JP4610143B2 - 子宮筋収縮抑制薬 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、アドレノメデュリンを含有する、子宮筋自動収縮またはブラジキニンによる収縮を抑制するための組成物に、より詳細には、子宮筋自動収縮またはブラジキニンによる収縮を選択的に抑制するための組成物に関する。
背景技術
産科の分野で最も重要な問題の一つは早産の管理である。妊娠２２週以後から３７週未満の分娩を早産といい、全分娩の５〜１０％を占める。早産により分娩された新生児を早産児といい、低出生体重児であることが多い。近年、新生児管理は著しく進歩したとはいえ、早産児は正常分娩された新生児と比較して罹患率および死亡率が高いので、可能な限り妊娠状態を維持して早産を予防することが望ましい。
現在広範に用いられている早産予防薬としては、β_２−アドレナリン作用性の交感神経作用薬、硫酸マグネシウム、およびインドメサシン（プロスタグランジン合成阻害剤）などが公知である。
代表的なβ_２−アドレナリン作用性作用薬であるリトドリンは、母体に、頻脈、レニン分泌の増大、高血糖症（および新生児の低血糖症）を含む種々の心血管性および代謝性の副作用を引き起こす。テルブタリンおよびアルブテロールを含む他のβ_２−作用性作用薬は、リトドリンと同様の副作用を有する。
４〜８ｍｇ／ｄＬの治療範囲を超える血漿濃度の硫酸マグネシウムは、心臓伝導および神経筋伝達の阻害、呼吸低下、ならびに心停止を引き起こし、従って腎機能が損なわれた場合には、この薬剤は好適ではなくなる。
インドメサシンは、胎児の肺動脈高血圧症、動脈管開存異常などの胎児副作用があるので、大量使用および長期使用は禁忌である。
このように、現在公知の早産予防薬は種々の欠点を有する。それゆえ、これらの欠点を有さない、新規な早産予防薬が望まれている。
分娩の開始、すなわち陣痛発来の機序は、いまだ完全には解明されていないが、子宮収縮作用をもつオキシトシン、プロスタグランジンなどの関与が示唆されている。ブラジキニンもオキシトシンおよびプロスタグランジンと同様に、子宮収縮作用を有するが、その生理的、あるいは病態生理的な意義については、未だ不明である。しかし、ブラジキニンは本来、炎症性のメディエーターであり、妊娠子宮における異常な増加が早産、流産を引き起こす可能性が示唆されている（文献１；文献リストは本書末尾に記載する）。そのため、子宮筋の自動収縮を抑制し得る薬剤、またはブラジキニンの子宮筋収縮作用を抑制し得る薬剤、特に子宮筋の自動収縮を選択的に抑制し得る薬剤、またはブラジキニンの子宮筋収縮作用を選択的に抑制し得る薬剤が見出されれば、早産を予防するためだけでなく、流産を予防するため、帝王切開前に分娩を停止するために有用であると考えられる。
さらに、この薬剤は、月経困難症を治療するために有用であると考えられる。なぜなら、月経困難症は、排卵周期中の月経に関連する周期的痛みによって特徴付けられ、この痛みは、子宮の収縮および虚血に由来するものと考えられるからである。
アドレノメデュリン（ＡＭ）は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）ファミリーの一員であり、当初、ヒト褐色細胞腫から降圧作用を有するペプチドとして単離された（文献２）。ＡＭは、種々の組織において様々な役割を果たすことが知られている（文献３）。これは、ＡＭの生体に対する作用機序が一様ではないことを示唆する。
メス生殖系（例えば、下垂体の後葉（文献３）および子宮（文献４）におけるＡＭタンパク質あるいはＡＭ ｍＲＮＡのレベルは、副腎髄質におけるレベルと同程度に高い。また、母体血液中の循環ＡＭのレベル（文献５）ならびに胎児胎盤組織（文献６）および子宮（文献７）におけるＡＭおよびＡＭ ｍＲＮＡの量は、両方とも、正常な妊娠の間に上昇した。妊娠合併症の１つである妊娠中毒症では、母体の血漿ＡＭレベルは変化しなかった（文献５）かまたは低下（文献８）したが、羊水および臍静脈中のＡＭ含量は、正常妊娠（文献９）と比較して高かった。しかし、これらの胎児組織および母体組織におけるＡＭの生理学的役割およびＡＭの機能の詳細は、依然として不明である。
ＡＭの子宮収縮に与える影響については、ＡＭが、５μＭ以上の高濃度でのみガラニン（ＣＧＲＰニューロンに含まれる神経ペプチド）による子宮の緊張性収縮を抑制すること、さらにその作用がＣＧＲＰ［８−３７］により消失することが、唯一報告されている（文献７）。しかし、ガラニンによる子宮収縮の意義が全く不明であること、また、ＡＭの作用が、ナノモル（ｎＭ）オーダー以下の濃度（ＡＭが作用しうる濃度として多くの論文で報告されている）ではみられず、マイクロモル（μＭ）オーダー以上という高濃度でしか確認できないことから、生理的なＡＭの作用を反映しているとは考えにくい。
子宮の運動性（収縮／弛緩）は、交感神経、副交感神経による神経性の調節だけでなく、ＣＧＲＰ（文献１０）や、一酸化窒素（ＮＯ）、オキシトシン、プロスタグランジンＦ_２α（ＰＧＦ_２α；血圧上昇、血管収縮、腸管運動促進、子宮収縮、黄体退行促進、および気管支収縮作用を有し、分娩誘発剤として使用される代表的なプロスタグランジン）などの様々な物質により協調的に調節されている。また、前述のブラジキニンのように、異常収縮を引き起こし、早産の原因となりうるものも子宮の運動性に影響を与える。しかし、子宮の自動収縮、ならびにオキシトシン、ＰＧＦ_２αなどの調節因子による収縮、あるいは、ブラジキニンによる収縮にＡＭがどのような影響を与えるかは、全く知られていない。
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、子宮筋の自動収縮またはブラジキニンによる収縮を抑制する、好ましくは選択的に抑制する新規な薬剤を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者は、もともと血圧降下作用を有するペプチドとして同定されたアドレノメデュリンが、子宮筋の自動収縮およびブラジキニンによる収縮を抑制する作用を有すること、およびこの抑制作用が選択的であることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
本発明の子宮筋自動収縮またはブラジキニンによる収縮を抑制するための組成物は、アドレノメデュリンを含有する。本発明の組成物は、子宮筋自動収縮またはブラジキニンによる収縮を選択的に抑制するため、早産を予防するため、流産を予防するため、帝王切開前に分娩を停止するため、または月経困難症を治療するために用いられ得る。
１つの実施態様において、上記アドレノメデュリンは、（ａ）配列表の配列番号１の１３位のＳｅｒから５２位のＴｙｒまでのアミノ酸配列を有するペプチド；（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ子宮筋収縮抑制作用を有するペプチド；（ｃ）配列表の配列番号１の１位のＴｙｒから５２位のＴｙｒまでのアミノ酸配列を有するペプチド；（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ子宮筋収縮抑制作用を有するペプチド；（ｅ）配列表の配列番号１の−７３位のＡｌａから５２位のＴｙｒまでのアミノ酸配列を有するペプチド；（ｆ）アミノ酸配列（ｅ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ子宮筋収縮抑制作用を有するペプチド；（ｇ）配列表の配列番号１の−９４位のＭｅｔから９１位のＬｅｕまでのアミノ酸配列を有するペプチド；または、（ｈ）アミノ酸配列（ｇ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ子宮筋収縮抑制作用を有するペプチドを含む。
他の実施態様では、上記アドレノメデュリンのＣ末端は、アミド化されるか、またはＧｌｙが付加され得る。
他の実施態様では、上記アドレノメデュリンにおいて、配列表の配列番号２の１６位のＣｙｓと２１位のＣｙｓとが架橋され得る。上記架橋は、ジスルフィド結合または−ＣＨ_２−ＣＨ_２−結合であり得る。
本発明の早産または流産の予防方法は、アドレノメデュリンを含有する組成物を用いる。
本発明は、早産または流産の予防薬を製造するためのアドレノメデュリンの使用を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の実施においては、特に指示されない限り、当該分野で既知であるタンパク質の分離および分析法、組換えＤＮＡ技術、およびアッセイ方法が採用される。
Ｉ．定義
以下に、本発明を説明する上で用いられる用語を説明する。
アドレノメデュリンは、上述のように、当初、血圧降下作用を有するペプチドとしてヒト褐色細胞腫から単離されたペプチドである。本発明において、用語「アドレノメデュリン」は、この特定のペプチドに限定されず、このペプチドに対してアミノ酸配列における実質的な相同性を有するペプチドもまた含んでいう。相同なペプチドの例として、種変異体、および対立遺伝子変異体がある。ヒト由来のアドレノメデュリンは、配列表の配列番号２の１位のＴｙｒから５２位のＴｙｒまでのアミノ酸配列を含む。（配列表の配列番号２の−９４位のＭｅｔから９１位のＬｅｕまでのアミノ酸配列からなるペプチドは、プレプロアドレノメデュリンと考えられる。シグナルペプチドがプロセシングされた配列表の配列番号２の−７３位のＡｌａから９１位のＬｅｕまでのアミノ酸配列からなるペプチドは、プロアドレノメデュリンと考えられる。配列表の配列番号２の１３位のＳｅｒから５２位のＴｙｒまでのアミノ酸配列からなるペプチドは、血圧降下作用が確認されたアドレノメデュリンフラグメントである。これらのいずれの形態も、本発明において使用され得る。）ヒト由来のアドレノメデュリンは、配列表の配列番号１の４４７位のＴから６０２位のＣまでのポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。ブタ由来のアドレノメデュリンの場合、配列表の配列番号４の１位のＴｙｒから５２位のＴｙｒまでのアミノ酸配列を含む。ブタ由来のアドレノメデュリンは、配列表の配列番号３の４３０位のＴから５８５位のＣまでのポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。ラット由来のアドレノメデュリンは、配列表の配列番号６の１位のＴｙｒから５０位のＴｙｒまでのアミノ酸配列を含む。ラット由来のアドレノメデュリンは、配列表の配列番号５の４３３位のＴから５８２位のＴまでのポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
ヒトの疾患または治療の目的において、ヒト由来のペプチドが好ましいことは明らかである。しかし、他の哺乳動物由来の相同なペプチドもまた目的に応じて使用可能である。さらに、他の哺乳動物由来のペプチドとの比較は、ヒト由来のペプチドの所望の活性が保持された改変体を得るうえで重要である。
本発明に用いられるアドレノメデュリンは、上記の配列によって必ずしも限定されることはなく、これらの配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ所望の活性が保持された相同なペプチドも対象として含まれる。
アミノ酸の保存的置換は、相同なペプチドを得るための好ましい手段のひとつである。保存的置換は、代表的には以下のグループ内での置換を包含する：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
２つのアミノ酸配列の間の相同性は、必要であればギャップを導入して、残基の適合を最適化することにより決定される。ヒトのアドレノメデュリンに実質的なアミノ酸配列相同性を有するペプチドは、ヒトのアドレノメデュリンのアミノ酸配列と、代表的には少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、そしてより好ましくは少なくとも約８０％の相同性を有し、そして特に好ましい実施態様では、少なくとも約９０％以上の相同性を有する。相同性決定のためのソフトウェアは、容易に入手可能である。
本発明においては、定義上、下記の実施例１と実質的に同一の条件（ＡＭの添加濃度は１００ｎＭとする）で測定したとき、子宮筋の自動収縮度が実施例１のコントロール区に示された値の約９０％以下、好ましくは約８０％以下であるとき、またはブラジキニンによる収縮度が実施例２のコントロール区に示された値の約９０％以下、好ましくは約８０％以下であるとき、「子宮筋収縮抑制作用を有する」という。
本発明においては、定義上、下記の実施例１と実質的に同一の条件（ＡＭの添加濃度は１００ｎＭとする）で測定したとき、子宮筋の自動収縮度が実施例１のコントロール区に示された値の約９０％より高い、好ましくは約９５％以上であるとき；ブラジキニンによる収縮度が実施例２のコントロール区に示された値の約９０％より高い、好ましくは約９５％以上であるとき；またはオキシトシンもしくはプロスタグランジンＦ_２αによる収縮度が実施例４においてＡＭ添加前に示された値の約９０％より高い、好ましくは約９５％以上であるとき収縮を「抑制しない」という。
本発明においては、子宮筋の自動収縮またはブラジキニンによる収縮は抑制するが、オキシトシンおよびプロスタグランジンＦ_２αによる収縮は抑制しない場合に、「選択的な子宮筋収縮抑制作用を有する」という。
本発明に用いられるペプチドのＣ末端は、アミド化されていても、されていなくてもよい。「Ｃ末端のアミド化」とは、ペプチドの修飾反応の１つをいい、ペプチドのＣ末端アミノ酸のＣＯＯＨ基が、ＣＯＮＨ_２の形態になることをいう。生体内で作動する多くの生理活性ペプチドは、はじめ分子量のより大きな前駆体タンパク質として生合成され、これが細胞内移行の過程で、Ｃ末端アミド化のような修飾反応を受けて成熟する。アミド化は、Ｃ末端アミド化酵素が、前駆体タンパク質に作用することによって、行われる。前駆体タンパク質においては、アミド化される残基のＣ末端側には常にＧｌｙ残基が存在し、さらにそのＣ末端側に、例えばＬｙｓ−ＡｒｇあるいはＡｒｇ−Ａｒｇなどの塩基性アミノ酸配列対が続いていることが多い（文献１１）。
ＩＩ．子宮筋収縮抑制作用を有するアドレノメデュリン
本発明においては、アドレノメデュリンは、子宮筋自動収縮またはブラジキニンによる収縮を抑制するため、好ましくは選択的に抑制するための組成物の有効成分として利用される。また、アドレノメデュリンは、早産または流産の予防薬を製造するための有効成分として利用される。アドレノメデュリンは、天然の供給源から単離されたもの、組換えＤＮＡ技術を使用して産生したもの、または化学合成したものであり得る。
アドレノメデュリンを天然の供給源から単離する場合、例えば、以下のようにして精製し得る。アドレノメデュリンは、例えばまず、ヒト褐色細胞腫を破壊して得られる粗抽出物を、各種クロマトグラフィーにかけることによって精製され得る。その際、血小板ｃＡＭＰの活性の上昇をモニターすることによって、目的のアドレノメデュリンを含むフラクションを得ることができる。アドレノメデュリンの単離および精製方法については、特開平７−１９６６９３号公報に記載される。
アドレノメデュリンを組換えＤＮＡ技術を使用して産生する場合、目的のペプチドをコードするＤＮＡ配列が、種々の組換え系を用いて発現される。発現ベクターの構築および適切なＤＮＡ配列を有する形質転換体の作製は、当該技術分野で公知の方法によって実施される。発現は、原核生物系または真核生物系で実施され得る。
原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、バチルス属菌、およびその他のバクテリアが用いられる。そのような原核生物には、複製部位と宿主に適合する制御配列とを含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドである、ｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ここでの制御配列とは、転写開始のためのプロモーター、必要に応じてオペレーター、およびリボソーム結合部位配列を含むと定義される。この制御配列には、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（文献１２）、トリプトファンプロモーター系（文献１３）、およびλ由来のＰ_ＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（文献１４）のような一般的に用いられているものが包含される。
真核生物宿主としては、例えば酵母および哺乳動物細胞が用いられ得る。このような真核生物には、複製部位と宿主に適合する制御配列とを含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、酵母は、ｐＹＥＵｒａ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて形質転換される。その他に、真核生物宿主で有用なプロモーターには、例えば糖分解酵素を合成するためのプロモーター（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（文献１５）；エノラーゼ遺伝子由来のプロモーター；ＹＥｐ１３から得られたＬｅｕ２遺伝子由来のプロモーター；メタロチオネイン由来のプロモーター；ＳＶ４０由来の初期または後期プロモーター、ポリオーマウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウイルス、およびトリ肉腫ウイルス由来のプロモーターのような他のウイルスプロモーターが包含される。宿主細胞と適切なプロモーターとの組合せは当業者に公知であり、必要に応じて適切に選択され得る。
発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによって形質転換体が得られる。この形質転換体を適当な条件で培養することにより、所望のアドレノメデュリンを得ることができる。
アドレノメデュリンの化学合成は、当該技術分野で公知の方法で行われ得る。例えば、ペプチド合成機による個相法で合成され得る。Ｃ末端がアミド化されているペプチドは、ベンズヒドリルアミンレジンを用いて、ペプチド合成機にてＣ末端アミノ酸から順次Ｎ末端アミノ酸まで標準的なＤＣＣ／ＨＯＢｔで縮合させ、得られたペプチドレジンから標準的な開裂法（トリフルオロメタンスルホン酸法）で、目的とするペプチドを切り出して、作製し得る。
Ｃ末端がアミド化されたアドレノメデュリンを得るためには、宿主内で発現させて得られたペプチドのＣ末端のカルボキシル基を、化学的にアミド化するか、または目的とするアミノ酸配列のＣ末端にＧｌｙが付加したペプチドを調製し、これに前述のＣ末端アミド化酵素を作用させてアミド化すればよい。
あるいは、アドレノメデュリンのＣ末端にＧｌｙが付加したペプチドは、前述の通り、生体内のＣ末端アミド化酵素の作用によってＣ末端がアミド化され得る。
ジスルフィド結合は、例えば、空気酸化または適当な酸化剤でペプチドを酸化することにより形成させ得る。ジスルフィド結合の−ＣＨ_２−ＣＨ_２−結合への置換は、周知の方法（文献１６）により行い得る。一般に、ジスルフィド結合を−ＣＨ_２−ＣＨ_２−結合に置換することにより、ジスルフィド結合の開裂がなくなり、タンパク質が安定化する。
以上のようにして得られたアドレノメデュリンが子宮筋収縮抑制作用を、好ましくは選択的な子宮筋収縮抑制作用を有することは、当該分野で公知の、子宮筋収縮作用についてのアッセイ方法を用いて行われ得る。アッセイ方法の例としては、エストロゲンで前処理した雌ラットの子宮を用いる方法、発情前期または発情期の処女の雌ラットの子宮を用いる方法、妊娠中、分娩中、あるいは分娩後の雌ラットの子宮を用いる方法などが挙げられる。エストロゲンで前処理した雌ラットの子宮を用いる場合、例えば、以下の条件で子宮筋収縮抑制作用をアッセイし得る：エストロゲン（例えば、１７β−エストラジオール）を投与した雌ラットから子宮を摘出し、これをいくつかに切断することにより子宮断片を得る。子宮断片の血管付着部を除去して、子宮切片を得る。得られた子宮切片を、リンゲル液などの緩衝液中に浸漬しながら、アイソメトリックトランスデューサーおよびアイソトニックトランスデューサーなどの測定装置を用いて、子宮筋の収縮を継続的に調べる。自動収縮をする子宮筋の律動が一定になったところで、またはブラジキニン、オキシトシン、もしくプロスタグランジンＦ_２αを添加した後に、溶液に被験ペプチドを添加し、子宮筋の収縮の変化を調べる。被験ペプチドの存在下および非存在下で子宮筋を収縮させて、収縮のレベルを比較することにより、ペプチドの子宮筋収縮抑制作用が判断される。このようにして子宮筋の自動収縮、またはブラジキニン、オキシトシン、もしくはプロスタグランジンＦ_２αによる子宮筋の収縮に対する被験ペプチドの作用を決定する。子宮筋の自動収縮またはブラジキニンによる子宮筋の収縮は抑制するが、オキシトシンもしくはプロスタグランジンＦ_２αによる子宮筋の収縮は抑制しない被験ペプチドは、選択的な子宮筋収縮抑制作用を有すると判断される。
ＩＩＩ．子宮筋収縮抑制用組成物の調製
本発明の組成物は、有効量のアドレノメデュリンに加えて、当業者に公知の任意の賦形剤を含有し得る。賦形剤の例としては、乳糖、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウム、ミョウバンなどが挙げられる。
本発明の組成物は、当該分野で公知の方法に従って調製され得る。
本発明の組成物は、任意の形状であり得る。本発明の組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような固体；または水溶液および懸濁液のような液体であり得る。本発明の組成物を錠剤として経口投与する場合、通常、乳糖、コーンスターチ、およびステアリン酸マグネシウムのような賦形剤が使用され得る。本発明の組成物をカプセル剤として経口投与する場合、通常、乳糖および乾燥コーンスターチのような賦形剤が使用され得る。水性懸濁液として経口投与するためには、アドレノメデュリンを乳濁液または懸濁液と組み合わせて使用し得る。水性懸濁液は、必要に応じて、甘味剤および香料を含有し得る。本発明の組成物を筋肉内、腹腔内、皮下、および静脈内注射する場合は、滅菌した溶液にアドレノメデュリンを溶解させて緩衝液を調製し、ｐＨを適切な値に調節する。本発明の組成物を静脈内投与する場合は、組成物は等張であることが好ましい。
本発明の組成物は、早産または流産の予防薬として用いられ得る。
ＩＶ．子宮筋収縮抑制用組成物の投与
本発明の組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載されているような従来のペプチドの処方物の形で投与され得る。例えば、本発明の組成物は、経口投与；静脈投与、筋肉注射、腹腔内注射、および皮下注射のような非経口投与により投与され得る。これらのペプチドを羊水中へ補充することも可能である。好ましくは、これらのペプチドは、注射によって投与され得る。
本発明の組成物を、ヒトに投与する場合、１日あたりの用量は、通常、患者の症状、重篤度、感受性に対する個体差、体重、年齢などを考慮して、当業者によって適切に決定され得る。本発明の組成物は、１日１回投与されてもよいし、１日数回に分けて投与されてもよい。
本発明の組成物を投与することにより、早産または流産が予防される。
（実施例）
以下、本発明の子宮筋自動収縮またはブラジキニンによる収縮を抑制するため、好ましくは選択的に抑制するための薬としてのアドレノメデュリンの作用についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。本実施例で用いたアドレノメデュリンは、配列番号６の１位のＴｙｒから５０位のＴｙｒまでのアミノ酸配列からなる、合成ペプチドである（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．より入手）。
（実施例１：雌ラット子宮の自動収縮に対するアドレノメデュリンの効果）
１０〜１２週齢の雌ラットに、０．２ｍｌの３０％エタノール中１μｇの１７β−エストラジオールを皮下注射した。
翌日、このラットの頭部を強打することにより、屠殺した。次いでこのラットを断頭し、瀉血し、そして子宮を摘出した。摘出した子宮を、ａ〜ｄの４つの部分に切断し（図１（Ａ））、次いで、各断片から血管の付着部側を切除することにより、子宮切片（図１（Ｂ））を得た。
アドレノメデュリンのラット子宮に対する影響を、アイソトニックトランスデューサーＴＤ−１１２Ｓ（日本光電社製）を１ｇ張力で用いて子宮切片の収縮を測定することにより調べた。
まず、子宮切片を、３０ｍｌのグルコース添加改変クレブス−リンゲル重炭酸溶液（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＫＲＢ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）（以下、単に「改変ＫＲＢ溶液」という。）中に浸したまま、アイソトニックトランスデューサーに取り付けた。改変ＫＲＢ溶液の組成は、以下の通りである：１２２ｍＭ ＮａＣｌ、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０３ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、２．４ｍＭ ＣａＣｌ_２、および１１ｍＭグルコース；ｐＨ７．４）。
子宮筋収縮を継続的に測定した。子宮筋の自動的律動が一定になるのを確認した後、１０^−４Ｍアドレノメデュリン（実験サンプル）または蒸留水（コントロールサンプル）を、それぞれ、３０μｌずつ、グルコース添加改変ＫＲＢ溶液に添加し、アドレノメデュリンの濃度を１００ｎＭとした。アドレノメデュリンまたは蒸留水の添加から３０分後、４．５ＭのＫＣｌを３００μｌ添加してＫＣｌ濃度を４５ｍＭとした。
結果を、図２（ａ）〜（ｄ）に示す。ここで、図２の（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ図１（Ａ）のａ〜ｄの部分の子宮切片を用いて得られた結果に対応する。図２（ａ）および（ｂ）はコントロールを、図２（ｃ）および（ｄ）は１００ｎＭアドレノメデュリン添加の結果を示す。それぞれの図の左側の矢印は、蒸留水またはアドレノメデュリンを添加した時点を示す。それぞれの図の右側の矢印は、４５ｍＭのＫＣｌを添加した時点を示す。
図２（ａ）および（ｂ）に示されるように、子宮筋の自動収縮は、蒸留水の添加の影響を受けなかった。一方、アドレノメデュリンを添加した場合、子宮筋の自動収縮が顕著に抑制された（図２（ｃ）および（ｄ））。また、４５ｍＭのＫＣｌの添加により、コントロール添加サンプルでもアドレノメデュリン添加サンプルでも強い収縮が起きたことから、アドレノメデュリンの添加が、子宮平滑筋細胞の脱分極によって生じる電位依存性Ｃａチャネルの活性化による筋収縮には影響を与えないことがわかった。
なお、アイソメトリックトランスデューサーを用いて同じ実験を行ったところ、上記と同じ結果が得られた（データは示さず）。
（実施例２：雌ラット子宮に対するアドレノメデュリンの濃度依存的効果）
実施例１と同様に子宮切片を調製し、改変ＫＲＢ溶液中でアイソトニックトランスデューサーにとり付け、子宮筋の収縮を継続的に測定した。子宮筋の自動的律動が一定になるのを確認した後、１×１０^−６、２×１０^−６、７×１０^−６、２×１０^−５、および７×１０^−５Ｍ アドレノメデュリン（実験サンプル）、または蒸留水（コントロールサンプル）を、それぞれ、最初の添加を０分として、５分後、１２分後、２２分後、および３２分後に改変ＫＲＢ溶液に３０μｌずつ添加して、アドレノメデュリンの濃度を各々１、３、１０、３０、および１００ｎＭとした。次いで、アドレノメデュリンまたは蒸留水の最初の添加から４５分後、４．５ＭのＫＣｌを３００μｌ添加してＫＣｌの濃度を４５ｍＭとした。
結果を、図３（ａ）〜（ｃ）に示す。ここで、図３の（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ図１（Ａ）のｂ〜ｄの部分の子宮切片を用いて得られた結果に対応する。図３（ａ）および（ｂ）は、１〜１００ｎＭの各種濃度のアドレノメデュリン添加の結果を、そして図３（ｃ）はコントロールを示す。それぞれの図の矢印は、アドレノメデュリン、蒸留水、またはＫＣｌを添加した時点を示す。
図３（ａ）および（ｂ）に示されるように、子宮筋の自動収縮は、アドレノメデュリンの添加により、濃度依存的に抑制されることがわかった。
（実施例３：アドレノメデュリンによるブラジキニン誘導性子宮筋収縮の抑制）
実施例１と同様に子宮切片を調製し、改変ＫＲＢ溶液中でアイソトニックトランスデューサーにとり付け、１０ｎＭブラジキニン（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を改変ＫＲＢ溶液に添加した時点から、子宮筋の収縮を継続的に測定した。ブラジキニンの添加の２０分後、１００ｎＭアドレノメデュリンまたは蒸留水をさらに添加した。
結果を、図４（ａ）および（ｂ）に示す。ここで、図４の（ａ）および（ｂ）は、それぞれ図１（Ａ）のａおよびｃの部分の子宮切片を用いて得られた結果に対応する。図４（ａ）は、１００ｎＭアドレノメデュリン添加の結果を、そして図４（ｂ）は蒸留水添加の結果を示す。それぞれの図の矢印は、ブラジキニン、アドレノメデュリン、または蒸留水を添加した時点を示す。
図４（ａ）および（ｂ）に示されるように、ブラジキニンにより誘導される子宮筋の収縮は、アドレノメデュリンの添加により抑制された。
（実施例４：オキシトシンまたはプロスタグランジンＦ_２αによる収縮に対するアドレノメデュリンの効果）
８〜１２週齢の雌ラットを用い、実施例１と同様にして子宮切片を調製した。
次いで、３７℃にて、９５％ Ｏ_２／５％ ＣＯ_２を通気した、３０ｍｌの改変ＫＲＢ溶液を満たした組織チャンバー中に子宮切片を入れ、実施例１と同様に子宮切片の収縮を測定した。４０分間の平衡化後、子宮切片を、１μＭ ＡＭ［２２−５２］または１μＭ ＣＧＲＰ［８−３７］の非存在下または存在下で１５分間プレインキュベーションし、次いでＡＭを組織チャンバー中の改変ＫＲＢ溶液に添加することによりＡＭの濃度を１〜１００ｎＭに徐々に増加させながらＡＭに曝露した。
１７β−エストラジオール注射を与えていないラットを用いる別の実験では、１０ｎＭ ブラジキニン、１ｎＭ オキシトシン、または１μＭ ＰＧＦ_２αによる子宮収縮に対する１００ｎＭ ＡＭの効果を、１μＭ ＡＭ［２２−５２］または１μＭ ＣＧＲＰ［８−３７］の非存在下または存在下で試験した。
いずれの測定においても、４５ｍＭ ＫＣｌ分極により子宮を最終的に収縮させ、子宮の応答を確認した。結果を図６（ａ）〜（ｆ）および図７（ａ）〜（ｅ）に示す。
エストロゲンの一種である１７β−エストラジオールで処理したラットから単離した子宮切片は、律動様式で自動収縮した（図６（ａ）；ここでは、ＡＭ溶液の代わりに蒸留水を添加している）。濃度を徐々に増すように（１〜１００ｎＭ）ＡＭをチャンバーに加えることにより、自動収縮は、濃度依存的に抑制された（ＩＣ_５０＝２３ｎＭ）（図６（ｂ）および（ｃ））。ＡＭの抑制効果は、１００ｎＭ ＡＭにより子宮筋が完全に弛緩した場合でさえも、改変ＫＲＢ溶液を洗浄交換しＡＭを除去することにより可逆的であった（図６（ｃ））。１μＭ ＡＭ［２２−５２］または１μＭ ＣＧＲＰ［８−３７］のいずれかを予め添加することは、それ自体では効果が無かったが、１〜１００ｎＭ ＡＭの添加による収縮抑制効果をほぼ完全に妨げた（図６（ｄ）および６（ｅ））。図６（ｆ）は、図６（ｂ）、（ｄ）、および（ｅ）の結果を比較したグラフである。
エストロゲン処理していないラットから子宮切片を調製した場合、これらは、種々の間隔および振幅で自動収縮した。図７（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に示すように、１ｎＭ オキシトシン、１μＭ ＰＧＦ_２α、または１０ｎＭ ブラジキニンは、いずれも、収縮を顕著に刺激した。１００ｎＭのＡＭは、オキシトシン（図７（ａ））またはＰＧＦ_２α（図７（ｂ））により引き起こされる収縮に対して、ほとんど影響を与えなかった。他方、ブラジキニンによる収縮は、自動収縮を完全に抑制し得る濃度である１００ｎＭのＡＭにより完全にブロックされた（図７（ｃ））。ブラジキニンによる収縮に対するＡＭの抑制効果は、ＡＭ［２２−５２］またはＣＧＲＰ［８−３７］を予め添加することにより消失した（図７（ｄ）および（ｅ））。
（実施例の考察）
本発明者の知る限り、本実施例は、ＡＭが、ラット子宮の自律的な自動収縮を濃度依存的に可逆的に抑制することを初めて実証した。さらに、ＡＭは、ブラジキニンによる収縮は抑制したが、オキシトシン、ＰＧＦ_２αあるいは、高Ｋ刺激による収縮には影響しなかった。このことは、ＡＭの作用が、子宮平滑筋を直接的に弛緩させるものでなく、自動的収縮、あるいは、ブラジキニンによる収縮の発生機構を選択的に抑制していることを示唆する。
本実施例において、ＡＭによる子宮収縮抑制作用は、ＡＭレセプターに対するアンタゴニストであるＡＭ［２２−５２］と、ＣＧＲＰレセプターに対するアンタゴニストであるＣＧＲＰ［８−３７］の両者でブロックされた。このことより、ＡＭの作用は、ＡＭレセプターとＣＧＲＰレセプターの両者を介して発現すると考えられる。ＡＭの作用がＣＧＲＰ［８−３７］によってブロックされることに関しては、本実施例以外にも、単離されたラット腸間膜血管系においてＡＭの血管拡張作用を、ＣＧＲＰ［８−３７］がブロックする（文献１７）、ラット脳室へのＡＭ投与による心拍数および血圧の上昇を、ＡＭ［２２−５２］あるいはＣＧＲＰ［８−３７］がブロックする（文献１８）などの報告がある。また、ラット子宮を用いた結合実験において、ＡＭは、^１２５Ｉ−ＡＭ結合、^１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合の両者を置換しうる、すなわち、ＡＭは、ＡＭの結合部位だけでなく、ＣＧＲＰの結合部位にも結合しうることが報告されている（文献７）。これらの知見は、本実施例で得られた結果を裏付けるものである。
子宮におけるＡＭ蛋白、ＡＭ遺伝子の発現は、ＡＭが発見された副腎髄質における発現のレベルに匹敵して多い（文献７；文献３）。ラットおよびヒトの子宮で、ＡＭが発現しているのは、子宮平滑筋組織より、むしろ子宮内膜組織であることが報告されている。このことより、子宮内膜で産生されたＡＭが、パラクリン因子として子宮平滑筋に作用してものと推測される。
さらに、ＡＭによる子宮収縮抑制作用の臨床的な意義について考察する。
妊娠子宮において、ＡＭの発現量は非妊娠時の約１．８〜約４．５倍、^１２５Ｉ−ＡＭ結合量は約１０倍、^１２５Ｉ−ＣＧＲＰ結合量は約４倍といずれも増加するが（文献７；文献４；文献１９）、ＣＧＲＰの発現量は、検出限界以下に減少することが報告されている（文献７）。これらの知見と、本実施例で得られた「ＡＭが、ＡＭレセプターおよびＣＧＲＰレセプターの両者を介して子宮収縮を抑制する」との結果をあわせると、妊娠子宮においては、発現が増加したＡＭが、子宮収縮を抑制することにより、妊娠の維持に重要な役割を果たしている可能性が示唆される。
また、本実施例において、ＡＭは、ブラジキニンによる収縮は抑制したが、オキシトシンおよびＰＧＦ_２αによる収縮は抑制しなかった。一般に、オキシトシンおよびＰＧＦ_２αによる収縮は、分娩において重要な役割を担うとされている。一方、ブラジキニンによる収縮については、その生理的、あるいは病態生理的な意義は、未だ不明であるものの、本来、ブラジキニンが炎症反応によって局所で産生される炎症性のメディエーターである（文献２０）ことから、妊娠子宮における異常な増加が早産、流産を引き起こす可能性が示唆されている（文献１）。したがって、ＡＭは、オキシトシンおよびＰＧＦ_２αによる正常分娩時の収縮は阻害することなく、ブラジキニンによる異常収縮のみを選択的に抑制することによって、流早産を防止し、妊娠を維持するように働いている可能性が示唆される。
上記の結果をまとめると、非妊娠ラットの単離した子宮切片において、アドレノメデュリン（ＡＭ）は、自動定期収縮を濃度依存的に抑制した（ＩＣ_５０＝２３ｎＭ）。ＡＭの抑制効果は、ＣＧＲＰレセプターについての推定アンタゴニストであるカルシトニン遺伝子関連ペプチド［８−３７］（ＣＧＲＰ［８−３７］）によっても、ＡＭレセプターの推定アンタゴニストであるＡＭ［２２−５２］のいずれによっても、完全に防止された。ＡＭはまた、ブラジキニンによる子宮収縮を減衰させた。ブラジキニンによる子宮収縮は、ＣＧＲＰ［８−３７］またはＡＭ［２２−５２］によりブロックされる。一方、ＡＭは、オキシトシンまたはプロスタグランジンＦ_２αによる収縮応答には抑制効果がない。これらの結果は、ＡＭが子宮筋の自動収縮およびブラジキニンによる子宮筋の収縮を選択的に抑制することを示す。
文献
１．Ｓｃｈｒｅｙら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ，ａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ（１９９２）４５：１３７−１４２
２．Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９３）１９２：５５３−５６０
３．Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１３９：２２５３−２２６４
４．Ｍａｋｉｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９９）３７１：１５９−１６７
５．Ｍｉｎｅｇｉｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．（１９９９）５：７６７−７７０
６．Ｄｉｌｏｒｉｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９９）１４０：２０１−２０６
７．Ｕｐｔｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９７）１３８：２５０８−２５１４
８．Ｈａｔａら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９７）３５０：１６００
９．Ｍａｒｉｎｏｎｉら、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．（１９９９）９３：９６４−９６７
１０．Ａｎｏｕａｒら、Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９８）３５７：４４６−４５３
１１．水野、生化学第６１巻、第１２号、１４３５〜１４６１頁（１９８９））
１２．Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８，１０５６）
１３．Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７）
１４．Ｓｈｉｍａｔａｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）
１５．Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：２０７３）
１６．Ｏ．Ｋｅｌｌｅｒら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９７４）５７：１２５３）
１７．Ｎｕｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９３）１９６：２４５−２５１
１８．Ｓａｉｔａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９８）２７４：Ｒ９７９−Ｒ９８４
１９．Ｄｏｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．（１９９８）１７９：４９７−５０６
２０．ＤｅＬａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９１）２６０：Ｇ２１３−２１９
産業上の利用可能性
本発明により、アドレノメデュリンを含有する、子宮筋自動収縮またはブラジキニンによる収縮を抑制するため、好ましくは選択的に抑制するための組成物が提供される。この組成物は、早産および流産を予防するため、帝王切開時に分娩を停止するため、ならびに月経困難症を治療するために有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１（Ａ）は、実施例において子宮切片を採取した子宮部位を示す模式図である。図１（Ｂ）は、調製した子宮切片の形状を示す模式図である。
図２（ａ）は図１（Ａ）のａの子宮切片に蒸留水を；図２（ｂ）は図１（Ａ）のｂの子宮切片に蒸留水を；図２（ｃ）は図１（Ａ）のｃの子宮切片に１００ｎＭアドレノメデュリンを；そして図２（ｄ）は図１（Ａ）のｄの子宮切片に１００ｎＭアドレノメデュリンを添加した場合に子宮筋の収縮を測定した結果示すグラフである。
図３（ａ）は図１（Ａ）のｂの子宮切片に１〜１００ｎＭアドレノメデュリンを；図３（ｂ）は図１（Ａ）のｃの子宮切片に１〜１００ｎＭアドレノメデュリンを；そして図３（ｃ）は図１（Ａ）のｄの子宮切片に蒸留水を添加した場合に子宮筋の収縮を測定した結果を示すグラフである。
図４（ａ）は図１（Ａ）のａの子宮切片にブラジキニンを添加し、次いで１００ｎＭアドレノメデュリンを添加した場合の子宮筋の収縮を、図４（ｂ）は図１（Ａ）のｂの子宮切片にブラジキニンを添加し、次いで蒸留水を添加した場合に、子宮筋の収縮を測定した結果を示すグラフである。
図５は、ヒト褐色細胞腫由来のアドレノメデュリンのアミノ酸配列を示す図である。ＲＥ１からＲＥ６は、このアミノ酸配列をアルギニルエンドペプチダーゼで切断した場合に生成される断片を示す。
図６は、ＡＭによる子宮の自動収縮の濃度依存的抑制；ＡＭ［２２−５２］またはＣＧＲＰ［８−３７］による防止を示す図である。（ａ）〜（ｅ）は、類似の結果を有する５つの別々の実験からの代表的な記録である。^†ｐ＜０．０５、薬物なしでの応答と比較（一因子分散分析）；^‡ｐ＜０．０５、ＡＭ単独と比較（二因子分散分析）。
図７は、ＡＭによっては引き起こされるが、ＡＭ［２２−５２］またはＣＧＲＰ［８−３７］によるオキシトシンまたはＰＧＦ_２αの防止によっては引き起こされない、ブラジキニンによる子宮収縮の抑制を示す図である。（ａ）から（ｅ）は、類似の結果を有する５回の別々の実験からの代表的な記録を示す。

Claims (17)

1. アドレノメデュリンを含有する、子宮筋自動収縮またはブラジキニンによる収縮を抑制するための組成物。
2. 子宮筋自動収縮またはブラジキニンによる収縮を選択的に抑制するために用いられる、請求項１に記載の組成物。
3. 早産を予防するために用いられる、請求項１または２に記載の組成物。
4. 流産を予防するために用いられる、請求項１または２に記載の組成物。
5. 帝王切開前に分娩を停止するために用いられる、請求項１または２に記載の組成物。
6. 月経困難症を治療するために用いられる、請求項１または２に記載の組成物。
7. 前記アドレノメデュリンが、
   （ａ）配列表の配列番号２の１３位のＳｅｒから５２位のＴｙｒまでのアミノ酸配列を有するペプチド、または、
   （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ子宮筋収縮抑制作用を有するペプチドである、
   請求項１または２に記載の組成物。
8. 前記アドレノメデュリンが、
   （ｃ）配列の配列番号２の１位のＴｙｒから５２位のＴｙｒまでのアミノ酸配列を有するペプチド、または、
   （ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ子宮筋収縮抑制作用を有するペプチドである、
   請求項７に記載の組成物。
9. 前記アドレノメデュリンが、
   （ｅ）配列表の配列番号２の−７３位のＡｌａから５２位のＴｙｒまでのアミノ酸配列を有するペプチド、または、
   （ｆ）アミノ酸配列（ｅ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ子宮筋収縮抑制作用を有するペプチドである、
   請求項８に記載の組成物。
10. 前記アドレノメデュリンが、
    （ｇ）配列表の配列番号２の−９４位のＭｅｔから９１位のＬｅｕまでのアミノ酸配列を有するペプチド、または、
    （ｈ）アミノ酸配列（ｇ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ子宮筋収縮抑制作用を有するペプチドである、
    請求項９に記載の組成物。
11. 前記アドレノメデュリンのＣ末端がアミド化されている、請求項１または２に記載の組成物。
12. 前記アドレノメデュリンのＣ末端にＧｌｙが付加されている、請求項１または２に記載の組成物。
13. 前記アドレノメデュリンにおいて、配列表の配列番号２の１６位のＣｙｓと２１位のＣｙｓとが、架橋されている、請求項１または２に記載の組成物。
14. 前記架橋が、ジスルフィド結合である、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記架橋が、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−結合である、請求項１３に記載の組成物。
16. アドレノメデュリンを含有する早産または流産の予防薬。
17. 早産または流産の予防薬を製造するためのアドレノメデュリンの使用。

Images