JP4688203B2 - 脳卒中等における二次的な脳疾患事象におけるエイコサペンタエン酸（ｅｐａ）およびドコサヘキサエン酸（ｄｈａ）を使用した薬剤 - Google Patents

Description

本発明は、脳に血液を供給する動脈のアテローム性動脈硬化の症状を示す患者の二次的な脳疾患事象、特に脳卒中の予防における、ｎ−３ＰＵＦＡエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を使用した薬剤に関する。

魚または長鎖ｎ−３ポリ不飽和脂肪酸類（ＰＵＦＡ）、特にＥＰＡおよびＤＨＡなど、油の多い魚および魚油中で多く見られるものの消費が、西洋人中において心血管疾患を防止していることには、多くの疫学的な証拠が存在する。長鎖ｎ−３ＰＵＦＡは空腹時血漿中のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）濃度を低下させ、食後に脂血症性の反応を減少させる。食用魚油がアテローム性動脈硬化症を減少させることは既に動物モデルにより実証されているが、これは、脂質の低下、発育因子生産の減少、炎症の減少、またはこれらの効果の組み合わせによるものであろう。二次予防の研究では、既に心筋梗塞（ＭＩ）を患っている患者に対して長鎖のｎ−３ＰＵＦＡを投与することにより重要な利益が得られることが証明されているが、これはＥＰ−Ｂ−１１５２７５５に記載され請求されている。ｎ−３ＰＵＦＡは、突然死を減少させることに特に力があるが（ＥＰ−Ｂ−１１５２７５５参照）、これは脂質の大きな減少が見られなくても発生する効果である。この効果は、ｎ−３ＰＵＦＡがもつ抗血栓症および抗不整脈作用によると推測されてきた。その一方で、ｎ−３ＰＵＦＡが、その炎症に抗する働きによりアテロームプラークの安定化に寄与すると、我々は考えてきた。逆に、ｎ−６ＰＵＦＡリノレン酸は、ひまわり油など植物油中で見られるものであるが、炎症を促進しうるものであり、この場合、リノレン酸の摂取増大がプラークの不安定化に繋がっているのではないかという指摘がある。

我々の知る範囲では、ｎ−６またはｎ−３ＰＵＦＡがプラークの安定性に対してもつ効果を報告した研究は存在しない。Ｒａｐｐ等は（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１９９１年、第二巻、９０３−９１１頁参照）動脈内膜切除を受けることになっている患者に、手術前の一定期間、魚油を非常に高用量（一日につき４８グラムから６４グラム）で消費させる研究を実施したが、彼らは、手術により除去されたプラーク内のｎ−３ＰＵＦＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ； ２０： ５ｎ−３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ； ２２： ６ｎ−３）のレベルが、対照患者から除去されたプラーク内と比べ、非常に高いということを発見した。しかし、Ｒａｐｐ等は、プラークの構造に関する詳細については述べていない。
欧州特許 ＥＰ−Ｂ−１１５２７５５ Ｒａｐｐ等（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１９９１年、第二巻、９０３−９１１頁） Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００１年、７３巻、５３９‐４８頁 Ｓｔａｒｙ他著。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９５年、９２巻、１３５５‐７４頁 Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０００年、２０巻、１２６２‐７５頁

とりわけ、我々は、経口で魚油を投与された患者において、薄い炎症を起こした覆いではなく、より形のよい繊維性の覆いにより覆われたプラークの数がより多くなる傾向が見られること、さらに、プラークへのマクロファージの侵入がそれ程酷くないことをも発見した。周知の通り、アテローム性動脈硬化症によるプラークを破裂しやすくさせている特徴には、それが薄い線維性の覆いをもつことおよびマクロファージなど炎症細胞の数の増大が含まれる。頚動脈のプラーク内にマクロファージが存在することは、また、例えば脳卒中や一過性脳虚血発作のような、脳疾患事象の発生率増加と関連するものとして知られている。それゆえ、魚油の経口投与は、脳に血液を供給する動脈のアテローム性動脈硬化の症状をもつ患者の脳疾患事象、特に脳卒中を予防するのを助ける効果的かつ安全な方法を提供することにある。

したがって、本発明は、脳に血液を供給する動脈のアテローム性動脈硬化症の兆候を示す患者の脳にダメージを与えることを阻止するための経口用の薬剤の調合において、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡを使用することに向けられている。

本発明の好ましい実施例において、経口用の薬剤は、脳血管障害、一過性黒内障そして／または一過性脳虚血発作の症状を示している患者が脳卒中を起こすのを阻止するためのものである。

ここで我々は、本発明に導いた実験に基づく研究を、詳細に説明する。

[患者および方法]
[研究計画]
頚動脈血管内膜切除術を受けることになっている、換言すれば、脳に血液を供給する動脈のアテローム性動脈硬化の進行した症状を呈している患者で、実験参加に同意した者は、二重盲検法により、無作為にカプセルに入れて提供される三種類の油のうち一種類を受け取るようにされた。対照油は、パーム油と大豆油を８０：２０の割合で混合したものであって、この混合油の脂肪酸組成は、イギリス人の大人の平均的な食事の脂肪酸組成と合っている。その他の油は、ひまわり油およびＥＰＡ／ＤＨＡ含有の魚油であった。油の脂肪酸組成は、表１に掲載されている。カプセルにはそれぞれ、１グラムの油と１ミリグラムの(α‐トコフェロールが含まれていた。患者たちは、手術を受けるまでの間、一日に６カプセルの割合で消費しており、一日三回、食事毎に二つのカプセルを消費するように勧められていた。従って、提供された長鎖ｎ‐３ＰＵＦＡの量は、一日につき１．４グラムであった。提供されたリノレン酸の量は一日につき３．６グラムであったが、それは、この脂肪酸の摂取量が４０パーセント上昇したことを表している。

表１ 研究で使用されたカプセルの脂肪酸組成。

標本の大きさはＲａｐｐ他（Ａｒｔｅｒｉｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１９９１年、１１巻、９０３−１１頁）で述べられているプラークのリン脂質（ＰＬ）の脂肪酸組成を基に、本研究で採用されたＥＰＡ・ＤＨＡ服用量は１０から１５倍低いものである点に考慮しつつ、計算された。これを基準に、５０人という大きさの標本が、Ｐ ＜ ０．０５でのプラークＰＬ内のＥＰＡの１倍上昇を検出するのに必要であると計算された。脱落者比率が２０パーセントまで出ることを見越して、本研究では１８８人の患者が募集された。

研究に参加する際に、空腹時の静脈血標本がＥＤＴＡに取り入れられた。次いで患者たちは上述の形でカプセルの消費を開始し、７日間にわたり食物を計量して日記につけることを継続した。研究期間中、患者たちは投薬を継続し、食事を変更しないようにアドバイスされた。患者たちと規則正しく接触することで順守監視が促され、戻されたカプセルの個数を数えること、および、ＬＤＬ脂質分画の脂肪酸組成を測定することにより、評価された。条件に従うことが不可能だと報告した患者は（ｎ＝５）本研究参加を取りやめた。返却されたカプセル個数の計測により、いずれの治療グループにおいても順守が８５パーセント超であったことが示唆された。さらに、各血漿ＬＤＬ脂質分画中におけるＥＰＡの比率が、魚油を投与されたグループの患者の９０パーセント超において、全脂肪酸量１００グラム中で０．５グラム以上の割合で増加した。これらの所見は、各治療グループにおいて順守が少なくとも８５から９０パーセント成されたことを示す。

頚動脈プラークの外科的な切除は、患者が本研究に参加した後、一般的に７から１９０日たってから行われた。７日以内に外科手術を受けた患者は本研究から排除された。外科手術の前日の朝、空腹時の静脈血標本が、再度採られた。外科手術の際に、頚動脈プラークは採集され、洗浄処理された。次いでそれは、総頚動脈を起点に２ミリメートル幅の断面に切り分けられた。生化学分析用の切断面は液体窒素で冷凍された。組織学分析用の切断面はホルムアルデヒド中に固定され、次いでパラフィン蝋中に埋め込まれた。免疫組織化学分析用の切断面は最適切断温度の埋め込み媒体中で凍らされ（Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、スタンステッド、イギリス）、−７０度で保存された。

[習慣的な栄養摂取の分析]
摂取食品の日記は、ＦＯＯＤＢＡＳＥ（脳化学研究所、ロンドン、イギリス）の修正を使用しつつ習慣的な栄養摂取を知るために分析されたが、それは脂肪酸摂取の決定に有効であった。

[血漿脂質とリポ蛋白]
血漿中のコレステロールおよびトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の全濃度は、市販されている比色分析検定器（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ株式会社、プール、イギリス）を使用して決定された。低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）は、１．７ミリリットルの血漿（固形臭化カリウムを加えることにより１．２４グラム／ミリリットルの濃度に調整された）を３．３ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水の下に層を形成させ、次いで密封管内で１００、０００ｒｐｍの速さで２時間、摂氏１５度で、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ超遠心分離機のＢｅｃｋｍａｎ ＴＬＡ‐１００．４ローター中で遠心分離して形成された二段階の密度勾配上の血漿から調整された。精製ＬＤＬは、脂肪酸組成分析のために、−７０度で冷凍された。

[脂肪酸組成分析]
ＬＤＬのＰＬ、コレステリルエステル（ＣＥ）、およびＴＡＧ分画、および頚動脈プラークの分岐に最も近い冷凍断片の脂肪酸組成が、決定された。全脂質が抽出され、薄層クロマトグラフィーにより脂質分画が分離され、各分画の脂肪酸組成が、Ｔｈｉｅｓ他により記述された（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．２００１年、７３巻、５３９‐４８頁）ガス・クロマトグラフィーにより決定された。

[頚動脈プラークの形態]
パラフィンに埋め込まれた断片は、ヘマトキシロンおよびエオシンにより染色された。分岐に最も近い位置の断片は、米国心臓病協会の出版したガイドライン（Ｓｔａｒｙ他著。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９５年、９２巻、１３５５‐７４頁）およびＶｉｒｍａｎｉ他によって提案された本システムの修正（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０００年、２０巻、１２６２‐７５頁）の双方を使用して分類された。断片は心臓血管病理学者（ＰＪＧ）により、順不同に、患者に関する情報を提供すること無しに検査された。米国心臓病協会（ＡＨＡ）の分類には以下の６の級、またはタイプ、すなわち、タイプＩ（初期障害）；タイプＩＩ（早期障害または脂肪皺）；タイプＩＩＩ（中間障害または前アテローム）；タイプＩＶ（アテロームまたはアテローム斑）；タイプＶ（線維アテロームまたは線維障害）；タイプＶＩ（表層異常および／または出血および／または血栓堆積を伴う障害）を含む。Ｖｉｒｍａｎｉ他により提案された本分類の修正は、以下のような重大性の増大を示す記述による一連の等級わけ、すなわち病理学的内膜厚増大（基質中の滑らかな筋肉細胞が、細胞外脂質蓄積の領域を伴うが、壊死や血栓はみられない）；線維性被覆のアテローム（形の良い壊死した核があり、その上を繊維が覆っている。血栓はない）；薄い線維性被覆のアテローム（マクロファージおよびリンパ球が侵入した薄い繊維性被覆、筋肉細胞が滑らかなのは稀で、壊死した核が下にある。血栓はない）；糜爛（管腔血栓症）；プラーク破裂（破裂した線維性アテローム。壊死した核に管腔血栓が通じている）；石灰小結節および線維石灰性プラーク（発疹性石灰化）を含む。

[頚動脈プラークの免疫組織化学]
分岐に二番目に近いプラークの区域は、免疫組織化学検査に使用された。区域はマクロファージ（表面にＣＤ６８が存在することにより識別された）およびＴリンパ球（表面にＣＤ３が存在することにより識別された）の存在、および、二種類の接着分子、つまり導管細胞接着分子‐１（ＶＣＡＭ‐１）および細胞間接着分子‐１（ＩＣＡＭ‐１）を検出するために染色されたが、それらは、免疫細胞のプラーク中への運動と関連している。冷凍プラークの低温保持された区域は有機シラン化合物を上塗りした顕微鏡用スライドに載せられた。内因性のペルオキシダーゼ活動は阻止され、次いで区域は順次、異なる抗ヒト抗体の最適希釈液、つまりビオチン化した山羊の抗マウス（ＶＣＡＭ−１を染色するためのブタ抗山羊）免疫グロブリンG（ＤＡＫＯ、イーリー、イギリス）およびストレプトアビジンーホースラディッシュ・ペルオキシターゼ（ＤＡＫＯ、イーリー、イギリス）を使用して培養された。最後に、ペルオキシダーゼ活動は、基質として過酸化水素、色原体として３‐アミノ‐９‐エチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ株式会社、プール、イギリス）を使用して可視化された。染色された区域はホルマリンを使用して固定化され、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンを使用して対比染色され、そして、顕微鏡を使用して１０倍の倍率で観察された。使用された一次抗体は、マウス抗ヒト抗体ＣＤ３（Ｌｅｕ ４、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、オックスフォード、イギリス）、マウス抗ヒト抗体ＣＤ６８（ＫＰ１、ＤＡＫＯ、イーリー、イギリス）、マウス抗ヒト抗体ＩＣＡＭ‐１（Ｒ( Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、オックスフォード、イギリス）および山羊抗ヒト抗体VＣＡＭ‐１（Ｒ ( Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、オックスフォード、イギリス）であった。染色は、０（染色なし）、１（中程度の染色）、または２（濃い染色）に分類された。

[統計的分析]
本研究を完了した患者に関してのみ、データは示されている（参照グループでｎ＝５７、ひまわり油グループでｎ＝５２、及び魚油グループでｎ＝５３）。異なる治療グループ間での、年齢、肥満度指数（ＢＭＩ）、研究開始時の血中脂質度、病歴、薬剤の使用および習慣的な栄養摂取は、単一要因分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して比較された。血中脂質濃度およびＬＤＬ脂質分画の脂肪酸組成に対する治療の効果は、ベースライン値からの変化として判定された。異なる治療グループ間でのベースラインからの変化は、ベースライン値および治療の継続期間を共同変量として使用して単一要因共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）により比較されたが、この時、治療の効果が顕著である場合にはスチューデントｔ‐検定を使ってグループ相互の違いを同定した。幾つかの事例では、治療後の値は、対応のあるスチューデントｔ‐検定により同一の治療グループ内でのベースライン値と比較され、また、事後のスチューデントｔ‐検定により、単一要因分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、治療後の値は治療グループ間で比較された。異なる治療グループ間において、頚動脈プラーク脂質分画の脂肪酸組成は、共同変量として油による治療の持続期間を使用し単一要因共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を使用して比較され、この際、治療の効果が顕著である場合にはスチューデントｔ‐検定を使ってグループ相互の違いを同定した。染色強度（免疫組織化学）およびプラークの形態の分布は、カイ自乗検定を使用して治療グループ間で比較された。各治療グループ内における各分布の平均値の等級が決定され、これらはヨンキー・テラプストラ検定により比較された。相関関係は、スペルマン相関係数（ρ）として決定された。全ての分析は、ＳＰＳＳバージョン１１（ＳＰＳＳ、シカゴ、イリノイ州、アメリカ）を使用して執り行われ、全ての事例において、Ｐ ＜ ０．０５の数値は統計的有意差を示すものとみなされた。

[結果]
[患者の特質]
１８人の患者が本研究から離脱したが、１３人は臨床的な理由からであり、５人は本研究の手続きに従うことができなかったからであった。さらに８人の患者が研究から除かれたが、それは、彼らが研究開始から７日以内に外科手術を受けたからであった。

本研究に最後まで参加した患者の特質は、表２に示されている。研究登録時に、治療グループ間において、性別比率、年齢、ＢＭＩ、空腹時の血漿ＴＡＧおよびコレステロール濃度、エネルギーおよび個々の脂肪酸を含む個々の主要栄養素および微量栄養素の摂取、喫煙者／元喫煙者の人数比、病気になった頚動脈の狭窄の程度、病歴および医薬品の使用という点に関して、重大な差異は認められなかった（全てのＰは、少なくとも０．１４３８超である。単一要因分散分析（ＡＮＯＶＡ））（表２参照）。各グループは、同じ期間だけ補足的な油を摂取した（表２参照）。ひまわり油グループの患者は一日につき３．６グラムのリノレン酸を余分に摂取したが、この脂肪酸の消費量は約４０パーセント上昇した。魚油グループの患者は一日につき１．４グラムの長鎖のｎ‐３ＰＵＦＡを余分に消費したが、ＥＰＡの摂取量は、およそ１０倍に、そしてＤＨＡの摂取量はおよそ４倍に上昇した。

表２ 研究登録時の患者の特質。

年齢、ＢＭＩ、血中脂質および栄養摂取のデータは、平均値(標準偏差を示す（年齢とＢＭＩ範囲は括弧内に示されている）。
狭窄に関するデータは、中央値とカッコ内に示された２５番目および７５番目の百分順位の値。
油治療期間の長さに関するデータは、中央値とカッコ内に示された１０番目および９０番目の百分順位の値。
（注１）このデータは、７日間にわたり食べたものの重さを記録した日記を元に計算されている。
（注２）元喫煙者の大半は、本研究登録の３年以上前に、喫煙を止めている。
（注３）脳卒中のことである。
（注４）一時的な、部分的または完全な失明のことである。

［血漿中脂質濃度］
血漿中のコレステロール濃度に対して、有意な治療の効果は見られなかった（データは示されていない）。しかし、血漿中のＴＡＧ濃度に関しては有意な効果が見られた（Ｐ＝０．０１８４；単一要因共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ））。魚油の投与は、血漿中のＴＡＧ濃度の有意な減少をもたらしたが（−０．４８±１．０６ｍｍoｌ／Ｌ）、この値は、他のグループでは有意な変化は認められなかった。従って、血漿中のＴＡＧ濃度は、ベースライン値（Ｐ＝０．００３２；対応のあるスチューデントｔ―検定）と比べて、魚油による治療後、有意に低かった（１．２±０．８ｍｍoｌ／Ｌ）。さらに、治療終了時の魚油グループの血漿中ＴＡＧ濃度は、他の二グループにおけるそれと比べ、有意に低かった（参照グループに対してＰ＝０．０２９４ 及びひまわり油グループに対してＰ＝０．０３４７。単一要因分散分析（ＡＮＯＶＡ））。魚油を使用した治療期間の長さと血漿中ＴＡＧ濃度の変化の間には、有意な一次相関が存在した（(＝−０．４４、Ｐ＝０．０１１８）。

［ＬＤＬ脂質分画の脂肪酸組成］
ＬＤＬ ＰＬ、ＣＥそしてＴＡＧにおける幾種類かの脂肪酸の比率に対して、有意な治療効果があった。魚油治療後、三つのＬＤＬ脂質分画全てにおいてＥＰＡおよびＤＨＡの比率が上昇した（表３）。これらの比率はベースラインと有意に異なっており（各分画のＥＰＡに対しＰは０．０００１未満、ＣＥ中のＤＨＡに対してＰは０．００３１、ＰＬおよびＴＡＧ中のＤＨＡに対してＰは０．０００１未満；対応のあるスチューデントｔ−検定）、治療後の他の二グループにおける比率とも有意に異なっていた（少なくともＰ≦０．０００３；単一要因分散分析（ＡＮＯＶＡ））。魚油グループにおけるＬＤＬ ＰＬ中の長鎖ｎ‐３ＰＵＦＡの比率上昇は、リノレン酸、ジ-ホモ-γ-(-リノレン酸（２０：３ｎ‐６）およびアラキドン酸（２０：４ｎ‐６）の比率の有意な減少を伴っていた。魚油グループにおけるＬＤＬ ＣＥおよびＴＡＧ中の長鎖ｎ‐３ＰＵＦＡの比率上昇は、リノレン酸とオレイン酸（１８：１ｎ‐９）のそれぞれの比率の有意な減少を伴っていた。ひまわり油による治療は、ＬＤＬ ＣＥ中のリノレン酸の比率増大という結果を生んだが、それは主にオレイン酸を犠牲にしてであった。これらの所見は、表３に要約されている。

表３ ＬＤＬ脂質分画の脂肪酸組成に対する油食餌療法の効果。

［頚動脈プラークの脂肪酸組成］
プラーク脂質分画のそれぞれにおけるＥＰＡおよびＤＨＡの比率およびプラークＰＬ中のリノレン酸比率に対して、有意な治療効果が存在した。魚油グループの患者の頚動脈プラークに含まれるＰＬ、ＣＥおよびＴＡＧ中でのＥＰＡ比率は、参照グループの患者（ＰＬ、ＣＥそしてＴＡＧのそれぞれにつき、Ｐ ＜ ０．０００１、０．００５３、及び０．０００７；単一要因共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ））、そしてひまわり油グループの患者（ＰＬ、ＣＥそしてＴＡＧのそれぞれにつき、Ｐ ＜ ０．０００１、０．０２７８そして０．００２４；単一要因共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ））のそれと比べ、高かった。プラークＰＬ中のＥＰＡ比率と魚油による治療期間の長さの間には大きな正の一次関係が存在した（(＝０．４１、Ｐ＝０．００５１）。魚油グループの患者の頚動脈プラーク中に含まれるＣＥおよびＴＡＧにおけるＤＨＡ比率は、参照グループの患者のそれ（ＣＥおよびＴＡＧのそれぞれに関してＰは０．００４２および０．０２４１；単一要因共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ））と比べ、高かった。さらに、魚油グループの患者の頚動脈プラーク中に含まれるＰＬおよびＣＥにおけるＤＨＡ比率は、ひまわり油グループの患者のそれ（ＰＬおよびＣＥのそれぞれに関してＰは０．０１００および０．０２７８；単一要因共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ））と比べ、高かった。魚油グループの患者のプラークに含まれるＰＬには、他の二グループのそれと比較すると低い比率のリノレン酸がみられた（参照グループに対して、Ｐは０．０１１８。ひまわり油グループに対してＰは０．００１５；単一要因共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ））。参照グループとひまわり油グループの間で、プラーク脂質分画中の脂肪酸組成に大きな変化は見られなかった。これらの所見は表４にまとめられている。
表４ 異なる油治療グループの頚動脈プラーク脂質分画中の脂肪酸組成。

データは、平均値±標準偏差である。
異なる上付きの文字によって示された一列内の値は、相互に有意に異なっている（治療期間の長さを共変量に使用した単一要因共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ））。

［頚動脈プラークの形態生理学的分類］
ＡＨＡ分類を使用して決定された障害形態の分布は、魚油を摂取した患者と、参照油またはひまわり油を摂取した患者との間で、有意に異なっている（参照油グループに対してＰは０．０２３４、ひまわり油グループに対してＰは０．０１０７；カイ自乗検定）。これは、魚油グループ中でタイプＩＶ障害（「アテローム」）の比率がより大きく、タイプＶ（「線維アテロームおよび線維性障害」）の割合がより低いためであると考えられる。各グループ中において中間的な治療期間よりも短く、または長く治療を受けた患者の障害タイプの分布を比較した。中間的な治療期間よりも短い治療を受けた患者のプラークに関しては、分布は、治療グループ間で有意の差はなかった。しかし、魚油の治療を中間的な治療期間よりも長く受けた患者の障害分布は、参照油グループおよびひまわり油グループ（それぞれ、Ｐは、０．０１１１および０．０４３２；カイ自乗検定）の双方において観察されたそれと、有意に異なった。全ての患者にわたり、ＥＰＡおよびＤＨＡ含有量は、タイプＩＶプラークで最大であり、タイプＶＩのプラークで最小だった。

修正ＡＨＡ分類を利用して決定された障害タイプ分布は、魚油を摂取した患者と、参照油またはひまわり油を摂取した患者の間で、有意に異なった（参照油グループに対しては、Ｐは０．０３４４、ひまわり油グループに対しては、Ｐは０．０３１３；カイ自乗検定）。この相違は、魚油グループにおいて、きれいな形をした線維性の覆いのある障害の比率がより大きく、血栓（線維性の覆いのあるアテローム）が不在であり、そして薄い、炎症を起こした線維性の覆いのある障害（薄い線維性の覆いのあるアテローム）の比率がより低かったためであろうと考えられる。

参照油グループとひまわり油グループの間で、プラーク障害タイプの分布に有意の差は見られなかった。これらの所見は、表５および６にまとめられている。

表５ 異なる油治療グループにおける頚動脈プラークの形態。

（注１）障害タイプ分布は、魚油グループと参照油グループ（Ｐは０．０２３４）の間で有意に異なり、また、魚油とひまわり油グループ（Ｐは０．０１０７）の間でも有意に異なる（カイ自乗検定）。
（注２）障害タイプ分布は、魚油グループと参照油グループ（Ｐは０．０３４４）の間で有意に異なり、また、魚油グループとひまわり油グループ（Ｐは０．０３１３）の間で有意に異なる（カイ自乗検定）。

表６ ＡＨＡ分類による頚動脈プラーク脂質中のｎ‐３ポリ不飽和脂肪酸含有量およびマクロファージ（抗ＣＤ６８）染色強度。

異なる上付き文字で示されたＡＨＡ分類値は、相互に有意に異なっている（単一要因共分散分析（ＡＮＯＶＡ））。
＊は、抗ＣＤ６８染色強度２は、染色強度１と異なっていることを示している（対応の無いスチューデントのt-test）。

［頚動脈プラーク中のリンパ球およびマクロファージ］
異なる治療グループの患者から採られたプラーク中のＩＣＡＭ‐１またはＶＣＡＭ‐１の存在に関して、違いは見られなかった（データは示されていない）。同様に、プラーク中のＴリンパ球の存在に関して、治療効果は見られなかった。対照的に、魚油を摂取した患者のプラーク断片は、マクロファージマーカーである抗ＣＤ‐６８でやや染色されにくく、このグループに関する染色点数の分布は他のグループと比べ、異なっており（参照油に対してＰ ＜ ０．０００１、ひまわり油に対してＰは０．００１６；カイ自乗検定）、染色強度の平均的ランクは有意に低かった（Ｐは０．０２４６）。魚油による治療期間の長さは、抗ＣＤ‐６８染色強度と有意に逆相関の関係にある（(＝−０．３５２、Ｐ＝０．０３０１）。平均的治療期間よりも短期間魚油を摂取した患者のプラークは、平均的治療期間よりも長期間治療を受けた患者のそれ（染色強度１は４７パーセント、染色強度２は５３パーセント）と比べ、より高い抗ＣＤ６８染色強度を示した（染色強度１は２５パーセント、染色強度２は７５パーセント）。しかし、これらの染色強度の分布には、有意な変化は見られなかった（Ｐは０．０８２７；カイ自乗検定）。各グループ中での、平均的治療期間よりも短期間または長期間治療を受けた患者からとったプラークの抗ＣＤ６８染色強度の分布を比較した。魚油グループで観察された分布は、参照油のグループ（平均治療期間よりも短期間の治療を受けた、または、長期間受けた患者グループの各々に対してＰ ＜ ０．０００１および０．００４８）、および、ひまわり油のグループ（平均治療期間よりも短期間の治療を受けた、または、長期間受けた患者グループの各々に対してＰ ＜ ０．０１０９および０．０３６３）双方のそれと有意に異なる（カイ自乗検定）。全ての患者に亘って、マクロファージが高度に浸透したプラーク（つまり、抗ＣＤ６８染色強度が２）は、軽度の浸透を受けたプラーク（つまり、抗ＣＤ６８染色強度１）と比べ、ＥＰＡおよびＤＨＡを非常に少なく含有する（表６）。

抗ＣＤ６８染色スコアまたは染色強度の平均的ランクの分布に関して、参照油グループとひまわり油グループの間に、有意な差は存在しなかった。

Ｔリンパ球およびマクロファージ染色の所見は、表７にまとめられている。

表７ 異なる油治療グループに属す患者の頚動脈プラークにおけるＴリンパ球およびマクロファージ染色。

（注１）染色スコアの分布は、魚油グループと参照油グループの間（Ｐ ＜ ０．０００１）で、および、魚油グループとひまわり油グループの間（Ｐ＝０．００１６）で、有意に異なる（カイ自乗検定）。
（注２）異なる上付き文字で示された、一列中の数値は、相互に有意に異なっている（Ｐ＝０．０２４６；ヨンキー・テラプストラ検定）。

［考察］
本研究において患者の食事にひまわり油を追加することは、一日当たり３．６グラムのリノレン酸を提供することだが、測定された結果に対して非常に限定的な影響しか与えなかった。これは恐らく、これらの患者が既に、習慣的な食餌においてかなりの量のリノレン酸を消費していたからであると考えられるが、この摂取量は、イギリスの大人に関して報告されているものとも一致する。われわれの所見では、少なくとも研究期間においては、進行した頚動脈アテローム性動脈硬化の被験者のリノレン酸摂取量が４０(まで増大すること、および、本脂肪酸を標準的な量消費することは、頚動脈プラークへのリノレン酸取り込みの増大に繋がらず、また、プラークの安定性変化に繋がるのでもなかったことを示した。

食餌に魚油を追加することは、血漿中ＴＡＧ濃度を有意に下げた。ＴＡＧ低下の程度は、魚油追加に関する他の研究で見られたものと一致しており、魚油を追加した期間の長さと関連していた。

ＥＰＡやＤＨＡのような長鎖ｎ‐３ＰＵＦＡは、通常、少量消費され、従って、血漿および組織内脂質中で比較的低い割合で見られる。しかし、これらの脂肪酸消費が増大したことは、ＬＤＬ脂質分画に関する本研究において観察されたように、さまざまな血液および組織内脂質滞留中でそれらの比率が増大したことからわかる。本研究の鍵となる所見とは、長鎖ｎ‐３ＰＵＦＡが少量消費されたとき、それらはアテローム硬化性プラーク脂質に即座に取り込まれるということである。プラーク脂質、特にＰＬにＥＰＡを取り込むことは、時間に対して一次的である。我々が知る限りでアテローム動脈硬化性プラークにおける脂肪酸組成に対する魚油補給の効果に関して検討した唯一の先行研究は、Ｒａｐｐ他による上記の研究のみだが、そこでは、大量の魚油を消費したとき、続けて、プラーク脂質中へのＥＰＡとＤＨＡの大量の取り込みが見られることが述べられていた。しかし、Ｒａｐｐ他は、プラークの形態に対するＥＰＡ／ＤＨＡ摂取の効果に関して吟味していなかった。本発明では、画期的な二次予防に関する研究（例えばＥＰ‐Ａ‐１、１５２、７５５参照）において使用された量と同程度に投与されたｎ‐３ＰＵＦＡが、プラーク脂質滞留に取り込まれていることを証明した。さらに、われわれが行ったような少量の投与程度であっても、ｎ‐３ＰＵＦＡの取り込みが比較的短い時間枠内で発生している。このことから、アテローム性動脈硬化プラークはかなり動的であり、ある程度の脂質の交替が、アテローム性動脈硬化がかなり進行した段階であってさえも見られることが示唆している。

免疫組織化学的染色およびプラークの形態の測定は、ｎ‐３ＰＵＦＡが大きな影響力をもつことを明らかにした。魚油グループでは、薄い炎症を起こした覆いではなくきれいな形をした覆いをもつプラークが、他の二グループのいずれと比較しても多く見られた。さらに、魚油による治療を受けた患者のプラークは、マクロファージによる侵入の程度が激しくなかった。本研究において魚油の追加の結果として観察されるプラーク形態の変化は、従って、より安定的なプラーク、つまり破裂の危険性がより低いものになったことを示している。これらの相違（つまり、マクロファージの侵入程度がより激しくないものとなり、きれいな形をした線維性の覆いに覆われたプラークの数が増大したこと）は、プラーク脂質中により大量のＥＰＡおよびＤＨＡが含有されたことと関連しており、ここから、プラークの安定性を決定するのがこれらのｎ‐３ＰＵＦＡであることが示される。

［薬剤の調合と投与の形態］
本発明では、薬剤の有効成分はＥＰＡ、ＤＨＡ、またはＥＰＡとＤＨＡの混合物である。これらのｎ‐３ＰＵＦＡ脂肪酸は、自然に発生するトリグリセリドの形で存在することもあり、また、薬剤としての受容可能な塩類または誘導体類、特にそれらのエチルエステル類または他のアルキルエステルの形をとることもある。

将来に他のＥＰＡおよびＤＨＡの原料が市販される可能性もあるが、活性成分は、適切な形で魚油から誘導される。薬剤となりうる品位の魚油を生の魚油から製造する方法、および、製品中にさまざまな濃度のＥＰＡおよび／またはＤＨＡを含有させる方法は、当業者には公知である。ｎ‐３ＰＵＦＡの摂取速度を速め、患者の薬剤服用順守を確実にするという観点から、魚油中のＥＰＡおよび／またはＤＨＡ濃度を高め、例えば毎日一つまたは二つのカプセルという形で、適切な服用量が与えられるようにすることが好ましい。活性成分として、ＥＰＡ・ＤＨＡの混合物を２０重量パーセントから１００重量パーセント含有する組成が使用されるのが好ましく、ＥＰＡとＤＨＡの混合物が７０重量パーセント以上含有される組成が使用されるのがより好ましく、ＥＰＡ／ＤＨＡ混合物が７０から９０重量パーセント含有される組成が使用されるのが最も好ましい。混合物中でのＥＰＡのＤＨＡに対する比率が大きな意味を持つとは考えられていないが、通常、ＥＰＡ：ＤＨＡの相対量が１：２から２：１であることが好ましく、およそ３：２であることがより好ましい。

薬剤の活性成分がＥＰＡとＤＨＡの混合物を含有することが好ましいが、本発明の範囲において、これらのｎ‐３ＰＵＦＡ酸のそれぞれを単独で使用することが記されている。本質的に純粋なＥＰＡまたはＤＨＡを調合する方法は公知であり、文献中に記載されている。

本発明の本薬剤は、経口投与用のものである。例えばマイクロカプセル封入により得られた粉末など、他の経口剤型も必要に応じて使用されうるが、経口剤型は、硬いまたはやわらかい殻を持つカプセルであるのが適切である。

本薬剤は、活性成分として定義されたＥＰＡおよびＤＨＡ活性成分に加え、一種類またはそれ以上の、当業者には公知の薬剤として使用可能な担体を含んでもよい。組成は、充填剤、安定剤、増量剤、結合剤、加湿剤、界面活性剤、潤滑剤その他をも、薬品組成を確定する技術において示されているように、含有してもよい。

さらに、例えばヒドロキシトルエン、ブチラート、キノン、トコフェロール、アスコルビン酸その他の酸化防止剤、防腐剤、着色剤、香料、人口甘味料および他の薬品成分も、使用されうる。酸化防止剤は、薬剤に関して特に好まれる選択的成分である。

［経口用の薬剤調合の実施例］
［一つのカプセルにつき１グラム入るソフトゼラチンカプセル］
組成：
ＥＰＡエチルエステル ５２５ ミリグラム／カプセル
ＤＨＡエチルエステル ３１５ ミリグラム／カプセル
ｄ‐( トコフェロール ４ 免疫単位／カプセル
ゼラチン ２４６ ミリグラム／カプセル
グリセロール １１８ ミリグラム／カプセル
活性成分および賦形剤は重量を測定され、高速攪拌機を使用して均一化された。混合物は次いで、コロイド・ミルにかけられ、カプセル充填の準備ができているステンレス鋼の容器中で脱気された。混合物は、サイズ２０長円形のソフトゼラチンカプセルに（平均重量１．４グラム）、通常のカプセル封入機を使用して充填された。

本発明の薬剤は、脳に血液を送る動脈のアテローム性動脈硬化の症状を示す患者に対して、あらゆる適切な服用量で投与されうるが、それは、ｎ‐３ＰＵＦＡが非常に高い服用レベルであっても本質的に無毒だからである。上述の試験投与では、服用量の管理は、全体で約１．４グラムのＥＰＡとＤＨＡが一日につき提供される形でなされたが、これがプラークの安定性を向上させるのに効果的であったことが示された。一般的に、投薬量は一日につきＥＰＡおよび／またはＤＨＡを０．５グラムから５．０グラムとなり、好ましくは一日につき１．０グラムから３．０グラムである。

本発明の薬剤は、脳に血液を供給している動脈のアテローム性動脈硬化の症状、例えば脳卒中や一過性脳虚血発作を示している患者に対して、さらなる、恐らくは命取りとなる発作の危険性を減少させる目的で投与されるのが適切である。この目標のため、本薬剤は他の治療剤、例えばアスピリンおよびワルファリンなど、そのような患者に二次的な脳疾患事象が発生する危険性を減少させるものとして知られるものと併用することもできる。

Claims (9)

1. ＥＰＡとＤＨＡの混合物または薬剤として使用可能であるそれらの塩または誘導体を用いた、一過性黒内障及び一過性脳虚血発作の両者またはいずれかの症状を示す患者の脳卒中を予防するための経口用の薬剤において、プラークの安定化のために一日のＥＰＡ及びＤＨＡの投薬量が、０．５グラムから５．０グラムの範囲となるように使用され、前記混合物中のＥＰＡのＤＨＡに対する比率が１：２から２：１の範囲であることを特徴とする薬剤。
2. 請求項１に記載の薬剤であって、前記比率が３：２であることを特徴とする薬剤。
3. 請求項１又は２に記載の薬剤であって、前記ＥＰＡおよびＤＨＡはエチルエステルとして存在することを特徴とする薬剤。
4. 請求項２又は３に記載の薬剤であって、前記薬剤が活性成分として前記混合物を２０パーセントから１００パーセントの範囲で含有することを特徴とする薬剤。
5. 請求項４に記載の薬剤であって、前記薬剤が活性成分として前記混合物を７０重量パーセントより多く含有することを特徴とする薬剤。
6. 請求項５に記載の薬剤であって、前記薬剤が活性成分として前記混合物を７０重量パーセントから９０重量パーセント含有することを特徴とする薬剤。
7. 請求項１から６の何れかに記載の薬剤であって、前記薬剤が、前記ＥＰＡおよびＤＨＡのための酸化防止剤をも含有することを特徴とする薬剤。
8. 請求項１から７の何れかに記載の薬剤であって、前記薬剤が、ＥＰＡ及びＤＨＡの投薬量が一日につき１．０グラムから３．０グラムとなるように投与されることを特徴とする薬剤。
9. 請求項１から８の何れかに記載の薬剤であって、前記経口用の薬剤がカプセルの形態をとることを特徴とする薬剤。