JP4684344B2 - ペプチドホルモンレセプターリガンドに関するアッセイ法およびその使用 - Google Patents

Description

発明の背景
本発明は、国立衛生研究所（National Institute of Health）助成金番号#DK46767の下、一部、政府の基金によって行われたものであり、そのため、政府は本発明において一定の権利を有する。

本発明は、ペプチドホルモンレセプターに対する作用物質である化合物を同定し、使用する方法に関する。

かなりの数の病気やその他有害な作用が、レセプター活性の異常により起きるため、ペプチドホルモンレセプターは、薬物研究の重要な標的となっている。目的のペプチドホルモンの一つである、コレシストキニン（CCK）は、二つの別個のレセプター、CCK-AおよびCCK-B/ガストリンを有するニューロペプチドである（Vanderhaeghenら, Nature, 257:604-605, 1975（非特許文献１）; Dockray, Nature, 264:568-570, 1976（非特許文献２）; Rehfeld,J. Biol. Chem., 253:4022-4030, 1978（非特許文献３）; Hillら, Brain Res., 526:276-283, 1990（非特許文献４）;Hillら, Neurosci., 10:1070-1081, 1990（非特許文献５）; Woodruffら, Neuropeptides, (Suppl.) 19:57-64, 1991（非特許文献６））。周縁型レセプターのCCK-Aレセプターは、不連続な脳核の中に存在し、ある種の生物においては、脊椎に存在し、また、胆嚢収縮および膵臓の酵素分泌に関与する。CCK-B/ガストリンレセプターは、大脳皮質、小脳、基底核、および脳の扁桃体の中に最も豊富にあり、胃腸管、ECL細胞、ならびに腎臓細胞の中にも豊富に存在する。CCK-Bレセプター作用物質は、不安、パニック発作、痛覚脱失、および飽和を調節すると考えられてきた（Ravardら, Trends Pharmacol. Sci., 11:271-273, 1990（非特許文献７）; Singhら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:1130-1133, 1991（非特許文献８）; Farisら, Science, 219:310-312, 1983（非特許文献９）; Dourishら, Eur. J. Pharmacol., 176:35-44, 1990（非特許文献１０）; Wiertelakら, Science, 256:830-833, 1992（非特許文献１１）; Dourishら, Science, 245:1509-1511, 1989（非特許文献１２））。

Vanderhaeghenら, Nature, 257:604-605, 1975 Dockray, Nature, 264:568-570, 1976 Rehfeld,J. Biol. Chem., 253:4022-4030, 1978 Hillら, Brain Res., 526:276-283, 1990 Hillら, Neurosci., 10:1070-1081, 1990 Woodruffら, Neuropeptides, (Suppl.) 19:57-64, 1991 Ravardら, Trends Pharmacol. Sci., 11:271-273, 1990 Singhら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:1130-1133, 1991 Farisら, Science, 219:310-312, 1983 Dourishら, Eur. J. Pharmacol., 176:35-44, 1990 Wiertelakら, Science, 256:830-833, 1992 Dourishら, Science, 245:1509-1511, 1989

本出願人らは、ペプチドホルモンレセプターに特異的な作用物質、例えば、ペプチド、ペプトイド、または非ペプチド作用物質などを同定するための組織的なスクリーニング・アッセイ法を開発した。本アッセイ法は、リガンドの固有の活性を増幅できるペプチドホルモンレセプター、例えば、構成的な活性を有するペプチドホルモンレセプターが、レセプター特異的な作用物質を同定するためのスクリーニング用媒体として有用であるとの、本出願人らの認識に基づいている。対応するヒトの野生型におけるシグナル伝達活性の基礎レベルよりも高いシグナル伝達活性を有するレセプターは、逆作用物質によって誘導される、シグナル伝達活性の低下を検出するために一層有用である。いずれの場合にも、レセプターは、リガンドがヒトの野生型レセプターと相互作用して生じるシグナルと同じように、リガンドがそのレセプターと相互作用して生じるシグナルを増幅する。このように、レセプターのシグナル伝達を増幅することができる、レセプターの形状は、対応するヒトの野生型レセプターに対する正の作用物質および逆作用物質を効率的にスクリーニングする上で有用である。

したがって、本発明は、候補化合物がペプチドホルモンレセプターの作用物質であるか否かを判定するための方法を特徴とする。本方法において、作用物質の固有の活性を増幅させる、より大きなまたは増強された能力を有する形状のペプチドホルモンレセプター（以後、「強化レセプター」という）に、候補化合物を接触させる。強化レセプターのセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性を、候補化合物の存在下で測定して、候補化合物が存在しないところで測定した強化レセプターのセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性と比較する。セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性の変化は、候補化合物が作用物質であることを示している。例えば、セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性の上昇は、この化合物が、完全または不完全な正の作用物質のいずれかであることを示しており、セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性の低下は、この化合物が逆（「負の」ともいう）作用物質であることを示している。本方法は、同定された作用物質を、作用薬として有効な用量で哺乳動物に投与することによって、ペプチドホルモンレセプターに関係する生理学的障害を治療または予防するために作用物質を用いることをさらに含みうる。

「固有の活性」とは、レセプターを活性化することができる、すなわち、作用物質として作用することができるリガンドの能力を意味する。「増幅する」とは、リガンドが強化レセプターと相互作用するときに生じるシグナルが、同じリガンドが、例えば、野生型のヒト・レセプターなど、対応する非強化レセプターと相互作用するときに生じるシグナルよりも、正の作用物質に対しては高く、または、逆作用物質に対しては低くなることを意味する。本発明の目的にとって、「非強化レセプター」とは、目的のペプチドホルモンに対する、野生型のヒト・レセプターのことである。「対応する」とは、例えば、構成的に活性のある変異レセプターなどのような、別の形状をとる同型のペプチドホルモンレセプターを意味する。例えば、構成的に活性のある変異CCK-B/ガストリンレセプターに対応する野生型は、野生型CCK-B/ガストリンレセプターであり、ヒトのCCK-B/ガストリンレセプターは、ラットのCCK-B/ガストリンレセプターに対応するヒト型である。

本明細書において用いられる「作用物質」には、正の作用物質、例えば、完全もしくは不完全な正の作用物質、または負の作用物質、すなわち逆作用物質が含まれる。作用物質は、レセプターの活動を開始させるように、レセプターと結合する化学物質である。ペプチドホルモンレセプターについて、作用物質は、好ましくはセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性を変化させる。正の作用物質は、例えば、セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性などの、レセプターの活性を促進または上昇させる化合物である。「完全な作用物質」とは、レセプターを、活性の最大レベル、例えば自然の、すなわち内因性のペプチドホルモンによって誘導される活性レベルまで活性化できる作用物質を意味する。「不完全な作用物質」とは、完全な作用物質に比較して、固有の活性が低下した正の作用物質を意味する。本明細書において用いられる「ペプトイド」とは、ペプチドに由来する不完全または完全な作用物質である（Horwellら、Eur. J. Med. Chem., 30 Suppl.:537S-550S, 1995; Horwellら、J. Med. Chem., 34:404-14, 1991）。

本明細書において用いられる「逆作用物質」は、負の固有の活性を有し、逆作用物質の非存在下で測定した野生型レセプターのシグナル伝達活性と比べて、レセプターのシグナル伝達活性を低下させる。これに対して、本明細書において用いられる「拮抗物質」とは、レセプター活性を上昇させたり低下させたりする、作用物質の能力を阻害する化学物質を意味する。「完全な」または「完璧な」拮抗物質には、固有の活性はなく、レセプターの基礎活性に影響を与えない（図１）。ペプチド由来の拮抗物質は、本明細書における目的にとって、非ペプチドリガンドであると考えられる。

完全な作用物質、不完全な作用物質、逆作用物質、および拮抗物質の間の違いを説明する概略図が図１に示されている（また、Milliganら、TIPS, 16:10-13, 1995も参照のこと）。図１において、不活性状態Ｒと活性状態Ｒ^＊との間の平衡は、それぞれのレセプターによってさまざまであり、レセプターリガンドの存在によっても変化する。作用物質は、Ｒ^＊を安定化させることによって機能するが、逆作用物質は、Ｒを選択的に安定化させる。完全な作用物質（これらが平衡を右側に最大に動かすため、シーソーの最右端にある）と完全な逆作用物質（シーソーの最左端にある）との間には、リガンドの連続性が存在すると考えられる。拮抗物質は、平衡の位置を変えることはないが、支点の位置を規定する。拮抗物質とは、例えば、競合的または非競合的阻害物質である。

本発明に係るスクリーニングアッセイ法において有用なペプチドホルモンレセプター特異的なペプチドおよび非ペプチド作用物質の実例を、以下に述べる。非ペプチドリガンドには、ベンゾジアゼピンおよびその誘導体、例えば、アザビシクロ[3.2.2]ノナンベンゾジアゼピン（「L-740,093」；Castro Pineiroら, WO 94/03437；Castro Pineiroら, 米国特許第5,521,175号参照）が含まれるが、これらに限定されない。L-740,093 SおよびL-740,093 Rは、それぞれ、L-740,093のS-鏡像体およびR-鏡像体を指す。ペプチドホルモンレセプターが、CCK-AレセプターまたはCCK-B/ガストリンレセプターである場合には、有用なペプチド作用物質には、ガストリン（例えば、ガストリン-17の硫酸化型（「ガストリンII」）、もしくは非硫酸化型（「ガストリンI」）、またはガストリン-34の硫酸化型もしくは非硫酸化型）、またはコレシストキニン（CCK）（例えば、硫酸化CCK-8 （CCK-8s）、非硫酸化CCK-8 （CCK-8d）、CCK-4 、またはペンタガストリン）が含まれるが、これらに限定されない。CCK-B/ガストリンレセプターの完全な作用物質には、CCK-8s、およびより好ましくは、ガストリン（ガストリンI）が含まれるが、これらに限定されない。

強化されたレセプターは、必ずしもとはいえないが、それに対応するヒトの野生型レセプターの基礎活性より高い基礎活性を有する場合がある。対応する野生型レセプターの活性と比較した、強化レセプターの活性を測定するための方法は、以下に説明され、実証されている。強化レセプターの実例としては、例えば構成的に活性のある変異レセプターなどの、合成された変異レセプター；化合物の固有の活性を増強させる、正常な基礎活性を有するその他の変異レセプター；例えば、天然の構成的に活性なレセプターなど、増強されたレセプター活性により疾患の表現型を生じる変異レセプターなどの、天然の変異レセプター；ならびに、例えば、ラット、マウス、マストミス（mastomys）、ツメガエル、もしくはイヌのレセプター、またはその雑種変異体といった、対応する野生型ヒトレセプターよりもはるかに作用物質シグナルを増幅させる、構成的に活性なもしくは野生型の非ヒトレセプターが含まれる。

本発明に係るスクリーニングアッセイ法において有用なペプチドホルモンレセプターの、さらに別の実例には、以下のペプチドホルモンに特異的なレセプターが含まれるが、これらに限定はされない：すなわち、アミリン、アンギオテンシン、ボンベシン、ブラジキニン、C5aアナフィラトキシン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）、ケモカイン、コレシストキニン（CCK）、エンドセリン、エリスロポエチン（EPO）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ホルミルメチオニルペプチド、ガラニン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、糖蛋白質ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、レプチン、黄体形成ホルモン（LH）、メラノコルチン、ニューロペプチドＹ、ニューロテンシン、オピオイド、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、セクレチン、ソマトスタチン、タキキニン、トロンビン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管形成性腸管ペプチド（VIP）、およびバソプレッシン。強化レセプターは、例えば、インシュリンレセプターのように、膜通過ドメインを一つ有するペプチドホルモンレセプターも、さらに包含しうる。

本発明はまた、例えば、ペプチド、ペプトイドまたは非ペプチドリガンドなどの、リガンド中の作用物質活性を検出するのに適した型のペプチドホルモンレセプター、例えば、変異型のペプチドホルモンレセプターを単離する方法を特徴とする。本方法には、（a）第一のペプチドホルモンレセプターの機能的ドメイン領域を、第二のペプチドホルモンレセプターの、対応する機的能ドメイン領域と交換する段階、および（b）対応する野生型ヒトレセプターと比較した、第一のペプチドホルモンレセプターの作用物質シグナルを増幅する能力を測定する段階が含まれる。機能的ドメインは、細胞内ループ、細胞内ループに隣接した膜通過ドメイン部位、膜通過ドメイン、細胞内ループから離れたところにある膜通過ドメイン領域、または細胞外ループでもよい。野生型のヒトレセプターによる増幅レベルよりも高い、第一のペプチドホルモンレセプターによる増幅レベルは、第一のペプチドホルモンレセプターが、非ペプチドリガンドにおける作用物質活性を検出するのに適していることを示している。対応領域は、例えば、5個から10個のアミノ酸のブロックのように、1個から10個のアミノ酸でもよいし、または30個までの、もしくは100個までのアミノ酸長でもよい。第一および第二のペプチドホルモンレセプターは、好ましくは、異なるセカンドメッセンジャー経路に結合している。当業者は、ペプチドホルモンレセプターの、それぞれのアミノ酸のどれが、細胞外にあり、細胞内（細胞質）、またはレセプターの膜通過領域にあると考えられるのかを知っている。例えば、CCK-B/ガストリンレセプターの、細胞外、細胞内、および膜通過領域を、他のレセプターとの配列アラインメント（図２）、または親水性解析（Baldwin, EMBO J., 12:1693-1703, 1993）によって判定される。コンフォメーションレセプター模型作製については、さらに後述する。

非ペプチドリガンドにおける作用物質活性を検出するのに適した形状のペプチドホルモンレセプターを単離する別の方法には、（a）本来のアミノ酸を別のアミノ酸、すなわち置換アミノ酸に置き換えて、レセプターの一連の変異型を構築する段階、および（b）その結果できるペプチドホルモンレセプターの変異型の、作用物質シグナルを増幅することができる能力を、対応する野生型のヒトレセプターによる増幅レベルと比較して測定する段階が含まれる。ペプチドホルモンレセプターの変異型における増幅が、対応する野生型のヒトレセプターによる増幅レベルよりも大きいことは、変異型が、非ペプチドリガンドにおける作用物質活性を検出するのに適していることを示している。置換されたアミノ酸は、レセプターの細胞内ドメイン、もしくは、例えば膜通過ドメインの細胞内ドメイン側にある部分のような、レセプターの細胞内部位に隣接する膜通過ドメイン領域、または、例えば、細胞内ドメインの８もしくは10アミノ酸の中に位置することができる。置換アミノ酸は、各変異構築物における同型でもよいが、または、さまざまな型のアミノ酸をランダムに置換することができる。置換アミノ酸は、もとのアミノ酸と同じ電荷のものでも、異なる電荷のものでもよい。例えば、陰性のアミノ酸を陽性のアミノ酸と置き換えることができ、陽性のアミノ酸を陰性のアミノ酸と置き換えることもでき、または、陽性もしくは陰性のアミノ酸と、中性のアミノ酸を置き換えることもできる。好ましくは、置換アミノ酸は、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはセリンである。

さらに、含まれるのは、本明細書において開示されている、さまざまな変異ペプチドホルモンレセプターと、それらの各々の核酸コード配列である。本発明に係る変異ペプチドホルモンレセプターには、CCKーAレセプターMHA21/35、ならびに、変異CCK-B/ガストリンレセプターMH40（配列番号：9）、MH128（配列番号：10）、MH156（配列番号：11）、MH162（配列番号：12）、MH31（配列番号：17）、MH131（配列番号：18）、MH13（配列番号：20）、MH130（配列番号：21）、MH129（配列番号：22）、MH72が含まれるが、これらに限定はされない。プラスミド操作、保存、および細胞のトランスフェクトは、通常の技術を持つ当業者に既知の方法により行なうことができる。例えば、Ausubelら（編）、分子生物学における最新プロトコール（Current Protocol in Molecular Biology）、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク、1988、1995を参照のこと。

所定のペプチドホルモンレセプターに特異的な作用物質を同定するための効果的で迅速なアッセイ法によって、当業者は、さらなる薬学的研究のための先導化合物として用いるための作用物質を同定することができる。特に、体系的な化学修飾を行なうことができ、本発明の方法に従い、強化レセプターを用いて、それらの効果をさらに評価することができる。このような開発法にしたがって、ペプチドホルモンレセプターに関係する病気に対する治療に役立つように、新しい作用物質の固有の活性を最適化することができる。

拮抗物質とは反対に、特定のリガンドが、正の作用物質または逆作用物質として機能することがわかると、どのリガンド種が、所与の生理学的な効果を実現する可能性が最も高いか、または望ましくない副作用なしに生理学的な効果を実現する可能性が最も高いか同定するのが容易になる。このように、本発明は、さらに、ペプチドホルモンレセプターに関係する生理学的障害を治療または予防するための方法で、例えば、ヒトなどの哺乳動物に、ペプチドホルモンレセプターに作用物質として作用するリガンドを投与することを含む方法を特徴とする。リガンドは、ペプチドホルモンレセプターに作用物質として作用するのに有効な量、すなわち、完全もしくは不完全な逆作用物質、または、完全もしくは不完全な正の作用物質としての効果を有する量で投与される。ペプチドホルモンレセプターは、以下のペプチドホルモンのひとつに特異的なレセプターでありうるが、これに限定する必要はない：アミリン、アンギオテンシン、ボンベシン、ブラジキニン、C5aアナフィラトキシン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）、ケモカイン、コレシストキニン（CCK）（例えば、CCK-AまたはCCK-B/ガストリンレセプター）、エンドセリン、エリスロポエチン（EPO）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ホルミルメチオニルペプチド、ガラニン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、糖蛋白質ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、インシュリン、レプチン、黄体形成ホルモン（LH）、メラノコルチン、ニューロペプチドＹ、ニューロテンシン、オピオイド、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、セクレチン、ソマトスタチン、タキキニン、トロンビン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管形成性腸管ペプチド（VIP）、およびバソプレッシン。

逆作用物質は、例えば、構成的に活性のあるレセプターなどの、ペプチドホルモンレセプターの強化された基礎活性に起因する生理学的障害を治療または予防する上で特に有用である。例えば、逆作用物質は、例えば、天然のペプチドホルモンレセプターなどの、ペプチドホルモンレセプターの強化活性によって生じ、または継続もしくは悪化する新生物を治療するために有用である。実例としては、例えば、神経内分泌腺腫、ゾリンジャー-エリソン（Zollinger-Ellison）症候群、または胃カルチノイド腫瘍などの、CCK-B/ガストリン関連腫瘍；TSH関連腫瘍；多発性内分泌腺腫症I型；例えば、小細胞癌などの肺癌；例えば、CCK関連脳腫瘍などの脳腫瘍；例えば、副腎腫または腎細胞癌などの腎臓癌が含まれるが、これらに限定されない。作用物質は、例えば、ペプチドホルモンレセプターを発現している組織における腫瘍、例えば、膵臓、下垂体、もしくは副腎の腫瘍など、原発性腫瘍の治療に、特に有用である。

本発明の別の態様において、LHレセプターの逆作用物質は、性的早熟を治療または予防するのに有用な化合物であるかもしれず、FSHレセプターの逆作用物質は、不妊症を治療または予防するのに有用な化合物であるかもしれず、TSHレセプターの逆作用物質は、甲状腺腫を治療または予防するのに有用な化合物であるかもしれない。G-LP1レセプターの逆作用物質または正の作用物質は、肥満症、またはI型もしくはII型糖尿病などの糖尿病を治療または予防するのに有用な化合物でありうる。

非ペプチド作用物質はさらに、胃腸管に関係した障害、または、例えば、睡眠、不安、パニック、食欲調節、ストレス、もしくは痛みなどに関する障害、または、後述する障害を治療または予防する上で有用である。

生理学的障害を治療または予防する本発明の方法において有用な候補化合物は、例えば、ペプチド、ペプトイド、または非ペプチドリガンドなど、ペプチドホルモンレセプターに特異性をもって結合するリガンドであり、好ましくは非ペプチドリガンドである。候補化合物は、本明細書において開示されているスクリーニングアッセイ法によって、正のまたは逆の作用物質であることが示される。例示されている候補化合物には、ペプチド化合物（例えば、Horwellら、Eur. J. Med. Chem., 30 Suppl. :537S-550S, 1995; Horwellら、J. Med. Chem., 34:404-14, 1991を参照）、CCKのジペプトイド類似体（例えば、Horwellら、J. Med. Chem., 34:404-14, 1991を参照）、環状ヌクレオチド、および修飾アミノ酸（例えば、Dethloffら、Drug Met ab., 24:267-93, 1992を参照）、例えば[Bockら、J. Med. Chem., 33:450-55, 1990]に記載されている化合物などの、ベンゾジアゼピン誘導体、またはこれらの誘導体が含まれる。ペプチドホルモンレセプター作用物質活性を有するさらに別のベンゾジアゼピン誘導体が、以下の特許、および特許出願に記載されており、それらはそれぞれ、参照として本明細書に組み入れられる：欧州特許出願第167919号、欧州特許出願第284256号、欧州特許出願第434360号、欧州特許出願第434364号、欧州特許出願第434369号、欧州特許出願第514125号、欧州特許出願第51426号、欧州特許出願第514133号、欧州特許出願第508796号、欧州特許出願第508797号、欧州特許出願第508798号、欧州特許出願第508799号、欧州特許出願第523845号、欧州特許出願第523846号、欧州特許出願第559170号、欧州特許出願第549039号、欧州特許出願第667334号、国際公開公報第9211246号、国際公開公報第93032078号、国際公開公報第9308175号、国際公開公報第9307131号、国際公開公報第9317011号、国際公開公報第9319053号、国際公開公報第9308175号、国際公開公報第9413648号、国際公開公報第9403437号、国際公開公報第9611689号、および米国特許第5,521,175号。Henkeら、J. Med. Chem., 39:2655-58,1996;または、Willsonら、J. Med. Chem., 39:3030-34, 1996（どちらも、参照として本明細書に組み入れられる）において説明されている化合物で、逆作用物質であることが示された化合物も含まれる。

さらなる実例として、ペプチドホルモンレセプターに起因する生理学的障害を治療または予防する方法において有用なベンゾジアゼピン化合物は、下記の化学式（I）のベンゾジアゼピン化合物である：

式中、
R^１は、Hを表し、C_１−６アルキルは、選択的に1個以上のハロ（halo）、C_３−７シクロアルキル、シクロプロピルメチル、(CH_２)_ｒイミダゾリル、(CH_２)_ｒトリアゾリル、(CH_２)_ｒテトラゾリル（ここで、rは、1、2または3）、CH_２CO_２R^１１（ここで、R^１１は、C_１−４アルキル）、または、CH_２CONR^６R^７（ここで、R^６とR^７は、それぞれ独立に、HまたはC_１−４アルキルを示し、または、R^６とR^７は一緒に、pが4または5である、CH_２p鎖を形成する）で置換され、
R^２は、NHR^２または(CH_２)_ｑR^１３（ここでqは、0、1、2、または3である）を表し、
R^３は、C_１−６アルキル、ハロ（halo）、またはNR^６R^７を表すが、ここで、R^６およびR^７は、上記の通り定義される、

R^４およびR^５は、それぞれ独立に、H、NR^９R^９’（R^９およびR^９’は、上記の通り定義される）、または、アザシクリック基もしくはアザビシクリック基によって選択的に置換されたC_１−１２アルキル、1個以上のC_１−４アルキル基で選択的に置換されたC_４−９シクロアルキル、1個以上のC_１−４アルキル基によってシクロアルキル環の中で選択的に置換されたC_４−９シクロアルキルC_１−４アルキル、選択的に置換されたアリル、選択的に置換されたアリルC_１−６アルキル、またはアザシクリック基もしくはアザビシクリック基を表し、または、R^４およびR^５は共に、選択的に置換されたアザシクリック基もしくはアザビシクリック基環系の残基を形成し、
Xは、0、1、2、または3であり、
R^１２は、C_１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、C_１−４アルコキシ、テトラゾール環においてC_１−４アルキルで選択的に置換された(CH_２)_ｑ-テトラゾリル、(CH_２)_ｑイミダゾリル、(CH_２)_ｑ-トリアゾリル（ここで、ｑは、0、1、2、または3である）、5-ヒドロキシ-4-ピロン、NR^６R^７、NR^９COR^１１、NR^９CONR^９’R^１１（ここで、R^９およびR^９’は、それぞれ独立に、HまたはC_１−４アルキルであり、また、R^１１は、上記の通り定義される）、SO(C_１−６アルキル)、SO_２(C_１−６アルキル)、トリフルオロメチル、CONHSO_２R^８、SO_２NHCOR^８（ここで、R^８は、C_１−６アルキルであるが、選択的に、アリル、2,2-ジフルオロシクロプロパンまたはトリフルオロメチルで置換される）、SO_２NHR^１０（ここで、R^１０は、複素環を含む窒素である）、B(OH)_２、(CH_２)_ｑCO_２H（ここで、qは、上記の通り定義される）からなる群より選択される、1個以上の置換基によって選択的に置換されたフェニル基またはピリジル基を表し、または、R^１２は、下記の置換基を表す：

式中、X^１は、CHまたはNを表し、Wは、CH_２またはNR^９を表すが、ここで、R^９は、上記の通り定義され、かつ、W^１は、CH_２を表し、もしくは、W、およびW^１は、それぞれOを表し、または、
R^１２は、下記の置換基で置換されたフェニル基を表す：

式中、X^２は、O、S、またはNR^９であるが、R^９は上記の通り定義され；Zは、結合、O、またはSであり；ｍは、1、2、または3であり；nは、1、2、または3であり；かつ、yは、0、1、2、または3であり、
R^１３は、下記の置換基を表す：

式中、R^１４は、HまたはC_１−６アルキルを表し、R^１５は、H、C_１−６アルキル、ハロ、またはNR^６R^７を表すが、ここでR^６とR^７は、上記の通り定義され、かつ、点線は、選択的な共有結合を表し、また、NR^４R^５が、置換されていないアザシクリック環系を表す場合、R^２は、R^１２が、選択的に置換されたフェニルまたは下記の構造式である、NHR^１２ではないという条件で、薬学的に許容される塩またはそのプロドラッグ：

化学式（I）の化合物は、光学異性体およびその混合物を含む、すべての考えられるラセミ体および異性体を含むものである。各発現は、いずれの構造物においても、一回以上出現するが、同じ構造において明確な他の部位とは無関係であるものとする。本発明は、上記の化学式（I）の化合物のプロドラッグを、その範囲中に含む。一般的に、このようなプロドラッグは、必要とされる化学式（I）の化合物にインビボで容易に変換できる、化学式（I）の化合物の機能的な誘導体である。適当なプロドラッグ誘導体の選抜および調製のための常法は、例えば、H. Bungaard編、Elsevier社、1985の「プロドラッグの設計」で説明されている。

本明細書で用いられる場合、別の特記しない限り、アルキルは、直鎖または分枝鎖で飽和した炭化水素を意味し、ハロにはフロロ、クロロ、ブロモ、およびヨードが含まれ、本明細書で用いられる場合、別に特記しない限り、アルキルは、直鎖または分枝鎖で飽和した炭化水素を意味し、アザシクリックは、非芳香族の、窒素を含む単環を意味し、アザビシクリックは、非芳香族の、窒素を含む二重環を意味し、アリルは、選択的に置換された炭素環またはヘテロ環芳香族置換基、特に、フェニルを意味し、ヘテロアリルは、好ましくは、rまたは6員環分子をもち、かつ、O、SおよびNから選択される少なくとも１個の原子を含む、芳香環を意味する。化学式（I）の化合物は、参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第94/03437号の方法に従い調製される。

本発明に係るスクリーニングアッセイ法によって、当業者は、どの候補リガンドが治療または予防用途に最適であるかを、容易に同定することができる。例えば、好ましい作用物質と、それら各々の誘導体には、L-740,093 [3(R,S)-アミノ-1,3-ジヒドロ-5-((1S,4S)-5-メチル-2,5-ジアザビシクロ[2,2,1]ヘプタン-2-イル)-2H-1-プロピル-1,4-ベンゾジアゼピン-2-オン]、L-740,093 R [(-)-N-[5-(3-アザビシクロ[3.2.2]ノナン-3-イル)-2,3-ジヒドロ-1-メチル-2-オキソ-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-3-イル]-N'-[3-メチルフェニル]尿素、L-740.093 S [(+)-N-[5-(3-アザビシクロ[3.2.2]ノナン-3-イル)-2,3-ジヒドロ-1-メチル-2-オキソ-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-3-イル]-N'-[3-メチルフェニル]尿素、L-365,260 [3R(+)-N-(2,3-ジヒドロ-1-メチル-2-オキソ-5-フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-3-イル]-N'-(3-メチルフェニル尿素)]、およびL-364,718。

本発明のさまざまな態様において用いられる他の用語は、以下の定義から理解されると思われる。例えば、「ペプチドホルモン」とは、細胞外レセプター、すなわち、「ペプチドホルモンレセプター」と接触することによって、標的細胞と相互作用するポリペプチドを意味する。「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに結合しているアミノ酸残基の少なくとも一部を含む分子を意味するために、本細書において漠然と用いられる。「変異レセプター」は、自然界では優勢である対応するレセプター、例えば天然野生型レセプターの一つ以上のアミノ酸残基が、異なる種類のアミノ酸残基で欠失または置換されている形状のレセプターであると理解される。「構成的に活性のあるレセプター」とは、対応する野生型レセプターよりも高い基礎活性を有するレセプターを意味するが、ここで、「活性」とは、正の作用物質による一層の活性化がなくても、シグナル伝達する、レセプターの自発的能力を意味する。構成的に活性のあるレセプターの基礎活性は、逆作用物質によって低下させることもができる。「天然の」レセプターとは、動物の体内に存在するものと同じ形状もしくは配列のレセプター、または、「野生型」配列として、当業者には既知の配列と同義である形状のレセプターを指す。当業者は、「野生型」レセプターとは、従来から、レセプターの「野生型」アミノ酸コンセンサス配列であると認められているもの、または、リガンド結合およびシグナル伝達の正常な生理学的パターンを有する「天然」のレセプターを指すことを理解していると思われる。「セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性」とは、レセプターの活性化に応答する細胞内刺激（cAMP、cGMP、ppGpp、イノシトールリン酸、またはカルシウムイオンが含まれるが、これらに限定されない）の産生、または、レセプター活性化に応答する、キナーゼ、ホスファターゼを含むがこれらに限定されないタンパク質の活性化、または膜チャンネルの活性化もしくは阻害を意味する。

本明細書で用いられる「配列の同一性」とは、２つの核酸またはポリペプチド分子の間のサブユニット配列の類似性を意味する。例えば、２つのポリペプチドのそれぞれの所定の位置（配列アラインメントを行なう従来から既知の方法によって決定される）がセリンによって占められている場合など、２つの分子の両方における所定の位置が、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基によって占められていれば、それらは、その位置で同一である。２つの配列の間の同一性は、適合または一致する位置の数の直接の関数であり、例えば10個のうち9個が合致するなど、２つのポリペプチド配列における位置が90％一致していたら、この２つの配列は、互いに、90％の配列同一性を有するということになる。２つの比較配列の配列同一性を比較するために、配列を解析しアラインメントする方法は、当業者には周知である。本明細書で用いられる「生物学的活性」とは、ペプチドホルモンレセプターがリガンド、例えば作用物質または拮抗物質に結合し、シグナル伝達を誘導する能力を意味する。

本発明の、その他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかになると思われる。

本発明者らは、まず、図面について簡単に説明する。

図1は、完全または不完全な作用物質、逆作用物質、および拮抗物質の間の関係を示す概略図である。 図2は、クローン化されたCCKレセプターの推定アミノ酸配列のマルチプルアラインメントを示す図である：マストミス（mastomys）のCCK-B（配列番号：1）、ラットのCCK-B（配列番号：2）、ヒトのCCK-B（配列番号：3）、イヌのCCK-B（配列番号：4）、ヒトのCCK-A（配列番号：5）、ラットのCCK-A（配列番号：6）、およびツメガエルのCCK-XL（配列番号：7）。「A」は、EからQへの置換により、レセプターの基礎活性を上昇させることなしに、PD 135,158における固有の活性が上昇したhCCK-Aレセプター中の位置を示している。「B」は、LからSまたはEへの置換により、レセプターの基礎活性が上昇した、hCCK-Bレセプター中の位置を示している。hCCK-Aレセプターにおける対応するLからSへの置換は、基礎活性の上昇を引き起こさなかった。「C」は、VからEへの置換により、基礎活性が上昇した、hCCK-Bレセプター中の位置を示している。ヒトのCCK-Aレセプターにおける、対応するIからEへの置換は、基礎活性の上昇をもたらさない。表示した数字は、包括的なものであり、各レセプターは、欠失または挿入があるために異なっている。 図３は、野生型CCK-B/ガストリンレセプターにおける、ペプチドリガンド、ペプチド由来リガンド、および非ペプチドリガンドの固有活性（上図）を、構成的に活性のあるレセプター変異体（下図）において増幅したことを示す棒グラフである。 図4は、非ペプチド作用物質L-740,093によるイノシトールリン酸の産生を示す図である。上図：構成的に活性のあるヒトCCK-B/ガストリンレセプターを発現しているCOS-7細胞において、L-740,093 Sは、イノシトールリン酸産生を刺激した。下図：YM022は、10 nMのL-740,093-Sによって誘導される不完全な作用物質の活性を弱める。 図5は、非ペプチド逆作用物質L-740,093Rのイノシトールリン酸の産生の阻害を示す図である。上図：構成的に活性のあるヒトCCK-B/ガストリンレセプターを発現しているCOS-7細胞において、L-740,093Rが、基礎的なイノシトールリン酸産生を阻害する。下図：10 nMのL-740,093 Rによって誘導される逆作用物質の活性は、YM022によって、濃度依存的な様式で部分的に阻止される。 図6は、野生型レセプターおよび構成的に活性のあるレセプターを利用するCCK-B/ガストリンレセプターリガンドの固有活性を比較したものである。すべての化合物に対する値は、対数-直線相関に従っている（r2=0.93）。 図７は、^１２５I-CCK-8レセプター結合の程度を示す競合結合曲線である。CCK-8、ガストリンI、およびCCK-4（パートA）、ならびにL-364,718およびL-365,260（パートB）の濃度を上昇させたときの、hCCK-B-pcDNAIによって一過的にトランスフェクトされたCOS-7細胞への、^１２５I-CCK-8の結合が示されている。 図8は、カルシウムキレート剤EGTAを添加したとき（パートAの左パネル）と、添加しないとき（パートAの右パネル）の、組換えヒト脳CCK-Bレセプターを発現するCOS-7細胞における、セカンドメッセンジャーシグナル伝達（すなわち、細胞内カルシウムの移動）を示すグラフである。これを、イノシトールリン酸の産生の上昇を平行に並べた（パートB）。 図9は、ヒトCCK-B/ガストリンレセプターの7回膜通過（TM）ドメイン構造を表す概略図である。第三の細胞内ループのC末端ドメインを、黒で強調してある。 図10は、野生型CCK-B/ガストリンレセプター（WT）、または二つの構成的に活性のある変異体（Mut.1, Mut.2）の内の一つによってトランスフェクトされたCOS-7細胞における、イノシトールリン酸の基礎的な蓄積を示す棒グラフである。 図11は、ヒトCCK-A（hCCK-A）、ヒトCCK-B（hCCK-B）、イヌCCK-B（dCCK-B）、マウスCCK-B（mCCK-B）、およびマストミス（mastomys）のCCKレセプターなどの、CCKレセプターの機能比較を示す棒グラフである。 図12は、作用物質CCK-8、L-365,260、およびPD136,450が、野生型CCK-Aレセプターまたは構成的に活性のあるCCK-Aレセプター（MHA21/35）と接触したときに、イノシトールリン酸（IP）産生を刺激する効率の比較を示す棒グラフである。 図13は、不完全な正の作用物質であるペプトイドPD136,450のさまざまな濃度での、イノシトールリン酸（IP）応答のレベルを示すグラフである。■：変異CCK-AレセプターMHA21/35、▲：野生型ヒトCCK-Aレセプター。

最近の薬物開発努力によって、拮抗物質として作用することにより、G-蛋白質に結合したペプチドホルモンレセプターを競合的に遮断する小分子が得られた。これに対して、このレセプター族を活性化させる、非常に少ない非ペプチドリガンドが同定されている。ここにおいて、本出願人らは、CCK-B/ガストリンレセプターに対して拮抗物質として作用することが知られている非ペプチドリガンドの化学的修飾により結果としてこのリガンドが、拮抗物質から正の作用物質または逆作用物質に変換されることを明らかにする。

本出願人らは、ヒトCCK-B/ガストリンレセプター（^３２５L→E、MH162（配列番号：19））の構成的に活性のある変異体を用いたスクリーニングアッセイ法を設計したため、このような修飾の結果生じるリガンドの固有活性の変化を検出することができた。いくつかのペプチドリガンド、ペプトイドリガンド、およびベンゾジアゼピンをもとにした非ペプチドリガンドを、このアッセイ法で調べ、組換え野生型レセプターまたは構成的に活性のある変異レセプターそれぞれを活性化させる能力を評価した。完全に正の作用物質は、ペプチド作用物質CCK-8の固有の活性と比較すると、どちらのレセプターにおいても同様のシグナル伝達効果を持っていた。アッセイ法において、構成的に活性のある変異レセプターを用いると、低い固有活性をもつリガンドのシグナル伝達効果は対数的に増幅された。ベンゾジアゼピン由来の非ペプチド拮抗物質の原型であるL-365,260は、ヒトの野生型CCK-B/ガストリンレセプターの基礎活性をほとんど上昇させなかったが、^３２５L→E変異体、MH162（配列番号：19）を用いて、不完全な作用物質として同定された。L-365,260を少し化学修飾すると、純粋な拮抗物質（YM022）、不完全な作用物質（L-740,093 S）または逆作用物質（L-740,093 R）が生じた。このように、例えば、正逆のまたは固有の活性をもつ新規の非ペプチド作用物質を発見するプロセスが、このスクリーニングアッセイ法において、例えば、構成的に活性のある変異レセプターなどの強化レセプターを用いることによって促進されるはずである。

Ｉ．実施例：
Ａ．CCK-B/ガストリンレセプター：以下の実施例により、作用物質をスクリーニングするための、強化されたペプチドホルモンレセプターである、構成的なCCK-B/ガストリンレセプターMH162（^３２５Ｌ→Ｅ）の使用が明らかにされる。

ヒトCCK-B/ガストリンレセプターの構成的に活性のある変異体を用いて、いくつかのベンゾジアゼピンに基づく推定非ペプチド「拮抗物質」が、このレセプターに結合されると、検出可能な、作用物質としての固有活性を有することが判明した。

構成的に活性のあるCCK-B/ガストリンレセプター変異体MH162（^３２５Ｌ→Ｅ；配列番号：19）を、一過的にCOS-7細胞の中で過剰発現させた。それが構成的に活性であったという事実は、リガンド非依存的なイノシトールリン酸の産生があったことから明らかであった。これに対して、野生型レセプターは、リガンド依存的なイノシトールリン酸産生のみを示す。ペプチド作用物質のCCK-8、またはガストリンIで最大限に刺激すると、変異レセプターも野生型レセプターも、同じようなイノシトールリン酸産生を誘導した（図3）。これに対して、構成的なCCK-Bレセプター変異体MH162（配列番号：19）を、アッセイで用いることによって、３つのベンゾジアゼピン由来の化合物である、L-740,093 R、YM022、およびL-365,260の異なった固有活性が検出されただけであった。これらの化合物は、すべて、以前から、野生型CCK-B/ガストリンレセプターに対する非ペプチド拮抗物質の原型であると考えられていた（Castro Pineiroら、国際公開公報第94/03437号；Lottiら、Eur. J. Pharmacol., 162:273-280, 1989；Nashidaら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 270:1256-61, 1994；Nashidaら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 269:725-31, 1994）。対応するレセプターの親和性より、少なくとも100倍高い濃度で、すべての化合物の固有活性（イノシトールリン酸形成を最大に刺激する割合）を調べた。

ベンゾジアゼピンL-365,260は、完全な作用物質であるCCK-8と比べて62％の効力を持っており、それを根拠に、^３２５Ｌ→Ｅの構成的に活性のある変異レセプターMH162（配列番号：19）における不完全な作用物質であると同定された（図3、右側）。実際、L-365,260の機能を、野生型CCK-B/ガストリンレセプターとともに、詳しく再調査してみると、他の非ペプチド化合物では見られなかったような、わずかにしか検出できないが有意なイノシトールリン酸産生の上昇も明らかになった。

上記の結果から、ベンゾジアゼピンのバックボーンに結合した化学基における小さな変化が、小さな非ペプチド化合物の固有の活性に顕著な変容をもたらすことができると結論された。ベンゾジアゼピン由来のCCKレセプターリガンドの立体化学は、レセプター選択性だけでなく結合親和性を変化させることができるもう一つの特徴である（Showellら、J. Med. Chem. 37:719-721, 1994）。

以下の補足的な観察によって、リガンドの立体化学における差異が、CCK-B/ガストリンレセプター特異的な化合物の機能的な特性を決定していることが確認された。例えば、L-740,093 Sが、^３２５Ｌ→Ｅ CCK-B/ガストリンレセプター変異体MH162（配列番号：19）における、ほとんど完全な作用物質であることが示された（図3）。ヒトの野生型CCK-B/ガストリンレセプターで調べると、L-740,093 Sは、不完全な作用物質（CCK-8と比較すると、25％効力）として機能する。このように、L-740,093 Sは、CCK-B/ガストリンレセプターに特異的であることが知られている、最初の非ペプチド作用物質である。L-740,093 Sの鏡像体であるL-740,093 Rは、S型鏡像異性体の特性と反対の特性を有する。740,093 Rは、構成的に活性のあるレセプターの基礎活性を、ほぼ、野生型のレベルにまで低下させるため、逆作用物質として作用している。

本スクリーニングアッセイ法の利点のひとつは、例えば、逆作用物質などの作用物質と、拮抗物質とを区別することができることである。作用物質を調べるとき、ペプチドホルモンレセプターの強化された型（例えば、構成的なレセプター）で観察されるシグナル伝達活性のレベルは、ヒトの野生型レセプターで観察される活性とは異なる。これに対して、拮抗物質は、強化された型でも、ヒト野生型レセプターでも、同様のシグナル伝達活性を示す。純粋な作用物質は、さらに、正の作用物質と逆作用物質の効果を減衰させると考えられる。

試験した化合物の中で、YM022が、野生型または構成的に活性のあるCCK-B/ガストリンレセプターのいずれに対しても、固有の活性をほとんど示さなかったため、「完璧な」逆作用物質に最も近かった。野生型レセプターおよび構成的に活性のあるレセプターの両方において、YM022は、CCK-8が誘導するイノシトールリン酸産生を、同様のpA2値（それぞれ、9.78と9.37）によって表される、ほぼ同一の親和性で遮断した。L-740,093 Sを非ペプチド作用物質として機能的分類したことに矛盾することなく、この化合物によって誘導されるイノシトールリン酸産生は、YM022によって遮断することができた（pA2= 9.54; 図4）。YM022はまた、構成的に活性のあるCCK-B/ガストリンレセプターに対するL-740,093 Rの逆作用物質活性を減衰させることができる（図5）。濃度依存的な様式で、YM022は、20 nMのL-740,093 Rで阻害されていた構成的に活性のあるレセプターの基礎活性を部分的に回復させた。基礎活性が完全に回復されなかったという事実は、YM022それ自体は、この変異体において、純粋なレセプター作用物質というより、弱い逆作用物質であるという事実により説明される。

pA2値は、競合的な作用物質の機能的な親和性を測定するものである。IC_５０値（50％阻害濃度）とは対照的に、pA_２値は、どの作用物質濃度が、作用物質の親和性を測るために用いられたかに関係しない。理想的には、pA_２値も、どの特異的な作用物質化合物が、作用物質の親和性を測るために試験されたかということとは無関係であるべきである。pA_２値は、作用物質濃度応答曲線を、２倍分（by a factor of two）右にずらす特異的作用物質濃度の負の対数と定義されている。換言すると、所定の拮抗物質濃度の存在下で、同じ効果を誘導するためには、拮抗物質がないときに必要とされる作用物質の2倍の量が必要となる。競合的拮抗物質のpA_２値は、一般的には、シフトプロット（Shift plot）で評価されるが、簡易化した「ナル（null）」法（Lazarenoら、Trends in Pharmacol. Sci., 14:237-239, 1993）によって測定してもよい。

非ペプチドリガンドに加えて、構成的に活性のある変異CCK-BレセプターMH162（^３２５Ｌ→Ｅ；配列番号：19）は、ペプトイドと名付けられた、ペプチド由来の不完全な作用物質の固有活性を増幅させた（Horwellら、Eur. J. Med. Chem., 30 Suppl.:537S-550S, 1995; Horwellら、 J. Med. Chem., 34:404-14, 1991）。以下の実験で用いられたペプトイドは、CCKのカルボキシ末端の４アミノ酸を含むテトラペプチドであるCCK-4を連続的に修飾して得られた。２つのペプトイド化合物の原型であるPD 135,158とPD 136,450は、野生型CCK-B/ガストリンレセプターの存在下で調べると不完全な作用物質であるが、構成的に活性のあるCCK-B/ガストリンレセプターの存在下では、ほぼ完全な作用物質に変化する。このように、非ペプチド化合物同様、ペプチド由来の化合物も、野生型のCCK-B/ガストリンレセプターに比べて、構成的に活性のあるもので調べると、効力の上昇を示すことができる。効力におけるこのような顕著な変化にもかかわらず、野生型対変異型レセプターの親和性の比率は、^１２５Ｉ-CCK-8競合結合実験で判定したところ、2倍の範囲内であった（表1A）。CCK-B/ガストリンレセプターリガンドの固有の活性と、野生型レセプターと構成的に活性のあるレセプターとの間での効力の変化との間には明らかな相関は見られなかった（表1B）。

L-740,093 Sの固有活性は、最近になって、インビボで不完全な作用物質であることが明らかになった「ペプトイド」リガンドPD 135,158（Dingら、Gastroenterology, 109:1181-87, 1995）で観察された固有活性に匹敵した。

構成的に活性のあるCCK-B/ガストリンレセプターに関する先例は、非ペプチド先導化合物について、ある程度の固有活性をスクリーニングするための「拡大鏡」として変異レセプターを用いる新しい方法を例示している。構成的に活性のある^３２５Ｌ→Ｅ変異体MH162は、化合物が野生型レセプターを刺激するために有している固有の活性の検出を確実に促進した（図6）。これは、試験したペプチド、「ペプトイド」、および非ペプチドのリガンドの範囲すべてに当てはまった。
表１：

Ｂ．CCK-Aレセプター：作用物質を同定するために強化レセプターを用いるもう一つの実施例において、CCK-Aレセプター変異体のMHA21/35（配列番号：5の^１３８Ｅ→Ｑおよび^３０３ＡＮＬＭ→ＨＶＳＡ修飾）を用いて、ペプトイド化合物PD 136,450を試験した。図12は、MHA21/35 CCK-A変異体レセプターの、ヒト野生型CCK-Aレセプターに較べて、ペプチドCCK-8、非ペプチドL-365,260、およびペプトイドPD 136,450の作用物質の固有活性を強化する能力を示している。図13は、ペプトイド作用物質PD 136,450の濃度関数として、構成的なCCK-A変異体レセプターMHA21/35による、不完全な作用物質の効力の増幅を示している。

II．レセプター結合および活性の解析：
Ａ．レセプター結合解析：以下の実施例によって、例えば、CCK-AまたはCCK-B/ガストリンレセプターなどのCCKレセプターへのリガンドの結合を測定することができる。この実施例において、ヒトCCK-B/ガストリンレセプターへのリガンドの結合親和性を測定する。

COS-7細胞（1.5×10^６）を10-cmの培養皿（ヌンク社(Nunc)）に接種して、5％CO_２、95％空気のインキュベータにて、37℃で、10％仔ウシ血清を含む、ダルベッコ（Dulbecco's）の改変イーグル（Eagle's）培地で増殖させた。一晩インキュベートした後、hCCKB（HCCKB-pcDNA I）を有する5〜7μgの発現ベクターpcDNA Iで、細胞をトランスフェクトした（Pacholczykら、Nature 350:350-354, 1991）。トランスフェクトして24時間後、24穴皿（コスター社(Costar)）に細胞を分けた（2×10^４細胞/ウェル）。さらに24時間後、25 mMのフェニルメチルスルフォニルフルオライド（PMSF）を補添したハンクス（Hank's）緩衝液の中で、競合結合実験を行った。20 pMの^１２５Ｉ-CCK-8（デュポン-ニューイングランドヌクレア社(Dupont-New England Nuclear）を、放射性リガンドとして用いた。37℃では、インキュベートして80秒後に、平衡結合が起きた。次に、細胞の単層を3回洗浄し、1NのNaOHで加水分解し、レセプターに対する放射活性量を定量した。非標識作用物質（例えば、CCK-8、非硫酸化CCK-8（CCK-8us）、ガストリンI、CCK-4（ペニンシュラ社(Peninsula））と拮抗物質（L-364,718およびL-365,260（メルク社(Merk））を、濃度0.1 pMから10μMの範囲にわたって調べた。すべての結合実験を、3回から5回繰り返した。

放射性リガンド結合解析のために特別に設計されたコンピュータソフトウェアを用いて競合実験データを解析した（インプロット4.0、グラフパッド社(GraphPad)、カリフォルニア州サンディエゴ）。競合結合と飽和結合データの解析も、コンピュータ化した非直線的曲線適合を用いて行なうことができる（McPherson, G.A., J.Pharmacol Methods, 14:213-28, 1985）。

ヒトCCK-B/ガストリンレセプターcDNAで安定的にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いた、上記のアッセイを繰り返すことによって、すべての作用物質と拮抗物質の親和性を確認した。このCHO細胞系は、標準的なリポフェクチンプロトコール（ベセスダ・リサーチラボラトリー社(Bethesda Research Laboratories）を用いて、CHO細胞の中にhCCKB-pcDNAI Neo発現ベクター（インビトロゲン社(Invitrogen)）をトランスフェクトさせた後、G418選抜をすることにより確立された。

単離された原形質膜で、結合パラメータを決定したところ、例えば、22℃、60分で、結合を行なうことができる（Kopinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3605-09,1992）。結合した放射性リガンドと遊離放射性リガンドとの分離は、レセプター結合フィルターマット濾過を用いて行なうことができる（Klueppelberg, U.G.ら、1989、Biochemistry 28:3463-8）。

本発明に係るCCK-B/ガストリン変異体レセプターの結合特異性を、野生型CCK-B/ガストリンレセプターの典型的な結合特異性と比較するためには、マツモト（Matsumoto）ら（Am. J. Physiol., 252:G143-G147, 1987）、およびリー（Lee）ら、（J. Biol. Chem., 268(II):8164-69, 1993）を参照のこと。

結合親和性の、野生型ヒトCCK-Bレセプターとの比較：例えば、ヒトCCK-B/ガストリンレセプターなどの、ヒト野生型レセプターへの放射性標識リガンドの結合に関する基準値を決定した（Leeら、J. Biol. Chem., 268(II):8164-69, 1993を参照のこと）。COS-7細胞で発現するヒト脳CCK-B/ガストリンレセプターの、作用物質への親和性の特徴を調べた（図7）。構造的に関連する作用物質である、CCK-8、ガストリンI、およびCCK-4はすべて、^１２５Ｉ-CCK-8の、組換えレセプターを発現しているCOS-7細胞への結合に関しては、濃度依存的な様式で競合した。CCK-8、ガストリンI、およびCCK-4について計算したIC_５０値は、それぞれ、0.14、0.94、および32 nMであった（図7、パートA）。同様の^１２５Ｉ-CCK-8競合曲線を、L-364,718とL-365,260についても評価し（図7、パートB）、IC_５０値が、それぞれ、145および3.8 nMであることが明らかとなった。トランスフェクトされなかった細胞は、置換可能な結合を示さなかった。

Ｂ．レセプターシグナル伝達活性解析：
CCKレセプターへの作用物質の結合により、細胞内カルシウム濃度とホスファチジルイノシトールの加水分解とが増加することが明らかになる。

[Ca ^２＋ ]の測定： hCCKB-pcDNAIでトランスフェクトした48時間後、修正クレブス-リンゲル（Krebs-Ringer）重炭酸緩衝液中で、COS-7細胞に、Ca^２＋フルオロフォアfura-2を組み込んだ。10^−７ MのCCK-8、または10^−６ MのガストリンIで細胞を刺激した後の、蛍光放出比（340:380 nm）における変化を、以前に説明されているところ（Rajanら、Diabetes,38:874-80, 1989）にしたがって測定した。ガストリン誘導による[Ca^２＋]の増加が、主に、細胞内の[Ca^２＋]プールから発生することを確認するために、細胞外カルシウムをEGTA（2.5 mM）でキレート化することができる。

イノシトールリン酸代謝の測定：hCCKB-pcDNAIでトランスフェクトされたCOS-7細胞を、10μCi/ml[^３H] myo-イノシトール（ARC）を添加した、イノシトールを含まないダルベッコ（Dulbecco's）の改変イーグル（Eagle's）培地（DMEM、ギブコ社(GIBCO)）で、解析に先立つ24時間培養した。修正クレブス-リンゲル（Krebs-Ringer）重炭酸で、1時間平衡化した後、細胞を、10^−７ MのCCK-8で10秒間刺激して、メタノール-HCl中で回収した。水層をクロロフォルムで抽出して、凍結乾燥し、強度の陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによって、イノシトール1,4,5-三リン酸（Ins-1,4,5-P_３）とイノシトール1,3,4,5-テトラキスリン酸（Ins-1,3,4,5-P_４）について解析を行なった（Augerら、Cell, 57:167-75, 1989）。

シグナル伝達活性の、野生型ヒトCCK-Bレセプターのシグナル伝達活性との比較：ヒト野生型CCK-Bレセプターのセカンドメッセンジャーシグナル伝達活性の基準レベルを、このレセプターを発現しているCOS-7細胞のCCK-8による刺激への応答で測定した（図8；リー（Lee）ら、J. Biol. Chem., 268(II):8164-69, 1993を参照のこと）。CCK-8（10^−７ M）は、遊離した細胞質カルシウム[Ca^２＋]_ｉの顕著な増加を誘発した（図8、パートA、左側パネル）。挿入配列を含まない発現ベクターpcDNAIでトランスフェクトした細胞においては、遊離細胞質カルシウムの変化は見られなかった。細胞外カルシウム（緩衝液中、1.5 mM Ca^２＋）を、2.5 mMのEGTAでキレート化した後、CCK-8（10^−７ M）を加えても、なお、一過的に[Ca^２＋]_ｉを増加させた（図8、パートA、右側パネル）が、このことは、CCK誘導による[Ca^２＋]i増加の最初のピークが、主に、細胞内のCa^２＋プールから発生することを示唆している。矢印は、CCK-8s（0.1 μM）またはEGTA（2.5 mM）の添加を示す。[Ca^２＋]_ｉ応答のパターンから、組換えレセプターへのCCK-8の結合が、ホスフォリパーゼCの活性化を通して、細胞内シグナル伝達を誘発することが示唆される。このことは、hCCKB-pcDNAIでトランスフェクトされたCOS-7細胞中のイノシトールリン酸代謝を、CCK-8刺激の10秒後に測定することにより確認された（図8、パートB）。CCK-8に誘導された[Ca^２＋]_ｉのピークの直前になるため、この時点が選択された。CCK-8（10^−７ M）は、Ins-1,4,5-P_３のレベルを、刺激を受けていない対照のhCCKB-pcDNAIでトランスフェクトされたCOS-7細胞に対して453％上昇させた（n=3, p<0.001）。Ins-1,4,5-P_３の直接の代謝物であるIns-1,3,4,5-P_４のレベルも、対照に対して186％上昇した（n=3, p<0.01）。

全イノシトールリン酸含量を測定するための簡易化した方法：上記の方法は、Ins(1,4,5)P_３の含量を特異的に評価するものであるが、簡易化したスクリーニング法を用いて、イノシトールリン酸の全濃度を調べることができる。これは、簡易化した方法では、特異的な、異性体を区別しないからである。（図3、4、5、6、および10に示した実験については、この方法を用いて、イノシトールリン酸生成を測定した。）

イノシトールを含まず、3μCi/mlの^３Hミオ-イノシトール（NEN、45-80 Ci/mmol）を補添した、無血清のダルベッコ（Dulbecco's）改変イーグル（Eagle's）培地（DMEM、ギブコ社(GIBCO)）中で、レセプターcDNA-pcDNAIでトランスフェクトしたCOS-7細胞を、解析に先立ち18時間培養した。次に、その細胞をDMEM/10 mM LiCl_２で2回洗浄し、リン酸緩衝食塩水/10 mM LiCl_２で2回洗浄した。リン酸緩衝食塩水/10 mM LiCl_２の中で、37℃で30分間、推定作用物質で刺激した後、細胞を氷冷メタノール中で掻き取った。脂質をクロロフォルムで抽出した（Pfeifferら、FEBS Lett., 204:352-356, 1986）。ドウェックス（Dowex）1-X8カラム（バイオラド社(BIORAD)）と、水/60 mM ギ酸アンモニウム（ammonium fornate）/2 M ギ酸アンモニウム（ammonium fornate）で分別溶出を用いた、強度の陰イオン交換クロマトグラフィーによって、イノシトールリン酸に関する上層の解析を行なった。液体シンチレーションカウントによって、溶出された放射活性を測定し、イノシトールリン酸含量を、カラムに入れた全^３H-放射活性の割合として表示した。

頭頂部から取った天然の細胞のガストリンレセプターに結合したセカンドメッセンジャー経路に関する詳細な情報は、以下の参考文献から得ることができる：Mullem, S.ら、1984、Biochim. Bioiphys. Acta. 805:181-5; Chew, C.S.ら、1986、Biochim. Bioiphys. Acta. 888:116-25; Roche, S.ら、1991、FEBS Letts., 282:147-51。

イノシトールリン酸の産生に加えて、例えば、cAMP、cGMP、ppGpp、もしくはカルシウムイオン産生によって、または、例えば細胞内pH、pH-感受性染料、もしくは、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子の発現を指標として用いて、または、電気生理学的技術によって、チャンネル活性、もしくは細胞の減極もしくは脱分極を測定して、セカンドメッセンジャーシグナル伝達活性を測定することができる。

III．非ペプチド作用物質の固有の活性を増幅することのできる、適当なペプチドホルモンレセプター：
本発明に係るスクリーニングアッセイ法は、ペプチドホルモンレセプターで、対応するヒト野生型レセプターよりも高い活性を有するものを用いて行なうことができる。強化された基礎活性によって、リガンドの固有活性が増幅されるため、不完全な作用物質によるレセプターの活性化、または逆作用物質による阻害のいずれかを検出するのに有用である。対応する野生型レセプターに較べて、強化された基礎活性をもたないが、それでも、不完全な作用物質の固有活性を増幅するレセプターも有用である。

非ペプチド作用物質をスクリーニングするために有用なペプチドホルモンレセプターの実例には、以下のペプチドホルモン（それらそれぞれの野生型アミノ酸配列に関する参照とともに）と相互作用する、さまざまな形のレセプターが含まれる：アミリン、アンギオテンシン、ボンベシン、ブラジキニン、C5aアナフィラトキシン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、ケモカイン、コレシストキニン（CCK）、エンドセリン、卵胞刺激ホルモン（FSH）、ホルミルメチオニルペプチド、ガラニン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、糖蛋白質ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、レプチン、黄体形成ホルモン（LH）、メラノコルチン、ニューロペプチドＹ、ニューロテンシン、オピオイド、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、セクレチン、ソマトスタチン、タキキニン、トロンビン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管形成性腸管ペプチド（VIP）、およびバソプレッシン。強化レセプターは、さらに、例えば、インシュリンレセプターのように、膜通過ドメインを一つ有するペプチドホルモンレセプターも包含することができる。上記ペプチドホルモンレセプターの野生型アミノ酸配列は、ワトソンとアーキンストール（Watson and Arkinstall）の[G-蛋白質結合レセプター（The G-Protein Linked Receptor）,アカデミック出版、ニューヨーク州、1994]において、利用可能であり、および/または参照される。

作用物質の固有活性を増幅することができるペプチドホルモンレセプターの形には、以下の形状のレセプターが含まれるが、それらに限定されない：

１．不完全な作用物質の固有活性を増幅することができる変異ペプチドホルモンレセプター。
不完全な「ペプトイド」作用物質PD 135,158の固有活性を強化するが、作用物質に依存しない基礎レセプター活性を外見上上昇させることのない変異ヒトCCK-Aレセプターの既存の実例は、変異CCK-AレセプターMHA35である。MHA35は、ヒト野生型CCK-Aレセプターのアミノ酸138-ERY-140を、ベクターpcDNAIの中でQRYに置換することによって作出された（野生型CCK-Aレセプターのアミノ酸配列の例については、図2を参照のこと）。

２．^１３８E、^３０５Lおよび^３１２Iの1個以上の残基が、別のアミノ酸残基、例えば、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、またはグルタミン酸残基に置換されたCCK-Aレセプター。例えば、5個のアミノ酸を置換して（配列番号：5の^１３８E→Qと^３０３ANLM→HVSAという変更）、構成的に活性のあるCCK-Aレセプター変異体を構築し、この結果できたレセプターをMHA 21/35と名付けた。

３．^１５１E、^３２５Lおよび^３３２Vの1個以上の残基を、別のアミノ酸残基、例えば、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、またはグルタミン酸残基に置換したCCK-B/ガストリンレセプター。

４．天然の構成的に活性のある変異レセプターを含むが、それらに限定されない天然の変異レセプターであって、例えば、構成的に活性のある天然の変異レセプターによって生じる表現形質など、病気、またはその他の有害な表現形質に関係するレセプター。実例としては、以下のペプチドホルモンレセプターが含まれるが、これらに限定されない：
a）黄体形成ホルモン（LH）レセプター遺伝子における点突然変異が、いくつかの性的早熟の発生の原因である。LHレセプターの以下のアミノ酸残基を変えることによって、本発明に係る変異レセプターを構築することができる：568番目のアラニン残基を別のアミノ酸、例えばバリンに（Latronicoら、J. Clin. Endo. & Meta., 80(8): 2490-94, 1995）；578番目のアスパラギン残基を別のアミノ酸、例えば、グリシンまたはチロシンに（Kosugiら、Human Mol. Genet., 4(2):183-88, 1995; Laueら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(6):1906-10, 1995）；571番目のMet残基を別のアミノ酸、例えばIleに、または577番目のThr残基を別のアミノ酸、例えばIleに（Kosugiら、前記；Laueら、前記）；542番目のIle残基を別のアミノ酸に、564番目のAsp残基を別のアミノ酸に、581番目のCys残基を別のアミノ酸に、または578番目のAsp残基を別のアミノ酸に（Laueら、前記）；例えば、膜通過ヘリクス6または細胞内ループ3において、細胞内ドメイン近傍部位にある、膜通過ヘリクス5または6の中のアミノ酸残基（Laueら、前記）。

また、卵胞刺激ホルモン（FSH）レセプター、および甲状腺刺激ホルモン（TSH）レセプターの対応する残基における突然変異が含まれる（Latronicoら、前記）。

b）天然の、構成的に活性のある副甲状腺（PTH）レセプターが、保存された223番目でHisからArgへの置換によって生じることがある（Schipaniら、Science, 268:98-100, 1995）。関連するレセプターの対応する残基で、代りになるアミノ酸に置換することによって、例えば、グルカゴン様ペプチド1（G-LP1）レセプターにおける相同体Hisを別のアミノ酸に置き換えて、構成的に活性のある変異G-LP1レセプターを構築することができる。アミノ酸の相同性による、PTHまたはG-LP1に関連するレセプターのいずれかにおける同様の変更には、セクレチン、血管形成性腸管ポリペプチド（VIP）、グルカゴン、G-LP1、およびカルシトニンが含まれるが、これらに限定されない。

上に列挙した天然の変異レセプターのいずれかを用いたスクリーニングアッセイ法において同定された非ペプチドの正または逆の作用物質は、対応する有害な表現形質に対して、治療上有用である。

５．合成変異レセプターを同定するための方法
欠失解析により、セカンドメッセンジャーのシグナル伝達において重要な細胞内レセプターのドメインが明らかとなる：組換えCCK-AおよびCCK-B/ガストリンレセプターは、どちらも、ホスホリパーゼCの活性化とつながっている。本出願人らは、CCK-B/ガストリンレセプターの３番目の細胞内ループが、セカンドメッセンジャーのシグナル伝達において重要な残基を含んでいるのではないかと仮説を立てた。この仮説を調べるために、各々が３番目の細胞内ループの中で6個から55個のアミノ酸を欠失した、一連の欠失変異体を作成した。各変異レセプターをCOS-7細胞の中で発現させて、[^１２５I]CCK-8結合と、^３Hイノシトールリン酸形成を調べた。３番目の細胞内ループのカルボキシ末端における12アミノ酸を欠失させると、CCK-8結合に関しては正常な親和性と能力を有するが、CCK-8に誘導されるイノシトールリン酸形成の最大値が90％低下する結果になった。ただし、この組における他のレセプターはすべて、正常にシグナルを伝達した。そして、後述するように、機能的に重要であることが明らかになった12アミノ酸を含む領域を、構成的に活性のある点突然変異に関してスクリーニングした。

方法１：cAMP生成レセプターとのドメイン交換により、構成的なレセプター活性が生じる：構成的に活性のある変異レセプターを迅速に同定するための方法は、２つのレセプターの間で、例えば、約5〜10個の長さのアミノ酸である、機能的なドメインを交換することに依存している。２つのレセプターの一方は、例えば、野生型レセプターなど、望ましい変異レセプターの主要な鋳型となる形状のレセプターであり、第二のレセプターは、第一のレセプターとは異なるペプチドホルモンレセプターである。候補レセプターは、例えば、同一のまたは異なるセカンドメッセンジャー経路によるシグナルなどの、異なるシグナル伝達経路と連結しており、さらに、アミノ酸配列は密接に関連している。これらの基準は、本来の意味で正常に機能するアミノ酸鎖は、異なるセカンドメッセンジャーのシグナル伝達経路に結合した密接に関連するレセプターに移植された場合、作用物質とは独立にシグナル伝達を行なうことができるという考えに基づいている。

ドメイン交換法を用いて、CCK-B/ガストリンレセプターの、構成的に活性のある変異体を同定した。第三の細胞内ループにおける一連の短い分節を、hCCK-Bとほとんど同一のレセプターであるバソプレッシン2レセプターに由来する相同なアミノ酸配列で連続的に置換した。バソプレッシン2は、また、CCK-B/ガストリンレセプターとは違って、アデニル酸シクラーゼのシグナル伝達経路に結合しているため、CCK-B/ガストリンレセプターによってドメイン交換をするためのよい候補である。

試験したところ、CCK-B/ガストリンレセプターの相同な位置への5個のアミノ酸置換（QAKLL（配列番号：13）からAHVSA（配列番号：14））は、CCK-B/ガストリンレセプターの構成的な活性をもたらした。QAKLL（配列番号：13）からAHVSA（配列番号：14）への置換は、イノシトールリン酸形成の基礎レベルを、野生型CCK-B/ガストリンレセプターの290％まで上昇させる結果をもたらした（図9、変異体2）。さらに、構成的な活性をもたらす変異体には、LLのSAへの置換、LからSへの置換、また、LからEへの置換が含まれる。

方法２：グルタミン酸スキャニング突然変異誘発法によって、構成的に活性のあるレセプターが同定される：欠失解析もしくはドメイン交換に加えて、またはそれらの代りに、本出願人らが「アミノ酸スキャニング突然変異誘発法」と名付けた処理法を用いて、変異レセプターを作出することができる。アミノ酸スキャニング突然変異誘発法は、レセプターの細胞内ループまたは細胞内部位に隣接する膜通過ドメインの部分のいずれかに見られる各アミノ酸を連続的に置換することを含む。実験上の選択は、例えば、陰性のアミノ酸を陽性のアミノ酸と交換すること、陽性のアミノ酸を陰性のアミノ酸と交換すること、または、陽性もしくは陰性のアミノ酸を中性のアミノ酸と交換することなど、アミノ酸の電荷を変化させることである。もう一つの選択は、例えば、中性の各アミノ酸を別の中性のアミノ酸と交換するなど、各アミノ酸を交換することである。

CCK-B/ガストリンレセプターの場合には、欠失解析を最初に用いて、セカンドメッセンジャーのシグナル伝達に重要な第三の細胞内ループの中に、機能的に重要な12個のアミノ酸断片を明らかにした。続いて、この12個の断片の中の中性アミノ酸のすべてを、次々に別のアミノ酸、好ましくはグルタミン酸と置換した。スキャニング解析技術は、グルタミン酸を一つ置換すると、野生型の値と比較して、一過的にトランスフェクトされたCOS-7細胞における、イノシトールリン酸の蓄積の基礎レベルを228％上昇させる結果になった（図9、変異体1）。

この実施例において、本出願人らは、第三の細胞内（IC）ループのカルボキシ末端に限定された領域と、第三のICループに隣接した、六番目の膜通過の部分を集中的に研究した。中性アミノ酸残基の代りに、グルタミン酸残基を（E）を導入した。

構成的に活性のあるレセプターには、^３２５L→E（MH162；配列番号：19）と、^３３２V→E（MH129；配列番号：22）におけるアミノ酸置換を含んでいる。すべての変異体を、上述したようにして、pcDNAIベクターの中に構築した。

図9は、ヒトCCK-B/ガストリンレセプターの7つの膜通過（TM）ドメインの構造を表した概略図である。細胞内シグナル伝達にとって非常に重要な、第三の細胞内ループのC末端ドメインを黒く塗って強調してある。この断片の中で、レセプターに構成的な活性を付与する2つの突然変異が見出された。突然変異の一つは、グルタミン酸置換スキャニング（変異体1；MH129（配列番号：22））によって構築され、第二の突然変異は、ドメイン交換によって構築された（変異体2；MH162（配列番号：19））。野生型CCK-B/ガストリンレセプター、または2つの異なる構成的に活性のある変異体によってトランスフェクトされたCOS-7細胞における、基礎的なイノシトールリン酸の蓄積を示す棒グラフが、図10に示されている。

方法３：変異レセプターを作出する第三の方法は、目的のレセプターを、ペプチドホルモン、生物起源のアミン、ロドプシン、またはその他のG-蛋白質結合レセプターを含むがこれらに限定されない既知の構成的に活性のある変異レセプターと並べることである。このようなアラインメントの実施例が、図2に示されている。一般的に、既知の変異体において構成的な活性をもたらす突然変異を、目的とするレセプターの対応する位置に導入することができる。既知の構成的に活性のある変異レセプターの実例には、卵胞刺激ホルモン（FSH）レセプター、甲状腺刺激ホルモン（TSH）レセプター、および、例えばLHレセプターにおける568番目のAlaからValへの突然変異（Latronicoら、J. Clin. Endo. & Meta., 80(8):2490-94, 1995）など、黄体形成ホルモンレセプターが含まれるが、これらに限定はされない。

この方法を用いて、アラインメントに基づき、CCK-A変異レセプターを構築した。ヒトおよびラットのCCK-A配列、マストミス（mastomys）、ラット、ヒト、およびイヌのCCK-B/ガストリンレセプター、ならびにツメガエルCCK-A/CCK-Bの中間レセプター（CCK-XL;図2）を含むマルチプルアラインメントマップが作成された。このマップに基づいて、強化された変換活性を有する既知の構成的に活性のあるロドプシン変異体に基づき、CCK-Aレセプターの保存されたアミノ酸138-ERY-140を、アミノ酸QRYで置き換えた（Arnisら、J. Biol. Chem., 269:23873-81, 1994）。改変されたアミノ酸残基は、膜通過ドメインIIIの中にあり、第二の細胞内ループに隣接する。シグナル伝達の基礎レベルは上昇しなかったが、非ペプチドリガンドPD 135,158の固有活性は有意に上昇した。

方法4：レセプターの細胞内部位を連続的に欠失させ、野生型レセプターに較べて基礎活性が上昇するもの、または、不完全な作用物質の過剰活性を探すことによって、さらに別の変異レセプターを作出することができる。

強化された基礎活性を有する野生型レセプター：
本発明の方法において有用なペプチドホルモンレセプターには、対応するヒトの野生型レセプターと比較すると、非ペプチド作用物質の固有活性を増幅することができるか、またはヒトの野生型レセプターよりも高い基礎活性を有する、非ヒトレセプターが含まれる。

図11において、イノシトールリン酸産生の基礎レベルを、ヒトCCK-A（hCCK-A）、ヒトCCK-B（hCCK-B）、イヌCCK-B（dCCK-B）、マウスCCK-B（mCCK-B）、およびマストミス（mastomys）CCKレセプター（図11、パートA）について測定し、hCCK-Bの基礎レベルに対する割合で示した。

また、ラットのCCK-B/ガストリンレセプターと、関連するツメガエルCCKレセプターに関する実験も１回行なった（表2）。ヒトMH162（^３２５L；配列番号：19）のE変異体を陽性対照として用いた（n=14）。
表２

野生型ヒトCCK-AおよびCCK-B/ガストリンレセプターは、COS-7細胞において、（空のプラスミドベクターpcDNAIでトランスフェクトした対照用細胞と比較して）基礎的なイノシトールリン酸産生の有意でない変化を誘導しただけだった。同様に、野生型のラットCCK-AおよびイヌCCK-B/ガストリンレセプター、また、密接に関連するツメガエルのCCKレセプターも、すべて、基礎的な状態では、多かれ少なかれ、活性はなかった。これに対して、野生型のマウスCCK-B/ガストリンレセプター、およびマストミス・ナタレンシス（mastomys natalensis）に由来するその相同レセプターは、COS-7細胞における基礎的なイノシトールリン酸産生を、対照用pcDNAIよりも有意に上昇させた。野生型ヒトCCK-B/ガストリンレセプターのわずかな基礎活性と比較すると、野生型のマウスおよびマストミスの相同レセプターの基礎活性は、それぞれ、7倍および11倍高いと評価された。ちなみに、ヒトのCCK-B/ガストリンレセプターの^３２５L-E変異体は、基礎的な状態において、ヒトの野生型レセプターよりも、少なくとも16倍は活性があるようだった。CCK-8による刺激に対する最大の応答が、試験したレセプターすべて（陽性対照）で同等であったことから、記載された生物種の基礎活性における違いは、レセプター発現の程度の違いには関連していないことは明らかであった。

IV． 治療的用途
野生型または構成的に活性のあるレセプターの活性を、薬理学的に改変することができれば、新しい種類の臨床的に有用な薬物へのドアを開くことになる。強化レセプターにより、作用物質として作用することができる薬物の発見が可能となり、それによって、広い範囲にわたる病気の治療または予防に関する利点を有する。甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、および副甲状腺ホルモンレセプターの、構成的に活性のある変異体が天然に存在することは、既に知られており（上記参照）、非ペプチド作用物質/逆作用物質のスクリーニングのための出発点が提供されうる。例えば、甲状腺腫の病因であると示唆されている、構成的に活性のある甲状腺刺激ホルモンレセプターを抑止する薬物を用いて、腫瘍の増殖を阻害することができた。同様に、構成的に活性のある黄体形成ホルモンレセプターを有する患者において、逆作用物質は、性的早熟の開始を遅延させることができた。

化学式（I）の化合物を含むがこれらに限定されない非ペプチド作用物質は、CCKおよび/またはガストリンレセプターが関係する、中枢神経系疾患を治療および予防するための作用物質として有用である。このような病状の例には、消化性および十二指腸潰瘍などの胃腸潰瘍、過敏性腸管症候群、胃食道逆流病、または膵臓性もしくはガストリンの過剰分泌、急性膵臓炎、または運動性障害を含む胃腸障害；神経弛緩障害、晩発性ジスキネジー、パーキンソン病、精神病、またはジル・ド・ラ・ツレット（Gilles de la Tourette）症候群など、CCKがドーパミン、セロトニン、およびその他のモノアミン性神経伝達物質と相互作用することにより引き起こされる中枢神経系障害を含む中枢神経系障害；鬱病；精神分裂病；食欲調節システムの障害；ゾリンジャー-エリソン（Zollinger-Ellison）症候群、腔および細胞過形成、または痛みが含まれる。

非ペプチド作用物質は、さらに、以下の用途に有用である：
１）CCKレセプターおよび/またはガストリンレセプターに関係する不安またはパニックに関する神経学的な障害の治療または予防；
２）アヘンまたは非アヘンによって媒介される痛覚脱失、ならびに知覚麻痺、または痛覚の喪失を直接的に誘導すること；
３）慢性の治療、または薬物もしくはアルコールの乱用によって生じる禁断応答の治療または予防。このような薬物には、ベンゾジアゼピン、コカイン、アルコール、およびニコチンが含まれるが、これらに限定されない；
４）ストレスおよびその薬物乱用との関係の治療；
５）CCKレセプターが関係しているかもしれない腫瘍学的疾患の治療。このような腫瘍学的疾患の例には、小細胞腺癌、ならびに中枢神経系グリア細胞およびニューロン細胞の原発性腫瘍が含まれる。例としては、食道下部、胃、腸、結腸の腫瘍、および小細胞肺癌を含む肺癌が含まれるが、これらに限定されない；
６）例えば、発作、低糖症、脳性麻痺、一過性の脳虚血発作、心肺外科手術中または心停止の間に起きる脳虚血、周産期窒息、癲癇、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、オリーブ橋小脳委縮、溺れるなどして起こる酸素欠乏症、脊椎および頭部傷害、ならびに環境神経毒を含む神経毒による中毒などの病的状態の結果として起きる神経変性疾患の治療または予防。

さらに、ある種のタイプの検査および眼内手術の後、化学式（I）の化合物を用いて、治療目的のために、縮瞳を誘導することができよう。眼内手術の例には、人工水晶体の移植をともなう白内障手術が含まれる。CCK逆作用物質化合物を用いて、例えば、虹彩炎、ブドウ膜炎、および外傷に伴って起きる縮瞳を予防することができる。逆に、作用物質の誘導体を用いて、例えば、緑内障の治療のために、縮瞳を誘導することができる。したがって、本発明は、医薬品の調製において用いるために、化学式（I）の化合物、またはその塩もしくはプロドラッグを提供する。

本発明はまた、治療において用いるために、化学式（I）の化合物を提供する。

さらなる、または代替的な態様において、本発明は、CCKおよび/またはガストリンレセプターに関係する生理学的障害を治療または予防するための方法で、それを必要とする患者に、化学式（I）の化合物を、CCKおよび/またはガストリンレセプターの作用物質または逆作用物質としての用量を投与することを含む方法を提供する。

ヒト患者において、ペプチドホルモンレセプターの作用物質または逆作用物質として、ある化合物を用いる場合、一日当たりの用量は、通常、処方する医師が決定する。一般的に、用量は、患者の症状の重さによるだけでなく、年齢、体重、および各患者の反応によっても変化する。しかし、多くの場合、効果的な一日当たりの用量は、体重当たり約0.001 mg/kgから約2μg/kgの範囲内にあるが、好ましくは、例えば、体重当たり約0.1 mg/kgから約100 mg/kgというように、約0.01 mg/kgから約200 mg/kgの範囲内にあり、１回でまたは分割して投与される。当業者は、場合によっては、これらの制限を外れた用量を使用する必要があることを理解している。

さらに、インビトロの試験が指示するところは、例えば、本発明に係る作用物質が、ナノモル（subnanomolar）の範囲で（例えばL-740,093 R）、および20 nMの範囲で（例えばL-740,093 S）効果があるなど、有益である。本発明に係る作用物質は、一回でまたは分割した用量で経口もしくは全身に、または、当業者に知られているその他の方法で投与することができる。

その他の態様
本発明は、さらに、ペプチドホルモンレセプターの活性に影響を与える作用物質または逆作用物質を検出するために、その活性を増幅するさらに別の方法を包含する。例えば、増幅の仕組みには、例えば、ペプチドホルモンレセプターの調節因子、例えば、G-蛋白質または下流のメッセンジャーとして作用する分子のいずれかの発現を、過剰発現させるかまたは中和することにより、レセプターに誘導されるシグナル伝達に関係する細胞内因子を修飾することが含まれる。または、増幅の仕組みには、レセプターのシグナル伝達を検出するために用いられるシグナル変換（transduction）アッセイ法の動力学的条件を最適化することが含まれうる。例えば、β-ガラクトシダーゼアッセイ法などの特定のアッセイ法によって、作用物質の活性を検出するために、インキュベートする時間を延長することができ、または感度が低下するのを避けるために短くすることもできる。

ペプチドホルモンレセプターのアミノ酸配列、レセプター特異的な作用物質および逆作用物質、レセプターのコンフォメーション、薬理学、レセプターをコードする遺伝子、引き続き行われる追跡実験のための動物モデル、ならびにデータベースの登録番号についてのさらなる情報は、ワトソンとアーキンストール（Watson and Arkinstall）のG-蛋白質結合レセプター（The G-Protein Linked Receptor）,アカデミック出版、ニューヨーク州、1994；また、コラコフスキー（Kolakowski, L. F.）、「G-蛋白質に結合レセプターのデータベース（The G Protein-Coupled Database ）」ワールド-ワイド-ウェブ・サイト（World-Wide-Web Site）、GCRDB-WWWを参照して得ることができる。

上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな用途や条件に適合させるために、本発明を、さまざまに改変し修飾することができる。

Claims (15)

1. 非ペプチド候補化合物が、ペプチドホルモンレセプターの拮抗物質であるかを判定するための方法であって、
   （a）対応する野生型レセプターに較べて、作用物質の活性を増幅させることができる形状のペプチドホルモンレセプターに、該ペプチドホルモンレセプターに対して固有の活性がない候補化合物を既知の正または逆の作用物質の存在下で接触させる段階と
   （b）該候補化合物の非存在下における該形状のペプチドホルモンレセプターの活性と比較して、該候補化合物の存在下で該形状のペプチドホルモンレセプターの活性を測定する段階であって、該既知の作用物質の活性の減衰により、候補化合物が該ペプチドホルモンレセプターの拮抗物質であることが示される、前記段階とを含む、前記方法。
2. レセプターの形状が、変異レセプターである、請求項１記載の方法。
3. レセプターの形状が、対応するヒトの野生型レセプターの基礎活性よりも高い基礎活性を有するものである、請求項１記載の方法。
4. レセプターの形状が、構成的に活性のあるレセプターである、請求項１記載の方法。
5. レセプターの形状が、非ヒトレセプターである、請求項１記載の方法。
6. レセプターの形状が、非ヒト野生型レセプターである、請求項５記載の方法。
7. レセプターの形状が、ヒト変異レセプターである、請求項１記載の方法。
8. レセプターの形状が、天然の変異レセプターである、請求項１記載の方法。
9. 候補化合物が、ペプトイドである、請求項１記載の方法。
10. MHA21/35 ([Gln¹³⁸,His³⁰³,Val³⁰⁴,Ser³⁰⁵,Ala³⁰⁶]hCCK-A レセプター)として同定されたCCK-Aレセプターの変異型をコードしている核酸。
11. 請求項１０記載の核酸によってコードされているポリペプチド。
12. MH40([Ala³²²,His³²³,Val³²⁴,Ser³²⁵,Ala³²⁶]hCCK-B/ガストリンレセプター)、MH128([Ser³²⁵,Ala³²⁶]hCCK-B/ガストリンレセプター)、MH156([Ser³²⁵]hCCK-B/ガストリンレセプター)、MH162([Glu³²⁵]hCCK-B/ガストリンレセプター)、及びMH129 ([Glu³³²]hCCK-B/ガストリンレセプター)からなる群より選択される、CCK-B/ガストリンレセプターの変異型をコードしている核酸。
13. 請求項１２記載の核酸によってコードされているポリペプチド。
14. 変異型がMH162である、請求項１３記載の核酸。
15. 請求項１４記載の核酸によってコードされているポリペプチド。

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