JP4609930B2 - Ｈｅｒ−２指向性治療に対する応答を予測する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2002年12月11日に出願された、米国仮出願第６０／４３２９４２号の優先権を主張するものである。
本発明は、ＨＥＲ−２指向性治療に対する個別の応答を予測する方法に関するものである。
細胞増殖と分化の過程には、反応性細胞の表面に発現する特異的な受容体を介して作用する増殖因子が関与している。固有のチロシンキナーゼ活性を有するような表面受容体に結合するリガンドは、最終的には細胞の増殖や分化を引き起こす多くの事象を誘発する（Carpenterら, 1979, Biochem., 48: 193-216; Sachsら, 1987, Cancer Res., 47: 1981-1986）。チロシンキナーゼ受容体は配列の類似性及び際だった特徴に基づいて、いくつかのグループに分類される。これらのグループの一つは、ｅｒｂＢ−１（ＥＧＦＲ又はＨＥＲ−１とも称される）（上記の Carpenterら）、ｅｒｂＢ―２（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）（Sembaら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 6497-6501; Coussensら, 1985, Science, 230: 1130-1139; Bargmannら, 1986, Cell, Vol. 45, 649-657）、ｅｒｂＢ―３（ＨＥＲ−３）（Krausら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 9193-9197; Carrawayら, 1994, J. Biol. Chem., 269: 14303-14306）、及びｅｒｂＢ―４（ＨＥＲ−４）（Plowmanら, 1993, Nature, 366: 473-475; Tzaharら, 1994, J. Biol. Chem., 269: 25226-25233）を含む上皮増殖因子受容体ファミリーを包含する。
上皮に由来する多くの腫瘍は、多様なｅｒｂＢ（ＨＥＲ）受容体を発現しており、自己分泌受容体の活性化が腫瘍細胞の増殖において役割を果たすことを示唆する１つ又はそれ以上のＥＧＦ関連リガンドを共発現している。これらのリガンドは、異なるｅｒｂ―Ｂ／ＨＥＲ受容体を活性化することから、多様なｅｒｂＢ受容体の組み合わせが腫瘍において活性状態にある可能性があり、これはｅｒｂ―Ｂを標的とした治療に対する応答に影響を与える特徴である。ｅｒｂＢ受容体は、下流の情報伝達系につながる様々なリガンドによって刺激されるホモ二量体及びヘテロ二量体を形成し、その程度及び性質は特定の二量体とリガンドとの組み合わせに依存する。例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕは、上皮増殖因子受容体ファミリーの他の構成員と共にヘテロ二量体を形成する好ましいパートナーとみられるが、最終的に形成される二量体は、リガンド及び細胞に発現したｅｒｂＢ受容体によって決定される。リガンドは、二量体形成のパートナーを選択するだけでなく、受容体の膜部位間移動（トランスロケーション）、活性化、及び内包化の時間経過にも影響するものである。例えば、ＮＤＦ／ＨｅｒｅｇｕｌｉｎはｅｒｂＢ―３又はｅｒｂＢ―４受容体の一方とヘテロ二量体を形成することによってｅｒｂＢ―２のチロシンリン酸化を促進させるものである（Pelesら, 1992, Cell 69, 205-216, Pelesら, 1993, EMBO J. 3, 961-971, Holmesら, 1992, Science 256, 1205-1210; Tzaharら, 1994, J. Biol. Chem., 269, 25226-25223; Plowmanら, 1993, Nature 366, 473-475; Pinkas-Kramarskiら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9387-9391; Pinkas-Kramarskiら, 1996, J. Biol. Chem., 271, 19029-19032; Pinkas-Kramarskiら,1998, Oncogene, 16, 1249-1258）。研究対象の細胞株によって、ＮＤＦ／Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎは、結果として、形態変化、脂質の誘導、及び細胞内接着因子−１の発現をもたらす増殖停止と分化のフェノタイプを誘発するか、又は細胞分裂誘起反応を誘導する（Holmesら, 1992, Science, 256: 1205-1210; Pelesら, 1992, Cell, 69: 205-216; Bacusら, 1993, Cancer Res., 53: 5251-5261）。
リガンド結合後の下流情報伝達は、活性化された受容体に結合可能な一連の結合（ドッキング）タンパク質によって決定される。例えば、ｅｒｂＢ受容体ヘテロ二量体の活性化は、下流におけるＭＡＰＫ―Ｅｒｋ１／２及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴの増殖及び生存経路に結合して、それを活性化するものである。腫瘍に於いてその経路が制御不可能になると疾病が進行し難治性となる（Tzaharら, 1996, Mol. Cell. Biol. 16, 5276-5287; Fukazawaら, 1996, J. Biol., Chem. 271, 14554-14559, Olayioyeら, 1998, Mol. Cell. Biol. 18, 5042-5051; Langeら, 1998, J. Biol. Chem. 273, 31308-31316; Hackelら, 1999, Curr. Opin. Cell Biol. 11, 184-189）。ＨＥＲ−３はホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の主要な結合（ドッキング）部位である。加えて、ＮＤＦ／Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎの刺激はＰＩ３Ｋ経路の活性化及びＡＫＴのリン酸化を引き起こす（Altiokら, 1999, J. Biol. Chem. 274, 32274-32278; Liuら, 1999, Biochem. Biophys. Res. Comm. 261 897-903; Xingら, 2000 Nature, Med. 6 189-195）。これらの所見は、ＨＥＲ―３と胸部腫瘍細胞に過剰発現されたＨＥＲ―２／ｎｅｕ受容体とのヘテロ二量化の結果として起こる情報伝達カスケードにおけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴを示唆しており、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの活性化は細胞の生存を促進し、腫瘍の攻撃性（aggressiveness）を増大させる（Bacusら, 2002, Oncogene 21, 3532-3540）。加えて、ＡＫＴ２はＨＥＲ―２／ｎｅｕを過剰発現している胸部腫瘍内に過剰発現され活性化されていると報告されている（出典同じ）。
ｅｒｂＢ―２／ＨＥＲ―２は、あらゆる胸部腫瘍の２０〜３０％に過剰発現しており、またその過剰発現は予後の不良と関連している。このことは、ｅｒｂＢ―２／ＨＥＲ―２は抗がん剤の標的としての使用が可能であることを示唆している（Slamonら, 1987; Hudziakら, 1989; Tagliabueら, 1991）。ｅｒｂＢ―２を過剰発現している胸部腫瘍細胞に、ＨＥＲ―２／ｅｒｂＢ―２に特異的な抗体を化学療法剤（シスプラチン、ドキソルビシン、又はタキソールのような）とともに処理すると、化学療法剤単独での処理に比べて高い細胞障害性反応を引き出した（Hancockら, 1991; Artegaら, 1994; Pietrasら, 1994）。抗ＨＥＲ―２／ｅｒｂＢ―２抗体が化学療法剤に対して細胞障害性を増大させる一つの可能なメカニズムは、ＨＥＲ―２／ｅｒｂＢ―２タンパク質の発現を調節すること（Bacusら, 1992&1993; Stancovskiら, 1991; Klapperら, 1997&2000）、又はＤＮＡ修復を遮断することである（Arteagaら, 1994&2001; Pietrasら, 1994）。
細胞増殖に対する抗ＨＥＲ―２／ｅｒｂＢ―２抗体の有効性により、ＨＥＲ―２／ｅｒｂＢ―２又はＥＧＦＲを過剰発現した腫瘍を治療の標的とする多くの方法が用いられてきた。臨床応用として、一つの方法はＨＥＲ―２／ｎｅｕ又はＥＧＦＲのヌクレオチド結合部位を遮断する阻害剤を用いることによって受容体のキナーゼ活性を阻害することである（Brunsら, 2000; Christensenら, 2001, Erlichmanら, 2001, Herbstら, 2002; Hidalgoら, 2001; Moasserら, 2001; Fujimuraら, 2002; Normannoら, 2002）。二つ目の方法は、ＨＥＲ―２／ｎｅｕ受容体の安定性に影響を与えるアンサマイシンを用いることである（Munsterら, 2002; Bassoら, 2002）。他の方法は、様々なｅｒｂＢ受容体、特にＥＧＦＲ又はＨＥＲ―２／ｎｅｕに対する抗体の使用である（Alaoui-Jamaliら, 1997; Albanellら, 2001(a); Baselgaら, 1994&2002; Mendelsohn, 1990）。ＨＥＲ―２／ｎｅｕに対する様々な抗体の解析は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５の同定へと導いた。この抗体は、膜貫通領域のすぐ近くに位置するシステイン過剰ドメインIIにある細胞外のエピトープ（アミノ酸５２９番から６２７番まで）を認識する。胸部腫瘍細胞に４Ｄ５を処理し、受容体リン酸化試験によって測定すると、ＨＥＲ―２‐ＨＥＲ―３複合体のＮＤＦ／ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ活性化が部分的に阻害される。ヒトへの慢性投与を可能にするために、マウス４Ｄ５は完全にヒト化され、トラスツズマブ／ハーセプチン（登録商標）を生み出した。（Sliwkowskiら, 1999, Yeら, 1999; Carterら, 1992; Fujimoto-Ouchiら, 2002; Vogel,ら, 2001&2002）。
多くのモノクローナル抗体又は低分子物質など、ＥＧＦＲ又はｅｒｂＢ―２を標的にしたチロシンキナーゼ阻害剤が開発されてきた。例えば、ハーセプチン（登録商標）は、胸部腫瘍がｅｒｂＢ―２タンパク質を過剰発現している、又はｅｒｂＢ―２遺伝子の増幅を示している女性の２５％に対する治療が承認されている（Cobleighら, 1999, J. Clin. Oncol. 17, 2639-2648）。加えて、いくつかのＥＧＦＲを標的とした治療は目下、臨床研究中である（Mendelsohn & Baselga, 2000, Oncogene 19, 6550-6565; Xiaら, 2002, Oncogene 21, 6255-6263)。
フェーズI、II及びIIIの臨床試験等の確立された評価の過程に基づいて抗腫瘍薬の開発がなされてきた。フェーズIの研究は、その薬の最大耐用量、最適な投与スケジュール及び投与量を制限する毒性を判定することを目的としている。細胞障害性のがん治療は従来、起こり得る応答についての腫瘍プロファイルを理解することなしに、患者に投与する最大耐用量（ＭＴＤ）をベースとした開発がなされてきた。それゆえ、患者はしばしば、治療効果に限りがある毒性治療を施されてきた。近年になって、腫瘍増殖及び生存経路の解明により、腫瘍を標的化する治療の開発が促進されてきた。重篤な副作用を生じさせない標的化療法に於いて、ＭＴＤに依存することは適切なことではない。患者サンプルの細胞情報伝達を阻害するのに十分な、最適用量及び投与スケジュールを確定することのほうがよほど的確なことである。情報伝達生体マーカーのための生物学的試験法が、このようなプロトコル（治療計画）の確立のために必要とされる。
前臨床的には、ｅｒｂＢ受容体を標的化した治療の多くは、まず細胞増殖を抑制する抗腫瘍効果を発揮するが、治療上はそれらの常習的な投与が必要である。用量を超えた投与は効果がなく、むしろ毒となるので、所定の標的を最大限に阻害する投与量又は用量範囲である生物学的有効量（ＢＥＤ）の同定は極めて重要なことである。なおその上に、これらの薬剤の多くは、細胞障害性の治療と組み合わせて使用されるものであって、そこで投与された毒性は許容範囲を超えるものであるかもしれないので、ＢＥＤに基づいた用量を守らなければならない。「標的化治療（targeted-therapy)」とは、起こり得る一連の応答が存在し、またそれを同定できること含んでいる。
ヒトがん患者に対して不適切又は効果のない治療を施したことによる重篤且つ悪化した結果を鑑みると、当該技術分野に於いて、腫瘍治療に対する応答を個別に予測する必要性がある。さらに、ハーセプチン（登録商標）の様な、新規なＨＥＲ―２標的化療法を効果的に開発し、臨床上の承認を受けるには、患者の応答性を予測することができる診断方法を開発する必要性がある。
（発明の要約）
本発明は、ＨＥＲ２指向性治療に対する個別の応答性を予測するための方法を提供するものである。
本発明は、ＨＥＲ２指向性治療に対する個別の応答性を予測するための方法を提供するものである。
まず第一に、本発明は、ＨＥＲ２指向性治療に応答する、ＨＥＲ２を過剰発現する哺乳動物の腫瘍を同定する方法であって、（ａ）ＩＧＦＲポリペプチド、（ｂ）ＥＧＦＲポリペプチド、（ｃ）ＮＤＦポリペプチド、（ｄ）リン酸化されたＳ６リボソームポリペプチド、（ｅ）リン酸化されたＡＫＴポリペプチド、及び（ｆ）リン酸化されたＥＲＫポリペプチドからなる一つ又は複数のポリペプチドの発現、リン酸化又はその両方のパターンを検出するために、哺乳動物の腫瘍から得られたサンプルを解析する工程を含み、ここでポリペプチド、発現、リン酸化、又はその両方の検出されたパターンの特定の組み合わせが、ＨＥＲ２指向性治療に応答する哺乳動物の腫瘍を同定するものである方法、を提供する。
特定の態様に於いては、哺乳動物の腫瘍が応答していることを同定するパターンとは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＩＧＦＲポリペプチドの発現が減少しているものである。別の態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＡＫＴポリペプチドのリン酸化の減少、Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化の減少又はその両方を伴い、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しているものである。更なる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＥＲＫポリペプチドのリン酸化の減少を伴い、ＥＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しているものである。さらなる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＳ６リボソームポリペプチドのリン酸化の増加を伴い、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が減少しているものである。別の態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＮＤＦポリペプチドの発現の増加を伴い、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が減少しているものである；ここにおいて更に検出パターンは、Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化の増加を包含することができる。
第二に、本発明は、ＨＥＲ２指向性治療に応答しない、ＨＥＲ２を過剰発現する哺乳動物の腫瘍を同定する方法であって、（ａ）ＩＧＦＲポリペプチド、（ｂ）ＥＧＦＲポリペプチド、（ｃ）ＮＤＦポリペプチド、（ｄ）リン酸化されたＳ６リボソームポリペプチド、（ｅ）リン酸化されたＡＫＴポリペプチド、及び（ｆ）リン酸化されたＥＲＫポリペプチドからなる一つ又は複数のポリペプチドの発現、リン酸化又はその両方のパターンを検出するために、哺乳動物の腫瘍から得られたサンプルを解析する工程を含み、ここでポリペプチド、発現、リン酸化、又はその両方の検出されたパターンの特定の組み合わせが、ＨＥＲ２指向性治療に応答しない哺乳動物の腫瘍を同定するものである方法、を提供する。
特定の態様に於いては、応答しない哺乳動物腫瘍を同定するパターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して哺乳動物の腫瘍ではＡＫＴポリペプチドのリン酸化の増加、Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化の増加又はその両方を伴い、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しているものである。別の態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＥＧＦＲポリペプチドの発現が減少及びＮＤＦポリペプチドの発現が増加しているものである。更なる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＥＧＦＲポリペプチドの発現が減少しているものである。別の態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＮＤＦポリペプチドの発現が減少しているものである。更なる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＥＧＦＲポリペプチドが減少及びＥＲＫポリペプチドのリン酸化が増加しているものである。更なる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＩＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しており、ＮＤＦの発現が減少しているものである。
第三に、本発明は、ＨＥＲ２を過剰発現するがん患者を、ＨＥＲ２を標的とする分子で治療するために選択する方法であって、（ａ）患者から得られた細胞又は組織サンプルにおける（ｉ）ＩＧＦＲポリペプチド、（ｉｉ）ＥＧＦＲポリペプチド、（ｉｉｉ）ＮＤＦポリペプチド、（ｉｖ）リン酸化されたＳ６リボソームポリペプチド、（ｖ）リン酸化されたＡＫＴポリペプチド、及び（ｖｉ）リン酸化されたＥＲＫポリペプチドからなる一つ又は複数のポリペプチドの発現、リン酸化、又は発現とリン酸化の両方のパターンを決定し、（ｂ）発現、リン酸化、又は発現とリン酸化の両方の検出パターンに基づいて患者を選択する工程を含む方法、を提供する。ポリペプチド、発現、リン酸化、又は発現及びリン酸化のパターンの特定の組み合わせは、ＨＥＲ２を標的とする分子による治療をするがん患者を選択することに用いられる。
特定の態様に於いては、ＨＥＲ２を標的とする分子で治療する患者を選択する検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＩＧＦＲポリペプチドの発現が減少しているものである。別の態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＡＫＴポリペプチドのリン酸化の減少、Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化の減少又はその両方を伴い、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しているものである。更なる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＥＲＫポリペプチドのリン酸化の減少を伴い、ＥＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しているものである。更なる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＳ６リボソームポリペプチドのリン酸化の増加を伴い、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が減少しているものである。別の態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＮＤＦポリペプチドの発現の増加を伴い、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が減少しているものである；ここでさらには、検出パターンは、Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化の増加を包含することができる。
第四に、本発明は、ＨＥＲ２を過剰発現するがんを有し、ＨＥＲ２を標的とする分子で治療しない患者を選択する方法であって、（ａ）患者から得られた細胞又は組織サンプルにおける（ｉ）ＩＧＦＲポリペプチド、（ｉｉ）ＥＧＦＲポリペプチド、（ｉｉｉ）ＮＤＦポリペプチド、（ｉｖ）リン酸化されたＳ６リボソームポリペプチド、（ｖ）リン酸化されたＡＫＴポリペプチド、及び（ｖｉ）リン酸化されたＥＲＫポリペプチドからなる一つ又は複数のポリペプチドの発現、リン酸化、又はその両方のパターンを決定し、（ｂ）発現、リン酸化、又は発現とリン酸化の両方の検出パターンに基づいて患者を選択する工程を含む方法、を提供する。ポリペプチド、発現、リン酸化、又は発現とリン酸化のパターンの特定の組み合わせは、ＨＥＲ２を標的とする分子で治療しないがん患者を選択することに用いられる。
特定の態様に於いては、ＨＥＲ２を標的とする分子で治療しない患者を選択する検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＡＫＴポリペプチドのリン酸化の増加、Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化の増加又はその両方を伴い、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しているものである。別の態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＥＧＦＲポリペプチドの発現が減少及びＮＤＦポリペプチドの発現が増加しているものである。更なる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＥＧＦＲポリペプチドの発現が減少しているものである。別の態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＮＤＦポリペプチドの発現が減少しているものである。更なる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＥＧＦＲポリペプチドの発現が減少及びＥＲＫポリペプチドのリン酸化が増加しているものである。更なる態様では、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、哺乳動物の腫瘍ではＩＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しており、ＮＤＦの発現が減少しているものである。
上述したものを含む本発明の様々な局面では、ＡＫＴポリペプチドのリン酸化、Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化、又はその両方の検出は、哺乳動物の腫瘍から得られたサンプルがＨＥＲ２指向性治療を受けた後に測定することができる。さらに、ＨＥＲ２指向性治療とは、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２（ハーセプチン（登録商標））による又はｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２（ハーセプチン（登録商標））治療を包含した治療である。加えて、サンプルを少なくとも一つの化学療法剤と接触させるものである。さらには、（ａ）から（ｆ）のうち一つ又は複数のポリペプチドの発現、リン酸化、又はその両方の検出パターンは、生物学的検出試薬を使うことによって測定することができる。その生物学的検出試薬は、抗体又は核酸プローブであってもよい。さらには、リン酸化ＡＫＴポリペプチドの検出パターンは、４７３位のリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに特異的な抗体を用いて測定され、リン酸化Ｓ６リボソームポリペプチドの検出パターンは、２３５位のリン酸化されたセリン残基を含むエピトープに特異的な抗体を用いて測定され、及び／又は、リン酸化ＥＲＫポリペプチドの検出パターンは、２０２位のリン酸化スレオニン残基及び２０４位のリン酸化チロシン残基を含むエピトープに特異的な抗体を用いて測定することができる。さらには、哺乳動物の腫瘍から得られたサンプルは、パラフィン包埋された生検サンプルであってもよい。また、哺乳動物の腫瘍は、ＨＥＲ２ポリペプチドに結合する抗体を用いてＨＥＲ２の過剰発現を同定することができる。
第五に、本発明は、哺乳動物の腫瘍のＨＥＲ２指向性治療に対する応答性を特徴付けるためのキットであって、（ａ）ＩＧＦＲポリペプチドに結合する抗体、並びに（ｂ）リン酸化されたＡＫＴポリペプチドに結合する抗体、（ｃ）リン酸化されたＳ６リボソームポリペプチドに結合する抗体、（ｄ）ＥＧＦＲポリペプチドに結合する抗体、（ｅ）ＨＥＲ２ポリペプチドに結合する抗体、（ｆ）ＮＤＦポリペプチドに結合する抗体、及び（ｇ）リン酸化ＥＲＫポリペプチドに結合する抗体のうち一つ又はそれ以上を含むキット、を提供する。ある態様では、（ｂ）の抗体は免疫学的に４７３位にリン酸化セリン残基を持つＡＫＴポリペプチドに特異的であり、（ｃ）の抗体は免疫学的に２３５位にリン酸化セリン残基を持つＳ６リボソームポリペプチドに特異的であり、及び／又は、（ｆ）の抗体は免疫学的に２０２位にリン酸化スレオニン残基及び２０４位にリン酸化チロシンを持つＥＫＴポリペプチドに特異的である。別の態様では、キットはさらに（ａ）から（ｇ）の一部の抗体に結合する少なくとも一つの２次抗体を含む。
本発明の特定の態様は、後述の「特定の好ましい態様の更なる詳細な説明」及び上述の「特許請求の範囲」より明らかになるものである。
（好ましい態様の詳細な説明）
本発明は、ヒトのがん患者を含む腫瘍を有する対象における腫瘍治療に対する応答を予測するための方法を提供する。加えて、本発明は、胸部腫瘍を処理するための治療薬を含む治療薬の投与が最も効果的になるがん患者を同定するための予測的生体マーカーを提供する。特に、ハーセプチン（登録商標）のような薬剤を含むＨｅｒ２／ｎｅｕを標的化する治療薬の効果を評価するための予測的生体マーカーを提供する。
本発明は、ヒトのがん患者を含む腫瘍を有する対象における腫瘍治療に対する応答を予測するための方法を提供する。加えて、本発明は、胸部腫瘍を処理するための治療薬を含む治療薬の投与が最も効果的になるがん患者を同定するための予測的生体マーカーを提供する。特に、ハーセプチン（登録商標）のような薬剤を含むＨｅｒ２／ｎｅｕを標的化する治療薬の効果を評価するための予測的生体マーカーを提供する。
化学療法剤が外科的な処置に加えて又は外科的な処置の後に用いられる、伝統的な抗がん治療法と比較して、術前（neoadjuvant）化学療法（又は１次的化学療法）は、特定のがん患者の初期処置として薬剤を投与することからなる。3センチ以上の初期がんに対する、この手法の利点の１つは、化学療法による腫瘍の縮小効果により、大多数の患者において保守的な外科的措置（胸部がん患者における根治的な乳房切除のようなものとは反対に）を後に又は同時に適用することができるということである。他の利点は、様々な腫瘍をもつ患者全体の約3分の２において、部分的又は完全な応答が達成されることである。結果的に、大多数の患者は、化学療法の2、3サイクル後に応答することから、腫瘍が化学療法剤に対して無応答である患者を同定するのに、施された化学療法のインビボにおける効果をモニターすることが可能である。非応答性の腫瘍を適時同定することによって、臨床医は、がん患者が治療によって被る不必要な副作用を制限したり、代替治療を施すことが可能となる。残念ながら、組織学的検査を含む当該技術分野に於ける現行の方法は、正確に適時同定するには不十分である。本発明は、がん患者に施すことによって効果的な結果（すなわち腫瘍の縮小又は消失）を高い可能性で期待できる、より情報に富み効果的な治療（法）を開発する方法を提供する。
腫瘍診断は従来、疾病の初期診断及び疾病経過（処置前、処置中、処置後）のその後の観察の両面から、患者から切除された細胞又は組織サンプルを組織学的に検討することにより確立されている。臨床病理学者は、そのようなサンプルが良性か悪性かを正確に判定することができ、悪性とみなされる腫瘍サンプルの攻撃性を見極める必要がある。なぜならこの様な判定結果は、患者にとっての適切な治療を選択するうえでの基準となるからである。同様に、病理学者としては処置、特に化学療法剤や生物学的薬剤を用いた処置の結果、どの程度腫瘍が進行しているのか又は縮小しているのかを見極める必要がある。
従来より組織学的な検討には、サンプルの形態学的特徴を光学顕微鏡での観察を容易にするため、組織染色の手法が必要となる。病理学者は通常、染色されたサンプルを検討して、腫瘍サンプルが悪性であるかどうか性質上の判定する。しかしながら、腫瘍の攻撃性を単にサンプルの組織学的検討からのみ確定することは困難である。なぜなら腫瘍の攻撃性はしばしば、タンパク質の発現、発現抑制、及びタンパク質のリン酸化のような、腫瘍内の細胞における生化学的結果であり、それはサンプルの形態が反映される場合もあれば、されない場合もあるからである。それゆえ、腫瘍サンプル内の細胞の生化学を評価できることが重要なのである。さらに、腫瘍関連遺伝子の遺伝子発現及び関連タンパク質のタンパク質リン酸化、又はより特異的には腫瘍関連情報経路の細胞構成成分を観察して定量できることが望ましい。
腫瘍治療は、単に腫瘍の組織観察あるいは疾病部位よりもむしろ腫瘍の分子プロファイリングに基づいたものである。腫瘍組織に標的化した治療の生物学的効果を明瞭にすること、及びこれらの効果を臨床応答と関連付けることは、腫瘍内で制御されている支配的な増殖及び生存の経路を同定する助けとなる。それによって起こり得る応答パターンを確立させ、そして逆に耐性を克服する戦略をデザインする理論を提供することができる。成長因子受容体の効果的な診断標的化は、腫瘍の成長又は生存が、標的化された受容体又はその受容体ファミリーによって促進されているのか、その治療で標的化されていない他の受容体によって促進されているのかどうか、また下流の情報伝達が他の発癌経路の関連を示唆するものであるかどうかを見極めなければならない。
ハーセプチン（登録商標）治療が考慮されている患者のために、標的のＨＥＲ―２／ｎｅｕの他に、更なる生体マーカーを考慮する必要がある。それは少なくともＥＧＦＲ及びｅｒｂＢリガンドのＮＤＦ及びＴＧＦαの状態が、胸部がん患者におけるハーセプチン（登録商標）治療応答に影響を与えるからである。それゆえ必ずしも、ＨＥＲ―２／ｎｅｕ発現だけを考慮して包括的なｅｒｂＢの発癌活性又はｅｒｂＢ阻害剤に対して見込まれる応答を予測することはできないのである。加えて、これまでの研究から、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２／ｎｅｕの異常な発現があるにもかかわらず、必ずしもすべての腫瘍細胞がＥｒｂＢ受容体の阻害に応答するわけではないことが示されてきた。例として、ＭＫＮ７及びＢＴ４７４ ｅｒｂＢ受容体を過剰発現している癌種細胞株が挙げられる：ＢＴ４７４細胞はハーセプチン（登録商標）に応答するが、ＭＫＮ７細胞は応答しない（Motoyamaら, Cancer Research, 62, 3151-3158 (2002)）。更に、ｅｒｂＢ阻害剤の活性によるＥＧＦＲ又はＨＥＲ２受容体活性が減少したことによって引き起こされる増殖阻害は、ＥＧＦ又はＮＤＦ／ＨｅｒｅｇｕｌｉｎのようなＥＧＦ関連リガンドの存在によって、解消されるかもしれない（出典同じ）。この事象は、二重特異性ＥｒｂＢ−１／ＥｒｂＢ―２阻害剤を使うことによって減弱化することができ、それによって多様なＥｒｂＢ受容体を同時に阻害し、抗腫瘍活性を増加させるものである。
加えて、多くの腫瘍では、ＮＤＦ／Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ又はＴＧＦαの発現がＨＥＲ―２／ＥＧＦＲのヘテロ二量体化の自己分泌ループを形成する。ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現を抑制すること（ダウンレギュレーション）は、これらのヘテロ二量体によって生み出される情報伝達を阻害する重要な方法である。発現の抑制は、受容体の細胞内取り込みを引き起こすハーセプチン（登録商標）処理によって達成される。さらには、高度にリン酸化されたＥＲＫ（あるいはｐＡＫＴ）は、ＥＧＦＲの発現及びＮＤＦの存在と共に観察されるとき、肯定的な治療効果にとっての否定的な予測因子となりうる。これは、腫瘍細胞の増殖を促進する他の経路の存在を示唆するものである。高度のｐＥＲＫはまた、ｐ２７の抑制を通してハーセプチン（登録商標）に対する耐性にも関連している。これは高度のｐＥＲＫすなわち腫瘍細胞増殖に貢献するかもしれない、（エストロゲン受容体のＭＡＰＫ及びＡＫＴ経路の相互（クロス）活性化のような）他の情報伝達を意味する。加えて、リン酸化されたＡＫＴは、高ｐＡＫＴ陽性患者がハーセプチン（登録商標）に対して低い応答性を示すといったような、ハーセプチン（登録商標）に対する応答の重要な部分を示してきた。高度にリン酸化されたＡＫＴは、ＰＤＧＦＲ同様インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ−１）の高発現と関連し、その結果としてハーセプチン（登録商標）に耐性になることが示されてきた。興味深いことに、臨床試験のデータは、２重阻害剤（即ち、ＨＥＲ−１／ｎｅｕ及びＨｅｒ―２／ｎｅｕに特異的な）の使用は、処置によってｐＥＲＫ及びｐＡＫＴの抑制がみられた患者には臨床効果があるが、処置後にｐＥＲＫ及びｐＡＫＴレベルが減少しない患者には有効でないことを示した。このように、ｐＥＲＫ及びｐＡＫＴと同様ＨＥＲ−１及びＨＥＲ−２を過剰発現した患者においては、抗腫瘍活性はＨＥＲ−１及びＨＥＲ−２受容体の活性化に依存し、臨床応答がみられた。これに対して、２重阻害剤の処置の後でもｐＥＲＫ及びｐＡＫＴの活性が高く保たれている患者においては、臨床応答が起こらなかった。組み合わせ療法は、臨床上重要な意味を持つものである。ＥｒｂＢ−１指向性のモノクローナル抗体ｍＡｂ２２５及びｍＡｂ４Ｄ５の組み合わせは、卵巣腫瘍細胞株の増殖を、いずれかのｍＡｂだけのときに比べて強く阻害した（Yeら, 1999, Oncogene 18: 731-8）。ＥｒｂＢ指向性モノクローナル抗体に加えて、ＧＷ５７２０１６及びＰＫＩ１６６といった両性ＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ―２キナーゼ阻害剤とも称される多数の別種のＥｒｂＢ−１／ＥｒｂＢ―２二重特異性阻害剤が最近報告されているが、それらは目下臨床試験中のものである。（Motoyamaら, 2002, Cancer Research 62: 3151-3158）。それゆえ、ハーセプチン（登録商標）に対する応答は、腫瘍における多様なｅｒｂＢ受容体及びそれらのリガンドの発現によって影響を受ける。
このように、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現だけでは、ハーセプチン（登録商標）のような分子に対する応答を予測することはできない。ＨＥＲ−２／ｎｅｕはオーファン（リガンドがない）受容体であり、その活性を発揮するためには、パートナーとしてＥＧＦＲ（ＨＥＲ−１）及びＨＥＲ―３が必要である。ＨＥＲ−１及びＨＥＲ―３のＨＥＲ−２とのヘテロ二量体化は、ＥＧＦ又はＮＤＦの存在によって促進される（Trazerら, 1996, EMBO J. 15: 254-64, Graus-Porta, 1997, EMBO J., 16: 1647-55）。そしてこのようにＨＥＲ−２活性はＨＥＲ−１又はＨＥＲ―３に依存する。他の受容体もまたｅｒｂＢ受容体を活性化する可能性がある。これらの受容体は、下流の増殖及び生存経路への情報伝達を介して発癌の介在をしているのかもしれない。例えば、ＩＧＦＲ受容体は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを指向した胸部がん治療に対する患者応答に介在しているかもしれない。Ｓ６リボソームタンパク質の高度リン酸化を伴ったＩＧＦＲの高発現は、ｅｒｂＢの発現に関わらず、患者の低応答性と相関している。このことは、ＩＧＦＲはｅｒｂＢ受容体のトランス活性化を介してというよりもむしろｅｒｂＢ受容体の下流の情報伝達を直接活性化することを示している。細胞株を用いた研究はまた、患者応答におけるＩＧＦＲの役割を示唆してきた。ハーセプチン（登録商標）耐性ＩＧＦＲの活性化により起こることが示されてきた（Luら, 2001, J. National Cancer Institute 93: 1852）。加えて、ＨＥＲ２／ｎｅｕと同様ＩＧＦＲを共標的化することは、胸部がん細胞の相乗的成長阻害を生み出すことが示されてきた（Camirandら, 2002, Med Sci Monit. 8: (12): BR521-6）。それゆえ、ＩＧＦＲ発現及び下流情報伝達の解析は、胸部がん患者に起こり得るハーセプチン（登録商標）応答を正確に評価するのに重要である。
このように、多様な上流の情報を統合して応答を予測するといった、下流の情報伝達タンパク質活性化のマーカーは、一つも存在しない。しかしながら、ｐ―ＥＲＫ及びｐ―ＡＫＴの解析は、ＥＧＦＲを過剰に発現している患者においては予測可能であることが分かってきた。それゆえ、活性なｅｒｂＢ受容体の存在下、高度なＥＲＫ及びＡＫＴの情報伝達は、ハーセプチン（登録商標）治療の有効性が低いことを示している。ＡＫＴ活性化は胸部がん細胞株におけるハーセプチン（登録商標）耐性となることが示されてきた（Yakesら, 2002, Cancer Res. 62: 4132-41; Clarkら, 2202, Mol. Cancer Ther. 1: 707-17）。加えて、Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化の解析は、ＩＧＦＲ発現の予測力を大いに増大させた。Ｓ６が高度にリン酸化された患者においては、ＩＧＦＲの発現に基づいて陽性反応は８％〜６７％の幅であった。Ｓ６リン酸化の低い患者のおおよそ３０％は、ＩＧＦＲ発現に関わらず応答した。これらの結果はまた、ハーセプチン（登録商標）治療に応答する活性なＩＧＦＲ情報伝達を欠いていた患者のみにおいて、臨床サンプルの解析に反映された。胸部がんにおけるＩＧＦ情報伝達は、ＡＫＴの活性化を介して起こり（Ohら, 2002, Neoplasia 4: 204-17; Dufournyら, 1997, J Biol Chem. 272: 31163-71）、このことはＳ６リボソームタンパク質のリン酸化を誘発する。それゆえ、Ｓ６リン酸化はそれらのＩＧＦＲを過剰発現している腫瘍における活性なＩＧＦ情報伝達の指標となりうる。
ハーセプチン（登録商標）処置に加えて、化学療法及び放射線治療が含まれると、下流情報伝達と患者応答の解析は複雑なものになる。例えば、ＡＫＴ及びＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、ＤＮＡ傷害性試薬に応答して働くことが知られている（Clarkら, 2002, Mol. Cancer Ther. 1:707-17; Bacusら, 2001, Oncogene 20: 147-155）。組み合わせ治療を行っている患者における下流情報伝達を考慮することは、単なる受容体又はリガンドの発現レベルの解析からは得ることのできない付加的な予測情報を提供するものである。ハーセプチン（登録商標）を単一の治療薬として投与されている患者を解析することによって、他の治療に対する応答を介在する生体マーカーとは対照的に、同定されたどのマーカーがハーセプチン（登録商標）に対する応答を介在したかを判定するのに用いることができる。それにもかかわらず、一般のハーセプチン（登録商標）組み合わせ療法を行っている胸部がん患者の診断法をデザインする上で、同定された生体マーカーは、その他のものの中では有用である。
さらに、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ／ＮＤＦによるＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路のアップレギュレーションは、応答を予測するのに重要である。ｐＡＫＴは、高レベルのサイクリンE及び低レベルのサイクリン阻害剤ｐ２７と関連している。
ＨＥＲ２を指向した治療の適用の前に、それぞれの治療に最適な候補を見出すために、それぞれの腫瘍に対して本発明の方法に従った診断がなされた。本発明の方法に従えば、ハーセプチン（登録商標）のようなＨＥＲ２指向性治療は、患者の腫瘍成長がインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）のような他のチロシンリンキナーゼによって引き起こされるのではなく、ｅｒｂＢ受容体によって引き起こされるＡＫＴ／ｍＴＯＲのような細胞内経路に依存するときには有効である。これらの下流情報伝達の高レベルの活性化がｅｒｂＢ受容体に依存することなく引き起こされる場合には、ハーセプチン（登録商標）治療は有効ではない。本発明の方法を用いることによって臨床医は、がん患者の指向性治療の、より効果的な組み合わせを選択することができる。
本発明のＨＥＲ２指向性治療として、例えば、別名ハーセプチン（登録商標）としても知られるｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２が挙げられる。哺乳動物の腫瘍から得られたサンプルは、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、又はタキソールのような少なくとも一つの化学療法剤と接触可能である。
当該技術分野において公知の自動化された（コンピュータ支援）イメージ解析システムにより、腫瘍サンプルの目視検査（visual examination）を拡大することができる。代表的な態様においては、細胞又は組織サンプルは、特定の生物学的マーカーに特異的な検出可能に標識れた試薬に曝され、次いで細胞の拡大画像は、電荷結合素子（ＣＣＤ）又はテレビカメラのようなカメラから画像を受けたコンピュータによって加工される。このようなシステムは、例えば、サンプル中のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｐＥＲＫ、ＮＤＦ、ＴＧＦ―α、ＩＧＦＲ、ｐＳ６、及びｐＡＫＴ、又は他の付加的な診断用生体マーカーの発現及び活性化レベルを検出及び測定するために用いられる。このように、本発明の方法は、組織学的に同定された腫瘍細胞におけるより正確な腫瘍診断、及び遺伝子発現のより優れた特徴づけ、特に腫瘍マーカー遺伝子又は特定のがんの型及び亜型（例えば、異なる悪性度を持っているなど）に発現していることが知られている遺伝子の発現の特徴づけを提供する。この知見により、患者に、同定された腫瘍細胞の型又はその亜型に臨床効果のある薬剤を投与することができるので、より情報に基づいた、より効果的な治療法の適用が可能となる。
従来の抗がん治療のもう一つの欠点は、個別のヒト患者における特定のがん治療に特異的な化学療法剤の有効性が予測できないことである。このように予測不可能なことから、当該技術に於いては、治療開始前に、一つ又はそれ以上の選択された薬剤が抗がん剤として機能するかどうか判断できないし、又は個々の患者の一連の治療の予後を確かなものにすることができない。特定の個人にとってどの治療法が最も効果的であるか判断する現行の方法はないので、臨床上の特定の腫瘍が臨床医に治療法の選択を提示できるといった、この方法は特に重要である。患者個人に提示された治療薬（あるいは薬剤の組み合わせ）の予則される効果がよく見極められるということが、本発明の方法の利点である。本発明でクレームされている方法は、化学療法の有効性を評価するにあたって、時間及び費用の面で効果的であること、そしてがん患者の侵襲を最小にするという、付加的な理由から好都合なものとなっている。
本発明の方法は、ＨＥＲ２指向性治療に応答する哺乳動物の腫瘍を同定するために用いることができる。さらに、本発明の方法は、ＨＥＲ分子を標的とする治療に際して、腫瘍を持つ患者を選択するのに利用することができる。さらには、本発明の方法は、ＨＥＲ２指向性治療に応答しない哺乳動物の腫瘍を同定することに用いることができる。さらに、本発明の方法は、ＨＥＲ２を分子標的とする治療を受けない腫瘍を持つ患者を選択するのに利用することができる。
ポリペプチドの発現及びリン酸化のパターンは、本発明の方法を用いて、検出及び定量化される。特に、腫瘍関連情報伝達経路の細胞構成成分であるポリペプチドの発現とリン酸化のパターンが本発明の方法によって検出され、定量化される。例えば、ポリペプチドの発現とリン酸化のパターンは、そのポリペプチドに特異的な生物検出用試薬を用いることによって検出される。例えば、その生物検出用試薬は抗体であってもよい。他には、その生物検出用試薬は核酸プローブであってもよい。核酸プローブはサンプルへのハイブリダイズが検出できる一つ又はそれ以上の核酸断片の集合体であると定義される。そのプローブは、標的又はサンプルへの結合が検出できれば、標識されていなくても標識されていてもよい。そのプローブは、例えば、一つ又はそれ以上のクローン、単離された全染色体又は染色体断片、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物である、ゲノムの一つ又はそれ以上の特定の（前もって選択された）領域の核酸から産生される。その核酸プローブはまた、アレイにおけるように固層表面（例えば、ニトロセルロース、ガラス、石英、溶融シリカスライド）に固定化された単離された核酸であってもよい。そのプローブは例えば、ＷＯ９６／１７９５８に記載されるような核酸のアレイのメンバーであってもよい。このために、高密度アレイを産生できる技術を用いることができる（例えば、Fodor (1991) Science 767-773; Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; 米国特許第５，１４３，８５４号を参照のこと）。特定のプローブの配列は、「実質的に相同である」プローブを産生するためには、同じ由来の標的又はサンプルに特異的に結合する（すなわち特異的にハイブリダイズする）プローブとしての能力を保持しているという前提で、ある程度の修飾ができることは、当業者には認識されている。その「核酸」という用語は、１本鎖又は２本鎖のデオキシリボ核酸又はリボ核酸を意味する。この用語は、参照用の核酸として、所望の目的のための、同様又は改良された結合能を有する天然の核酸の公知のアナログを含む核酸、即ちオリゴヌクレオチドを包含する。本用語はまた、天然のヌクレオチドと同様の方法で、又は所望の目的応じて改良された速度で代謝される核酸を含む。本用語はまた、合成骨格をもつ核酸様の構造を包含する。当業者は、例えば結腸腫瘍細胞のスクリーニングを指向した米国特許第６，３２６，１４８号を参照することによって、サンプル中の腫瘍細胞をスクリーニングするための核酸プローブの使い方を認識できるものである。
胸部がんに関連するポリペプチドは、これらに限定されるものではないがＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ―３、ＩＧＦＲ、ＮＤＦ、ＴＧＦ−α、ｐ―ＥＲＫ、ｐＳ６、又はｐ―ＡＫＴを含む生体マーカーに対する適当な1次抗体を用いることで、直接的にあるいは適切な2次抗体（マウスの1次抗体を用いるときには、ウサギの抗マウスＩｇＧのような）及び／又は3次アビジン（すなわちストレプトアビジン）ビオチン複合体（“ＡＢＣ”）を用いることで、画像解析により定量化される。
本明細書に示される本発明の方法の実施において有用な試薬の例は、ベンタナメディカルサイエンス社（ＶＭＳＩ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）より得られるマウスモノクローナル抗体ＣＢ１１を含むＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な抗体を包含するがこれらに限定されるものではない。加えて、本発明の方法の実施において有用な試薬は、４７３位のリン酸化されたセリン残基に特異的な抗体を含むリン酸化ＡＫＴに特異的な抗体を包含するがこれらに限定されるものではない。ここでＡＫＴの配列は、配列番号１（表８）に表されている。さらには、本発明の方法の実施において有用な試薬は、２３５位のリン酸化されたセリン残基に特異的な抗体を含むリン酸化Ｓ６に特異的な抗体を包含するがこれに限定されるものではない。ここでＳ６の配列は、配列番号２（表８）に表されている。また、本発明の方法の実施において有用な試薬は、２０２位のリン酸化されたスレオニン残基と２０４位のリン酸化されたチロシン残基に特異的な抗体を含むリン酸化ＥＲＫに特異的な抗体を包含するがこれらに限定されるものではない。ここでＥＲＫの配列は、配列番号３（表８）に表されている。
さらに、予測されるポリペプチドの発現、リン酸化、又は発現とリン酸化の両方のパターンは、非腫瘍組織あるいは細胞サンプルと比較することができる。その非腫瘍組織又は細胞サンプルは、同じ個体の又はさもなければ異なる個体に由来する非腫瘍組織又は細胞サンプルから得られる。ポリペプチドの検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルに比べて、ポリペプチドが少なく検出された場合、哺乳動物の腫瘍、組織、又は細胞サンプルにおいて減少したとみなされる。ポリペプチドの検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルに比べて、ポリペプチドが多く検出された場合、哺乳動物の腫瘍、組織、又は細胞サンプルにおいて増加したとみなされる。ポリペプチドの検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルに比べて、ポリペプチドが全く同じか又はほとんど同じに検出された場合、哺乳動物の腫瘍、組織、又は細胞サンプルにおいて正常であるとみなされる。
ＨＥＲ２指向性治療に対して応答する、又は応答しない哺乳動物の腫瘍を同定するための本発明の方法は、 (ａ)ＩＧＦＲポリペプチド；(ｂ)ＥＧＦＲポリペプチド；(ｃ)ＮＤＦポリペプチド；(ｄ)リン酸化Ｓ６リボソームポリペプチド；(ｅ)リン酸化ＡＫＴポリペプチド；(ｆ)リン酸化ＥＫＴポリペプチドからなる一つ又は複数のポリペプチドの発現、リン酸化、又は両者のパターンを検出するために、哺乳動物の腫瘍から得られたサンプルを評価する段階を含む。ポリペプチドの組み合わせ、及び発現、リン酸化又は発現とリン酸化の両方は、ＨＥＲ２指向性治療に応答する、又は応答しない哺乳動物の腫瘍を同定する。当該方法は、これらのポリペプチドの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つすべての発現、リン酸化又は発現とリン酸化の両方のパターンの検出を含む。さらに、当該方法は、別のポリペプチドの発現、リン酸化、又はその両方からなる両者のパターンの検出のような他の工程を必要ではないが、含む可能性がある。
ハーセプチン（登録商標）処置に限らないがそのようなＨＥＲ２指向性分子を処置する、又は処置を施さない腫瘍を有する患者を選択する本発明の方法は、(ａ)ＩＧＦＲポリペプチド；(ｂ)ＥＧＦＲポリペプチド；(ｃ)ＮＤＦポリペプチド；(ｄ)リン酸化Ｓ６リボソームポリペプチド；(ｅ)リン酸化ＡＫＴポリペプチド；(ｆ)リン酸化ＥＫＴポリペプチドからなる一つ又は複数のポリペプチドの発現、リン酸化、あるいは両者のパターンを、その患者から得られた細胞又は組織サンプルにおいて測定する工程からなる。ポリペプチド及び発現、リン酸化、又は発現とリン酸化の両方のパターンとの組み合わせは、ＨＥＲ２を指向した分子を処置する腫瘍を有する患者又は処置を施さない患者を選択するために用いられる。当該方法は、これらのポリペプチドの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つすべての発現、リン酸化又は発現とリン酸化の両方のパターンの検出を含むことができる。さらに当該方法は、別のポリペプチドの発現、リン酸化、又はその両方のパターンの検出のような他の工程を必要ではないが、含む可能性がある。
例えば、応答しているとして哺乳動物の腫瘍を同定するパターン又はＨＥＲ２を指向した分子で処置する腫瘍を持った患者を選択するために用いられるパターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルに比べてＩＧＦＲポリペプチドの発現が低下している。あるいは、その検出されたパターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比べたときにＡＫＴポリペプチドのリン酸化の減少、Ｓ６リボソームたんぱく質のリン酸化の減少、又はその両方を伴う。他の可能性のある検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較してＥＲＫポリペプチドのリン酸化の低下を伴う、ＥＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しているものである。更なる検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較してＳ６リボソームポリペプチドのリン酸化の増加を伴う、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が低下しているものが含まれる。他の態様においては、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して哺乳動物の腫瘍におけるＮＤＦポリペプチドの発現増加を伴う、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が低下しているものである。ここにおける、更なる検出パターンはＳ６リボソームポリペプチドのリン酸化が増加しているものが含まれる。これらの同定されたパターンは限定されるものではないと理解される。
例えば、哺乳動物の腫瘍を応答しないものとして同定するパターン又はＨＥＲ２を標的化した分子の治療を施さないことをがん患者に選ばせるために用いることができるパターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較してＡＫＴポリペプチドのリン酸化の増加、Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化の増加、又はそれらの両方を伴う、ＩＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しているものである。他に、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較して、ＮＤＦポリペプチドの発現が増加しており、ＥＧＦＲポリペプチドの発現が低下しているものである。又は、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較してＥＧＦＲポリペプチドの発現が低下しているものである。さらに、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較してＮＤＦポリペプチドの発現が低下しているものである。又は、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較してＥＧＦＲポリペプチドの発現が低下しており、ＥＲＫポリペプチドのリン酸化が増加しているものである。さらに、検出パターンは、非腫瘍組織又は細胞サンプルと比較してＩＧＦＲポリペプチドの発現が正常又は増加しており、ＮＤＦの発現が低下しているものである。これらの同定されたパターンは限定されるものではないと理解される。
本発明の方法の実施において、染色過程は研究室の技師のような人によって実施される。又は、その染色過程は自動化されたシステムを用いて行うこともできる。どちらの場合にも、本発明の方法に従って用いられる染色技術は、当該分野において十分確立された標準的な技術とプロトコールに従って行われる。
「細胞又は組織サンプル」とは、細胞、より好ましくは腫瘍細胞を含み、塗抹標本、痰、生検、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿及び糞、又はこれらに限定はされないが、胸部、肺、腸、皮膚、頸、前立腺、及び胃のような器官から採取した組織のような、生体サンプルから単離される細胞を含む生物学的サンプルを意味する。例えば、組織サンプルは、機能的に関連した細胞又は近隣の細胞の領域を含む。
標的タンパク質の量は、染色された抗原の平均的な光学密度を測定することによって有利に定量化される。同様に、染色された全組織領域に対する比率又は割合は、例えば、2枚目の画像における（抗体の閾値レベルのような）対照レベルを超えて染色された領域として、容易に計算できる。生体マーカーを含んでいる核の可視化の後に、処置後の患者に由来する組織の染色された細胞の割合又は量は、未処置の組織にある細胞の割合又は量と比較される。本発明の目的のため、ポリペプチドの発現、リン酸化、又は発現とリン酸化の両方のパターンを「測定する（determining）こと」は、直接的な検討又は、例えば、契約診断サービスからの間接的な検討のどちらかを通して、そのようなポリペプチドについての情報を単に取得することを意味するものとして広く理解されている。
ハーセプチン（登録商標）及び化学療法剤を処置された患者から採取された胸部がん組織の切片は、本発明の方法に従って、ｅｒｂＢリガンド、受容体、下流情報伝達たんぱく質の発現、リン酸化又は発現およびリン酸化の両方、又はそれらの内、陽性処置応答を示すと予想される組み合わせに対する免疫組織学的手法によって解析される。これらの測定は、例えば、組織マイクロアレイを用いることによって、達成できる。組織マイクロアレイは、均一な染色及びスコア化の条件下、多様な組織サンプルを迅速にスクリーニングするための良好な方法（Hoosら, 2001, Am J Pathol. 158: 1245-1251）であって、本発明の方法において有利に用いられている。染色されたアレイのスコア化は、観察された染色を正確に定量化する自動化されたシステムによって達成できる。この解析の結果は、ハーセプチン（登録商標）治療等で患者を治療した後の結果を最も良好に予測する生体マーカーを同定するものである。患者の「応答の見込み」の０から１００％の範囲は、少数のリガンド、受容体、情報伝達タンパク質又はそれらの予測される組み合わせの発現、リン酸化、又はその両方に基づいて予測される。胸部がん患者由来の更なるサンプルは、組織マイクロアレイの結果に加えて又は代替として解析される。例えば、胸部がん患者に由来するサンプルの解析は、もしその患者の応答が受容体発現及び／又は下流情報伝達の特異的パターンと相関していれば、組織アレイの結論を支持するものである。
本発明は、一部には、本発明の方法を実行するためのキットを提供するものである。例えば、当該方法は、ＩＧＦＲポリペプチド、並びに、リン酸化ＡＫＴポリペプチドに結合する抗体、リン酸化Ｓ６リボソームポリペプチドに結合する抗体、ＥＧＦＲポリペプチドに結合する抗体、ＨＥＲ２ポリペプチドに結合する抗体、ＮＤＦポリペプチドに結合する抗体及びリン酸化ＥＲＫポリペプチドに結合する抗体のうち一つ又はそれ以上を結合する抗体を含む、ＨＥＲ２を標的化した治療に対する哺乳動物の腫瘍の応答性を特徴付けるキットを提供する。ＩＧＦＲポリペプチドに結合する抗体に加えて、そのキットは、リン酸化ＡＫＴポリペプチドに結合する抗体、リン酸化Ｓ６リボソームポリペプチドに結合する抗体、ＥＧＦＲポリペプチドに結合する抗体、ＨＥＲ２ポリペプチドに結合する抗体、ＮＤＦポリペプチドに結合する抗体、及びリン酸化ＥＲＫポリペプチドに結合する抗体のうち、1つか、2つか、3つか、4つか、又は5つすべてを含みうる。さらには、このキットは、限定はされないが付加的な抗体を含み、上記に同定した抗体のほかの付加的な構成成分を含むことができる。例えばそのようなキットは、ＨＥＲ２指向性治療を考慮中の、例えば、胸部がん患者のような特定の患者の適切な治療法を選択するための助けとして臨床家又は内科医によって用いられる。
本発明の特に有用な態様及び利点は、実施例1〜5により理解できるものである。これらの実施例は、本発明の特定の態様の例示、及びそれらの様々な利用である。これらは説明の目的のみに示されているものであって、発明をなんら限定するものではない。
生体マーカーの染色手順
ヒトの腫瘍組織切片は、以下のような本発明の方法に従って予測生体マーカーについて染色された。１０％の中性緩衝化されたホルマリンパラフィンブロックは、４ミクロンで切断された。そしてその切片は被覆されたスライド上に置かれた。ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の免疫染色は、ベンタナメディカルインスツルメント社（ＶＭＳＩ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の、前もって希釈されたＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に対する抗体を用いて行われた。ＨＥＲ３、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ（ＮＤＦ）、及びＩＧＦＲ抗体は、ネオマーカーズ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から得られた。ＴＧＦαに対する抗体は、オンコジーンサイエンス社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得られた。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＩＧＦＲ、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ、及びＴＧＦαは、検出化学物質のＩ―ＶＩＥＷ（ＶＭＳＩ）を附属した“ＢｅｎｃｈＭａｒｋ”（ＶＭＳＩ）を用いて免疫染色された。ｐＥＲＫ（１：１００）、ｐＡＫＴ（１：７５）及びリン酸化Ｓ６リボソームタンパク質に対する特異的な抗体は、セルシグナリングテクノロジー社（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から得られ、標識化されたストレプトアビジンパーオキシダーゼ技術（Vector Elite ABC Kit, Burlingame, CA）を用いて免疫染色された。染色に先立ち、ｐ―Ｓ６リボソームタンパク質、ｐＥＲＫ及びｐＡＫＴ用のスライドは、「デクローカー」（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．）の０．１Ｍのクエン酸緩衝液ｐＨ６．０を用いて抗原回復され、切片は1次抗体とともに4℃で一晩インキュベートされた。その翌日、スライドは“ＬＳＡＢ２”キット（Ｄａｋｏ）を検出試薬として用いて自動染色機（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．）で処理した。ＤＡＢ（Ｄａｋｏ）はクロモゲン色素として用いられた。免疫染色の後、すべてのスライドは、４％のエチルグリーン（シグマ）によって、手動で対比染色した。
ヒトの腫瘍組織切片は、以下のような本発明の方法に従って予測生体マーカーについて染色された。１０％の中性緩衝化されたホルマリンパラフィンブロックは、４ミクロンで切断された。そしてその切片は被覆されたスライド上に置かれた。ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の免疫染色は、ベンタナメディカルインスツルメント社（ＶＭＳＩ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の、前もって希釈されたＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に対する抗体を用いて行われた。ＨＥＲ３、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ（ＮＤＦ）、及びＩＧＦＲ抗体は、ネオマーカーズ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から得られた。ＴＧＦαに対する抗体は、オンコジーンサイエンス社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得られた。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＩＧＦＲ、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ、及びＴＧＦαは、検出化学物質のＩ―ＶＩＥＷ（ＶＭＳＩ）を附属した“ＢｅｎｃｈＭａｒｋ”（ＶＭＳＩ）を用いて免疫染色された。ｐＥＲＫ（１：１００）、ｐＡＫＴ（１：７５）及びリン酸化Ｓ６リボソームタンパク質に対する特異的な抗体は、セルシグナリングテクノロジー社（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から得られ、標識化されたストレプトアビジンパーオキシダーゼ技術（Vector Elite ABC Kit, Burlingame, CA）を用いて免疫染色された。染色に先立ち、ｐ―Ｓ６リボソームタンパク質、ｐＥＲＫ及びｐＡＫＴ用のスライドは、「デクローカー」（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．）の０．１Ｍのクエン酸緩衝液ｐＨ６．０を用いて抗原回復され、切片は1次抗体とともに4℃で一晩インキュベートされた。その翌日、スライドは“ＬＳＡＢ２”キット（Ｄａｋｏ）を検出試薬として用いて自動染色機（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．）で処理した。ＤＡＢ（Ｄａｋｏ）はクロモゲン色素として用いられた。免疫染色の後、すべてのスライドは、４％のエチルグリーン（シグマ）によって、手動で対比染色した。
ウェスタンブロット解析の手順
予測マーカーの発現を検出するためのウェスタンブロット解析は、次のように実施された。細胞は、氷冷した緩衝液中で溶解された（５０ｍＭのトリス塩酸 (ｐＨ７．５), １３７ｍＭの塩化ナトリウム, １ｍＭのＥＤＴＡ, １％ ノニデットP−４０, ０．２％のトリトン Ｘ−１００, １０％のグリセロール, ０．１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム, １０ｍＭのピロリン酸ナトリウム, ２０ｍＭのβグリセロリン酸、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、２μＭのロイペプチン、2μｇ／ｍｌのアプロチニン）。タンパク質濃度は、バイオラッドタンパク質アッセイキット（バイオラッドラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって測定された。同量のタンパク質、通常１レーンに１５μｇのタンパク質は、ゲル電気泳動、例えば、プレキャストの４〜１２％のビストリスＮｕＰａｇｅ勾配ゲル(インビトロジェン) 又は７．５％若しくは４〜１５％の勾配を持つ還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたゲル電気泳動によって分離された。そしてＨｙＢｏｎｄ−Ｃニトロセルロース膜（アマシャムライフサイエンス）又はイモビロンＰ膜のような膜へ転写された。膜は、ブロックされ、例えば、ｐ−ＡＫＴ及びｐ−ＥＲＫに対する抗体（セルシグナルテクノロジー）のような、1次抗体とインキュベートされた。抗体のインキュベートは、３％のウシ血清アルブミン及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液生理食塩水の中で、4℃で一晩行われた。シグナルは、化学発光(パーキンエルマーライフサイエンス)、又は（Xiaら, 2002, Oncogene 21: 6255-6263）に記載されている様なピアス社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のスーパーシグナルウェストフェムトマキシマム感受性基質キットを用いることによって、検出された。
予測マーカーの発現を検出するためのウェスタンブロット解析は、次のように実施された。細胞は、氷冷した緩衝液中で溶解された（５０ｍＭのトリス塩酸 (ｐＨ７．５), １３７ｍＭの塩化ナトリウム, １ｍＭのＥＤＴＡ, １％ ノニデットP−４０, ０．２％のトリトン Ｘ−１００, １０％のグリセロール, ０．１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム, １０ｍＭのピロリン酸ナトリウム, ２０ｍＭのβグリセロリン酸、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド、２μＭのロイペプチン、2μｇ／ｍｌのアプロチニン）。タンパク質濃度は、バイオラッドタンパク質アッセイキット（バイオラッドラボラトリーズ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって測定された。同量のタンパク質、通常１レーンに１５μｇのタンパク質は、ゲル電気泳動、例えば、プレキャストの４〜１２％のビストリスＮｕＰａｇｅ勾配ゲル(インビトロジェン) 又は７．５％若しくは４〜１５％の勾配を持つ還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたゲル電気泳動によって分離された。そしてＨｙＢｏｎｄ−Ｃニトロセルロース膜（アマシャムライフサイエンス）又はイモビロンＰ膜のような膜へ転写された。膜は、ブロックされ、例えば、ｐ−ＡＫＴ及びｐ−ＥＲＫに対する抗体（セルシグナルテクノロジー）のような、1次抗体とインキュベートされた。抗体のインキュベートは、３％のウシ血清アルブミン及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液生理食塩水の中で、4℃で一晩行われた。シグナルは、化学発光(パーキンエルマーライフサイエンス)、又は（Xiaら, 2002, Oncogene 21: 6255-6263）に記載されている様なピアス社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のスーパーシグナルウェストフェムトマキシマム感受性基質キットを用いることによって、検出された。
免疫組織化学法の手順
予測生体マーカーの発現、活性化又はその両方を検出及び測定するための免疫組織化学法は、以下のように行われた。ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＩＧＦＲ、ＴＧＦα、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ（ＮＤＦ）、ｐ−ＥＲＫ、ｐ−ＡＫＴ、及びｐ−Ｓ６リボソームタンパク質又はリン酸化レベルは、アルカリホスファターゼ技術若しくはパーオキシダーゼ技術及び免疫組織化学的に染色されたスライドの顕微鏡に基づく画像解析を用いて、（Bacusら, 1997, Analyt. Quant. Cytol. Histol. 19: 316-328に記載されているようにして）定量化された。定量化は前述（Bacus & Ruby, 1993, Pathol Annu, 28: 179-204）されているように、ＣＡＳ２００画像分析装置を用いて行われた。解析のために、腫瘍は染色レベルに基づいてそれぞれの抗体に対して陽性か陰性かに分類された。統計的解析は、頻度を定量化し、変数の間の相関の重要性を検定するピアソンのカイ二乗を計算するＳｙｓｔａｔを用いて行われた。すべての場合において、ｐ値は、全体の母集団分布に基づいて期待されるものに対するサンプルの分布のばらつきの重要性を示す。比較は、関連データがすべて有効であるサンプルに対してのみ行われた。結果として、殆どの比較に含まれる患者数は、有効サンプルの総数に比べてわずかに少なかった。
定量的な免疫組織化学法は（ＩＨＣ）は、前述（Bacusら, 1997, Analyt. Quant. Cytol. Histol. 19: 316-328）の通り実施された。ＥＧＦＲ、及びｅｒｂＢ―２（ＨＥＲ２）の免疫染色は、ベンタナメディカルサイエンス社（ＶＭＳＩ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の、前もって希釈されたＥＧＦＲ及びｅｒｂＢ―２（ＨＥＲ２）抗体を用いて、前述のＶＭＳＩ社の自動免疫染色モジュール“ＢｅｎｃｈＭａｒｋ”で実施した。ＶＳＭＩ社製の“Ｉ−Ｖｉｅｗ”検出キットは、会社の説明書に従って、ＶＭＳＩ社のあらかじめ希釈された1次抗体の３つすべてに対して行われた。ｅｒｂＢ―３（１：１０）、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ（１：２５）、及びＴＧＦα（１：２０）の抗体もまた、“ＢｅｎｃｈＭａｒｋ”でＩ−Ｖｉｅｗ検出試薬を用いて免疫染色した。ホスホＥｒｋ（１：１００）及びｐ−ＡＫＴ（１：７５）抗体は、製造業者によって記載されている標識化されたストレプトアビジンパーオキシデース技術を用いて免疫染色した。ホスホＥｒｋ及びｐ−ＡＫＴのスライドは、Ｂａｃｕｓら（1997, Analyt. Quant. Cytol. Histol. 19: 316-328）に記載されているようにして抗原回復された。スライドは、検出試薬として“ＬＳＡＢ2”キットを用いて、自動染色装置（Ｄａｋｏ社製）で免疫染色された。染色後、すべてのスライドは４％エチルグリーン（シグマ）を用いて手動で対比染色された。組織切片を調製し、解析する研究者には、患者の腫瘍の型及び治療への応答性については知らされていなかった。
予測生体マーカーの発現、活性化又はその両方を検出及び測定するための免疫組織化学法は、以下のように行われた。ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＩＧＦＲ、ＴＧＦα、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ（ＮＤＦ）、ｐ−ＥＲＫ、ｐ−ＡＫＴ、及びｐ−Ｓ６リボソームタンパク質又はリン酸化レベルは、アルカリホスファターゼ技術若しくはパーオキシダーゼ技術及び免疫組織化学的に染色されたスライドの顕微鏡に基づく画像解析を用いて、（Bacusら, 1997, Analyt. Quant. Cytol. Histol. 19: 316-328に記載されているようにして）定量化された。定量化は前述（Bacus & Ruby, 1993, Pathol Annu, 28: 179-204）されているように、ＣＡＳ２００画像分析装置を用いて行われた。解析のために、腫瘍は染色レベルに基づいてそれぞれの抗体に対して陽性か陰性かに分類された。統計的解析は、頻度を定量化し、変数の間の相関の重要性を検定するピアソンのカイ二乗を計算するＳｙｓｔａｔを用いて行われた。すべての場合において、ｐ値は、全体の母集団分布に基づいて期待されるものに対するサンプルの分布のばらつきの重要性を示す。比較は、関連データがすべて有効であるサンプルに対してのみ行われた。結果として、殆どの比較に含まれる患者数は、有効サンプルの総数に比べてわずかに少なかった。
定量的な免疫組織化学法は（ＩＨＣ）は、前述（Bacusら, 1997, Analyt. Quant. Cytol. Histol. 19: 316-328）の通り実施された。ＥＧＦＲ、及びｅｒｂＢ―２（ＨＥＲ２）の免疫染色は、ベンタナメディカルサイエンス社（ＶＭＳＩ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）の、前もって希釈されたＥＧＦＲ及びｅｒｂＢ―２（ＨＥＲ２）抗体を用いて、前述のＶＭＳＩ社の自動免疫染色モジュール“ＢｅｎｃｈＭａｒｋ”で実施した。ＶＳＭＩ社製の“Ｉ−Ｖｉｅｗ”検出キットは、会社の説明書に従って、ＶＭＳＩ社のあらかじめ希釈された1次抗体の３つすべてに対して行われた。ｅｒｂＢ―３（１：１０）、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ（１：２５）、及びＴＧＦα（１：２０）の抗体もまた、“ＢｅｎｃｈＭａｒｋ”でＩ−Ｖｉｅｗ検出試薬を用いて免疫染色した。ホスホＥｒｋ（１：１００）及びｐ−ＡＫＴ（１：７５）抗体は、製造業者によって記載されている標識化されたストレプトアビジンパーオキシデース技術を用いて免疫染色した。ホスホＥｒｋ及びｐ−ＡＫＴのスライドは、Ｂａｃｕｓら（1997, Analyt. Quant. Cytol. Histol. 19: 316-328）に記載されているようにして抗原回復された。スライドは、検出試薬として“ＬＳＡＢ2”キットを用いて、自動染色装置（Ｄａｋｏ社製）で免疫染色された。染色後、すべてのスライドは４％エチルグリーン（シグマ）を用いて手動で対比染色された。組織切片を調製し、解析する研究者には、患者の腫瘍の型及び治療への応答性については知らされていなかった。
ＩＨＣ用に、ＥＧＦＲ及びｅｒｂＢ−２抗体は、ベンタナメディカルサイエンティフィクインスツルメント社（ＶＭＳＩ）から、抗ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４３７）及びｐ−Ｅｒｋ１／２抗体は、セルシグナリングテクノロジー社（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から、ＴＧＦα、ｅｒｂＢ３、ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ、及びＩＧＦＲ−１に対する抗体は、ネオマーカー社から得た。
胸部がん組織のマイクロアレイ解析
ハーセプチン（登録商標）を用いた従来の化学療法を受けた２５０人の胸部がん患者由来の組織のマイクロアレイは、クリノミクスバイオサイエンス社（Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）から得た。腫瘍そのものは、最も一般的な浸潤性の腺管がん腫を伴ったものであるが、その組織学的解析は多様なものであった。すべての患者は、外科治療の後に放射線治療を受けていた。アレイの組織サンプルは、処置の前に取られたものである。ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現は、全患者のオリジナルの生体サンプルに対して、ハーセプテストシステム（ＤＡＫＯ、Ｃａｐｒｉｎｔｅｒａ、ＣＡ）を用いて測定された。患者応答はクリノミクスからの各々のの病理学者により決定されたものに最終的に追従する既往歴に基づいていた。
ハーセプチン（登録商標）を用いた従来の化学療法を受けた２５０人の胸部がん患者由来の組織のマイクロアレイは、クリノミクスバイオサイエンス社（Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ、ＭＡ）から得た。腫瘍そのものは、最も一般的な浸潤性の腺管がん腫を伴ったものであるが、その組織学的解析は多様なものであった。すべての患者は、外科治療の後に放射線治療を受けていた。アレイの組織サンプルは、処置の前に取られたものである。ＨＥＲ２／ｎｅｕの発現は、全患者のオリジナルの生体サンプルに対して、ハーセプテストシステム（ＤＡＫＯ、Ｃａｐｒｉｎｔｅｒａ、ＣＡ）を用いて測定された。患者応答はクリノミクスからの各々のの病理学者により決定されたものに最終的に追従する既往歴に基づいていた。
これらの患者の人口統計データは、表1に報告されている。患者の大多数は、腺管がん腫を浸潤しており、アントラサイクリン＋シクロホスファミドを処方されていた。患者の５７人は、転移を併発していた。すべての患者は、初期容量４ｍｇ／ｋｇのハーセプチン（登録商標）及び週に２ｍｇ／ｋｇの維持容量を服用していた。
２５０人の患者のオリジナル組織アレイのうち、７５サンプルは、臨床データの欠如のため、又は切片が使用可能な腫瘍組織を含んでいなかったため、解析に用いられなかった。全体的に見て、残りの患者の内１５％は、疾病がなかったか、又は治療後に安定した病状を呈したが、８５％は、再発した。残りの患者１７５人のうち、２８人のサンプルについてはハーセプテストの結果が欠損していたので、更なる解析からは除外された。ハーセプテストの結果が得られたサンプルのうちの７７サンプルについては、ハーセプテストのスコアが＋３であり、７０サンプルについては＋２又はそれ以下の染色強度であった（表1）。
ハーセプテストの染色スコアは、マイクロアレイを使い、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現レベルを解析することによって確認された（データ未提示）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現は、患者応答と強く相関していた。ＨＥＲ２／ｎｅｕが０又は＋１の患者の１００％は再発したが、＋３の患者は７７％だけが再発した。この応答率は、以前に報告されたものと類似している。（Baselga, 2002, Annuals of Oncology 13: 8-9参照）。これらの結果に基づいて、生体マーカーの更なる解析が、ＨＥＲ２を最も高いレベル（＋３）で発現している患者に集中的になされた。ハーセプテストの結果が最も高かった（＋３）サンプルのうちの７４は、原発腫瘍から採取されたもので、2つはリンパ節から、１つは副腎転移からのものであった。
ｐ−ＥＲＫ及びｐ−ＡＫＴ（ＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化体）の活性化された下流のシグナル、並びにｍＴＯＲ及びｐ−Ｓ６（リン酸化されたＳ６リボソームタンパク質）の下流のシグナルと同様に、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現している（ハーセプテストの染色スコアが＋３）７７人の患者は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＩＧＦＲ、及びＮＤＦ／Hｅｒｅｇｕｌｉｎ、及びＴＧＦ−αの発現について解析された。受容体キナーゼの解析は、ＨＥＲ２／ｎｅｕと同様に、ＥＧＦＲ発現がまた患者応答と有意に相関していることを明らかにした（表２）。ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現しているハーセプチン（登録商標）を処置した患者の中で、ＥＧＦＲ陽性患者の３０％については病状が安定していた、又は疾病がみられなかったが、ＥＧＦＲ陰性患者については疾病の進行がみられなかったのは９％のみであった。＋３ＨＥＲ２／ｎｅｕの患者７７人のうち、７０人はＨＥＲ３を発現していた。しかしながら、ＨＥＲ３の発現は、患者応答と有意には相関していなかった（ＨＥＲ３陰性の患者が少ないことから、データセットの中での比較は限られたものとなっている）。成長因子受容体ＨＥＲ３は、ＰＩ３キナーゼ結合部位を持っており、他のｅｒｂＢ受容体と活性なヘテロ二量体を形成するので、ｅｒｂＢ情報伝達の下流で重要な役割を示すと考えられる。他の成長因子受容体の発現はまた、下流の経路の直接的な刺激を介して、又はｅｒｂＢ受容体のトランス活性化を介して、患者応答を仲介するかもしれない。
ＮＤＦ及びＴＧＦ−αを含むｅｒｂＢリガンドの発現は、また、患者によって多様なものとなっている（表3を参照のこと）。患者のおおよそ７０％は、ＮＤＦを高いレベルで発現していたが、おおよそ５７％はＴＧＦ−αを高いレベルで発現していた。NDFレベルと患者の応答の間に有意な相関が観測された。ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現しているＮＤＦ陰性患者に於いてはかなり高い割合で再発がみられた（９１％）。ところが、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現しているＮＤＦ陽性患者のうち６２％にのみ再発がみられた。一方、ＴＧＦ−αレベルのみの場合と患者応答の間には、予測的な相関は見られなかった（表3を参照のこと）。しかしながら、患者におけるＴＧＦ−α又はＮＤＦの発現と、ＥＧＦＲの過剰発現との組み合わせは、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する患者における患者応答と正の相関を示した（それぞれｐ＝０．０２及びｐ＝０．０３）（データ未提示）。
ＨＥＲ２と、ＨＥＲ３又はＥＧＦＲとのヘテロ二量体の活性化は、ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の活性化をもたらす。そのＭＡＰＫ経路は、ＥＲＫの活性化又はリン酸化（ｐＥＲＫ）のレベルを解析することによって測定される。ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現しいて、病状が安定してる又は再発した患者に於いて、活性化されたＥＲＫのみのレベルの解析及び比較は、ｐＥＲＫレベルが上昇していることが患者応答の因子として劇的な効果を発揮していることを証明することはできなかった（表４を参照のこと）。同様に、この解析に基づいて、ＡＫＴの活性化（ｐＡＫＴ）だけでは、ハーセプチン（登録商標）を処置したＨＥＲ２陽性患者の応答の予測マーカーにはなりそうもない（表４を参照のこと）。また、Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化の解析は、ｍＴＯＲ及びｐ７０Ｓ６キナーゼを介した多様な情報を統合するものであるが、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する患者の患者応答と、有意な相関を示さなかった（表４を参照のこと）。しかしながら、ｐＥＲＫ及びｐＡＫＴの発現の検討がＥＧＦＲ及びＨＥＲ２／ｎｅｕを発現した患者に限られるならば、これらの情報伝達分子のいずれかの低発現は、ハーセプチン（登録商標）に対する陽性応答を有意に予測する判断材料となった（表５）。
解析の予測率を高めるために、腫瘍を特徴付ける多変量解析において、２つ又はそれ以上の生体マーカーを組み合わせることが想起される。この解析において、ＥＲＫ活性化を伴うＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＥＧＦＲ発現の組み合わせの観察は、応答を有意に予測した（表５を参照のこと）。例えば、ＥＧＦＲ発現が低く、ＥＲＫリン酸化レベルが高い患者は、応答しなかった（０％応答）が、ＥＧＦＲ発現が高く、ＥＲＫリン酸化レベルが低い患者は、高い応答率を示した（４２％応答）。同様に、ＮＤＦの高発現とＥＧＦＲ及びＨＥＲ２／ｎｅｕの高発現の組み合わせ、又はＴＧＦ−αの高発現とＥＧＦＲ及びＨＥＲ２／ｎｅｕの高発現の組み合わせは、ＥＧＦＲ及びＮＤＦリガンドの低発現を示した患者と比較して、よりよい応答を予測した（データ未提示）。この比較はしばしば劇的であった。例えば、ＥＧＦＲ、HER２／ｎｅｕ及びＮＤＦの高発現を示した患者の、３９％は、治療に応答したが、HER２／ｎｅｕの高発現でＥＧＦＲ及びＮＤＦの低発現を示した患者は、一人も応答しなかった（データ未提示）。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕの高発現、ＩＧＦＲの低発現、及びＳ６リボソームタンパク質の高リン酸化の組み合わせは、患者応答率が高かった（６７％、表５）。これは、治療に応答しない率が高かった、HＥＲ２／ｎｅｕ及びＩＧＦＲの高発現及びＳ６リボソームタンパク質の高リン酸化を示す患者と逆である。ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する患者がハーセプチン（登録商標）治療に応答するかどうかを予測するマーカーとして最良の組み合わせは、ＮＤＦの高発現、ＩＧＦＲの低発現、及びＳ６の高リン酸化である（表６）。逆に、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現し、ＮＤＦの低発現及びＩＧＦＲの高発現を示す患者は、Ｓ６の状態とは無関係に、一人も治療に応答しなかった（表６）。しかしながら、これらの結果は、これらの患者サンプルの少ない母集団を用いることによって得られた。ＮＤＦ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、及びＥＧＦＲの高発現レベルを示す患者において、ＥＲＫのリン酸化は、２８％（高ｐ−ＥＲＫ）から５４％（低ｐ−ＥＲＫ）までの応答の違いと相関していた（表６）。同様に、ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＮＤＦの発現を含む生体マーカーのほかのいかなる組み合わせをもちあわせ、低レベルのｐ−ＡＫＴを示す患者は、このタンパク質を過剰発現する患者と比べて、よりよく応答した（結果未提示）。あわせて考えると、このデータは、ＨＥＲ２／ｎｅｕは、そのリガンド、他のｅｒｂＢ受容体及びリガンドとともに、他の成長因子受容体と同様、ハーセプチン（登録商標）応答において役割を果たすことを示している。重要なことに、これらのタンパク質の選択された組み合わせの解析は、０から１００％までの変化に富む応答率と相関していた。
胸部がんサンプルの解析
７名の胸部がん患者由来のサンプルは、エール大学から得られた。これら７名の患者の臨床暦は、はじめての治療として化学療法の組み合わせでハーセプチン（登録商標）を処置されたものから、補助剤療法としてハーセプチン（登録商標）を処置されたものまで、変化に富んでいた。これらの７名のサンプルは、受容体、リガンド、及び情報伝達タンパク質の発現及びリン酸化について解析され、その結果は、組織マイクロアレイ解析の結果と比較された。
７名の胸部がん患者由来のサンプルは、エール大学から得られた。これら７名の患者の臨床暦は、はじめての治療として化学療法の組み合わせでハーセプチン（登録商標）を処置されたものから、補助剤療法としてハーセプチン（登録商標）を処置されたものまで、変化に富んでいた。これらの７名のサンプルは、受容体、リガンド、及び情報伝達タンパク質の発現及びリン酸化について解析され、その結果は、組織マイクロアレイ解析の結果と比較された。
７名すべての患者は、ＨＥＲ２／ｎｅｕでないポリペプチドに免疫学的に特異的なほかの抗体を用いた解析で測定されたように、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現していた。患者の既往歴は、変化に富んでいた。例えば、初期発症から４年後に転移性の疾病を再発した患者＃１は、ハーセプチン（登録商標）とドセタキセルを処方された。この患者は、組み合わせ治療開始から１年以上安定した疾病状態にあった。最初の放射線治療の後７ヵ月に単一の転移が発見された患者＃７は、ハーセプチン（登録商標）とビノレルビンを処方された。８週間の組み合わせ治療の後で疾病の悪化が見られた。７名の患者のうち、３名は、ハーセプチン（登録商標）応答を示した。一方他の４名は、応答しなかった（表７）。応答したもののうち１名は、ＩＧＦＲを発現していなかったが、ＥＧＦＲを発現しており、また下流の情報伝達タンパク質は陽性を示した。これらの応答したもののうち他の１名は、ＩＧＦＲ及びＥＧＦＲを発現したが、Ｓ６及びＥＲＫにおいて活性な下流情報伝達を示さなかった。すべての非応答者は、ＩＧＦＲを発現し、Ｓ６のリン酸化は陽性であった。非応答者のうち２名は、また、ＥＧＦＲを発現していた。これらの結果は、マイクロアレイ解析から得られた結果と一致している。ＩＧＦＲ発現とＳ６リン酸化によって示される活性なＩＧＦＲ受容体をもつ患者は、ハーセプチン（登録商標）に応答する可能性は低いが、一方ＩＧＦＲを欠損している患者、又はＩＧＦＲを持っているが下流の情報伝達がない患者は、応答の可能性が高そうである。
上記の開示は、本発明のある特別な態様を強調するものであり、全ての修飾、等価の代替は、添付の請求の範囲に詳しく説明される発明の精神及び範囲内であることは理解されるものである。
Claims (14)
- ＨＥＲ２指向性治療に応答する、ＨＥＲ２を過剰発現する哺乳動物の胸部腫瘍を同定する方法であって、
（ａ）ＩＧＦＲポリペプチドの発現レベル、及び
（ｂ）Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化レベル
のパターンを検出するために、哺乳動物の胸部腫瘍から得られたサンプルを解析する工程を含み、当該サンプルが示すパターンが、
ＩＧＦＲポリペプチドの発現が低下し、かつＳ６リボソームポリペプチドのリン酸化が増加する場合に、
ＨＥＲ２指向性治療に応答する、ＨＥＲ２を過剰発現する哺乳動物の胸部腫瘍であると同定するものである方法。 - 前記パターンを検出するための解析工程において、
（ｃ）ＮＤＦポリペプチドの発現レベルをさらに解析するものであり、
前記検出されるパターンが、
ＩＧＦＲポリペプチドの発現が低下し、Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化が増加し、かつＮＤＦポリペプチドの発現が増加する場合である、請求項１に記載の方法。 - 前記（ａ）及び（ｂ）、又はさらに（ｃ）のパターンを検出するための解析工程において、非腫瘍組織又は細胞サンプルでの対応するポリペプチドの発現又はリン酸化レベルと比較する工程が設けられている、請求項１又は２に記載の方法。
- ＨＥＲ２指向性治療がｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２（ハーセプチン（登録商標））を含むものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 哺乳動物の胸部腫瘍から得られたサンプルが、少なくとも一つの化学療法剤による治療を受けた哺乳動物由来のものである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 前記（ａ）及び（ｂ）、又はさらに（ｃ）のポリペプチドの発現又はリン酸化レベルの検出パターンが、生物学的検出試薬を用いて測定されたものである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 前記生物学的検出試薬が抗体である、請求項６に記載の方法。
- 前記生物学的検出試薬が核酸プローブである、請求項６に記載の方法。
- 前記Ｓ６リボソームポリペプチドのリン酸化レベルの検出パターンが、配列番号２の２３５位のリン酸化セリン残基を含むエピトープに特異的な抗体を用いて測定されたものである、請求項６又は７に記載の方法。
- 前記哺乳動物の胸部腫瘍から得られたサンプルがパラフィン包埋された生検サンプルである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
- 前記哺乳動物の胸部腫瘍から得られたサンプルが、あらかじめＨＥＲ２ポリペプチドに結合する抗体を用いてＨＥＲ２を過剰発現していると同定されたものである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
- 哺乳動物の胸部腫瘍のＨＥＲ２指向性治療に対する応答性を性状解析するためのキットであって、
（Ａ）ＩＧＦＲポリペプチドに結合する抗体、及び
（Ｂ）リン酸化されたＳ６リボソームポリペプチドに結合する抗体、又はさらに
（Ｃ）ＮＤＦポリペプチドに結合する抗体
を含むキット。 - 前記（Ｂ）の抗体が免疫学的に配列番号２の２３５位にリン酸化セリン残基を持つＳ６リボソームポリペプチドに特異的な抗体である、請求項１２に記載のキット。
- キットがさらに（Ａ）及び（Ｂ）又はさらに（Ｃ）のいずれかの抗体に結合する少なくとも一つの２次抗体を含むものである、請求項１２又は１３に記載のキット。
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