JP4680009B2 - 透析膜によってトラップされたレドックスポリマーと酸化還元酵素とを用いた、電気化学に基づくセンサー - Google Patents

Description

本発明は、一般的にはセンサーに関するものであり、特に、電気化学に基づくセンサーに関するものである。

液体サンプル中の検体の測定のために、酸化還元メディエーターと酸化還元酵素とを電極と共に使用する、電気化学に基づくセンサーの使用への関心が高まってきている。このような電気化学に基づくセンサーは、体液サンプル（たとえば血液または間質液サンプル）中の検体（たとえばグルコース）の、連続的または半連続的なモニタリングに特に適していると考えられる。たとえば、酸化還元メディエーター、酸化還元酵素および作用電極を使用する、電気化学に基づくグルコースセンサーは、比較的低いポテンシャル（たとえば、ＳＣＥに対し０．４Ｖ未満）を用いてグルコース濃度を決定（すなわち測定）することができ、これにより、作用電極におけるどのような妨害反応も制限することができる。電気化学に基づくセンサーの更なる説明については、たとえば、（参照によりその全体が本明細書に包含される）特許文献１，２を参照されたい。

典型的な電気化学に基づくセンサーでは、酸化還元メディエーターが、電気化学に基づくセンサーの酸化還元酵素と電極との間における電子の移動を促進する。その際、酸化還元酵素は、検体、酸化還元メディエーターおよび電極表面の存在によって推進されて、酸化状態と還元状態との間を循環する。この循環のネットの結果として、酸化還元酵素の元の酸化状態と触媒特性とが基本的に維持されつつ、電子が、電極の表面で受容されるか、あるいは供与される。

水性液体サンプル（たとえば、血液、尿または間質液等の体液サンプル）中の検体の測定に関し、十分に大きな反応速度を可能にするという観点からは、酸化還元酵素と酸化還元メディエーターとの両方について、ある程度の水溶性が有益であり得る。それゆえ、従来の電気化学に基づくセンサーには、水性液体サンプル中に溶媒和される酸化還元酵素と酸化還元メディエーターとを組み込み得る。

長時間安定であることが必要な、電気化学に基づくセンサー（たとえば連続的または半連続的な電気化学に基づくグルコースセンサー）については、酸化還元メディエーターが電極近傍から浸出して離れていかないことが不可欠である。さらに、酸化還元メディエーターが人間やその他の対象に有害な物質である場合には、酸化還元メディエーターが人体またはその他の対象の身体中に浸出することは、好ましくなく、従って回避すべきである。

浸出を防ぐために、酸化還元メディエーターは、水不溶性の合成ポリマー鎖（たとえばポリシロザン）に結合されてきた。しかしながら、このような化学組成には、フレキシビィリティが小さく、従って、その疎水性のために、水性媒体中における反応速度が低いという問題がある。さらに、親水性ポリマーのバックボーンに共有結合した酸化還元メディエーターは、電気化学に基づくセンサーの電極に、直接、効率的にかつ確実に結合させるという従来の結合には不適切であった。

それゆえ、本分野では、酸化還元酵素と酸化還元メディエーターとを使用し、かつ、酸化還元酵素および／または酸化還元メディエーターがセンサーの電極近傍から偶然浸出することのない、電気化学に基づくセンサーについてのニーズが依然存在する。さらに、このような電気化学に基づくセンサーの酸化還元メディエーターおよび酸化還元酵素は、十分に大きな反応速度を示すべきである。
米国特許第５，０８９，１１２号明細書 米国特許第６，２８４，４７８号明細書

本発明の実施形態に従う電気化学に基づくセンサーには、酸化還元酵素と酸化還元メディエーターとが含まれるが、酸化還元酵素および／または酸化還元メディエーターが、電気化学に基づくセンサーの電極近傍から偶然滲出することがない。さらに、そのような実施形態の酸化還元メディエーターおよび酸化還元酵素は、十分に大きな反応速度を示す。

本発明の実施形態に従う、電気化学に基づくセンサーには、少なくとも１つの電極表面を有する電極と、この電極表面上に載置したフィルムと、このフィルム上に載置した透析膜とが含まれる。このフィルムは、酸化還元酵素と親水性レドックスポリマー（すなわち、酸化還元メディエーターを結合させたポリマー、たとえば、酸化還元メディエーターを共有結合したポリマー）とを含む。さらに、透析膜が、レドックスポリマーと酸化還元酵素とを電極の近傍にトラップする役割を果たす。このようなトラップは、分子量が十分大きく、透析膜を通過しない酸化還元酵素と親水性レドックスポリマーとを採用することにより達成できる。

酸化還元酵素と親水性レドックスポリマーとは、両方とも、透析膜によって電極の近傍にトラップされるので、浸出が防止され、長期（たとえば、１０時間以上）に渡る連続的または半連続的な測定のために電気化学に基づくセンサーを使用することができるようになる。さらに、レドックスポリマーの親水性により、水性液体サンプルが存在する場合には十分に大きな反応速度が得られる。

本仕様書における一貫性と、本発明の明確な理解のために、本明細書で使用される用語について以下のように定義する。

用語「レドックスメディエーター」は、電極表面と酸化還元酵素との両方により還元（電子の受容）または酸化（電子の供与）され得る任意の化学的構成成分を意味する。

用語「親水性」は、水または水溶液に対し高い親和性を有する任意の化学種またはサブグループを意味する。したがって、親水性化合物は、水または水溶液に、引きつけられ、溶解し、または、吸収される傾向を有する。

用語「疎水性」は、水または水溶液に対し親和性が低い任意の化学種またはサブグループを意味する。したがって、疎水性化合物は、水または水溶液をはじき、または、これらに吸収されない傾向を有する。

用語「レドックスポリマー」は、少なくとも１つの酸化還元メディエーターを含むように改質された（誘導体化された）ポリマーを意味する。

図１−Ａ〜１−Ｄは、本発明の例示的な実施形態に係る、電気化学に基づくセンサー１００の一部を表している。電気化学に基づくセンサー１００には、基板１０２、電極表面１０６ａを有する参照電極１０４ａ、電極表面１０６ｂを有する作用電極１０４ｂ、電極表面１０６ｂ上に載置されたフィルム１０８およびフィルム１０８上に載置された透析膜１１０が含まれる。電気化学に基づくセンサー１００には、絶縁層１１２および参照インク層１１４も含まれる。当業者ならば、図１−Ａ〜１−Ｄが、電気化学に基づくセンサー（完全なもの）の一部のみを表しており、図１−Ａ〜１−Ｄを無用に複雑化しないように、電気化学に基づくセンサーの追加的構成要素（たとえば、筐体、分析／マイクロプロセッサ・モジュールおよび電気伝達回路）が描かれていないことを認識できよう。

また、当業者ならば、参照電極１０４ａと一体化されて電気化学的活性層を構成する参照インク層１１４が、作用電極１０４ｂに測定ポテンシャルを印加するための「ゼロポテンシャル」を設定するものであることを認識するであろう。さらに、図１−Ａ〜１−Ｄは、２電極形式の電気化学に基づくセンサーを表すものであるが、当業者ならば、本技術分野で公知の他の電気化学に基づくセンサー形式も本発明の実施形態で使用できることを認識するであろう。

基板１０２は、たとえば、ポリエチレンテレフタレートシート、（たとえば、米国のＧＥプラスチックから商業的に入手可能な）ポリブチレンテレフタレートシート、または、（たとえば、ドイツのＮＳＷ社から商業的に入手可能な）配向ポリスチレンフィルムから作製することができる。

参照インク層１１４は、たとえば、（英国、ウェールズ州、ＰｏｎｔｙｐｏｏｌのＧｗｅｎｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社から商業的に入手可能な）Ａｇ／ＡｇＣｌペーストまたは、部分的に可溶な塩を形成する金属（たとえば、銀、銅、チタンおよびリチウム）等の材料を含むがこれらに限られるわけではない任意の適切な電気化学的基準物質から形成することができる。

絶縁層１１２は、たとえば、（たとえば、Ｓｅｒｉｃｏｌ Ｉｎｋｓ社から商業的に入手可能な）誘電性のスクリーン印刷用インクペーストから形成することができる。参照電極１０４ａおよび作用電極１０４ｂは、適切な材料ならば、当業者に公知の任意の材料で形成することができる。たとえば、参照電極１０４ａおよび作用電極１０４ｂを、伝導性インク（たとえばカーボン伝導性インク）から形成することができる。

参照電極１０４ａ、作用電極１０４ｂ、絶縁層１１２および透析膜１１０の厚さは、適当などのようなものでもよい。しかしながら、これらの層の各々の典型的な厚さは１〜１００μｍの範囲にある。

フィルム１０８には、酸化還元酵素と親水性レドックスポリマーとが含まれる（図１には示されていない）。フィルム１０８のレドックスポリマーおよび酸化還元酵素は、透析膜１１０と絶縁層１１２とによって作用電極１０４ｂの近傍にトラップされる。

フィルム１０８の親水性レドックスポリマーおよび酸化還元酵素は、両方とも、（以下にさらに説明するように）基本的に透析膜１１０を通過しない、十分に高い分子量を持つ。親水性レドックスポリマーおよび酸化還元酵素の分子量は、所与の透析膜によって親水性レドックスポリマーがトラップされるのに適切であれば、どのような分子量でも可能である。一般的には、そのような親水性レドックスポリマーは、約１０ｋｇ／ｍｏｌ（１０，０００ダルトン）を超える分子量を有し、そのような酸化還元酵素は、５，０００ダルトン（５ｋｇ／ｍｏｌ）を超える分子量を有し、好ましくは、８０，０００ダルトン（８０ｋｇ／ｍｏｌ）を超える分子量を有する。この点では、グルコースオキシダーゼ（酸化還元酵素）が約１６０，０００ダルトン（１６０ｋｇ／ｍｏｌ）の分子量を有する点が注意される。

透析膜１１０は、比較的高分子量の化合物（たとえば、フィルム１０８の親水性レドックスポリマーや酸化還元メディエーター）を作用電極１０４ｂの近傍に保持し、比較的低分子量の化合物（たとえばグルコース）だけが通過できるのに適するようになっている。透析膜は、検体（たとえばグルコース）拡散調節層および妨害物質除去層としても機能し得る。

透析膜１１０としては、適切であれば、流延法によるポリマー透析膜または架橋ポリマー透析膜等の、本技術で公知の任意の透析膜を使用できる。適切な透析膜の例としては、（ｉ）２％（ｗ／ｖ）のセルロースアセテート（ＣＡ）と０．７％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを含有するアセトン溶液から作製された流延法による透析膜および、（ｉｉ）５％（ｗ／ｖ）のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と０．７％（ｗ／ｖ）のポリ（プロピレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＰＧＤＧＥ）とを含有する２−イソプロパノール溶液から形成された架橋ポリマー透析膜が挙げられるが、これらに限られるわけではない。

フィルム１０８中での使用に適した親水性レドックスポリマーは、たとえば、比較的高分子量のポリマーに酸化還元メディエーターを共有結合させることにより形成することができる。このような親水性レドックスポリマーの親水性は、親水性レドックスポリマーの酸化還元メディエーターと酸化還元酵素との間の好ましい相互作用を促進し、その結果、十分に大きな反応速度が得られるようになる。

フィルム１０８の酸化還元酵素としては、適切であれば、当業者に公知のどのような酸化還元酵素でも使用可能である。たとえば、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよび、キサンチンオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ）およびカタラーゼがあるが、これらに限られるわけではない。

本発明の実施形態に係る電気化学に基づくセンサーの構成要素が、容易に作製でき、製造中に溶液で取り扱うことができる点は、本発明の実施形態に係る電気化学に基づくセンサーの利点の一つである。したがって、そのような電気化学に基づくセンサーの製造は、たとえば、従来の印刷技術と塗布技術とを使って成し遂げることができる。

図２は、本発明の例示的な実施形態に係る、電気化学に基づくセンサーでの使用に適したレドックスポリマー２００を形成するためのプロセスの概要を表している。図２に示すように、レドックスポリマー２００は、親水性モノマーであるＮ−ビニルピロリジノン（ＮＶＰ）と酸化還元メディエーターであるビニルフェロセン（ＶＦｃ）との、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）によって開始されるフリーラジカル共重合によって形成され得る。当業者に公知の、ＮＶＰに代わり得る他の親水性モノマーとしては、アクリルアミドモノマー、ヒドロキシエチルメタクリレートモノマーおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）マクロモノマーが挙げられる。

ＮＶＰ：ＶＦｃのモル比は、図２中、ｍ：ｎで表され、たとえば、約１００：１〜約１００：５の範囲であり得る。ＶＦｃの比率が約５％を超えると、得られたレドックスポリマーが、水性液体サンプルによっては不溶性になり得る点に注意すべきである。さらに、ＶＦｃの比率が約１％未満であると、レドックスポリマー２００の酸化還元伝導度が、グルコースを測定するために必要とされる電子交換速度をサポートするには低すぎることになる場合がある。ＮＶＰの親水性がレドックスポリマー２００に比較的高い程度の親水性を与える点に注意すべきである。

本発明の実施形態に係る電気化学に基づくセンサーにおける使用に適したレドックスポリマーとしては、適切なものであれば、オスミウム錯体、キノン、フェリシアン化物、メチレンブルー、２，６−ジクロロインドフェノール、チオニン、ガロシアニン、インドフェノールおよびこれらの組み合わせ等の任意の酸化還元メディエーターが含まれ得るが、これらに限られるわけではない。さらに、レドックスポリマーは、適切なものであれば、たとえば、アクリル重合またはビニル重合可能な官能基を有する親水性モノマー等のどのような親水性モノマーからでも形成することができるが、これらに限られるわけではない。使用に適するその他の親水性モノマーの例としては、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、グリセリンメタクリレートおよびアクリルアミドが含まれる。メディエーターと親水性モノマーとが異なる場合には、図２で示されるプロセスに、それに準じた変更が必要である。

本発明の実施形態に係る電気化学に基づくセンサーへの使用に適したレドックスポリマーは、たとえば、酸化還元メディエーターに親水性ポリマー｛たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）｝をグラフトすることによって形成することもできる。図３は、ＰＥＧにＶＦｃをグラフトして、本発明の例示的実施形態に係る電気化学に基づくセンサーに使用するためのレドックスポリマー３００を形成するための反応経路を示している。図３に示された反応経路は、スチレンの存在下、過酸化ベンゾイルを開始剤として使用し、水素引抜機構によりレドックスポリマー３００を形成するものである。

図４は、フェロセンカルボキシアルデヒドにＰＥＩをグラフトして、本発明に係る電気化学に基づくセンサーの実施形態で使用するのに適したレドックスポリマー４００を形成するための反応経路を表している。図４の反応経路では、ＰＥＩの第二級アミン基が、フェロセンカルボキシアルデヒドのアルデヒド基とシッフ塩基（すなわちイミン）を形成する。シッフ塩基結合の形成は不安定であるため、このイミンを第三級アミンに還元するのに水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ₄）が使用される。

本発明の実施形態に係る電気化学に基づくセンサーの更なる態様と利益とを、以下の例により示す。

図２のレドックスポリマー２００の５％｛リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）｝溶液を用いたサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を、ガラス状カーボン電極（ＧＣＥ）を使用し、５０ｍＶ／ｓで、−０．１〜０．５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間で行った。これにより図５の曲線５００が得られた。この曲線は、レドックスポリマー２００が、ガラス状カーボン電極で酸化還元上活性であることを示している。

ついで、グルコースオキシダーゼ（酸化還元酵素）をＰＢＳに添加し、０．０５重量％の濃度にした。その後のＣＶスキャンの酸化還元ピークは、図５の曲線５１０で示すように、僅かに減少した。曲線５００に対する曲線５１０の酸化還元ピークの僅かな減少は、グルコースオキシダーゼの添加による僅かな希釈および／またはグルコースオキシダーゼの吸着による小部分のＧＣＥのパッシベーションに帰することができる。

ついで、グルコースをＰＢＳに添加して１００ｍＭの濃度にした。この添加により、図５のＣＶ曲線５２０により示されるように、酸化電流が増加した。グルコースオキシダーゼが、電極表面の全フェリセニウム部分をフェロセン部分に変換したので、曲線５２０内には還元波は観察されなかった。曲線５２０の特徴的形状は、極大電流がグルコース濃度に比例する接触波と称することもできる。

図２のレドックスポリマー２００を２−イソプロパノールに溶解した５％溶液にＧＣＥを浸漬した。ついで、ＧＣＥをこの５％溶液から取り出し、乾燥させた。ついで、このＧＣＥをＰＢＳに浸漬し、２０ｍＶ／ｓで、−０．１〜０．５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間でＣＶのテストを行った。ＣＶスキャンを続けると、酸化還元ピークの大きさが、図６に示すように急速に減少した。これは、レドックスポリマー２００をＧＣＥの近傍にトラップする透析膜がないと、レドックスポリマー２００がＧＣＥから洗い落されてしまうことを示している。

レドックスポリマー２００を２−イソプロパノールに溶解した５％（ｗ／ｖ）の溶液の０．５μＬを、炭素電極（２．２５ｍｍ×２．２５ｍｍ）上に塗布し、ついで、５０℃のオーブンで約５分間乾燥することにより、被覆電極を作製した。ついで、２％（ｗ／ｖ）のセルロースアセテート（ＣＡ）と０．７％のＰＥＧとのアセトン溶液を調製することにより、被覆電極上に透析膜を形成した。

次に、この被覆電極に０．８μＬのＣＡ／ＰＥＧ混合物を塗布し、５０℃のオーブンで３０分間乾燥した。ＣＡ／ＰＥＧ混合物により、炭素電極の近傍に大きな分子量のレドックスポリマー２００を保持する、流延法による透析膜が作製された。直上の記載のようにして作製したＧＣＥをＰＢＳに浸漬し、２０ｍＶ／ｓで、−０．１〜０．５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間でＣＶのテストを行った。ＣＶスキャンを続けると、酸化還元ピークの大きさは、電極の初期の濡れによりまず増加し、ついで、図７に示すように、徐々に減少した。図７で観察された減少率が、図６で観察された率より小さい点に留意する必要がある。これは、この実施例の透析膜が、炭素電極の近傍におけるレドックスポリマー２００のトラップに役立ったことを示している。

レドックスポリマー２００の５％（ｗ／ｖ）溶液の０．５μＬを炭素電極（２．２５ｍｍ×２．２５ｍｍ）上に塗布し、ついで、５０℃のオーブンで約５分間乾燥することにより、電気化学に基づくグルコースセンサーで透析膜のないものを作製した。次に、ＰＢＳ中グルコースオキシダーゼの１０％（ｗ／ｖ）溶液の１μＬを電極に塗布し、ついで、５０℃のオーブンで１０分間乾燥した。

電気化学に基づくグルコースセンサーに被覆用の透析膜を含めた以外は実施例４と同様にして電気化学に基づくグルコースセンサーを作製した。さらに具体的には、この被覆用の透析膜は、２％（ｗ／ｖ）のＣＡと０．７％のＰＥＧを含むアセトン溶液から作製した流延法による高分子膜であった。この透析膜は、実施例４に記載されたような電気化学に基づくグルコースセンサーに、このＣＡ／ＰＥＧ混合物の０．８μＬを塗布し、ついで、５０℃のオーブンで３０分間乾燥することにより形成した。このＣＡ／ＰＥＧ溶液から形成した、流延法による透析膜は、小さな分子量の検体（たとえばグルコース）を透過させる一方、大きな分子量のレドックスポリマー２００と酸化還元酵素（すなわちグルコースオキシダーゼ）とを保持する。

実施例４の電気化学に基づくグルコースセンサー（透析膜なし）および、実施例５の電気化学に基づくグルコースセンサー（透析膜あり）を、１００ｍＭのグルコースの存在下、独立にテストした。それぞれの電気化学に基づくセンサーの作用電極を、大気開放中、室温下、２０ｍＶ／ｓの速度で、−０．１〜０．５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間でスキャンした。得られた接触波は、１００分間の時間的間隔について１０分ごとに記録した。

図８−Ａと８−Ｂとから、電気化学に基づくグルコースセンサーで透析膜を持たないものについては、接触波の酸化電流が急速に減少することが示された。これは、そのような電気化学に基づくグルコースセンサーの電極からレドックスポリマー２００が洗い落とされたことを示唆している。しかしなから、透析膜を含んだ電気化学に基づくグルコースセンサーでは、接触波の酸化電流がより緩慢に減少した。従って、酸化還元メディエーターと酸化還元酵素とが、透析膜によって、電極の近傍に保持されたことが示された。

透析膜が、ＰＥＩとＰＰＧＤＧＥとを含んだ架橋ポリマーフィルムである以外は実施例５と同様にして、電気化学に基づくグルコースセンサーで透析膜を有するものを作製した。このような透析膜を形成するには、５２ｍｇのＰＥＩと１０６ｍｇのＰＰＧＤＧＥとを混合して、ＰＥＩ／ＰＰＧＤＧＥを１ｍＬの２−イソプロパノールに加えた混合物を形成した。次に、０．８μＬのＰＥＩ／ＰＰＧＤＧＥ混合物を、（上記実施例４と同様にして作製した）被覆炭素電極に塗布し、５０℃のオーブンで３０分間乾燥した。ＰＥＩとＰＰＧＤＧＥとの溶液から形成した透析膜は、架橋ポリマー透析膜の形状を持ち、小さな分子量の検体（たとえばグルコース）を通過させる一方、大きな分子量のレドックスポリマー２００と酸化還元酵素とを保持する。

ＰＥＩとＰＰＧＤＧＥとの溶液から作られた架橋ポリマー透析膜の親水性により、水溶液と接触するときに膜が膨潤するものと考えられる。ただし、本発明がこの考え方に制約されるわけではない。この膨潤により、架橋ポリマー透析膜にヒドロゲルの特性が付与される。したがって、得られた膜は、ヒドロゲル層と称することができる。さらに、そのようなヒドロゲル層を通る比較的低分子量の検体（たとえばグルコース）の浸透は、比較的高分子量のレドックスポリマーや酸化還元酵素の浸透よりずっと速い。

１０．４ｇのＮＶＰ、０．８７ｇのビニルフェロセン（ＶＦｃ）および０．１１ｇの２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を使用するフリーラジカル共重合で、本発明に係る電気化学に基づくセンサーへの使用に適したレドックスポリマーを合成した（図２の反応経路を参照されたい）。本反応は丸底フラスコで行った。反応を開始する前に、１時間、反応溶液に窒素を通すバブリングを行うことにより酸素を除去した。ついで、反応フラスコを、窒素雰囲気下、２４時間、マグネチックスターラーで連続的に撹拌しつつ、油浴で７０℃に加熱した。

得られたレドックスポリマーをジクロロメタンに溶解し、この溶液からジエチルエーテルで沈殿させた。次に、沈殿したレドックスポリマーをろ過し、５０℃のオーブンで乾燥した。その後、このレドックスポリマーの低分子量部分を、脱イオン水に対する透析により除去した。透析チューブは、カットオフ分子量が１６Ｋｇ／モルのセルロース膜であった。

本発明の実施形態に係る電気化学に基づくセンサーへの使用に適したレドックスポリマーを、（図３に示すように）グラフトプロセスにより合成した。最初、０．６ｇのＶＦｃを２．１ｇのスチレンに溶解することによってＶＦｃ溶液を作製した。０．２４ｇの過酸化ベンゾイル（７０％）を１．３７ｇのキシレン中に懸濁することによって、別の容器に過酸化ベンゾイルの懸濁液を作製した。１０ｇのＰＥＧ（分子量８Ｋｇ／モル）と２０ｇのエトキシエタノールとを混合し、ついで９０℃まで暖めることにより、さらに別の容器にＰＥＧ溶液を作製した。

次に、９０℃で、ＰＥＧ溶液にＶＦｃ溶液を添加し、ＶＦｃ／ＰＥＧ混合物を形成した。ＶＦｃ溶液の添加の直後、過酸化ベンゾイル懸濁液をＶＦｃ／ＰＥＧ混合物に添加し、反応混合物を形成した。グラフトが開始されると、反応混合物は赤橙色の単一相を形成した。反応混合物を９０℃で２時間撹拌し、ついで７０℃で一晩撹拌を継続した。その後、反応混合物を５０ｍＬのＡｎａｌａｒグレードの水に移し、レドックスポリマーを含む赤色／褐色のエマルジョンを形成させた。この赤色／褐色のエマルジョンは、本発明の実施形態に係る電気化学に基づくグルコースセンサーを作製する場合におけるＧＣＥの被覆への使用に適するものであった。

本発明の実施形態に係る電気化学に基づくセンサーへの使用に適したさらに他のレドックスポリマーを、（図４に示すように）グラフトプロセスによって合成した。この合成では、０．３ｇのフェロセンカルボキシアルデヒドを、５０ｍＬの乾燥メタノールおよび１８ｇのＰＥＩと混合し、反応混合物を形成した。ＰＥＩの数平均分子量（Ｍｎ）は１０Ｋｇ／モルであり、重量平均分子量（Ｍｗ）は２５Ｋｇ／モルであった。

ついで、反応溶液を、環境下で２時間撹拌した。反応は、反応溶液を分取し、メタノール溶離液を用いる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を実行することによってモニターした。ＴＬＣテストの結果、２時間後に全フェロセンカルボキシアルデヒドが反応してイミンになったことが示された。

次に、１００ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを１０ｍＬのメタノールに添加した。次に、これを上記反応溶液に加え、イミンを第三級アミンに還元した。水素化ホウ素ナトリウムを加えた後、反応溶液をさらに２時間撹拌し、続いて、１５ｍＬの水を徐々に添加した。次に、水素化ホウ素ナトリウムの全てを確実に反応させるため、さらに２０ｍＬの水を急速に添加した。ついで、反応溶液を１００ｍＬのジエチルエーテルで抽出し、可能性のある有機不純物を全て除去した。ついで、この有機相を廃棄した。この抽出ステップの後、反応溶液を、７０℃のオーブンで一晩かけて乾燥し、本発明に係る電気化学に基づくセンサーの形態への使用に適したレドックスポリマーを得た。

本発明を実施するに当たり、本発明の実施形態の代替形態を種々採用し得ることが理解されるべきである。添付のクレームは本発明の範囲を定義するものであり、これらのクレームの範囲内にある構造物およびそれらの均等物は本発明によりカバーされるものであることが意図されている。

本発明の具体的な実施態様は以下の通りである。

（１）電気化学に基づくセンサーであって、
少なくとも１つの電極表面を有する電極と、
当該電極表面上に載置したフィルムであって、
酸化還元酵素と、
親水性レドックスポリマーと
を含むフィルムと、
当該フィルム上に載置した透析膜と
を含んでなり、
当該透析膜が、当該電極近傍のレドックスポリマーをトラップする役目を果たす、
電気化学に基づくセンサー。
（２）前記透析膜が、架橋ポリマー透析膜である、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。
（３）水溶液と接触すると、前記架橋ポリマー透析膜がヒドロゲル層を形成する、実施態様３に記載の電気化学に基づくセンサー。
（４）前記透析膜が、流延法による透析膜である、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。
（５）前記酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。

（６）前記レドックスポリマーが、Ｎ−ビニルピロリジノンとビニルフェロセンとの共重合によって合成されたものである、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。
（７）前記レドックスポリマーが、ポリエチレングリコールにビニルフェロセンをグラフトすることによって合成されたものである、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。
（８）前記レドックスポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）にフェロセンカルボキシアルデヒドをグラフトすることによって合成されたものである、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。
（９）前記レドックスポリマーが、１０ｋｇ／ｍｏｌ（１０，０００ダルトン）を超える分子量を有する、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。
（１０）酸化還元酵素が、５ｋｇ／ｍｏｌ（５，０００ダルトン）を超える分子量を有する、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。

（１１）前記電極が作用電極である、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。
（１２）さらに作用電極を含んでなる、実施態様１に記載の電気化学に基づくセンサー。

本発明の原理を利用した例示的実施形態に関する詳細な説明および以下に説明する添付図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良い理解が得られるであろう。
本発明の例示的実施形態に係る電気化学に基づくセンサーの一部の上面の略図である。 図１Ａの電気化学に基づくセンサーの１Ｂ−１Ｂ線に沿った断面の略図である。 図１Ａの電気化学に基づくセンサーの１Ｃ−１Ｃ線に沿った断面の略図である。 図１Ａの電気化学に基づくセンサーの１Ｄ−１Ｄ線に沿った断面の略図である。 Ｎ−ビニルピロリジノン（ＮＶＰ）とビニルフェロセン（ＶＦｃ）との共重合により、本発明の例示的実施形態に係る電気化学に基づくセンサーに使用されるレドックスポリマーを形成する様子を簡略に示している。 ＶＦｃのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）へのグラフトにより、本発明の例示的実施形態に係る電気化学に基づくセンサーに使用されるレドックスポリマーを形成する様子を簡略に示している。 フェロセンカルボキシアルデヒドをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）にグラフトするための反応経路を簡略に示している。 図２のレドックスポリマーを含む種々の溶液でテストした電極のサイクリックボルタンモグラムである。 図２のレドックスポリマーで被覆された電極について、透析膜がない場合に得られたサイクリックボルタンモグラムである。 図２のレドックスポリマーで被覆され、ついで透析膜で被覆された電極について得られたサイクリックボルタンモグラムである。 図２のレドックスポリマーとグルコースオキシダーゼで被覆された電極の、透析膜がある場合とない場合とに関し、グルコース接触電流（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｕｒｒｅｎｔ）の大きさを、１００分間の測定について、時間の関数として表したものである。 図８Ａの測定の最初の１０分間について強調して表したものである。

符号の説明

１００ 電気化学に基づくセンサー
１０２ 基板
１０４ａ 参照電極
１０４ｂ 作用電極
１０６ａ 電極表面
１０６ｂ 電極表面
１０８ フィルム
１１０ 透析膜
１１２ 絶縁層
１１４ 参照インク層
２００ レドックスポリマー
３００ レドックスポリマー
４００ レドックスポリマー
５００ 曲線
５１０ 曲線
５２０ 曲線

Claims (9)

1. 電気化学に基づくセンサーであって、
   少なくとも１つの電極表面を有する電極と、
   当該電極表面上に載置したフィルムであって、酸化還元酵素と親水性レドックスポリマーとを含むフィルムと、
   当該フィルム上に載置した透析膜と
   を含んでなり、
   当該透析膜が、水溶液と接触するとヒドロゲル層を形成する架橋ポリマー透析膜であり、当該透析膜が、当該電極近傍のレドックスポリマーをトラップする役目を果たす、
   電気化学に基づくセンサー。
2. 前記酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項１に記載の電気化学に基づくセンサー。
3. 前記レドックスポリマーが、Ｎ−ビニルピロリジノンとビニルフェロセンとの共重合によって合成されたものである、請求項１に記載の電気化学に基づくセンサー。
4. 前記レドックスポリマーが、ポリエチレングリコールにビニルフェロセンをグラフトすることによって合成されたものである、請求項１に記載の電気化学に基づくセンサー。
5. 前記レドックスポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）にフェロセンカルボキシアルデヒドをグラフトすることによって合成されたものである、請求項１に記載の電気化学に基づくセンサー。
6. 前記レドックスポリマーが、１０ｋｇ／ｍｏｌ（１０，０００ダルトン）を超える分子量を有する、請求項１に記載の電気化学に基づくセンサー。
7. 酸化還元酵素が、５ｋｇ／ｍｏｌ（５，０００ダルトン）を超える分子量を有する、請求項１に記載の電気化学に基づくセンサー。
8. 前記電極が作用電極である、請求項１に記載の電気化学に基づくセンサー。
9. さらに参照電極を含んでなる、請求項８に記載の電気化学に基づくセンサー。

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