JP4668845B2

JP4668845B2 - Micro slicer

Info

Publication number: JP4668845B2
Application number: JP2006156393A
Authority: JP
Inventors: 泰司篠田; 公石倉; 芳光藤原; 泰行相良; 謙一工藤; 純一杉山; 甲洙都
Original assignee: Mayekawa Manufacturing Co
Current assignee: Mayekawa Manufacturing Co
Priority date: 2006-06-05
Filing date: 2006-06-05
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2026-06-05
Also published as: JP2007322386A

Description

本発明は、生体等の試料を冷凍して例えば１μｍ程度の微小厚さでスライスするマイクロスライサに係り、特に、例えば−１６０℃という低温を保ちながら試料を微小厚さでスライスできるマイクロスライサに関するものである。 The present invention relates to a micro slicer that freezes a sample such as a living body and slices the sample at a minute thickness of, for example, about 1 μm, and particularly relates to a micro slicer that can slice a sample at a minute thickness while maintaining a low temperature of −160 ° C., for example. It is.

生体試料等を顕微鏡観察用として例えば１μｍ程度に薄くスライスする装置は、従来、ミクロトームと称して回転するカッターを有し、パラフィンなどで固めた試料をスライスする装置が知られている。また、パラフィンなどで固めることが困難な試料は、凍結可能な流体と共に凍結させてスライスすることも行われている。 2. Description of the Related Art Conventionally, an apparatus for slicing a biological sample or the like as thin as about 1 μm for microscopic observation has conventionally been known as an apparatus that has a rotating cutter called a microtome and slices a sample solidified with paraffin or the like. In addition, samples that are difficult to harden with paraffin or the like are also frozen and sliced together with a freezeable fluid.

そしてこのように試料を凍結してスライスする場合、凍結とスライスを別な場所で行うと、凍結した流体や試料が融けたり、流体と共に凍結した試料の保持を的確に行うことが困難という問題が生じる。また、研究者が用いる試料の中には、例えば−１６０℃という低温を保ちながらスライスと観察まで実施でき、かつ、試料内部の凍結部の結晶軸が１方向であるようにしたい、というような要求もある。 And when freezing and slicing the sample in this way, if the freezing and slicing are performed at different locations, the frozen fluid or sample will melt or it will be difficult to accurately hold the frozen sample together with the fluid. Arise. In addition, some samples used by researchers want to be able to perform slicing and observation while maintaining a low temperature of −160 ° C., for example, and that the crystal axis of the frozen part inside the sample is in one direction. There is also a demand.

そのため例えば特許文献１には、流体に浸した状態で入れた試料を一体的に凍結させることのできる、上端が開放されて、冷却部と、試料のスライスに際して試料を容易に押し出すことができるよう、凍結した試料の周囲を解凍するための面状ヒータとを備えた筒状の容器を冷凍ユニットとして設け、さらに、先端がこの筒状の容器の底部を貫通して内部に伸びる送り軸を設けて、流体と共に凍結した試料を少しずつ送り出してカッターでスライスするようにした装置が提案されている。 For this reason, for example, Patent Document 1 discloses that a sample put in a fluid can be frozen as a single body, the upper end is opened, and the sample can be easily pushed out when the cooling unit and the sample are sliced. A cylindrical container provided with a planar heater for thawing the periphery of the frozen sample is provided as a refrigeration unit, and a feed shaft whose tip extends through the bottom of the cylindrical container and extends into the interior is provided. Thus, an apparatus has been proposed in which a sample frozen together with a fluid is fed out little by little and sliced with a cutter.

また、このように試料をスライスする装置を構成しても、冷却されていない空間に試料が押し出されると試料温度は当然上昇し、かつ、スライスすることによるカッターとの摩擦で更に温度が上昇する可能性がある。そのため特許文献２には、試料を凍結させたままスライスできるようにするため、クライオチャンバ内にミクロトームを収容し、温度変化に関して高いダイナミクスを実現できるよう、互いの温度に無関係に調整自在とした冷却可能な標本（試料）ホルダと冷却可能なカッタホルダとを設け、それぞれ温度制御してきわめて高品質のスライスが得られるようにしたクライオスタットミクロトームが示されている。 Even if the apparatus for slicing the sample is configured as described above, the sample temperature naturally rises when the sample is pushed out into an uncooled space, and the temperature further increases due to friction with the cutter caused by slicing. there is a possibility. Therefore, in Patent Document 2, in order to allow the sample to be sliced while being frozen, the microtome is accommodated in the cryochamber, and cooling can be adjusted independently of each other temperature so that high dynamics with respect to temperature change can be realized. A cryostat microtome is shown in which a possible specimen (sample) holder and a coolable cutter holder are provided and the temperature is controlled to obtain extremely high quality slices.

特開平１１−１１８６７９号公報Japanese Patent Laid-Open No. 11-118679 特開平１０−１１１２１９号公報JP-A-10-111219

しかしながら、特許文献１に示された装置は、前記したように凍結した試料の周囲を面状ヒータで解凍しているためその解凍時に試料に温度勾配が生じ、かつ、冷却されていない空間に試料が押し出された場合、試料温度は当然上昇する。また、スライスすることによるカッターとの摩擦で更に温度が上昇する可能性があり、さらに、試料を側面から冷却しているため、試料内部の凍結部の結晶軸がランダムとなる。また特許文献２に示されたクライオスタットミクロトームは、標本（試料）ホルダとカッタホルダの両者が冷却可能な大きさであることが必要で、大きな試料の場合はそれだけ装置が大がかりになり、コストも上昇してしまう。 However, since the apparatus shown in Patent Document 1 is defrosted around a frozen sample with a planar heater as described above, a temperature gradient is generated in the sample at the time of thawing, and the sample is placed in an uncooled space. When is pushed out, the sample temperature naturally rises. Further, there is a possibility that the temperature further rises due to friction with the cutter by slicing, and furthermore, since the sample is cooled from the side surface, the crystal axis of the frozen portion inside the sample becomes random. The cryostat microtome disclosed in Patent Document 2 requires that both the specimen (sample) holder and the cutter holder can be cooled, and in the case of a large sample, the apparatus becomes much larger and the cost increases. End up.

そのため本発明においては、凍結した際に内部の結晶軸が１方向となるようにし、かつ、試料内部に温度勾配を生じさせずに例えば−１６０℃という低温を保ちながらスライスできる、簡単な構成のマイクロスライサを提供することが課題である。 Therefore, in the present invention, the internal crystal axis becomes one direction when frozen, and the slice can be sliced while maintaining a low temperature of −160 ° C. without causing a temperature gradient inside the sample. The challenge is to provide a microslicer.

上記課題を解決するため本発明におけるマイクロスライサは、
本体内部に冷媒用配管が設けられて包埋材と共に切断される試料を凍結させる冷却容器と、前記凍結した試料と包埋材とからなる凍結体を前記本体上面から押し出す押し出し部材と、上面に押し出された前記凍結体を微小厚さでスライスするカッタとを有するマイクロスライサにおいて、
前記冷却容器とは別個に設けられて冷媒用配管が配されたダミー用冷却容器で、包埋材と共にダミー用試料を凍結させてダミー凍結体を形成し、該ダミー凍結体の検知温度に基づいて、少なくとも前記冷却容器に導入される冷媒の流量もしくは圧力を制御して前記凍結体の温度を一定に保ちながらスライスできるようにしたことを特徴とする。 In order to solve the above problems, the micro slicer in the present invention is:
A cooling vessel in which a refrigerant pipe is provided inside the main body and freezes the sample to be cut together with the embedding material, an extruding member for extruding a frozen body made of the frozen sample and the embedding material from the upper surface of the main body, and an upper surface In a micro slicer having a cutter for slicing the extruded frozen body with a minute thickness,
A dummy cooling container provided separately from the cooling container and provided with a refrigerant pipe. The dummy sample is frozen together with the embedding material to form a dummy frozen body. Based on the detected temperature of the dummy frozen body. Thus, the flow rate or pressure of the refrigerant introduced into the cooling container is controlled to enable slicing while keeping the temperature of the frozen body constant.

このように、スライスする試料と略同じ条件でダミー用試料を凍結させるダミーの冷却容器を用意すると共に、ダミー用試料の温度を検知して少なくとも冷却容器に導入される冷媒の流量もしくは圧力を制御し、スライスする試料を常に一定の温度に保ちながらスライスできるようにしたことで、非常に簡単な構成で試料を常に一定の温度に保ちながらスライスすることが可能となり、研究者の望むような顕微鏡観察用試料を容易に提供することができる。 In this way, a dummy cooling container for freezing the dummy sample under substantially the same conditions as the sample to be sliced is prepared, and at least the flow rate or pressure of the refrigerant introduced into the cooling container is controlled by detecting the temperature of the dummy sample In addition, since the sample to be sliced can be sliced while always maintaining a constant temperature, it becomes possible to slice the sample while maintaining the constant temperature with a very simple configuration. An observation sample can be easily provided.

また、前記試料及びダミー用試料と包埋材とを、切削可能な常温で固体の試料容器に収容して前記冷却容器及びダミー用冷却容器で冷却することで、試料を研究者の望む姿勢で凍結させることができるマイクロスライサとすることができる。 In addition, the sample and dummy sample and the embedding material are accommodated in a solid sample container at a normal temperature that can be cut, and cooled by the cooling container and dummy cooling container, so that the sample is in a posture desired by a researcher. It can be a micro slicer that can be frozen.

そして、前記固体の試料容器とダミー用試料容器とは金属製の前記冷却容器とダミー用冷却容器のそれぞれ上面に載置され、前記本体上面には、前記試料容器とダミー用試料容器とをガイドするガイド穴が設けられて、前記押し出し部材は前記金属製の冷却容器と共に固体の試料容器を前記ガイド穴から本体上面に押し出してスライスできるようにしたことで、固体の試料容器とダミー用試料容器とは、それぞれ金属製の冷却容器とダミー用冷却容器によってその底面から冷却されるから、凍結体は結晶軸が１方向となる。 The solid sample container and the dummy sample container are placed on the upper surfaces of the metal cooling container and the dummy cooling container, respectively, and the sample container and the dummy sample container are guided on the upper surface of the main body. A guide hole is provided, and the push-out member pushes a solid sample container together with the metal cooling container into the upper surface of the main body so as to be sliced, so that the solid sample container and the dummy sample container can be sliced. Is cooled from the bottom by a metal cooling vessel and a dummy cooling vessel, respectively, and the frozen body has a crystal axis in one direction.

そして、前記ダミー凍結体と前記それぞれの冷却用容器内の温度を検知し、その温度偏差に基づいて少なくとも前記冷却容器に導入される冷媒の流量もしくは圧力を制御し、前記凍結体の温度を一定に保ちながらスライスできるようにしたことで、さらに正確な温度制御が可能となる。 And the temperature in the said dummy frozen body and each said cooling container is detected, the flow volume or pressure of the refrigerant | coolant introduce | transduced into the said cooling container is controlled based on the temperature deviation, and the temperature of the said frozen body is fixed. By making it possible to slice while maintaining the temperature, more accurate temperature control becomes possible.

また、前記冷却用配管の冷却容器とダミー用冷却容器のそれぞれにおける少なくとも後流側に、対応した圧力で開閉する圧力弁を設けたことで、冷却容器とダミー用冷却容器それぞれの温度制御が容易になり、さらに、前記冷媒が、液体窒素、低温用ブラインを含む極低温液体冷媒とすることが本発明の好適な実施形態である。 In addition, by providing a pressure valve that opens and closes at a corresponding pressure at least on the downstream side of each of the cooling vessel and the dummy cooling vessel of the cooling pipe, it is easy to control the temperature of each of the cooling vessel and the dummy cooling vessel. Furthermore, it is a preferred embodiment of the present invention that the refrigerant is a cryogenic liquid refrigerant containing liquid nitrogen and low-temperature brine.

以上記載のごとく本発明になるマイクロスライサは、非常に簡単な構成で例えば−１６０℃という低温に冷却したまま試料内部に温度勾配を生じさせずに、かつ、凍結した際に内部の結晶軸が１方向となるようにして試料を微小厚さにスライスすることが可能であり、研究者の望むような顕微鏡観察用試料を提供することができる。 As described above, the micro slicer according to the present invention has a very simple configuration, for example, without causing a temperature gradient inside the sample while being cooled to a low temperature of −160 ° C., and has an internal crystal axis when frozen. The sample can be sliced to a minute thickness in one direction, and a sample for microscopic observation as desired by a researcher can be provided.

以下、図面を参照して本発明の好適な実施例を例示的に詳しく説明する。但しこの実施例に記載されている構成部品の寸法、材質、形状、その相対的配置等は特に特定的な記載がない限りは、この発明の範囲をそれに限定する趣旨ではなく、単なる説明例に過ぎない。 Hereinafter, exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. However, the dimensions, materials, shapes, relative arrangements, and the like of the components described in this embodiment are not intended to limit the scope of the present invention unless otherwise specified, but are merely illustrative examples. Not too much.

図１は本発明になる実施例１のマイクロスライサの概略ブロック図、図２は図１に示したマイクロスライサにおける冷却容器内部の概略説明図、図３は本発明になる実施例２のマイクロスライサの概略ブロック図である。 1 is a schematic block diagram of a microslicer according to a first embodiment of the present invention, FIG. 2 is a schematic explanatory diagram of the inside of a cooling container in the microslicer shown in FIG. 1, and FIG. 3 is a microslicer according to the second embodiment of the present invention. FIG.

図１に示した本発明の実施例１のマイクロスライサ１０は、生体等の試料と、凍結したときにこの試料を一定の姿勢でスライスできるよう液体の包埋材とを収容し、例えばパラフィンなどの切削可能な材料で形成した固体容器２８_１を載置して、液体窒素タンク１７からの配管１８が接続された冷却用金属製容器１１と、この冷却用金属製容器１１の底部を押して、凍結した試料と包埋材とを収容した固体容器２８_１をマイクロスライサ本体上壁２９上に押し出す押し出し部材１３と、押し出された固体容器２８_１内の凍結された試料が、カッター駆動装置１５によって回転するカッター１４で固体容器２８_１ごと、正確にスライスされるようガイドする、マイクロスライサ本体上壁２９に設けられた第１のガイド１２を有している。 A micro slicer 10 according to the first embodiment of the present invention shown in FIG. 1 contains a sample such as a living body and a liquid embedding material so that the sample can be sliced in a fixed posture when frozen. by placing the solid container 28 ₁ formed in cuttable material, and the cooling metal container 11 which pipe 18 is connected from the liquid nitrogen tank 17, by pushing the bottom of the cooling metal container 11, a push-out member 13 for pushing frozen sample and embedding material and a solid container 28 ₁ containing the above micro slicer body upper wall 29, frozen samples of extruded solid container 28 ₁ is, by the cutter drive 15 each solid container 28 ₁ by a cutter 14 to rotate and guide to be accurately sliced, and has a first guide 12 provided in the micro-slicer body upper wall 29.

また、本発明の実施例１のマイクロスライサ１０は、冷却用金属製容器１１と同様液体窒素タンク１７からの配管１８が接続され、冷却用金属製容器１１に設けられた第１のガイド１２と同様、マイクロスライサ本体上壁２９に設けられた第２のガイド２２が取り付けられて、ダミー用試料と包埋材とを収容したダミー固体容器２８_２を凍結させるダミーの冷却用金属製容器２１が用意されている。 Further, the micro slicer 10 according to the first embodiment of the present invention is connected to the pipe 18 from the liquid nitrogen tank 17 in the same manner as the cooling metal container 11, and the first guide 12 provided in the cooling metal container 11 Similarly, the second guide 22 is attached which is provided on the micro-slicer body upper wall 29, the cooling metal container 21 of the dummy is to freeze dummy solids vessel 28 ₂ accommodating a dummy sample and the embedding material It is prepared.

この冷却用金属製容器１１とダミーの冷却用金属製容器２１の内部の概略を示したのが図２である。なお、説明を簡略化するため、この図２では冷却用金属製容器１１の内部のみを示したが、ダミーの冷却用金属製容器２１内部も全く同様に構成されている。 FIG. 2 shows an outline of the inside of the cooling metal container 11 and the dummy cooling metal container 21. In order to simplify the description, only the inside of the cooling metal container 11 is shown in FIG. 2, but the inside of the dummy cooling metal container 21 is also configured in exactly the same manner.

図２において破線で示した１１は冷却用金属製容器であり、その内部には、液体窒素タンク１７から送られる液体窒素１７１を気化させて冷却用金属製容器１１を冷却する円柱型容器１１１が設けられ、ここで気化した液体窒素１７１は気体窒素１７２として図１における第１圧力バルブ１９へ送られる。 In FIG. 2, 11 indicated by a broken line is a cooling metal container, and a cylindrical container 111 for cooling the cooling metal container 11 by evaporating the liquid nitrogen 171 sent from the liquid nitrogen tank 17 is provided therein. The liquid nitrogen 171 provided and vaporized here is sent to the first pressure valve 19 in FIG. 1 as gaseous nitrogen 172.

そして固体容器２８_１はこの冷却用金属製容器１１の上に載置され、円柱型容器１１１が冷却されることで冷却された冷却用金属製容器１１によって下面から冷却される。そのため、固体容器２８_１内に収容された試料と包埋材とが凍結した凍結体は、結晶軸が１方向となり、かつ、ヒータを用いないから凍結体に温度勾配が生じる心配がない。 The solid container 28 ₁ is placed on the cooling metal container 11, cylindrical container 111 is cooled from the lower surface by the cooling metal container 11 that is cooled by being cooled. Therefore, the frozen body of the sample and embedding material contained in the solid container 28 ₁ is frozen, the crystal axis becomes one direction and, there is no risk that the temperature gradient occurs in the frozen bodies do not use the heater.

そして液体窒素タンク１７から送り出される液体窒素の流量を調整できるよう、冷却用金属製容器１１、ダミー冷却用金属製容器２１の後流に、第１圧力バルブ１９、第１圧力センサ２０、第２圧力バルブ２５、第２圧力センサ２６が用意され、また、温度制御のため冷却用金属製容器１１には、例えば熱電対などの第１温度センサをその内部の１６で示した部位に設置し、ダミーの冷却用金属製容器２１にはその内部の２３で示した部位に第２温度センサが、スライスされる試料の代わりに温度履歴を調べるため、包埋材と共に凍結してダミー凍結体となるダミー用試料に２４で示した第３温度センサが設置されている。 The first pressure valve 19, the first pressure sensor 20, and the second pressure downstream of the cooling metal container 11 and the dummy cooling metal container 21 are adjusted so that the flow rate of the liquid nitrogen delivered from the liquid nitrogen tank 17 can be adjusted. A pressure valve 25 and a second pressure sensor 26 are prepared, and a first temperature sensor such as a thermocouple is installed in a portion indicated by 16 inside the cooling metal container 11 for temperature control. The dummy cooling metal container 21 has a second temperature sensor at a portion indicated by reference numeral 23 in the inside thereof, and in order to check the temperature history instead of the sliced sample, it is frozen together with the embedding material to become a dummy frozen body. A third temperature sensor indicated by 24 is installed in the dummy sample.

そして、スライスされる包埋材と共に凍結して凍結体となった試料を収容した固体容器２８_１が、押し出し部材１３によって冷却用金属製容器１１と共に押し上げられ、固体容器２８_１がマイクロスライサ本体上壁２９から押し出され、さらにカッター１４でスライスされることで温度が変化することを防止するため、これら１６で示した第１温度センサ設置部位、２３で示した第２温度センサ設置部位、２４で示した第３温度センサを設置されたダミー凍結体などからの温度情報と、第１圧力センサ２０、第２圧力センサ２６からの液体窒素の圧力情報を元に、温度履歴による偏差を見ながら、例えば、第３温度センサと第２温度センサからの温度差を見て第１温度センサからの温度で凍結体の温度を、ＰＩＤ動作などを用いて予測制御し、少なくとも第１圧力バルブ１９を調節して、ダミー凍結体とは異なった温度となる、スライスする試料を含む凍結体の温度が常時一定となるよう、液体窒素タンク１７から送られる液体窒素の流量を制御し、試料の温度を一定に保つ制御装置２７が設けられている。 Then, the solid container 28 ₁ containing the sample became frozen body was freeze with embedding material is sliced is pushed up together with the cooling metal container 11 by the pushing member 13, the solid container 28 ₁ micro slicer on the body In order to prevent the temperature from being changed by being pushed out from the wall 29 and further sliced by the cutter 14, the first temperature sensor installation site indicated by 16, the second temperature sensor installation location indicated by 23, 24 Based on the temperature information from the dummy frozen body or the like where the third temperature sensor shown and the pressure information of the liquid nitrogen from the first pressure sensor 20 and the second pressure sensor 26, while watching the deviation due to the temperature history, For example, the temperature difference between the third temperature sensor and the second temperature sensor is observed, and the temperature of the frozen body is predicted using the temperature from the first temperature sensor using the PID operation or the like. The flow rate of liquid nitrogen sent from the liquid nitrogen tank 17 is adjusted so that the temperature of the frozen body including the sample to be sliced is always constant by adjusting at least the first pressure valve 19 and having a temperature different from that of the dummy frozen body. And a control device 27 is provided to keep the temperature of the sample constant.

このように構成した本発明のマイクロスライサ１０は、前記したように生体等の試料と液体の包埋材とを収容し、凍結したときにこの試料を一定の姿勢でスライスできるよう、例えばパラフィンなどの切削可能な材料で形成した固体容器２８_１を冷却用金属製容器１１上に載置する。そして、スライスされる試料の代わりとして温度を測定するためのダミーの試料と包埋材とを収容した、ダミーの固体容器２８_２をダミーの冷却用金属製容器２１上に載置して試料と同一条件で凍結させ、制御手段２７により、１６で示した第１温度センサ設置部位、２３で示した第２温度センサ設置部位、２４で示した第３温度センサを設置されたダミー用試料などからの温度情報と、第１圧力センサ２０、第２圧力センサ２６の値を観察しながら、第１圧力バルブ１９、第２圧力バルブ２５の開度を調節して液体窒素タンク１７から液体窒素を冷却用金属製容器１１、ダミー冷却用金属製容器２１に導入し、それぞれに収容した試料とダミー用試料を包埋材と共に冷却する。 The micro slicer 10 of the present invention configured as described above contains a sample such as a living body and a liquid embedding material as described above, and can be sliced in a fixed posture when frozen, for example, paraffin or the like. solid container 28 ₁ formed in cuttable material is placed on the cooling metal container 11. Then, housing a dummy sample and embedding material for measuring the temperature as a replacement for a sample to be sliced, and the sample is placed a dummy solid container 28 ₂ on the dummy cooling metal container 21 The sample is frozen under the same conditions, and is controlled by the control means 27 from the first temperature sensor installation site indicated by 16, the second temperature sensor installation site indicated by 23, the dummy temperature sample provided with the third temperature sensor indicated by 24, and the like. While observing the temperature information and the values of the first pressure sensor 20 and the second pressure sensor 26, the liquid nitrogen tank 17 is cooled by adjusting the opening of the first pressure valve 19 and the second pressure valve 25. It introduces into the metal container 11 for metal and the metal container 21 for dummy cooling, and cools the sample and dummy sample which were accommodated in each with the embedding material.

そして、試料とダミー用試料とが包埋材と共に凍結したら制御装置２７は、押し出し部材１３の図示していない駆動装置に指示し、凍結した試料を収容した固体容器２８_１を冷却用金属製容器１１と共に押し上げ、固体容器２８_１をマイクロスライサ本体上壁２９から所定量ずつ押し出されるよう指示し、そのため、固体容器２８_１は第１のガイド１２にガイドされて上昇してゆく。また制御装置２７は、同時にカッター駆動装置１５によりカッター１４を回転させ、スライス位置に到達した凍結した試料が、所定厚さでスライスされるよう押し出し部材１３の図示していない駆動装置により押し出し量を調節する。 Then, the control unit 27 When the sample and the dummy sample is frozen with encapsulant instructs the drive device (not shown) of the extrusion member 13, the cooling metal container a solid container 28 ₁ containing the frozen sample pushed with 11, the solid container 28 ₁ instructs extruded from micro slicer body upper wall 29 by a predetermined amount, therefore, the solid container 28 ₁ slide into upward guided by the first guide 12. Further, the control device 27 simultaneously rotates the cutter 14 by the cutter driving device 15, and the amount of extrusion is controlled by a driving device (not shown) of the pushing member 13 so that the frozen sample that has reached the slicing position is sliced at a predetermined thickness. Adjust.

また制御装置２７は、この間も前記したように、１６で示した第１温度センサ設置部位、２３で示した第２温度センサ設置部位、２４で示した第３温度センサを設置されたダミー凍結体などからの温度情報と、第１圧力センサ２０、第２圧力センサ２６の値を観察しながら、スライスによって上昇してゆく試料を含む凍結体側温度を、少なくとも第１圧力バルブ１９を調節することで、液体窒素タンク１７から冷却用金属製容器１１、ダミー冷却用金属製容器２１に送られる液体窒素の量を調節して、試料（凍結体）の温度が一定に保たれるようにする。なおこのとき、ダミー凍結体の温度が変化した場合は、当然のことながら、第２圧力バルブ２５も調節してダミー冷却用金属製容器２１側の温度も調節する。 In addition, as described above, the control device 27 also includes a dummy frozen body in which a first temperature sensor installation site indicated by 16, a second temperature sensor installation site indicated by 23, and a third temperature sensor indicated by 24 are installed. By adjusting at least the first pressure valve 19, the temperature of the frozen body including the sample rising by slicing is observed while observing the temperature information from the above and the values of the first pressure sensor 20 and the second pressure sensor 26. The amount of liquid nitrogen sent from the liquid nitrogen tank 17 to the cooling metal container 11 and the dummy cooling metal container 21 is adjusted so that the temperature of the sample (frozen body) is kept constant. At this time, if the temperature of the dummy frozen body changes, as a matter of course, the second pressure valve 25 is also adjusted to adjust the temperature on the dummy cooling metal container 21 side.

そのため、スライスする試料を含む凍結体は、このスライスする試料と略同じ条件で凍結されたダミー用試料を含むダミー凍結体とダミー冷却用金属製容器２１の内部、及び冷却用金属製容器１１の内部のそれぞれに設けられた温度センサで、スライスされる直前の試料と対応するダミー凍結体の温度を監視しながらスライスされるから、例え凍結した試料がマイクロスライサ本体２９外部に押し出されても常に一定の温度に保つことができ、研究者の望むような顕微鏡観察用試料を提供することができる。 Therefore, the frozen body including the sample to be sliced includes the dummy frozen body including the dummy sample frozen under substantially the same condition as the sample to be sliced, the inside of the dummy cooling metal container 21, and the cooling metal container 11. Each temperature sensor provided inside each slices while monitoring the temperature of the dummy frozen body corresponding to the sample immediately before slicing, so even if the frozen sample is pushed out of the microslicer body 29, it is always A constant temperature can be maintained, and a sample for microscopic observation as desired by a researcher can be provided.

以上が本発明になる実施例１のマイクロスライサ１０であるが、この実施例１では、冷媒として液体窒素を用いる場合を例に説明してきた。しかし、冷却用冷媒としては液体窒素だけでなく、前記したように例えば−１６０℃程度に冷却できるものであればこれらに限定されないことは自明であり、次に本発明になる実施例２として、低温用ブラインを用いて構成したマイクロスライサ３０について、図２に基づいて説明する。 The above is the micro slicer 10 of the first embodiment according to the present invention. In the first embodiment, the case where liquid nitrogen is used as the refrigerant has been described as an example. However, it is obvious that the cooling refrigerant is not limited to liquid nitrogen, as long as it can be cooled to, for example, about −160 ° C. as described above. A micro slicer 30 configured using low-temperature brine will be described with reference to FIG.

この図２に示した本発明になる実施例２のマイクロスライサ３０は、図１に示した実施例１のマイクロスライサ１０と同様、生体等の試料と、凍結したときにこの試料を一定の姿勢でスライスできるよう液体の包埋材とを収容し、例えばパラフィンなどの切削可能な材料で形成した固体容器４８_１を載置して、低温用ブラインタンク３７からの配管３８が接続された冷却用金属製容器３１と、この冷却用金属製容器３１の底部を押して、凍結した試料と包埋材とを収容した固体容器４８_１をマイクロスライサ本体上壁２９上に押し出す押し出し部材３３と、押し出された固体容器４８_１内の凍結された試料が、カッター駆動装置３５によって回転するカッター３４で固体容器ごと、正確にスライスされるようガイドする、マイクロスライサ本体上壁２９に設けられた第１のガイド３２を有している。 The microslicer 30 according to the second embodiment of the present invention shown in FIG. 2 is similar to the microslicer 10 according to the first embodiment shown in FIG. in houses and encapsulant liquid to be sliced, for example by placing the solid container 48 ₁ formed in cuttable material such as paraffin, a cooling pipe 38 from the low-temperature brine tank 37 is connected a metal container 31, the press bottom of the cooling metal holder 31, a pushing member 33 for pushing frozen sample and embedding material and a solid container 48 ₁ containing the above micro slicer body upper wall 29, extruded It was frozen solid sample container 48 _1, each solid container with a cutter 34 which is rotated by the cutter drive device 35, which guides to be accurately sliced, micro slicer And a first guide 32 provided in the body on the wall 29.

また、本発明の実施例１のマイクロスライサ１０と同様、低温用ブラインタンク３７からの配管３８が接続され、冷却用金属製容器３１に設けられた第１のガイド３２と同様、マイクロスライサ本体上壁２９に設けられた第２のガイド４２が取り付けられて、ダミー用試料と包埋材とを収容したダミー固体容器４８_２を凍結させるダミーの冷却用金属製容器４１が用意されている。 Similarly to the microslicer 10 of the first embodiment of the present invention, the pipe 38 from the low-temperature brine tank 37 is connected, and the first guide 32 provided in the cooling metal container 31 is connected to the microslicer main body. and the second guide 42 are mounted in the wall 29, the cooling metal container 41 of the dummy freezing the dummy solid container 48 ₂ accommodating a dummy sample and the embedding material is prepared.

なお、冷却用金属製容器３１とダミーの冷却用金属製容器４１の内部には、前記図２で説明した円柱型容器１１１と同様な、低温用ブラインでこれら冷却用金属製容器１１やダミーの冷却用金属製容器２１を冷却する部材が含まれるが、これは一般的な低温用ブラインによる冷却機構なので説明は省略する。 The cooling metal container 31 and the dummy cooling metal container 41 have a low-temperature brine similar to the cylindrical container 111 described in FIG. Although the member which cools the metal container 21 for cooling is contained, since this is a cooling mechanism by the common low temperature brine, description is abbreviate | omitted.

そして低温用ブラインタンク３７から低温用ブラインを送り出すため、ブライン用ポンプ４０が設けられ、さらにこの低温用ブラインの流量を調整できるよう、冷却用金属製容器３１、ダミー冷却用金属製容器４１の後流に、第１圧力バルブ３９、第２圧力バルブ４５が用意され、また、温度制御のため冷却用金属製容器３１には、例えば熱電対などの第１温度センサをその内部の３６で示した部位に設置し、ダミーの冷却用金属製容器４１にはその内部の４３で示した部位に第２温度センサが、スライスされる試料の代わりに温度履歴を調べるため、包埋材と共に凍結してダミー凍結体となるダミー用試料に４４で示した第３温度センサが設置されている。 A brine pump 40 is provided to send out the low temperature brine from the low temperature brine tank 37, and the cooling metal container 31 and the dummy cooling metal container 41 are arranged so that the flow rate of the low temperature brine can be adjusted. A first pressure valve 39 and a second pressure valve 45 are prepared in the flow, and a first temperature sensor such as a thermocouple is indicated by 36 in the cooling metal container 31 for temperature control. In the dummy cooling metal container 41, the second temperature sensor is frozen at the site indicated by 43 inside and frozen together with the embedding material to examine the temperature history instead of the sliced sample. A third temperature sensor 44 is installed on a dummy sample that becomes a dummy frozen body.

そして、スライスされる包埋材と共に凍結して凍結体となった試料を収容した固体容器４８_１が、押し出し部材３３によって冷却用金属製容器３１と共に押し上げられ、固体容器４８_１がマイクロスライサ本体上壁２９から押し出され、さらにカッター３４でスライスされることで温度が変化することを防止するため、これら３６で示した第１温度センサ設置部位、４３で示した第２温度センサ設置部位、４４で示した第３温度センサを設置されたダミー凍結体などからの温度情報を元に、前記したように温度履歴による偏差を見ながら例えばＰＩＤ動作を用いて予測制御制御し、ブライン用ポンプ４０、少なくとも第１圧力バルブ３９を調節して、ダミー凍結体とは異なった温度となる、スライスする試料を含む凍結体の温度が常時一定となるよう、低温用ブラインタンク３７から送られる低温用ブラインの流量を制御し、試料の温度を一定に保つ制御装置４６が設けられている。 Then, the solid container 48 ₁ containing the sample became frozen body was freeze with embedding material is sliced is pushed up together with the cooling metal container 31 by the pushing member 33, the solid container 48 ₁ micro slicer on the body In order to prevent the temperature from being changed by being pushed out from the wall 29 and further sliced by the cutter 34, the first temperature sensor installation site indicated by 36, the second temperature sensor installation location indicated by 43, 44 Based on the temperature information from the dummy frozen body etc. where the third temperature sensor shown is installed, predictive control control is performed using, for example, a PID operation while observing the deviation due to the temperature history as described above, and the brine pump 40, at least By adjusting the first pressure valve 39, the temperature of the frozen body including the sample to be sliced is always constant, which is different from the temperature of the dummy frozen body. So as to control the flow rate of the low-temperature brine sent from the low-temperature brine tank 37, the controller 46 is provided to maintain the temperature of the sample constant.

このように構成した本発明のマイクロスライサ３０は、前記したように生体等の試料と、凍結したときにこの試料を一定の姿勢でスライスできるよう液体の包埋材とを収容し、例えばパラフィンなどの切削可能な材料で形成した固体容器４８_１を冷却用金属製容器３１上に載置する。そして、スライスされる試料の代わりに温度を測定するためのダミーの試料と包埋材とを収容した、ダミーの固体容器４８_２をダミーの冷却用金属製容器４１上に載置し、制御手段４６により、３６で示した第１温度センサ設置部位、４３で示した第２温度センサ設置部位、４４で示した第３温度センサを設置されたダミー用試料などからの温度情報を観察しながら、ブライン用ポンプ４０、第１圧力バルブ３９、第２圧力バルブ４５を調節して低温用ブラインタンク３７から低温用ブラインを冷却用金属製容器３１、ダミー冷却用金属製容器４１に導入し、それぞれに収容した試料とダミー用試料を包埋材と共に冷却する。 As described above, the micro slicer 30 of the present invention configured as described above contains a sample such as a living body and a liquid embedding material so that the sample can be sliced in a fixed posture when frozen. solid container 48 ₁ formed in cuttable material is placed on the cooling metal container 31. Then, housing a dummy sample and embedding material for measuring the temperature instead of the sample to be sliced, and placed a dummy solid container 48 ₂ dummy on cooling metal container 41, the control means 46, while observing temperature information from a first temperature sensor installation site indicated by 36, a second temperature sensor installation location indicated by 43, a dummy sample in which a third temperature sensor indicated by 44 is installed, The brine pump 40, the first pressure valve 39, and the second pressure valve 45 are adjusted to introduce the low temperature brine from the low temperature brine tank 37 into the cooling metal vessel 31 and the dummy cooling metal vessel 41, respectively. The housed sample and the dummy sample are cooled together with the embedding material.

そして、試料とダミー用試料とが包埋材と共に凍結したら制御装置４６は、押し出し部材３３の図示していない駆動装置に指示し、凍結した試料を収容した固体容器４８_１を冷却用金属製容器３１と共に押し上げ、固体容器４８_１をマイクロスライサ本体上壁２９から所定量ずつ押し出されるよう指示し、そのため、固体容器４８_１は第１のガイド３２にガイドされて上昇してゆく。また制御装置４６は、同時にカッター駆動装置３５によりカッター３４を回転させ、スライス位置に到達した凍結した試料が、所定厚さでスライスされるよう押し出し部材３３の図示していない駆動装置により押し出し量を調節する。 Then, the control unit 46 When the sample and the dummy sample is frozen with encapsulant instructs the drive device (not shown) of the extrusion member 33, the cooling metal container a solid container 48 ₁ containing the frozen sample pushed with 31, instructs the extruded solid container 48 ₁ micro slicer body upper wall 29 by a predetermined amount, therefore, the solid container 48 ₁ slide into upward guided by the first guide 32. At the same time, the control device 46 rotates the cutter 34 by the cutter driving device 35, and the amount of extrusion is controlled by a driving device (not shown) of the pushing member 33 so that the frozen sample that has reached the slicing position is sliced at a predetermined thickness. Adjust.

また制御装置２７は、この間も前記したように、３６で示した第１温度センサ設置部位、４３で示した第２温度センサ設置部位、４４で示した第３温度センサを設置されたダミー凍結体などからの温度情報を観察しながら、スライスによって上昇してゆく試料を含む凍結体側温度を、ブライン用ポンプ４０、少なくとも第１圧力バルブ３９を調節し、低温用ブラインタンク３７から冷却用金属製容器３１に送られる低温用ブラインの量を調節して、試料（凍結体）の温度が一定に保たれるようにする。なおこのとき、ダミー凍結体の温度が変化した場合は、第２圧力バルブ４５も調節して、ダミー冷却用金属製容器４１側の温度も調節する。 In addition, as described above, the control device 27 is a dummy frozen body in which the first temperature sensor installation site indicated by 36, the second temperature sensor installation location indicated by 43, and the third temperature sensor indicated by 44 are installed. While observing temperature information from, etc., the frozen body side temperature including the sample rising by slicing is adjusted by adjusting the brine pump 40 and at least the first pressure valve 39, and the cooling low temperature brine tank 37 is used for the cooling metal container. The amount of the low-temperature brine sent to 31 is adjusted so that the temperature of the sample (frozen body) is kept constant. At this time, when the temperature of the dummy frozen body changes, the second pressure valve 45 is also adjusted to adjust the temperature on the dummy cooling metal container 41 side.

そのため、スライスする試料を含む凍結体は、このスライスする試料と略同じ条件で凍結されたダミー用試料を含むダミー凍結体とダミー冷却用金属製容器４１の内部、及び冷却用金属製容器４１の内部のそれぞれに設けられた温度センサで、スライスされる直前の試料と対応するダミー凍結体で温度を監視しながらスライスされるから、例え凍結した試料がマイクロスライサ本体２９外部に押し出されても常に一定の温度に保つことができ、研究者の望むような顕微鏡観察用試料を提供することができる。 Therefore, the frozen body including the sample to be sliced includes the dummy frozen body including the dummy sample frozen under substantially the same conditions as the sliced sample, the inside of the dummy cooling metal container 41, and the cooling metal container 41. The temperature sensors provided in each of the insides are sliced while monitoring the temperature with a dummy frozen body corresponding to the sample immediately before being sliced, so that even if the frozen sample is pushed out of the micro slicer body 29, it is always A constant temperature can be maintained, and a sample for microscopic observation as desired by a researcher can be provided.

本発明によれば、例えば−１６０℃という低温を保ちながら、試料内部に温度勾配を生じさせずに、かつ、凍結した際に内部の結晶軸が１方向となるようにして例えば顕微鏡観察用試料を研究者の望むように冷却しながらスライスして製作できる、簡単な構成のマイクロスライサを提供することができる。 According to the present invention, while maintaining a low temperature of, for example, −160 ° C., a temperature gradient is not generated inside the sample, and the internal crystal axis is unidirectional when frozen, for example, a sample for microscopic observation. It is possible to provide a microslicer with a simple structure that can be manufactured by slicing while cooling as desired by a researcher.

本発明になる実施例１のマイクロスライサの概略ブロック図である。It is a schematic block diagram of the micro slicer of Example 1 which becomes this invention. 本発明のマイクロスライサにおける冷却容器内部の概略説明図である。It is a schematic explanatory drawing inside the cooling container in the micro slicer of this invention. 本発明になる実施例２のマイクロスライサの概略ブロック図である。It is a schematic block diagram of the micro slicer of Example 2 which becomes this invention.

Explanation of symbols

１０マイクロスライサ
１１冷却用金属製容器
１１１円柱型容器
１２第１のガイド
１３押し出し部材
１４カッター
１５カッター駆動装置
１６第１温度センサ設置部位
１７液体窒素タンク
１７１液体窒素
１８配管
１９第１圧力バルブ
２０第１圧力センサ
２１ダミー冷却用金属製容器
２２第２のガイド
２３第２温度センサ設置部位
２４第３温度センサ設置部位
２５第２圧力バルブ
２６第２圧力センサ
２７制御装置
２８_１固体容器
２８_２ダミー用固体容器
２９マイクロスライサ本体上壁 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Micro slicer 11 Cooling metal container 111 Cylindrical container 12 1st guide 13 Extrusion member 14 Cutter 15 Cutter drive device 16 1st temperature sensor installation site 17 Liquid nitrogen tank 171 Liquid nitrogen 18 Piping 19 1st pressure valve 20 1st 1 Pressure sensor 21 Dummy cooling metal container 22 Second guide 23 Second temperature sensor installation part 24 Third temperature sensor installation part 25 Second pressure valve 26 Second pressure sensor 27 Controller 28 ₁ Solid container 28 _{2 For} dummy Solid container 29 Micro slicer body upper wall

Claims

A cooling vessel in which a refrigerant pipe is provided inside the main body and freezes the sample to be cut together with the embedding material, an extruding member for extruding a frozen body made of the frozen sample and the embedding material from the upper surface of the main body, and an upper surface In a micro slicer having a cutter for slicing the extruded frozen body with a minute thickness,
A dummy cooling container provided separately from the cooling container and provided with a refrigerant pipe. The dummy sample is frozen together with the embedding material to form a dummy frozen body. Based on the detected temperature of the dummy frozen body. The slicer can be sliced while controlling the flow rate or pressure of the refrigerant introduced into the cooling container to keep the temperature of the frozen body constant.

2. The micro slicer according to claim 1, wherein the sample, the dummy sample, and the embedding material are housed in a sample container that is solid at a normal temperature that can be cut and cooled by the cooling container and the dummy cooling container. .

The solid sample container and the dummy sample container are placed on the upper surfaces of the metal cooling container and the dummy cooling container, respectively, and a guide for guiding the sample container and the dummy sample container is provided on the upper surface of the main body. 3. The micro slicer according to claim 2, wherein a hole is provided, and the pushing member pushes a solid sample container together with the metal cooling container from the guide hole to the upper surface of the main body so as to be sliced.

The temperature in the dummy frozen body and the respective cooling containers is detected, and at least the flow rate or pressure of the refrigerant introduced into the cooling container is controlled based on the temperature deviation to keep the temperature of the frozen body constant. 4. The micro slicer according to claim 1, wherein slicing is possible.

The micro slicer according to any one of claims 1 to 4, wherein a pressure valve that opens and closes at a corresponding pressure is provided at least on the downstream side of each of the cooling vessel and the dummy cooling vessel of the cooling pipe. .

The micro slicer according to any one of claims 1 to 5, wherein the refrigerant is a cryogenic liquid refrigerant containing liquid nitrogen and a brine for low temperature.