JP4607875B2 - 生理活性分子間の結合を決定するための磁性粒子の使用 - Google Patents
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Description
−捕捉分子に結合されるターゲット分子。
−第2のターゲット分子に結合される捕捉分子に結合される第1のターゲット分子。
−ウィルスに結合される捕捉分子。
−第2の捕捉分子に結合されるウィルスに結合される第1の捕捉分子。
−ウィルス/セル分子の複合体。
−光学活性成分に囲まれる1又は複数の磁気コア。
−エンザイム、レドックス分子、レドックスエンザイムのような(生物)化学活性分子によって囲まれる1又は複数の磁気コア。
−生理活性及び/又は他の機能的な化合物が結合されるデキストレイン(dextrane)のような有機層でコーティングされた1又は複数の磁気コア。
−例えばポリスチレン(一般にラテックスとして知られる)、PMMAのようなポリマ球内にカプセル化された1又は複数の磁気コア。高分子マトリックス内で、他のシグナリング分子(例えばフルオロフォアのような)が、埋め込まれ又は共重合されることができる。
−フェリチンのような生物学的に活性な磁性粒子。
−マグネトソーム、リポソームのような磁性及び/又は検出成分を有するベシクル。
図1に概略的に示される本発明の第1の実施例により、生体分子間の相互作用の検出が実施される。生体分子C(好適には捕捉分子と呼ばれる)の1つは、例えば表面5が、捕捉分子が結合するポリマのような材料を含むときに直接的に、又はリンカ分子3を介して間接的に、表面5に結合される。ここで使用される表面5は、例えばガラス、プラスチック、有機結晶又は無機結晶(例えばシリコン)、アモルファス有機材料又はアモルファス無機材料(例えばシリコンナイトライド、シリコンオキサイド、シリコンオキシナイトライド、アルミニウムオキサイド)のような、生体分子で直接的(例えば架橋によって)又は間接的にコーティングするのに適した固定の基板、マトリックス又はグリッドに関する。適切な表面材料層及び結鎖化学は当業者に知られており、例えばA. M. Usmani及びN. Akmalの「Diagnostic Biosensor Polymers」(American Chemical Society, 1994 Symposium Book Series 556,Washington DC, USA, 1994)、Y. Lvov及びH. Mohwaldにより編集された「Protein Architecture, Interfacing Molecular Assemblies and Immobilization Biotechnology」(Marcel Dekker, New York, 2000)、David Wildの「The Immunoassay Handbook」(Nature Publishing Group, London, 2001, ISBN 1-56159-270-6)又はKress-Rogersの「Handbook of Biosensors and Electronic Noses. Medicine, Food and the Environment」(ISBN 0-8493-8905-4)に記述されている。
−ゆっくりした拡散スピード、表面との長い相互作用時間及び粒子の大きい接触面積は、大きいビーズが非特異的態様で表面にくっつく可能性を増やす。
−マイクロメートルサイズの粒子は、アッセイに不利益である沈殿スピードを示す。
−小さいビーズは、(単位ボリュームあたりのビーズの数に関して)大きいビーズより高い濃度の流体に分散されることができる。こうして、小さいビーズは、ターゲット分子及びセンサ表面のより高い相互作用レートをもたらす。
−ターゲットがセンサ表面に結合する前に、ターゲットは、それらを小さい磁性ビーズに結合させることによってラベリングされることができる。事前のラベリングは、一般的なやり方で(例えばビーズは、それらの表面上に一般的なタンパク質結合化学を有する)、又は捕捉分子(例えば磁性ビーズをもつ抗体)に対して特異的結合を有する生理活性分子によって、実施されることができる。
−アッセイは、結合アッセイ、競合アッセイ、移動アッセイ等でありえる。多分子複合体への磁力の印加は、分子解離の機会を増やす。これは、捕捉分子の高い親和性及び低い解離レートにより通常は非常にゆっくりである移動アッセイのスピードを高めるのを助けることができる。
磁性ビーズ間の力の決定。
ビーズのいくつかの組み合わせが可能である。良好なバランスが、ビーズのサイズ(小さいほど良い)及び磁気特性(磁気モーメント、磁気緩和)の間で求められることを必要とする。この具体例は、本発明の好適な実施例による2対の粒子について差のパラメートルの比較研究を示す。
以下の実施例において、第1及び第2のビーズは、サイズ及び磁気モーメントが異なる。実際的理由のために、本発明の第1のビーズ及び第2のビーズは、「小さい」及び「大きい」ビーズと称される。
第1の(小さい)ビーズ:直径100nm、m=10−16A.m2、超常磁性
第2の(大きい)ビーズ:直径1−μmm=10−13のA.m2、超常磁性
第1の(小さい)ビーズ:直径35nm、m=10−18A.m2、超常磁性
第2の(大きい)ビーズ:直径100nm、m=10−15A.m2、高密度の磁性材料
第1及び第2のビーズ間の引力を計算するために、2つの磁化されたビーズ間の力は、磁気モーメントのサイズ、モーメントの相対的な向き及びビーズの相対位置によって決定される。外部印加磁界の方向に沿ったビーズからビーズへのアプローチ(極から極へのアプローチ)のために、双極子間の引力が、次式によって与えられる:
第2のビーズは、それらの大きい磁気モーメントにより、外部的に印加される磁界勾配によって、流体内でマニピュレートされることができる。第2の粒子(大きいビーズ)のマニピュレーションスピードは、粘性媒体中の球状粒子の流れ抵抗に関する式を使用することによって評価されることができる:
溶液中の第1及び第2のビーズは、それらが共に溶液中に存在するとき、互いにほとんど影響を及ぼさないことが示されることができる:
これまで、第2のビーズは、本質的に表面に対して垂直なそれらの軌道を有するセンサ表面に向かって及びセンサ表面から離れる方へ移動されるとみなされていた。第2のビーズが弱く結合された第1のビーズをピックアップする効率は、センサ表面にわたって第2のビーズの側方移動を更に生成することによって高められることができる。側方移動は、ほんの例示にすぎないが、流体のせん断流動、アコースティック励起又は磁気動作のような任意の適切な手段によって生成されることができる。磁気動作は、外部磁界勾配によって及びチップ上に生成される勾配によって生成されることができ、例えばオンチップ電流ワイヤに電流を通すことによって生成されることができる。オンチップ電流ワイヤは、勾配がごくわずかなエネルギー消費をもって結合表面の非常に近くに生成されるという利点がある。オンチップ電流ワイヤ周辺に生成される磁界勾配は、次式に等しい。
この2つのビーズのストリンジェンシーの実施例は、2つの理由のため、磁気凝集に対して相対的に感度が低い:
(i)より低い磁気モーメントを有する第1の、例えば小さいビーズは、磁界中で凝集する傾向をほとんど有し得ない。
(ii)固定の第1のビーズ上のストリンジェンシー力は、単一の最も近い第2のビーズによって決定される[式(2)のx−4を参照]。より遠いビーズからの力は、無視できるほどであり、従って、第2のビーズの潜在的なクラスタリングは、第1のビーズに及ぼされる力を変化させない。
本発明の好適な実施例によるストリンジェンシープロシージャが、図5を参照して説明される。図5のデバイスは、マイクロフルイディックデバイスとして実現されることができる。
図2に概略的に示される本発明の第2の実施例により、それぞれが生理活性分子に結合される2つのビーズ1、2が使用される。ビーズ1、2は、任意には、同じ磁気モーメントを有する。1つの実験的な構成において、2つのビーズ1、2は、それぞれターゲット分子T及び捕捉分子Cに結合されることができる。代替の構成において、2つのビーズ1、2は、捕捉分子C(図3を参照)の異なる一部に結合する2つの異なるターゲット分子T1、T2に結合される。例えば、2つの異なるターゲット分子T1、T2は、捕捉分子である同じ抗原の異なるエピトープに向けられる抗体でありえ、それぞれがモノクローナル又はポリクローナル抗体でありえる。
は、それぞれのビーズの磁気モーメントを表し、rは、それぞれビーズのコア間の距離である。
本発明の第3の実施例によれば、2つのビーズ1、2が使用され、それらの一方だけが、磁気モーメントを有する。図4を参照されたい。2つの生理活性分子C、T間の非特異的結合は、(1)液体のフローFに非磁性ビーズ2をおくことによって、1つの分子(C又はTであるが、図4には捕捉分子Cとして示されている)に付着される非磁性ビーズ2上に生成される流体力と、(2)磁界勾配MGの印加によって他の分子に付着される磁性ビーズに作用する反対の磁力と、の組み合わせによって崩壊される。このアプリケーションは、例えばマイクロアレイのような固形基質に捕捉分子Cを付着させる必要なく、溶液中で本発明を実施することをも可能にする。
マイクロフルイディックデバイスとして実現されることができる第3の実施例の具体例が、図6を参照して記述される。磁気流体ボトルが、ゾーン28に提供される。ソース20からの流体は、例えば制御可能なポンプ21によって、ゾーン27、28、29を通って流れ、30から出るようにされる。ゾーン27及び29は、ゾーン28のフローレートと比較して、それぞれフローを増加させ、減少させるように形作られる。磁界勾配は、例えば1又は複数の永久磁石又は電磁石のような適切な磁界発生器24によって、ゾーン27−29に与えられる。磁界は、図6の左の方へ磁性ビーズを引き寄せる。ソース20からの液体のフローは、図6の右の方へビーズを追いやる傾向がある。第1の磁性ビーズ1(一般には大きさが第2の非磁性ビーズ2より非常に小さい)は、ターゲット分子によりラベリングされ、捕捉分子によりラベリングされた第2の非磁性ビーズ2と接触される。結果は、ビーズ1、2の混合物であり、それらの一部は、生体分子結合によって互いに結合される。力が均衡するとき、少なくとも1つの生体分子を介して互いに接続される第1及び第2のビーズの組み合わせは、例えばそれらが光学的又は磁気的システムのような適切な検出システムによって検出されることができるゾーン28において、静止したままである。ビーズ及び生体分子の混合物は、例えば25においてゾーン27へ注入される。最初に、ソース20からの液体のフローは低くてもよく、又は液体は静止していてもよい。磁界勾配の効果は、図6の左の方に第1の磁性ビーズ1を引っ張ることができる。ビーズ1、2が遠くに行き過ぎることを防ぐために、任意のフィルタ23が設けられることもできる。ポンプ21が、フローレートをゆっくり高めるように作動される。最初に、第1のビーズ1に結合されない非磁性ビーズ2及びその他の残りのものは、出口30を介してシステムから押し流される。ビーズ1、2の組み合わせの流体力が、十分高いレベルに達すると、これらの組み合わせは、右の方へ移動する。それらがゾーン29に入る場合、フローレートは減少し、磁界勾配によって生成される力が、ビーズが出口30に達しないように制御する。フローレートがわずかに低すぎる場合、磁界勾配は、図6の左の方へビーズ組み合わせ1、2の一部を移動させる傾向がある。しかしながら、より高いフローレートが、ゾーン27にあるとき、流体力は、組み合わせが遠くに行かないように制御する。結果は、ビーズ1、2の結合された組み合わせが流体磁気ボトル28にトラップされることである。ここで、ビーズ1及び/又はビーズ2の間の結合は、反対の磁力及び流体力によってもたらされる応力下におかれる。結合が非特異的である場合、結合は崩壊され、第1の磁性ビーズ1は、フィルタ23に向かって移動し、非磁性粒子は、システムから押し流される。それゆえ、流体磁気ボトル28にとどまるビーズの組み合わせは、特異的結合を有する。
Claims (14)
- 液体中の微生物学的なエンティティの間の結合のそれぞれ異なる強度を区別するための、磁界中における第1及び第2の粒子の使用であって、前記第1及び第2の粒子の両方が磁性であり、前記使用が、
前記液体中で移動可能な前記第1の粒子と第1の微生物学的なエンティティとの間の複合体を与えるステップと、
前記第1の微生物学的なエンティティと第2の微生物学的なエンティティとの間の結合のための前記液体内の条件を与えるステップと、
前記液体中で移動可能な第2の粒子を前記複合体に近づけるステップと、
第1の強度の結合を崩壊させ、より大きい第2の強度の結合を崩壊させないように、磁界を印加しつつ、前記第1及び前記第2の微生物学的なエンティティの間の前記結合に機械的応力を与えるように、前記第1及び/又は前記第2の粒子に作用するステップと、
を含む、使用。 - 前記結合の強度の区別が、特異的結合と非特異的結合との間の識別のために使用される、請求項1に記載の使用。
- 前記第1の微生物学的なエンティティがターゲット分子であり、前記第2の微生物学的なエンティティが捕捉分子である、請求項1又は請求項2に記載の使用。
- 前記第1の粒子が、微生物学的なエンティティに結合され、前記第2の磁性粒子が、微生物学的なエンティティに結合されない、請求項1乃至請求項3のいずれか1項に記載の使用。
- 前記第1及び前記第2の粒子の双方が、微生物学的なエンティティに結合される、請求項1乃至請求項3のいずれか1項に記載の使用。
- 前記第1の粒子が、ターゲットの微生物学的なエンティティに結合され、前記第2の粒子が、捕捉の微生物学的なエンティティに結合される、請求項5に記載の使用。
- 前記第1の粒子が、第1のターゲットの微生物学的なエンティティに結合され、前記第2の粒子が、第2のターゲットの微生物学的なエンティティに結合される、請求項5に記載の使用。
- 前記第1及び/又は前記第2の磁性粒子が常磁性である、請求項1乃至請求項7のいずれか1項に記載の使用。
- 前記第1の磁性粒子が、前記第2の磁性粒子の磁気モーメントより10倍小さい磁気モーメントを有する、請求項1乃至請求項8のいずれか1項に記載の使用。
- 前記第1の磁性粒子のサイズは、前記第2の磁性粒子のサイズより小さい、請求項1乃至請求項9のいずれか1項に記載の使用。
- 前記第1の磁性粒子が、1nm乃至1μmの直径を有し、より好適には10nm乃至200nmの直径を有する、請求項1乃至請求項10のいずれか1項に記載の使用。
- 前記第2の磁性粒子が、少なくとも100nmの直径を有する、請求項1乃至請求項11のいずれか1項に記載の使用。
- 前記第1又は前記第2の微生物学的なエンティティがアレイ上の捕捉スポットに配される、請求項1乃至12のいずれか1項に記載の使用。
- 流体摩擦力を、前記第1又は前記第2の微生物学的なエンティティに与えるステップを更に含む、請求項1乃至請求項13のいずれか1項に記載の使用。
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