JP4634712B2 - 抗ラジカル剤、該剤を含有してなる油脂組成物、飲食品、医薬品又は飼料 - Google Patents
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Description
技術分野
抗ラジカル剤、該剤を含有してなる油脂組成物、飲食品、医薬品又は飼料に関する。
背景技術
活性酸素等のラジカル物質は、生体内において、様々な疾病や老化の原因となる酸化的障害をもたらすことが知られている。脂質が酸素障害を受けて生じる脂質過酸化物（アルキルヒドロパーオキサイド）は、寿命が長い上に、脂質で出来ているため、脂質が豊富な細胞膜や臓器に蓄積することが考えられるし、腸管内で脂質ラジカルが生ずることを考えると、腸管上皮細胞に容易に接触して障害を与え、またカイロミクロンとなってリンパ系に取り込まれて血中へ到達することが考えられる。
血液中にはこのカイロミクロンの他、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白質）、ＨＤＬ（高比重リポ蛋白質）などの、脂質と蛋白質の複合体が多く存在する。ＬＤＬ中の脂質は金属イオンや上記脂質ラジカル等により、連鎖的脂質過酸化反応を受け、容易に酸化ＬＤＬとなる。酸化ＬＤＬは、動脈硬化症の重要な危険因子の１つであると考えられている。
従って、脂質過酸化物に起因するラジカルを捕捉することは、生体の酸化的障害を抑制する上で重要であり、抗酸化作用については、各種の研究がなされている。例えば、以下のものが挙げられる。
１）菜種種子の脱脂粕から抽出した水溶性成分には抗酸化作用がある（Ｈ．Ｎｏｗａｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｆａｔ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９４，１４９−１５２（１９９２）；Ｕ．Ｗａｎａｓｕｎｄａｒａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４２，１２８５−１２９０（１９９４））。
２）野菜等の植物の水抽出物にはラジカル捕捉・除去作用がある（前田浩、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｕｔａｇｅｎ Ｒｅｓ．，１８，５３−６１（１９９６））。
３）フトモモ科植物の溶媒抽出物を含有する過酸化脂質抑制剤（特開平１０−３６２７８）。
４）えごま種子又はえごま種子の発芽物の脱脂物を水及び／又は親水性有機溶剤で抽出してなるフリーラジカル消去剤（特開２０００−２３６８４７）。
５）オリーブ植物から得られる抽出物を有効成分とする抗酸化剤（特開２００１−１８１６３２）
以上のものは、何れも水溶性成分を有効成分とするものであり、水溶性抗ラジカル剤である。
これに対して、油脂製品への利用、または生体内での有効性を考えると、脂溶性抗ラジカル剤の存在は重要である。脂溶性抗ラジカル剤としては、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）やＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）等があるが、これらは化学合成によるものであるから、その使用が避けられる傾向がある。 天然物由来の脂溶性抗ラジカル剤としては、菜種由来の脱ガム油等が知られているが（特開平９−１５７６８７）、その活性は十分ではない。
また、天然物由来の脂溶性抗酸化剤としては、トコフェロールが知られているが、トコフェロールは、通常の食品の酸化を抑制する効果においてはそれなりの効果を有しているが、脂質ラジカル捕捉能の効果は十分でない。
以上のことから、天然物由来の高活性の脂溶性抗ラジカル剤の開発が待たれている。
発明の開示
本発明の目的は、食品（油脂組成物）の安定性を増し、同時に生体での酸化的障害を予防できる、天然物由来の高活性の脂溶性抗ラジカル剤を得ることにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、菜種原油のアルコール抽出物に高い抗ラジカル活性があることを知り、更に研究を重ねた結果、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の構成からなるものである。
１．４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを有効成分とする抗ラジカル剤。
２．４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを含有する菜種原油の抽出物からなる抗ラジカル剤。
３．菜種原油をアルコール又は含水アルコールで処理することを特徴とする４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールが濃縮された菜種原油の抽出物。
４．菜種原油を蒸留することを特徴とする４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールが濃縮された菜種原油の抽出物。
５．上記３又は４記載の菜種原油の抽出物を含有する抗ラジカル剤。
６．上記１、２、３、４又は５記載の抗ラジカル剤を含有してなる油脂組成物。
７．上記１、２、３、４又は５記載の抗ラジカル剤又は上記６記載の油脂組成物を添加した飲食品、医薬品又は飼料。
なお、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの構造式は、以下のとおりである。
本発明の抗ラジカル剤は、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを有効成分とすることを特徴とするものである。
本発明では、菜種原油のアルコール抽出物に高い抗ラジカル活性があることを知り、該活性成分を探求したところ、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールであることをつきとめ、本発明に到達したものである。
本発明の抗ラジカル剤の有効成分の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、油脂に易溶性であり、高い抗ラジカル活性を有する点で優れている。
従来の菜種脱脂粕より抽出した抗酸化剤は難脂溶性であるが、本発明の抗ラジカル剤の有効成分は、菜種原油から抽出したものであり、油脂に溶け易いため、食用油やその他油脂組成物の抗酸化剤として利用し易い。
また、本抗ラジカル剤を摂取した場合、脂溶性であるため生体内で細胞膜への親和性が高く、水溶性抗ラジカル剤が作用し難い脂質の豊富な細胞膜や臓器中で有効に作用する。
更に、本抗ラジカル剤の有効成分は、菜種原油の抽出物から得られるものであるので、原料面や安全面で有利である。
本抗ラジカル剤を添加した油脂組成物は、抗ラジカル性だけでなく、安定性も向上する。
何れにしても、本発明の抗ラジカル剤の有効成分である、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、油脂に易溶性であり、高い抗ラジカル活性を有することは、本発明で初めて知り得たことからみて、該成分の選択には格別の意義があることが分かる。
発明を実施するための形態
以下、更に本発明について詳述する。
（１）抽出
本発明の抗ラジカル剤の有効成分である、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、菜種原油をアルコールで抽出することにより濃縮することができる。
菜種油は、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）に属するナタネの種子から得られる油脂であるが、抽出に用いられる菜種原油は、圧搾油、抽出油、脱ガム油等から選ぶことができる。
抽出に用いるアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、又はそれらの含水物等が挙げられる。
抽出に好適な含水量は、アルコールにより異なるが、メタノールの場合は容積比で０〜１０％、エタノールでは５〜２０％である。
抽出条件は特に限定されない。例えば、温度は１０〜８５℃で、常温でも好適に抽出できる。振とう抽出や攪拌機等のついた抽出機で抽出することによって抽出効率を上げることもできる。抽出時間は数分〜数時間であり、長時間なほど十分に抽出されるが、抽出物中の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール濃度が低くなる可能性がある。
原料に対して、０．１〜２０倍量のアルコールで抽出し、好ましくは同様の抽出操作を２〜３回繰り返すのがよい。
本抽出は、油脂とアルコールとの液々抽出であり、アルコール画分を分離して濃縮し、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール含有抽出物を得る。
抽出方法には種々の方法が選択されるが、アルコールと油脂の溶解性に注意する必要がある。特にエタノールは、油脂との相溶性が比較的高いため、抽出物中の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール濃度を上げ、トリグリセリド濃度を抑えるためには、原料に対して０．１〜１倍量のエタノールで抽出するのが好ましい。
本発明の抗ラジカル剤の有効成分である、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、菜種原油を蒸留することでも濃縮することが出来る。
蒸留はどのような装置を用いて行ってもよく、例えば、薄膜式または遠心式蒸留装置を使用することができる。また低真空度の蒸留装置に加え、高真空度の蒸留装置（分子蒸留装置）も使用することができる。
蒸留条件は特に限定されない。例えば、温度は７０〜３００℃で、圧力は０．１〜１０Ｔｏｒｒ、時間は数分から数時間で好適に蒸留される。高温かつ高真空度で長時間蒸留するほど十分に蒸留されるが、菜種原油中の他の成分も蒸留されて、蒸留物中の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール濃度が低下したり、臭いや味質の面で好ましくない成分も混入する可能性がある。好ましくは、１３０〜１８０℃、１０分〜２時間、１．０〜３．０Ｔｏｒｒで蒸留を行うのがよい。また、水蒸気を吹き込むことにより、更に蒸留効率を高めることができる。
また、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、必要に応じて、２層分配法、カラムクロマトグラフィー法、薄層クロマトグラフィー法（ＴＬＣ法）、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）等を適用し、精製・分離して、濃縮することができる。
抗ラジカル剤中の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール量は、０．２重量％以上で十分である。
従って、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを０．２重量％以上含有するものであるならば、メタノールやエタノール抽出物、蒸留物等はそのまま抗ラジカル剤として使用可能である。
（２）適用
本抗ラジカル剤は、そのまま摂取してもよいが、一般の食用精製油等の油脂組成物に配合して、抗ラジカル性油脂組成物を得、この組成物を飲食品に添加して、抗ラジカル性の飲食品を得ることもできる。
また、本抗ラジカル剤を添加した製品（油脂組成物等）は、抗ラジカル性だけでなく、安定性も向上する。
飲食品としては、例えば、菓子類（ガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック、ゼリー、グミ、定菓等）、麺類（そば、うどん、ラーメンなど）、乳製品（ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等）、飲料（ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）等が挙げられる。
飲食品には、劣化防止剤、甘味料、香料、着色料、乳化剤、酸化防止剤、増量剤等の添加剤を適宜配合することができる。
また、同様にして、本抗ラジカル剤や抗ラジカル性油脂組成物を、医薬品、化粧品、飼料等に添加して、抗ラジカル性の医薬品、化粧品、飼料等を得ることができる。
油脂組成物中には、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを１０〜５０００ｐｐｍ添加すれば、抗ラジカル性油脂組成物となり、その効果を十分発揮することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、特に断らない限り、「％」は「重量％」を意味する。
（１）４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの単離・精製
以下の５工程により、菜種原油から４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを単離・精製した。
１． メタノール抽出
菜種原油４５０ｇにメタノール９０ｍｌを加え、シェーカーを用いて１０分間激しく振とうさせた。振とう後、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。上層のメタノール層を、ナス型フラスコに回収した。下層の菜種原油に再びメタノール９０ｍｌを加え、シェーカーで振とうした。これらの操作を合計３回繰り返して、回収したメタノール層からメタノールを蒸発させ、抽出物２．９ｇを得た。
２． ２層分配
工程１で得たメタノール抽出物２．９ｇを、実施例５と同様の方法で２層分配を行い、ヘキサン画分１．５ｇ、アセトニトリル画分０．８６ｇを得た。
アセトニトリル画分に高い抗ラジカル活性が認められたので、アセトニトリル画分を次の精製工程に使用した。
３． シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画
シリカゲル（関東化学製カラムクロマト用＜１５０μｍ）１５ｇを、３００ｍｍ×２０ｍｍ¢のガラスカラムに充填した。工程２で得たアセトニトリル画分５００ｍｇを、５ｍｌのクロロホルムに溶解し、カラムに注入した。これに、分離溶媒（ヘキサン／ジェチルエーテル（９０／１０）１７５ｍｌ、クロロホルム２２５ｍｌ、アセトン４００ｍｌ、メタノール２００ｍｌの順）を約２ｍｌ／ｍｉｎの流速で供給し溶出した。集めた各溶出画分はナスフラスコに回収し、エバポレーターで溶媒を留去し、クロロホルム画分１４４ｍｇ、アセトン画分２０５ｍｇ、メタノール画分４２ｍｇを得た。
クロロホルム画分に最も高い活性が認められたので、このクロロホルム画分を次の工程に使用した。
４． 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分取
工程３のクロロホルム画分１００ｍｇを、展開プレート（シリカゲル：Ｍｅｒｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０）／展開溶媒（ヘキサン／ジエチルエーテル＝８０／３０）を用いて展開した。プレート上の黄色バンドを確認し、スパチュラでシリカゲルごと目的の物質をかき取った。クロロホルム２０〜３０ｍｌを加え、よく振り混ぜた後、ガラスフィルターでシリカゲルを濾別した。エバポレーターで溶媒をとばして、濃縮物１３ｍｇを得た。得られた濃縮物を次の工程に使用した。
５． 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分取
工程４で得た濃縮物２ｍｇを用いて、下記の条件で、ＨＰＬＣ溶出を行った。０〜２０分は溶離液Ａを１００％流し、２０〜２５分にかけて溶離液Ａ１００％からＢ１００％へリニアグラジエントをかけ、２５分以降は溶離液Ｂを１００％流した。４．５分付近に見られたシングルピークを分取した。収量は１ｍｇであった。
（ＨＰＬＣの溶出条件）
カラム：Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．ＡＱＵＡＳＩＬＣ１８（４．６ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ）
サンプル量：１００μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）
溶離液Ａ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（９０／１０）
溶離液Ｂ：ＣＨ３ＣＮ
カラム温度：室温
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ検出器（３００ｎｍ，４５０ｎｍ）
（２）４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの同定
本同定は、以下の分析法で行った。
１）ＬＣ／ＭＳ
（分析法）
サンプルをメタノールに溶解させ、ＬＣ／ＭＳ（ＪＥＯＬ、ＪＭＳ−ＬＣｍａｔｅ）を用い、ＡＰＣＩ（＋）で測定した。
（分析結果）
主成分の低分解能ＭＳのｍ／ｚは１８１であった。
上記の低分解能ＭＳの分子量の測定結果によると、ＡＰＣＩ（＋）では、Ｍ＋Ｈでイオン化し易いため、ｍ／ｚ１８１成分の分子量は１８０となる。
そこで、ｍ／ｚ１８１成分について、高分解能（ミリマス）ＭＳによる分析を行い、正確な分子量を測定したところ、１８１．０８１３であった。
ＣＨＮ分析、Ｓ分析の結果より、Ｎ、Ｓが存在しないことが確認できた。
この結果を参酌すると、上記ｍ／ｚ１８１成分の分子式はＣ１０Ｈ１３Ｏ３となるから、分子量の計算値は１８１．０８６５となる。この分子量の計算値と上記の実測値の誤差は殆どないので、主成分の分子式はＣ１０Ｈ１２Ｏ３であると判断した。
２）ＮＭＲ
（分析方法）
サンプルを窒素気流下で乾燥させた後、重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）に溶解させ、専用のガラス管に入れ、ＮＭＲ（ＪＥＯＬ、４００ＭＨｚ）を測定した。（分析結果）
ＮＭＲの測定結果は、図１に示す。
このＮＭＲの結果から、以下のことがいえる。
３．９０ｐｐｍ：−ＯＣＨ３×２（線対称）のＨ６個
５．１７ｐｐｍ：Ｃ＝Ｃのｔｒａｎｓ位のＨ
５．５１ｐｐｍ：フェノールのＨ
５．６２ｐｐｍ：Ｃ＝Ｃのｃｉｓ位のＨ
６．６１ｐｐｍ：Ｃ＝Ｃのｇｅｍ位のＨとベンゼン環のＨ２個
また、１〜３ｐｐｍにはピークが見られないため、アルキル基（Ｃ−Ｃ）は存在しない。
上記のことから、ベンゼン環に、−ＯＨ、−ＯＣＨ３×２（線対称）、Ｃ＝ＣにＨが付いており、アルキル基（Ｃ−Ｃ）はないことが分かる。
以上の分析結果を合わせ考え、ケミカルシフトの計算値を参考にして、本精製物は、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールであると同定した。
（３）４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの定量
前記（１）−５．のＨＰＬＣ法を数回繰り返し、定量用の標準４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを得た。
本標品を用い、以下に示すＨＰＬＣ分析により、検量線を作成し、各サンプルの４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール濃度を求めた。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ２５０−４ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＮＨ２（４．０ＩＤ×２４４ｍｍ，５μｍ）
溶離液：１．２％イソプロピルアルコール／ヘキサン（ｖ／ｖ）
流量：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温（２５℃以下）
検出器：蛍光検出器（Ｅｘ２９８ｎｍ，Ｅｍ３２５ｎｍ）
試料量：５０μｌ
内部標準試薬：ペンタメチルクロマノール（ＰＭＣ）
測定時間：３０分
本分析の結果を図２に示す。ＰＭＣは６分前後（ピーク３）、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは１８分前後（ピーク７）に検出された。
（４）抗ラジカル活性
抗ラジカル活性は、以下の方法で測定した。
１）ＩＰＯＸ５０値
脂質過酸化物（アルキルパーオキサイド：ＲＯＯＨ）のモデル化合物としてターシャルブチルハイドロパーオキサイド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）を用いる測定系で、化学発光法により測定して、化学発光を５０％抑制する被験物の濃度を求める。
０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水２５０μｌに、１０ｍＭジエチレントリアミン５酢酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）５０μｌ、３００ｍＭ ｔ−ＢｕＯＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）５０μｌ、１００ｍＭルミノール（和光純薬（株）製）５０μｌ、被験物のエタノール溶液５０μｌを加えて十分に攪拌した後、１ｍｇ／ｌヘモグロビン（ブタ由来：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）５０μｌを加え、素早く極微弱発光測定装置（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＬＢ９５０５）にセットして、発光量を測定する。
被験液を入れない場合に対して、発光量を５０％に抑制する被験物濃度を求めて５０％抑制濃度（ＩＰＯＸ５０）とする。この値が小さいほどラジカル捕捉能が強いことを示す。
２）ＯＲＡＣ法におけるＴｒｏｌｏｘ比活性
ヒト血清の２００倍希釈溶液１０μｌに、１０μｌの所定濃度の被験試料、又は、６０μＭの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ）溶液を１０μｌ加える。次に、３．７３ｍｇ／ｌのβ−フィコエリトリン（β−ＰＥ）を１８０μｌ加え、３７℃で１分間、予備加温する。次いで、８０ｍＭの２，２′−アゾビス（２−アミジノプロパン）−ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）を１０μｌ加え、３７℃で反応を開始する。血清や添加試薬の希釈には、リン酸緩衝液（７５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いる。また、対照は被験試料の代わりに、上述したリン酸緩衝液を用いる。反応液の蛍光強度（Ｅｘ：５４０ｎｍ、Ｅｍ：５６５ｎｍ）を反応開始後より２分毎に測定し、蛍光強度（ｙ軸）−時間（ｘ軸）の曲線グラフを描く。被験試料、Ｔｒｏｌｏｘ、対照の得られた曲線とｘ軸、ｙ軸で挟まれた領域の面接（Ｓ）を算出する。被験物質の血清中での抗ラジカル活性は、以下の式でＴｒｏｌｏｘ比活性として算出する。
Ｔｒｏｌｏｘ比活性＝（被験試料のＳ−対照のＳ）／（ＴｒｏｌｏｘのＳ−対照のＳ）×（Ｔｒｏｌｏｘの濃度／被験試料の濃度）
この試験系では、ＡＡＰＨがペルオキシラジカルを発生させ、それが基質であるβ−ＰＥを酸化し、その結果、β−ＰＥの蛍光が消失する反応が起こる。Ｔｒｏｌｏｘは、水溶性ビタミンＥの誘導体であり、この試験系において抗酸化作用の基準物質として用いられる。これらの反応基質や基準物質はＯＲＡＣ（Ｏｘｙｇｅｎ Ｒａｄｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ）法に用いられるものである。ＯＲＡＣ法は、生体試料や天然物の抗酸化、抗ラジカル活性を簡便かつ正確に基準物質との比較値で求めることができ、広く用いられている方法である。
（５）ランシマット試験
本試験は、油脂の酸化安定性を測定するものである。
本試験は、試料を反応容器で１２０℃に加熱しながら、清浄空気を送り込み、酸化により生成した揮発性分解物を水中に捕集し、水の導電率が急激に変化する折曲点までの時間（ランシマット時間）を測定することにより行われる。
（６）熱安定性試験
熱安定性試験は、以下の方法で行った。
試験油５００ｇを鍋（直径２３ｃｍ）にはかりとり、電熱器により１８０℃に加熱する。規定温度到達後、直ちにジャガイモ天ぷら（直径４ｃｍ、厚さ０．６ｃｍ）を３分間揚げる。温度を１８０℃に維持したまま１時間ごとに、５時間まで天ぷらを揚げる。投入２０秒後のカニ泡の量を観察し、泡の量を鍋の表面積全体に対しての比率で５段階評価した（Ａ：０〜２０％、Ｂ：２１〜４０％、Ｃ：４１〜６０％、Ｄ；６１〜８０％、Ｅ：８１〜１００％）。
実施例１、比較例１
４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール６０μＭ、及びα−トコフェロールは３００μＭを試験に供し、表１に示すＴｒｏｌｏｘ比活性を算出した。
表１の結果によると、血清中における４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールのＴｒｏｌｏｘ比活性は、α−トコフェロールの約７倍を示した。このことから４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、血清中でα−トコフェロールより極めて強い抗ラジカル活性を発現することが分かる。
実施例２ （エタノール抽出物）
菜種原油１ｋｇに２００ｍｌの９９．５％エタノールを加え、１０分間激しく振とうした。遠心分離を行い、エタノール層を分取した。この操作を３回繰り返し、回収したエタノール層を濃縮してエタノールを除去し、抽出物２１ｇを得た。
実施例３ （含水エタノール抽出物）
菜種原油１ｋｇに２００ｍｌの９０％含水エタノールを加え、１０分間激しく振とうした。遠心分離を行い、エタノール層を分取した。この操作を３回繰り返し、回収したエタノール層を濃縮してエタノールおよび水を除去し、抽出物８ｇを得た。
実施例４ （メタノール抽出物）
菜種原油１ｋｇに２００ｍｌの９９．５％メタノールを加え、１０分間激しく振とうした。遠心分離を行い、メタノール層を分取した。この操作を３回繰り返し、回収したメタノール層を濃縮してメタノールを除去し、抽出物７ｇを得た。
実施例５ （２層分配アセトニトリル抽出物）
実施例４で得られたメタノール抽出物７ｇをヘキサン４５ｍｌに溶かして、分液漏斗▲１▼に入れた。これに９９．５％アセトニトリル１５ｍｌを加え振とうした。振とう後、下層（アセトニトリル層）を新たなヘキサン４５ｍｌの入っている分液漏斗▲２▼に移し、分液漏斗▲１▼には新たなアセトニトリル１５ｍｌを入れた。分液漏斗▲１▼及び▲２▼を振とうして、分液漏斗▲２▼の下層をナス型フラスコに分取し、分液漏斗▲１▼の下層は分液漏斗▲２▼に移した。分液漏斗▲１▼には新たなアセトニトリル１５ｍｌを入れ、同様の操作を合計２回繰り返した。分取した各下層を合わせ濃縮してアセトニトリルを除去し、抽出物１．５ｇを得た。
実施例６ （蒸留物）
菜種原油１０００ｇをクライゼンフラスコに張込み、１５０℃、３０分間、１．５Ｔｏｒｒ、水蒸気吹込み量対油１．５％で分子蒸留を行った。トラップから回収した回収物から水分を蒸発させ、蒸留物３ｇを得た。
実施例７ （４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール）
前記（３）の、菜種原油から単離・精製した４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを用いた。
上記の実施例の抽出物、蒸留物及び４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの抗ラジカル活性及び４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの含量を、表２に示す。
比較のために、菜種原油（比較例２）、１００％ビタミンＥ（比較例３）、５％ビタミンＥ（比較例４）、１％ビタミンＥ（比較例５）の抗ラジカル活性を同様に測定し、表２に示す。
なお、比較例３〜５では、ビタミンＥは、α−Ｔｏｃ６８．１％、β−Ｔｏｃ０．４％、δ−Ｔｏｃ０．１％のものを用い、菜種サラダ油に溶かして活性を測定した。
表２の結果から、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール又はその含有物は、従来のものに比し、優れた抗ラジカル活性を有することが分かる。
実施例８
実施例２で得られたエタノール抽出物を、菜種精製油に２％添加して抗ラジカル性菜種精製油を得た。
実施例９
実施例４で得られたメタノール抽出物を、菜種精製油に０．７％添加して抗ラジカル性菜種精製油を得た。
実施例１０
実施例５で得られたアセトニトリル画分を、菜種精製油に０．１５％添加して抗ラジカル性菜種精製油を得た。
実施例１１
実施例６で得られた蒸留物を精製菜種油に０．２％添加して、抗ラジカル活性菜種精製油を得た。
実施例８〜１１の抗ラジカル性菜種精製油の抗ラジカル活性と安定性を、表３に示す。
表３の結果から、本抗ラジカル剤を添加した油脂組成物は、抗ラジカル活性や熱安定性等が向上することが分かる。
産業上の利用の可能性
（１）本発明の抗ラジカル剤は、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを有効成分とするものであって、高い抗ラジカル活性を有する点で優れている。
（２）従来の菜種脱脂粕より抽出した抗酸化剤は難脂溶性であるが、本発明の抗ラジカル剤の有効成分は、菜種原油から抽出したものであり、油脂に易溶性のため、食用油やその他油脂組成物の抗酸化剤として利用し易い。
（３）本抗ラジカル剤を摂取した場合、脂溶性であるため生体内で細胞膜への親和性が高く、水溶性抗ラジカル剤が作用し難い脂質の豊富な細胞膜や臓器中で有効に作用する。
（４）本抗ラジカル剤の有効成分は、菜種原油の抽出物から得られるものであるので、原料面や安全面で有利である。
（５）本抗ラジカル剤を添加した製品（油脂組成物等）は、抗ラジカル性が付与されるだけでなく、安定性も向上する。
【図面の簡単な説明】
図１は、単離・精製した４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールのＮＭＲの測定図である。
図２は、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールのＨＰＬＣの測定図である。
抗ラジカル剤、該剤を含有してなる油脂組成物、飲食品、医薬品又は飼料に関する。
背景技術
活性酸素等のラジカル物質は、生体内において、様々な疾病や老化の原因となる酸化的障害をもたらすことが知られている。脂質が酸素障害を受けて生じる脂質過酸化物（アルキルヒドロパーオキサイド）は、寿命が長い上に、脂質で出来ているため、脂質が豊富な細胞膜や臓器に蓄積することが考えられるし、腸管内で脂質ラジカルが生ずることを考えると、腸管上皮細胞に容易に接触して障害を与え、またカイロミクロンとなってリンパ系に取り込まれて血中へ到達することが考えられる。
血液中にはこのカイロミクロンの他、ＬＤＬ（低比重リポ蛋白質）、ＨＤＬ（高比重リポ蛋白質）などの、脂質と蛋白質の複合体が多く存在する。ＬＤＬ中の脂質は金属イオンや上記脂質ラジカル等により、連鎖的脂質過酸化反応を受け、容易に酸化ＬＤＬとなる。酸化ＬＤＬは、動脈硬化症の重要な危険因子の１つであると考えられている。
従って、脂質過酸化物に起因するラジカルを捕捉することは、生体の酸化的障害を抑制する上で重要であり、抗酸化作用については、各種の研究がなされている。例えば、以下のものが挙げられる。
１）菜種種子の脱脂粕から抽出した水溶性成分には抗酸化作用がある（Ｈ．Ｎｏｗａｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｆａｔ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９４，１４９−１５２（１９９２）；Ｕ．Ｗａｎａｓｕｎｄａｒａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，４２，１２８５−１２９０（１９９４））。
２）野菜等の植物の水抽出物にはラジカル捕捉・除去作用がある（前田浩、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｕｔａｇｅｎ Ｒｅｓ．，１８，５３−６１（１９９６））。
３）フトモモ科植物の溶媒抽出物を含有する過酸化脂質抑制剤（特開平１０−３６２７８）。
４）えごま種子又はえごま種子の発芽物の脱脂物を水及び／又は親水性有機溶剤で抽出してなるフリーラジカル消去剤（特開２０００−２３６８４７）。
５）オリーブ植物から得られる抽出物を有効成分とする抗酸化剤（特開２００１−１８１６３２）
以上のものは、何れも水溶性成分を有効成分とするものであり、水溶性抗ラジカル剤である。
これに対して、油脂製品への利用、または生体内での有効性を考えると、脂溶性抗ラジカル剤の存在は重要である。脂溶性抗ラジカル剤としては、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）やＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）等があるが、これらは化学合成によるものであるから、その使用が避けられる傾向がある。 天然物由来の脂溶性抗ラジカル剤としては、菜種由来の脱ガム油等が知られているが（特開平９−１５７６８７）、その活性は十分ではない。
また、天然物由来の脂溶性抗酸化剤としては、トコフェロールが知られているが、トコフェロールは、通常の食品の酸化を抑制する効果においてはそれなりの効果を有しているが、脂質ラジカル捕捉能の効果は十分でない。
以上のことから、天然物由来の高活性の脂溶性抗ラジカル剤の開発が待たれている。
発明の開示
本発明の目的は、食品（油脂組成物）の安定性を増し、同時に生体での酸化的障害を予防できる、天然物由来の高活性の脂溶性抗ラジカル剤を得ることにある。
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、菜種原油のアルコール抽出物に高い抗ラジカル活性があることを知り、更に研究を重ねた結果、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の構成からなるものである。
１．４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを有効成分とする抗ラジカル剤。
２．４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを含有する菜種原油の抽出物からなる抗ラジカル剤。
３．菜種原油をアルコール又は含水アルコールで処理することを特徴とする４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールが濃縮された菜種原油の抽出物。
４．菜種原油を蒸留することを特徴とする４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールが濃縮された菜種原油の抽出物。
５．上記３又は４記載の菜種原油の抽出物を含有する抗ラジカル剤。
６．上記１、２、３、４又は５記載の抗ラジカル剤を含有してなる油脂組成物。
７．上記１、２、３、４又は５記載の抗ラジカル剤又は上記６記載の油脂組成物を添加した飲食品、医薬品又は飼料。
なお、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの構造式は、以下のとおりである。
本発明では、菜種原油のアルコール抽出物に高い抗ラジカル活性があることを知り、該活性成分を探求したところ、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールであることをつきとめ、本発明に到達したものである。
本発明の抗ラジカル剤の有効成分の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、油脂に易溶性であり、高い抗ラジカル活性を有する点で優れている。
従来の菜種脱脂粕より抽出した抗酸化剤は難脂溶性であるが、本発明の抗ラジカル剤の有効成分は、菜種原油から抽出したものであり、油脂に溶け易いため、食用油やその他油脂組成物の抗酸化剤として利用し易い。
また、本抗ラジカル剤を摂取した場合、脂溶性であるため生体内で細胞膜への親和性が高く、水溶性抗ラジカル剤が作用し難い脂質の豊富な細胞膜や臓器中で有効に作用する。
更に、本抗ラジカル剤の有効成分は、菜種原油の抽出物から得られるものであるので、原料面や安全面で有利である。
本抗ラジカル剤を添加した油脂組成物は、抗ラジカル性だけでなく、安定性も向上する。
何れにしても、本発明の抗ラジカル剤の有効成分である、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、油脂に易溶性であり、高い抗ラジカル活性を有することは、本発明で初めて知り得たことからみて、該成分の選択には格別の意義があることが分かる。
発明を実施するための形態
以下、更に本発明について詳述する。
（１）抽出
本発明の抗ラジカル剤の有効成分である、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、菜種原油をアルコールで抽出することにより濃縮することができる。
菜種油は、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）に属するナタネの種子から得られる油脂であるが、抽出に用いられる菜種原油は、圧搾油、抽出油、脱ガム油等から選ぶことができる。
抽出に用いるアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、又はそれらの含水物等が挙げられる。
抽出に好適な含水量は、アルコールにより異なるが、メタノールの場合は容積比で０〜１０％、エタノールでは５〜２０％である。
抽出条件は特に限定されない。例えば、温度は１０〜８５℃で、常温でも好適に抽出できる。振とう抽出や攪拌機等のついた抽出機で抽出することによって抽出効率を上げることもできる。抽出時間は数分〜数時間であり、長時間なほど十分に抽出されるが、抽出物中の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール濃度が低くなる可能性がある。
原料に対して、０．１〜２０倍量のアルコールで抽出し、好ましくは同様の抽出操作を２〜３回繰り返すのがよい。
本抽出は、油脂とアルコールとの液々抽出であり、アルコール画分を分離して濃縮し、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール含有抽出物を得る。
抽出方法には種々の方法が選択されるが、アルコールと油脂の溶解性に注意する必要がある。特にエタノールは、油脂との相溶性が比較的高いため、抽出物中の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール濃度を上げ、トリグリセリド濃度を抑えるためには、原料に対して０．１〜１倍量のエタノールで抽出するのが好ましい。
本発明の抗ラジカル剤の有効成分である、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、菜種原油を蒸留することでも濃縮することが出来る。
蒸留はどのような装置を用いて行ってもよく、例えば、薄膜式または遠心式蒸留装置を使用することができる。また低真空度の蒸留装置に加え、高真空度の蒸留装置（分子蒸留装置）も使用することができる。
蒸留条件は特に限定されない。例えば、温度は７０〜３００℃で、圧力は０．１〜１０Ｔｏｒｒ、時間は数分から数時間で好適に蒸留される。高温かつ高真空度で長時間蒸留するほど十分に蒸留されるが、菜種原油中の他の成分も蒸留されて、蒸留物中の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール濃度が低下したり、臭いや味質の面で好ましくない成分も混入する可能性がある。好ましくは、１３０〜１８０℃、１０分〜２時間、１．０〜３．０Ｔｏｒｒで蒸留を行うのがよい。また、水蒸気を吹き込むことにより、更に蒸留効率を高めることができる。
また、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは、必要に応じて、２層分配法、カラムクロマトグラフィー法、薄層クロマトグラフィー法（ＴＬＣ法）、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）等を適用し、精製・分離して、濃縮することができる。
抗ラジカル剤中の４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール量は、０．２重量％以上で十分である。
従って、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを０．２重量％以上含有するものであるならば、メタノールやエタノール抽出物、蒸留物等はそのまま抗ラジカル剤として使用可能である。
（２）適用
本抗ラジカル剤は、そのまま摂取してもよいが、一般の食用精製油等の油脂組成物に配合して、抗ラジカル性油脂組成物を得、この組成物を飲食品に添加して、抗ラジカル性の飲食品を得ることもできる。
また、本抗ラジカル剤を添加した製品（油脂組成物等）は、抗ラジカル性だけでなく、安定性も向上する。
飲食品としては、例えば、菓子類（ガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック、ゼリー、グミ、定菓等）、麺類（そば、うどん、ラーメンなど）、乳製品（ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等）、飲料（ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）等が挙げられる。
飲食品には、劣化防止剤、甘味料、香料、着色料、乳化剤、酸化防止剤、増量剤等の添加剤を適宜配合することができる。
また、同様にして、本抗ラジカル剤や抗ラジカル性油脂組成物を、医薬品、化粧品、飼料等に添加して、抗ラジカル性の医薬品、化粧品、飼料等を得ることができる。
油脂組成物中には、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを１０〜５０００ｐｐｍ添加すれば、抗ラジカル性油脂組成物となり、その効果を十分発揮することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、特に断らない限り、「％」は「重量％」を意味する。
（１）４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの単離・精製
以下の５工程により、菜種原油から４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを単離・精製した。
１． メタノール抽出
菜種原油４５０ｇにメタノール９０ｍｌを加え、シェーカーを用いて１０分間激しく振とうさせた。振とう後、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。上層のメタノール層を、ナス型フラスコに回収した。下層の菜種原油に再びメタノール９０ｍｌを加え、シェーカーで振とうした。これらの操作を合計３回繰り返して、回収したメタノール層からメタノールを蒸発させ、抽出物２．９ｇを得た。
２． ２層分配
工程１で得たメタノール抽出物２．９ｇを、実施例５と同様の方法で２層分配を行い、ヘキサン画分１．５ｇ、アセトニトリル画分０．８６ｇを得た。
アセトニトリル画分に高い抗ラジカル活性が認められたので、アセトニトリル画分を次の精製工程に使用した。
３． シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画
シリカゲル（関東化学製カラムクロマト用＜１５０μｍ）１５ｇを、３００ｍｍ×２０ｍｍ¢のガラスカラムに充填した。工程２で得たアセトニトリル画分５００ｍｇを、５ｍｌのクロロホルムに溶解し、カラムに注入した。これに、分離溶媒（ヘキサン／ジェチルエーテル（９０／１０）１７５ｍｌ、クロロホルム２２５ｍｌ、アセトン４００ｍｌ、メタノール２００ｍｌの順）を約２ｍｌ／ｍｉｎの流速で供給し溶出した。集めた各溶出画分はナスフラスコに回収し、エバポレーターで溶媒を留去し、クロロホルム画分１４４ｍｇ、アセトン画分２０５ｍｇ、メタノール画分４２ｍｇを得た。
クロロホルム画分に最も高い活性が認められたので、このクロロホルム画分を次の工程に使用した。
４． 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分取
工程３のクロロホルム画分１００ｍｇを、展開プレート（シリカゲル：Ｍｅｒｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０）／展開溶媒（ヘキサン／ジエチルエーテル＝８０／３０）を用いて展開した。プレート上の黄色バンドを確認し、スパチュラでシリカゲルごと目的の物質をかき取った。クロロホルム２０〜３０ｍｌを加え、よく振り混ぜた後、ガラスフィルターでシリカゲルを濾別した。エバポレーターで溶媒をとばして、濃縮物１３ｍｇを得た。得られた濃縮物を次の工程に使用した。
５． 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分取
工程４で得た濃縮物２ｍｇを用いて、下記の条件で、ＨＰＬＣ溶出を行った。０〜２０分は溶離液Ａを１００％流し、２０〜２５分にかけて溶離液Ａ１００％からＢ１００％へリニアグラジエントをかけ、２５分以降は溶離液Ｂを１００％流した。４．５分付近に見られたシングルピークを分取した。収量は１ｍｇであった。
（ＨＰＬＣの溶出条件）
カラム：Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．ＡＱＵＡＳＩＬＣ１８（４．６ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ）
サンプル量：１００μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）
溶離液Ａ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（９０／１０）
溶離液Ｂ：ＣＨ３ＣＮ
カラム温度：室温
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ検出器（３００ｎｍ，４５０ｎｍ）
（２）４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの同定
本同定は、以下の分析法で行った。
１）ＬＣ／ＭＳ
（分析法）
サンプルをメタノールに溶解させ、ＬＣ／ＭＳ（ＪＥＯＬ、ＪＭＳ−ＬＣｍａｔｅ）を用い、ＡＰＣＩ（＋）で測定した。
（分析結果）
主成分の低分解能ＭＳのｍ／ｚは１８１であった。
上記の低分解能ＭＳの分子量の測定結果によると、ＡＰＣＩ（＋）では、Ｍ＋Ｈでイオン化し易いため、ｍ／ｚ１８１成分の分子量は１８０となる。
そこで、ｍ／ｚ１８１成分について、高分解能（ミリマス）ＭＳによる分析を行い、正確な分子量を測定したところ、１８１．０８１３であった。
ＣＨＮ分析、Ｓ分析の結果より、Ｎ、Ｓが存在しないことが確認できた。
この結果を参酌すると、上記ｍ／ｚ１８１成分の分子式はＣ１０Ｈ１３Ｏ３となるから、分子量の計算値は１８１．０８６５となる。この分子量の計算値と上記の実測値の誤差は殆どないので、主成分の分子式はＣ１０Ｈ１２Ｏ３であると判断した。
２）ＮＭＲ
（分析方法）
サンプルを窒素気流下で乾燥させた後、重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）に溶解させ、専用のガラス管に入れ、ＮＭＲ（ＪＥＯＬ、４００ＭＨｚ）を測定した。（分析結果）
ＮＭＲの測定結果は、図１に示す。
このＮＭＲの結果から、以下のことがいえる。
３．９０ｐｐｍ：−ＯＣＨ３×２（線対称）のＨ６個
５．１７ｐｐｍ：Ｃ＝Ｃのｔｒａｎｓ位のＨ
５．５１ｐｐｍ：フェノールのＨ
５．６２ｐｐｍ：Ｃ＝Ｃのｃｉｓ位のＨ
６．６１ｐｐｍ：Ｃ＝Ｃのｇｅｍ位のＨとベンゼン環のＨ２個
また、１〜３ｐｐｍにはピークが見られないため、アルキル基（Ｃ−Ｃ）は存在しない。
上記のことから、ベンゼン環に、−ＯＨ、−ＯＣＨ３×２（線対称）、Ｃ＝ＣにＨが付いており、アルキル基（Ｃ−Ｃ）はないことが分かる。
以上の分析結果を合わせ考え、ケミカルシフトの計算値を参考にして、本精製物は、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールであると同定した。
（３）４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの定量
前記（１）−５．のＨＰＬＣ法を数回繰り返し、定量用の標準４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを得た。
本標品を用い、以下に示すＨＰＬＣ分析により、検量線を作成し、各サンプルの４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール濃度を求めた。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ２５０−４ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＮＨ２（４．０ＩＤ×２４４ｍｍ，５μｍ）
溶離液：１．２％イソプロピルアルコール／ヘキサン（ｖ／ｖ）
流量：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温（２５℃以下）
検出器：蛍光検出器（Ｅｘ２９８ｎｍ，Ｅｍ３２５ｎｍ）
試料量：５０μｌ
内部標準試薬：ペンタメチルクロマノール（ＰＭＣ）
測定時間：３０分
本分析の結果を図２に示す。ＰＭＣは６分前後（ピーク３）、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールは１８分前後（ピーク７）に検出された。
（４）抗ラジカル活性
抗ラジカル活性は、以下の方法で測定した。
１）ＩＰＯＸ５０値
脂質過酸化物（アルキルパーオキサイド：ＲＯＯＨ）のモデル化合物としてターシャルブチルハイドロパーオキサイド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）を用いる測定系で、化学発光法により測定して、化学発光を５０％抑制する被験物の濃度を求める。
０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水２５０μｌに、１０ｍＭジエチレントリアミン５酢酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）５０μｌ、３００ｍＭ ｔ−ＢｕＯＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）５０μｌ、１００ｍＭルミノール（和光純薬（株）製）５０μｌ、被験物のエタノール溶液５０μｌを加えて十分に攪拌した後、１ｍｇ／ｌヘモグロビン（ブタ由来：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）５０μｌを加え、素早く極微弱発光測定装置（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＬＢ９５０５）にセットして、発光量を測定する。
被験液を入れない場合に対して、発光量を５０％に抑制する被験物濃度を求めて５０％抑制濃度（ＩＰＯＸ５０）とする。この値が小さいほどラジカル捕捉能が強いことを示す。
２）ＯＲＡＣ法におけるＴｒｏｌｏｘ比活性
ヒト血清の２００倍希釈溶液１０μｌに、１０μｌの所定濃度の被験試料、又は、６０μＭの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ）溶液を１０μｌ加える。次に、３．７３ｍｇ／ｌのβ−フィコエリトリン（β−ＰＥ）を１８０μｌ加え、３７℃で１分間、予備加温する。次いで、８０ｍＭの２，２′−アゾビス（２−アミジノプロパン）−ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）を１０μｌ加え、３７℃で反応を開始する。血清や添加試薬の希釈には、リン酸緩衝液（７５ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いる。また、対照は被験試料の代わりに、上述したリン酸緩衝液を用いる。反応液の蛍光強度（Ｅｘ：５４０ｎｍ、Ｅｍ：５６５ｎｍ）を反応開始後より２分毎に測定し、蛍光強度（ｙ軸）−時間（ｘ軸）の曲線グラフを描く。被験試料、Ｔｒｏｌｏｘ、対照の得られた曲線とｘ軸、ｙ軸で挟まれた領域の面接（Ｓ）を算出する。被験物質の血清中での抗ラジカル活性は、以下の式でＴｒｏｌｏｘ比活性として算出する。
Ｔｒｏｌｏｘ比活性＝（被験試料のＳ−対照のＳ）／（ＴｒｏｌｏｘのＳ−対照のＳ）×（Ｔｒｏｌｏｘの濃度／被験試料の濃度）
この試験系では、ＡＡＰＨがペルオキシラジカルを発生させ、それが基質であるβ−ＰＥを酸化し、その結果、β−ＰＥの蛍光が消失する反応が起こる。Ｔｒｏｌｏｘは、水溶性ビタミンＥの誘導体であり、この試験系において抗酸化作用の基準物質として用いられる。これらの反応基質や基準物質はＯＲＡＣ（Ｏｘｙｇｅｎ Ｒａｄｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ）法に用いられるものである。ＯＲＡＣ法は、生体試料や天然物の抗酸化、抗ラジカル活性を簡便かつ正確に基準物質との比較値で求めることができ、広く用いられている方法である。
（５）ランシマット試験
本試験は、油脂の酸化安定性を測定するものである。
本試験は、試料を反応容器で１２０℃に加熱しながら、清浄空気を送り込み、酸化により生成した揮発性分解物を水中に捕集し、水の導電率が急激に変化する折曲点までの時間（ランシマット時間）を測定することにより行われる。
（６）熱安定性試験
熱安定性試験は、以下の方法で行った。
試験油５００ｇを鍋（直径２３ｃｍ）にはかりとり、電熱器により１８０℃に加熱する。規定温度到達後、直ちにジャガイモ天ぷら（直径４ｃｍ、厚さ０．６ｃｍ）を３分間揚げる。温度を１８０℃に維持したまま１時間ごとに、５時間まで天ぷらを揚げる。投入２０秒後のカニ泡の量を観察し、泡の量を鍋の表面積全体に対しての比率で５段階評価した（Ａ：０〜２０％、Ｂ：２１〜４０％、Ｃ：４１〜６０％、Ｄ；６１〜８０％、Ｅ：８１〜１００％）。
実施例１、比較例１
４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール６０μＭ、及びα−トコフェロールは３００μＭを試験に供し、表１に示すＴｒｏｌｏｘ比活性を算出した。
実施例２ （エタノール抽出物）
菜種原油１ｋｇに２００ｍｌの９９．５％エタノールを加え、１０分間激しく振とうした。遠心分離を行い、エタノール層を分取した。この操作を３回繰り返し、回収したエタノール層を濃縮してエタノールを除去し、抽出物２１ｇを得た。
実施例３ （含水エタノール抽出物）
菜種原油１ｋｇに２００ｍｌの９０％含水エタノールを加え、１０分間激しく振とうした。遠心分離を行い、エタノール層を分取した。この操作を３回繰り返し、回収したエタノール層を濃縮してエタノールおよび水を除去し、抽出物８ｇを得た。
実施例４ （メタノール抽出物）
菜種原油１ｋｇに２００ｍｌの９９．５％メタノールを加え、１０分間激しく振とうした。遠心分離を行い、メタノール層を分取した。この操作を３回繰り返し、回収したメタノール層を濃縮してメタノールを除去し、抽出物７ｇを得た。
実施例５ （２層分配アセトニトリル抽出物）
実施例４で得られたメタノール抽出物７ｇをヘキサン４５ｍｌに溶かして、分液漏斗▲１▼に入れた。これに９９．５％アセトニトリル１５ｍｌを加え振とうした。振とう後、下層（アセトニトリル層）を新たなヘキサン４５ｍｌの入っている分液漏斗▲２▼に移し、分液漏斗▲１▼には新たなアセトニトリル１５ｍｌを入れた。分液漏斗▲１▼及び▲２▼を振とうして、分液漏斗▲２▼の下層をナス型フラスコに分取し、分液漏斗▲１▼の下層は分液漏斗▲２▼に移した。分液漏斗▲１▼には新たなアセトニトリル１５ｍｌを入れ、同様の操作を合計２回繰り返した。分取した各下層を合わせ濃縮してアセトニトリルを除去し、抽出物１．５ｇを得た。
実施例６ （蒸留物）
菜種原油１０００ｇをクライゼンフラスコに張込み、１５０℃、３０分間、１．５Ｔｏｒｒ、水蒸気吹込み量対油１．５％で分子蒸留を行った。トラップから回収した回収物から水分を蒸発させ、蒸留物３ｇを得た。
実施例７ （４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノール）
前記（３）の、菜種原油から単離・精製した４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを用いた。
上記の実施例の抽出物、蒸留物及び４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの抗ラジカル活性及び４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールの含量を、表２に示す。
比較のために、菜種原油（比較例２）、１００％ビタミンＥ（比較例３）、５％ビタミンＥ（比較例４）、１％ビタミンＥ（比較例５）の抗ラジカル活性を同様に測定し、表２に示す。
なお、比較例３〜５では、ビタミンＥは、α−Ｔｏｃ６８．１％、β−Ｔｏｃ０．４％、δ−Ｔｏｃ０．１％のものを用い、菜種サラダ油に溶かして活性を測定した。
実施例８
実施例２で得られたエタノール抽出物を、菜種精製油に２％添加して抗ラジカル性菜種精製油を得た。
実施例９
実施例４で得られたメタノール抽出物を、菜種精製油に０．７％添加して抗ラジカル性菜種精製油を得た。
実施例１０
実施例５で得られたアセトニトリル画分を、菜種精製油に０．１５％添加して抗ラジカル性菜種精製油を得た。
実施例１１
実施例６で得られた蒸留物を精製菜種油に０．２％添加して、抗ラジカル活性菜種精製油を得た。
実施例８〜１１の抗ラジカル性菜種精製油の抗ラジカル活性と安定性を、表３に示す。
産業上の利用の可能性
（１）本発明の抗ラジカル剤は、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを有効成分とするものであって、高い抗ラジカル活性を有する点で優れている。
（２）従来の菜種脱脂粕より抽出した抗酸化剤は難脂溶性であるが、本発明の抗ラジカル剤の有効成分は、菜種原油から抽出したものであり、油脂に易溶性のため、食用油やその他油脂組成物の抗酸化剤として利用し易い。
（３）本抗ラジカル剤を摂取した場合、脂溶性であるため生体内で細胞膜への親和性が高く、水溶性抗ラジカル剤が作用し難い脂質の豊富な細胞膜や臓器中で有効に作用する。
（４）本抗ラジカル剤の有効成分は、菜種原油の抽出物から得られるものであるので、原料面や安全面で有利である。
（５）本抗ラジカル剤を添加した製品（油脂組成物等）は、抗ラジカル性が付与されるだけでなく、安定性も向上する。
【図面の簡単な説明】
図１は、単離・精製した４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールのＮＭＲの測定図である。
図２は、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールのＨＰＬＣの測定図である。
Claims (2)
- 菜種原油をアルコール若しくは含水アルコールで処理した抽出物又は菜種原油を蒸留して得られる蒸留物であって、４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを０．２重量％以上含有することを特徴とする抗ラジカル剤。
- 精製された食用油脂に４−ビニル−２，６−ジメトキシフェノールを１０〜５０００ｐｐｍ添加してなる油脂組成物。
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