（１９９９））を使用して、Ｓｉ／ＳｉＯ_２ウエハ上に電極アレイを作製した。第１段階では、標準的なＵＶフォトリソグラフィ、金属蒸発、およびリフト−オフ法によって、Ｎｉ／Ｃｒの１０ｎｍ接着層表面上に、３５ｎｍ厚のＡｕ層を含めて、３５μｍ間隔で向き合う一連の電極を作製した。第２段階では、このウエハを蒸発装置内で適当に傾けて、Ｎｉ／Ｃｒ５ｎｍを、その後Ａｕ１７ｎｍを、向き合う電極間を連結する帯状部分に堆積させた。しかし、ウエハが傾いているので、蒸発源の最も近くにある既存電極のエッジが蒸発ビームから表面を遮り、向かい合う電極間にサブ５０ｎｍの大きさの間隙が形成する。

ＤＮＡ検出
アレイの特定電極上に形成された特定オリゴヌクレオチド単分子膜を視覚化するために採用したプロトコルは、オリゴヌクレオチドハイブリッド化の比色検出法に基づく。チオール化されたオリゴヌクレオチドＸおよびＹに相補的な配列をもつビオチン化オリゴヌクレオチド（ＸはＴＣＴＴＧＴＴＧＴＴＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧ−ビオチン、およびＹはＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴ−ビオチン）を、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ（ＴＥ溶液）およびＮａＣｌ１Ｍに溶解して、最終濃度を２．５μＭとする。ビオチン化したオリゴヌクレオチドの適当な溶液を、室温で９０分間電極アレイに作用させ、表面結合した相補的チオール化オリゴヌクレオチドとハイブリッド化させる。ビオチン化オリゴヌクレオチド溶液をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）ですすぎ、さらに数回の洗浄ステップの後、ＴＢＳ／ツゥイーン２０中で、アルカリホスファターゼと複合化する単一クローン性抗ビオチン抗体を１：１０００に稀釈した液に、電極アレイを６０分間浸漬した。この電極アレイを、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムの溶液に浸漬すると、アルカリホスファターゼが存在する箇所で、したがってビオチン化オリゴヌクレオチドが電極アレイにハイブリッド化している箇所で、色の局所的な黒ずみが起きる。全てのオリゴヌクレオチドはＭＷＧバイオテックＡＧ（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ）から購入し、全ての試薬はシグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。

図面の詳細な説明
図１：洗浄直後の露出したＡｕ電極（破線）、ＭＣＨ分子単分子膜で被覆したあとの同一電極（実線）、およびＭＣＨ単分子膜を脱着したあとの同一電極（点線）のサイクリックボルタモグラム。いずれのボルタモグラムも、６２ｍＶ／秒、１００ｍＭリン酸塩緩衝液中、ｐＨ１０で、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して測定し、−０．４Ｖからスタートした。上昇および下降掃引がそれぞれの場合に示されている。

図２：選択的に被覆された電極アレイ。矢印で示すように、向かい合う電極を隔てるサブ５０ｎｍの間隙が、幅広の電極と狭い電極の間の特徴的接合点で生じている。２、４および６と標識化された電極を、記述した選択的脱着技術を使って、オリゴヌクレオチドＸで被覆し、その後記述した抗ビオチン抗体検出スキームを使って着色した。電極間の色のコントラスト（電極２、４および６は、電極１、３および５より顕著に黒ずんでいる）は、極めて高い選択的被覆が、ナノメートルの大きさの間隙を横切って達成されていることを示す。狭い中央の帯状部分は、当初、金属層がより薄かったために、幅広の電極より黒ずんでいる。

図３：図２の電極１および４の接合領域の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。写真は抗ビオチン抗体検出プロセスの後に撮った。挿入部分は、主要写真中央部の拡大画面であり、間隙が５０ｎｍを著しく下回ることを示す。

図４：電極１、３および５は、オリゴヌクレオチドＹで被覆され、電極２、４および６は、オリゴヌクレオチドＸで被覆された電極アレイ。矢印は、向かい合う電極を隔てるナノスケールの間隙を指す。（ａ）アレイをビオチン化オリゴヌクレオチドＹで処理し、続けて抗ビオチン抗体検出プロセスにより電極１、３および５は黒ずみ、表面に結合するオリゴヌクレオチドＹの存在を確認する。（ｂ）アレイをビオチン化オリゴヌクレオチドＸで処理し、続けて抗ビオチン抗体検出プロセスにより電極２、４および６は黒ずみ、表面に結合するオリゴヌクレオチドＸの存在を確認する。

清浄化電極、被覆電極および露出電極のＣＶトレース図。 マスキング分子が選択的に脱着した電極アレイの図。 本発明の方法による２本の電極間領域のＳＥＭ画像の図。 本発明の方法により被覆された、さらに２枚の電極アレイの図。

Claims (20)

1. 少なくとも２本の電極上に、少なくとも２種類の異なる被覆分子を被覆形成する方法であって、前記方法が、
   （ａ）少なくとも２本の独立してアドレスを呼び出せる電極のアレイを準備し、
   （ｂ）マスキング分子の層を全ての電極上に吸着させて、
   （ｃ）前記マスキング分子を、全てではないが少なくとも１本の電極から電気化学的な脱着を起こして、第１組の露出電極を曝し、
   （ｄ）第１被覆分子を第１組の露出電極上に吸着させ、
   （ｅ）全ての電極をマスキング分子に曝して、マスキング分子を全ての電極上に吸着させ、
   （ｆ）第２組の電極からマスキング分子の電気化学的脱着を起こして、第２組の露出電極を曝し、
   （ｇ）第２被覆分子を、第２組の露出電極上に吸着させること、
   を含む方法。
2. アレイが少なくとも１０本の、独立してアドレスを呼び出せる電極を含む請求項１に記載の方法。
3. アレイが少なくとも５０本の、独立してアドレスを呼び出せる電極を含む請求項２に記載の方法。
4. 少なくとも１０組の異なる電極上に少なくとも１０種類の異なる被覆分子を被覆形成するために、ステップ（ｃ）から（ｅ）を少なくとも８回繰り返すことを含む請求項１または請求項２に記載の方法。
5. 各電極の直径が５０μｍ以下である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 各電極の直径が９００ｎｍ以下である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
7. 各電極の直径が５００ｎｍ以下である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
8. 電極間の隔たりが３０μｍ以下である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 電極間の隔たりが９００ｎｍ以下である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
10. 電極間の隔たりが１００ｎｍ以下である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
11. 電極が金属電極であり、マスキング分子および被覆分子がチオール化されている請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 被覆分子が、少なくとも５００の分子量を有する高分子である請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 被覆分子が、少なくとも１０００の分子量を有する高分子である請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
14. 被覆分子が電極に吸着できるチオール化オリゴヌクレオチドである請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
15. オリゴヌクレオチド被覆分子に相補的なオリゴヌクレオチドで機能化されたナノ粒子を用意すること、および前記相補的なオリゴヌクレオチドをハイブリッド化すること、をさらに含む請求項１４に記載の方法。
16. 被覆分子が電極上に吸着できるチオール化ポリペプチドである請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
17. 吸着分子の配向を起こすために、ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）および／またはステップ（ｅ）および／またはステップ（ｇ）で、マスキング分子および／または被覆分子にＡＣもしくはＤＣ電場を印加することを含む請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
18. 電極からの脱着を阻止するために、ステップ（ｃ）および／または（ｆ）で、脱着を要しない電極の電位を制御することを含む請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
19. ステップ（ｂ）および／またはステップ（ｄ）および／またはステップ（ｅ）および／またはステップ（ｇ）で、吸着が必要な電極に電気化学的ＡＣもしくはＤＣ電位を印加することを含む請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 少なくとも３組の独立してアドレスを呼び出せる電極をもつアレイであって、各組は吸着する異なる被覆分子を有し、電極間の最小間隔が９００ナノメートル以下であるアレイ。

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