JP4594267B2 - 抗真菌物質の製造方法 - Google Patents
抗真菌物質の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4594267B2 JP4594267B2 JP2006105925A JP2006105925A JP4594267B2 JP 4594267 B2 JP4594267 B2 JP 4594267B2 JP 2006105925 A JP2006105925 A JP 2006105925A JP 2006105925 A JP2006105925 A JP 2006105925A JP 4594267 B2 JP4594267 B2 JP 4594267B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dhpa
- medium
- culture
- fungi
- antibacterial activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
真菌による種々の病気は、ヒトや動物の健康に甚大な影響を与えているため、それらの治療に有用な新規薬剤の開発が期待されている。
また、ある種の真菌は植物病原菌として知られており、農業に甚大な被害を与えている。さらに、最近の住宅事情を反映した結露等による住宅への糸状菌の進入は、ヒトにアレルギー等の症状をもたらし、ヒトや動物の健康に悪影響を及ぼしている。これらの有効な対策として、新規抗真菌剤の開発並びに植物防御の面から新たな農園芸用抗真菌剤の開発が期待されている。
また、従来から知られている抗真菌剤は殆どのものが疎水性の性質を示し、ハンドリング、商品形態、商品設計等の理由により、扱いやすい水溶性の抗真菌剤が求められていた。
また、本発明は、抗真菌物質を製造する方法を提供することを目的とするものである。
特に、アスペルギルス・ニガーに対して、DHPAは非常に低い濃度で生育を阻害する作用があること、および無機塩の存在下では、DHPAの抗真菌活性がさらに向上することを見出した。
さらに、本発明者は、ストレプトミセス属に属する放線菌(FERM P−17418)を培地に培養して得られた培養物から、DHPAを採取できることを見出した。
DHPAは、発酵法や化学合成法あるいはこれらの組み合わせにより製造することができる。また、発酵法による場合、生産菌はカビ、放線菌、酵母などのいずれでもよい。1例として、ストレプトミセス属に属する放線菌を使用する場合について説明する。
ストレプトミセス属に分類される放線菌(Streptomyces sp.) は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はFERM P−17418である。
例えば、蒸留水、イオン交換水、井戸水、水道水などに炭素源、窒素源を含有し、所望により、さらにミネラル類、ビタミン類などを含有する培地を利用することができる。培地の形状としては液状が望ましい。
炭素源としては、炭水化物、糖質類、有機酸塩、アルコール類などが利用できる。具体的には、グルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、乳酸、酒石酸などが用いられ、特にグルコースが好ましく用いられる。これら炭素源は単独で、あるいは2種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
窒素源としては、アンモニア塩類、硝酸塩類などの無機窒素化合物、またはペプトン、酵母エキス、カゼイン、肉エキス、コーン・スチープ・リカー、SVP(ソリュブル・ベジタブル・プロテイン)、尿素、大豆粕、魚粉、発酵廃棄物などの有機窒素化合物を挙げることができ、これら窒素源も単独で、あるいは2種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
本発明において、微生物を培養するための培養条件には特に制限はない。培養方式に関しても、例えば静置培養方式、通気攪拌培養方式及び振とう培養方式のいずれも用いられる。培養温度としては、20〜40℃の間ならばいずれでも構わないが、好ましくは30℃前後の温度で培養する。攪拌または振とう培養方式で培養する場合、攪拌回転数は通常の微生物培養に適用される範囲ならばよく、400rpm程度の条件が適当である。
次いで、得られた培養濾液から陽イオン交換樹脂でDHPAを吸着する。このとき用いる陽イオン交換樹脂に制限はないが、好ましくはDowex 50W−X2を使用する。その後、樹脂を水にて洗浄するが、好ましくは蒸留水を用いて行う。洗浄後、陽イオン交換樹脂に吸着したDHPAを溶離させるため、弱塩基性の溶液、例えばアンモニア水(NH4 OH溶液) 、炭酸水素ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液等で、好ましくはアンモニア水を用いて溶離する。
しかる後、活性フラクションを高速液体クロマトグラフィー等の方法で確認して収集する。この活性フラクションは、陰イオン交換樹脂等にて吸着する。陰イオン交換樹脂は、任意のもの用いることができるが、好ましくはDowex 1−X2を使用することができる。
無機塩としては、アルカリ金属やマンガン族金属の塩を用いることができ、より好ましくは塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マンガン等が挙げられる。また、その濃度は対象の真菌の種類などを考慮して決定すればよいが、好ましくは0.01M〜2.0M、より好ましくは0.1M〜1.5Mである。
無機塩の添加方法は特に制限がなく、DHPAと該塩が共存するように添加すれば良い。例えば、該塩溶液をDHPAあるいは該塩とDHPA溶液を混合し、両者を共存させることにより優れた抗菌作用が発揮される。また、DHPAまたはその溶液を抗真菌剤として使用する直前に、無機塩又はその溶液と混合しても良い。
DHPAを有効成分とする本発明の薬剤を真菌感染症の治療剤として使用するには、種々の投与形態に合わせて、該薬剤を既知の医薬品用担体と適宜組み合わせて製剤化すればよい。このような投与形態としては、例えば皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、座薬等による非経口投与、あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等による経口投与の全身投与の他、軟膏剤、ローション剤、膣座薬等の局所投与の形態を例示することができる。
実施例1 ジヒドロフェニルアラニンの調製
ストレプトミセス属に属する放線菌(FERM P−17418)の凍結乾燥菌体を50mLのYMG培地(0.5% 酵母エキス,0.5% 麦芽エキス,1% グルコース)を含む500mL容の坂口フラスコにて30℃で1日振盪培養した。これを5000mLのYMG培地を含む7000mL容のミニジャーファーメンターACD−I0を用い、通気量は3L/minで30℃で培養した。培養は、撹拌回転数400rpmで48時間行なった。
しかる後、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で濃縮し、メタノールに溶解した。次に、結晶が晶出する寸前までメタノールを濃縮し、その溶液を一晩撹拌することにより結晶化を行なった。この結果、培養液10Lに対し98%の結晶末を780g得た。
HPLC(高速液体クロマトグラフィー)の条件の検討
移動相は0.1Mのリン酸二水素ナトリウム(pH3.0)を用いた。カラムはYMC社のODS−AMを、ポンプは島津製作所のLC−6Aを用い、流速は毎分1mlで行なった。検出器には島津製作所のUV−10Aを用いた。検出波長は、210nmで行なった。その結果、DHPAのリテンションタイムは約6分であった。
DHPAはD2 O(重水)に溶かし、NMRで分析を行なった。 1H NMR、13C NMR、 1H− 1H COSY、 1H−13C COSY、HMBC、HMQCのスペクトラムを得、さらにFAB−MSも行なった。これらで得たスペクトルデータから2,5−ジヒドロフェニルアラニンであると同定した。
さらに、DHPAのD体、L体の決定は以下のようにして行なった。はじめに、1mg/Lの試料溶液を調製し、その液10μLに0.4%トリエチルアミンを含むアセトニトリル溶液を10L加え、よく混合した。次に、この混合液に0.2%の2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−グルコピラノシルイソシアネートを含むアセトニトリル溶液20Lを加えてよく混合し、室温で20分間放置した。10Lを光学異性体分割カラムL−カラムODSで分析した。溶出には、10mM リン酸二水素カリウム(pH2.8):メタノール(1:1,v/v)を用いた。また、検出器は前述の機器を使用し、検出は250nmの吸光を観察した結果、本物質はL−2,5−ジヒドロフェニルアラニンであると同定した。
DHPAの抗菌スペクトラムは液体培地希釈法によって調べた。
培地としては、細菌には3%ブイヨン培地を、酵母・糸状菌には2.5%麦芽汁培地を用いた。DHPAは30mg/mLになるように滅菌した蒸留水に溶解し、希釈して各試験培地に最終濃度1.0mg/mL〜0.97g/mLとなるように添加した。
DHPAの抗菌スペクトラムを表1に示す。最小生育阻止濃度(以下、MICと略す。)の判定は、細菌は30℃で、酵母は25℃で培養し、判定は24時間後に肉眼で行ない、糸状菌については25℃で培養し、判定は48時間後に行なった。
その結果、表から明らかなように、細菌に対してはDHPAは抗菌活性を示さず、酵母に対しては一部を除いてDHPAは抗菌活性を示した。一方、糸状菌に対しては低い濃度でDHPAは抗菌活性を示した。
このDHPAがアスペルギルス・ニガー ATCC6275に対し、低い濃度で抗菌活性を示すことは初めて明らかとなった。
DHPAは、フェニルアラニンと拮抗することが報告されており(Tatuo Yamasitaら、 ジャーナル オブ アンチバイオティクス、23,537(1970)、Dorothy S.Genghof、 カナディアン ジャーナル オブ アンチバイオティクス、16,545(1970)、MaryLou Snowら,ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー、33,1774(1968))、培地のアミノ酸成分によって抗菌活性が低くなっている可能性が考えられた。よって、培地にフェニルアラニンを含まないような合成培地においてDHPAのMICを判定した。
表から明らかなように、細菌や酵母に対しては、DHPAが高濃度で抗菌活性を示した。一方、アスペルギルス・ニガー ATCC6275等の糸状菌に対して、DHPAは低濃度で抗菌活性を示した。
培地として、2.5%麦芽汁培地と前述のツアペック−ドックス培地の2種を用い、アスペルギルスに対するDHPAのMICを調べた。判定は、参考例1に記載した方法と同様にして行なった。結果を表3に示した。
表3から分かるように、2.5%麦芽汁培地においては、DHPAは低い濃度で抗菌活性を示した。しかし、アスペルギルス・フラバス IFO6343、アスペルギルス・フミガツス IFO5840に対しては、DHPAは弱い抗菌活性を示した。一方、ツアペック−ドックス培地を使用すると、アスペルギルス・ニガーに対しては低い濃度のDPHAが抗菌活性を示した。しかし、アスペスギルス・フラバス IFO6343とアスペスギルス・フミガツス IFO5840に対してはDHPAの抗菌活性は認められなかった。
したがって、DHPAはアスペルギルス・ニガーに特異的に抗菌活性を示すことが分かった。
各種塩との共存下でDHPAの抗菌活性を測定した。測定に用いた培地は、酵母ニトロゲンベース、アミノ酸不含(ディフコ社、アメリカ)0.67%とグルコース2.0 %からなるものを使用した。この培地に表4に示す各種塩をそれぞれ添加し、サッカロミセス・セレビシエに対するDHPAのMICを測定した。その結果、サッカロミセス・セレビシエに対しては、DHPAをNa+ 、Li+ 、Mn2+等のイオンを生じる無機塩と共存した状態で用いたときに、抗菌活性は上昇した(表4参照)。すなわち、DHPAは1.2M 塩化ナトリウム、0.6M 硫酸ナトリウム、140mM 塩化リチウム、10mM 塩化マンガンと共存させたときに、抗菌活性が上昇した。しかし、1.2M 塩化カリウムや1.2M ソルビトールと共存した場合には、抗菌活性の上昇は認められなかった。
Claims (2)
- ストレプトミセス属に属する放線菌(FERM P−17418)を培地に培養し、培養物からL−2,5−ジヒドロフェニルアラニンを採取することを特徴とする抗真菌物質の製造方法。
- ストレプトミセス属に属する放線菌FERM P−17418株。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006105925A JP4594267B2 (ja) | 2006-04-07 | 2006-04-07 | 抗真菌物質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006105925A JP4594267B2 (ja) | 2006-04-07 | 2006-04-07 | 抗真菌物質の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000055404A Division JP3811326B2 (ja) | 2000-03-01 | 2000-03-01 | 抗真菌剤とその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006197945A JP2006197945A (ja) | 2006-08-03 |
JP4594267B2 true JP4594267B2 (ja) | 2010-12-08 |
Family
ID=36956468
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006105925A Expired - Fee Related JP4594267B2 (ja) | 2006-04-07 | 2006-04-07 | 抗真菌物質の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4594267B2 (ja) |
-
2006
- 2006-04-07 JP JP2006105925A patent/JP4594267B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2006197945A (ja) | 2006-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hu et al. | Synthesis, characterization and antibacterial activity of guanidinylated chitosan | |
CA1300059C (en) | Antibiotic vermisporin, process for the production thereof and pharmaceutical composition comprising it as an active antibacterial agent | |
US20090257984A1 (en) | Antifungal compositions containing the endophyte fungus alternaria alternata and or its metabolites, as antagonist agents of plasmopara viticola | |
CN110551786A (zh) | 一种提高a40926 b0产量的发酵培养基及其方法 | |
US9879048B2 (en) | Isolation, identification, and uses of antifungal compounds | |
EP0311193B1 (en) | Antifungal fermentation product | |
CN101209952B (zh) | 倍半萜类化合物及其组合物和从植物中提取的方法与其应用 | |
JP3811326B2 (ja) | 抗真菌剤とその利用 | |
JP4594267B2 (ja) | 抗真菌物質の製造方法 | |
Kuvarina et al. | Formation of various antimicrobial peptide emericellipsin isoforms in emericellopsos alkalina under different cultivation conditions | |
WO2013096697A2 (en) | Isolation, identification, and used of antifungal compounds | |
EP3626815B1 (en) | Strain of microorganism clonostachys rosea f. catenulata as a biofungicide, plant growth stimulant and metabolite producer for agricultural use | |
CN102144992B (zh) | 苯基甘氨酸衍生物制备对金黄色葡萄球菌有抑菌和杀菌活性的抗菌剂的用途 | |
US4376778A (en) | Antibiotic substances and processes for production thereof | |
NL8001842A (nl) | Nieuwe antibiotica die istamycinen zijn genoemd, werk- wijzen voor de bereiding van deze antibiotica, alsmede farmaceutische preparaten met werkzaamheid tegen bacterien die deze antibiotica bevatten en werkwijze voor het remmen van de groei van bacterien. | |
EP0178909B1 (en) | Guanidylfungin derivatives and their production | |
CN110478486B (zh) | 一种杀菌药物组合物及其在制备抗真菌生物膜药物中的应用 | |
US20110130357A1 (en) | Aminoglycosides: Synthesis and Use as Antifungals | |
JP2594167B2 (ja) | 新規抗生物質sf2698物質およびその製造法 | |
CN112661814B (zh) | 一种抗菌肽化合物及抗菌肽提取物及其制备方法和用途 | |
Mandal et al. | Production and Characterization of Novel Board-spectrum Antimicrobial 5-butyl-2-pyridine carboxylic acid from Aspergillus fumigatus nHF-01 | |
JP2540671B2 (ja) | 新規微生物生育抑制物質、その製造法および用途 | |
Class et al. | Patent application title: ISOLATION, IDENTIFICATION, AND USES OF ANTIFUNGAL COMPOUNDS Inventors: Eric W. Schmidt (Salt Lake City, UT, US) Eric W. Schmidt (Salt Lake City, UT, US) Joseph O. Falkinham (Blacksburg, VA, US) Peter W. Jeffs (Chapel Hill, NC, US) Assignees: UNIVERSITY OF UTAH RESEARCH FOUNDATION | |
CN100567299C (zh) | 新的抗真菌化合物、制备方法及用途 | |
CN101429202B (zh) | 一种顶头孢菌素及其制法和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20061023 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061023 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070226 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090323 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20090423 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100223 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100415 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100824 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100916 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130924 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |