JP4572572B2 - Process for producing optically active carboxylic acid - Google Patents
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Description
本発明は、微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を利用してα,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二重結合を光学選択的に還元し、光学活性カルボン酸を製造
する方法に関する。光学活性カルボン酸は医薬、農薬の重要な合成中間体である。
The present invention optically selectively reduces the α, β carbon / carbon double bond of α, β-unsaturated carboxylic acid by utilizing the microbial cell, the treated product of the microbial cell and / or the culture solution. The present invention relates to a method for producing an active carboxylic acid. Optically active carboxylic acids are important synthetic intermediates for pharmaceuticals and agricultural chemicals.
下記一般式（Ｉ） The following general formula (I)
で表されるα,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二重結合を光学選択的に還元して
生成する下記一般式（ＩＩ）
The following general formula (II) produced by optically reducing the α, β-carbon / carbon double bond of α, β-unsaturated carboxylic acid represented by
で表される光学活性カルボン酸は、生理活性又は薬理活性成分(医薬品、農薬など)の中間原料として有用な物質である。生理活性成分は光学異性体を選択的に製造することが求められ、該カルボン酸の光学活性体は、さらに有用な中間原料となり得ると考えられる。
しかしながら、微生物を用いて炭素・炭素二重結合を不斉還元する方法は報告が少なく、α,β-不飽和カルボン酸を還元する酵素としてはクロストリジウム（Clostridium）属
微生物由来のエノエートレダクターゼの報告があるが、該酵素で生成する光学活性カルボン酸は本発明で生成する前記一般式（ＩＩ）で表される光学活性カルボン酸とは逆の立体異性体である。（非特許文献１）
また、一般的に化学合成法による炭素・炭素二重結合の不斉還元は、触媒が高価である、触媒残渣の除去等プロセス上煩雑な工程が必要になること、等の難点があり、より安価で簡便な製造法の開発が望まれていた。
However, there are few reports on the asymmetric reduction of carbon / carbon double bonds using microorganisms, and enoate reductase derived from Clostridium microorganisms is the enzyme that reduces α, β-unsaturated carboxylic acids. However, the optically active carboxylic acid produced by the enzyme is a stereoisomer opposite to the optically active carboxylic acid represented by the general formula (II) produced in the present invention. (Non-Patent Document 1)
In general, the asymmetric reduction of carbon / carbon double bonds by chemical synthesis methods has the disadvantages that the catalyst is expensive, complicated processes such as removal of catalyst residues are required, and the like. Development of an inexpensive and simple manufacturing method has been desired.
本発明は、前記一般式（Ｉ）で表されるα,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二
重結合を光学選択的に還元することにより前記一般式（ＩＩ）で表される光学活性カルボン酸を製造する新規な方法を提供することを課題とする。
The present invention is represented by the general formula (II) by optically reducing the α, β carbon / carbon double bond of the α, β-unsaturated carboxylic acid represented by the general formula (I). It is an object of the present invention to provide a novel method for producing an optically active carboxylic acid.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、α,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二重結合を光学選択的に還元する能力を有する微生物を選別し、得ら
れた微生物を用いることにより、α,β-不飽和カルボン酸を基質として光学活性カルボン酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have selected a microorganism having the ability to optically reduce the α, β carbon / carbon double bond of α, β-unsaturated carboxylic acid. The inventors have found that by using the obtained microorganism, optically active carboxylic acid can be efficiently produced using α, β-unsaturated carboxylic acid as a substrate, and the present invention has been completed.
That is, the gist of the present invention is as follows.
（１） 下記一般式(Ｉ) (1) The following general formula (I)
で表されるα,β-不飽和カルボン酸に、クロストリジウム アセチレデュセンス（Clostridium acetireducens）、クロストリジウム バラティ（Clostridium barati）、クロストリジウム カダベリス（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム コクレアリウム（Clostridium cochlearium）、クロストリジウム コクレアタム（Clostridium cocleatum）、クロストリジウム ファラクス（Clostridium fallax）、クロストリジウム ゴニ（Clostridium ghonii）、クロストリジウム ヒラノニス（Clostridium hiranonis）、クロストリジウム ハイドロキシベンゾイカム（Clostridium hydroxybenzoicum）、クロストリジウム イレギュラリス（Clostridium irregularis）、クロストリジウム ラクタティファーメンタンス（Clostridium lactatifermentans）、クロストリジウム レントピュトレセンス（Clostridium lentoputrescens）、クロストリジウム マレノミナタム（Clostridium malenominatum）、クロストリジウム マヨンベイ（Clostridium mayombei）、クロストリジウム オセアニカム（Clostridium oceanicum）、クロストリジウム ペプチディヴォランス（Clostridium peptidivorans）、クロストリジウム プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロストリジウム ピュトリフィカム（Clostridium putrificum）、クロストリジウム スティクランディ（Clostridium sticklandii）、クロストリジウム サブターミナレ(Clostridium subterminale）、クロストリジウム シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム テタノモーファム（Clostridium tetanomorphum）から選択される微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を作用させ、
下記一般式(ＩＩ)
In represented alpha, the β- unsaturated carboxylic acid, Clostridium acetylene les du sense (Clostridium acetireducens), Clostridium Barati (Clostridium barati), Clostridium Kadaberisu (Clostridium cadaveris), Clostridium Kokureariumu (Clostridium cochlearium), Clostridium Kokureatamu (Clostridium cocleatum, Clostridium fallax, Clostridium ghonii, Clostridium hiranonis, Clostridium hydroxybenzoicum, Clostridium irregularisment, Tricium lactis ), Clostridium lentoputrescens, Crost Clostridium malenominatum, Clostridium mayombei, Clostridium oceanicum, Clostridium peptidivorans, Clostridium propionicum, Clostridium propionicum, Clostridium putricum sticklandii), Clostridium subterminale, Clostridium symbiosum, Clostridium tetanomorphum microbial cells, treated cells and / or culture solution,
The following general formula (II)
で表される光学活性カルボン酸を生成させることを特徴とする光学活性カルボン酸の製造方法(一般式（Ｉ）、（II）中、Ｒ1はハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基、フェニル基、メシチル基、ナフチル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ベンジル基、フェネチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基、ベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基、フェニル基、メシチル基、ナフチル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ベンジル基、フェネチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基、またはベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基を示す)。 In during the production process represented optically active carboxylic acid, characterized in that to produce the optically active carboxylic acid (general formula (I), (II), R 1 is a halogen atom, amino group, nitro group, hydroxy group , C1-C8 straight chain, branched chain, cyclic alkyl group, phenyl group, mesityl group, naphthyl group, C1-C4 alkoxy group, benzyl group, phenethyl group, cyanomethyl group, aminomethyl group, hydroxymethyl Group, nitromethyl group, methoxymethyl group, chlorophenyl group, aminophenyl group, hydroxyphenyl group, nitrophenyl group, methoxyphenyl group, benzyloxy group, phenoxy group, trifluoromethoxy group , R 2 and R 3 are each independently Te hydrogen atom, a halogen atom, amino group, nitro group, hydroxy group, a straight-chain having 1 to 8 carbon atoms, branched chain, cyclic alkyl group Phenyl group, a mesityl group, a naphthyl group, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, a benzyl group, a phenethyl group, a cyanomethyl group, aminomethyl group, hydroxymethyl group, nitromethyl group, a methoxymethyl group, chlorophenyl group, aminophenyl group, hydroxy A phenyl group, a nitrophenyl group, a methoxyphenyl group, a benzyloxy group, a phenoxy group, or a trifluoromethoxy group ).
（２） Ｒ2またはＲ3のどちらか一方が水素原子である、（１）に記載の製造方法。
（３） Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2がプロピル基、Ｒ3が水素原子である、（２）
に記載の製造方法。
（４） Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2がフェニル基、Ｒ3が水素原子である、（２）
に記載の製造方法。
(2) The production method according to (1), wherein either R 2 or R 3 is a hydrogen atom.
(3) R 1 is a hydroxymethyl group, R 2 is a propyl group, R 3 is a hydrogen atom, (2)
The manufacturing method as described in.
(4) R 1 is a hydroxymethyl group, R 2 is a phenyl group, and R 3 is a hydrogen atom, (2)
The manufacturing method as described in.
（５）Ｒ１がメチル基、Ｒ２が炭素数１〜４のアルキル基本、Ｒ３が水素原子である、（２）に記載の方法。
(5) The method according to (2), wherein R 1 is a methyl group, R 2 is an alkyl base having 1 to 4 carbon atoms, and R 3 is a hydrogen atom.
本発明によれば、一般式（Ｉ）で表されるα,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素
二重結合を微生物を用いて立体選択的に還元し、一般式（ＩＩ）で表される光学活性カルボン酸を簡便に製造することができる。
According to the present invention, the α, β carbon / carbon double bond of the α, β-unsaturated carboxylic acid represented by the general formula (I) is stereoselectively reduced using a microorganism, and the general formula (II) The optically active carboxylic acid represented by can be easily produced.
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、（１） 下記一般式(Ｉ)
The present invention is described in detail below.
In the present invention, (1) the following general formula (I)
で表されるα,β-不飽和カルボン酸に、該化合物のα,β炭素・炭素二重結合を立体選択
的に還元する能力を有する微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を作用させ、下記一般式(ＩＩ)
A microorganism cell having the ability to stereoselectively reduce the α, β carbon / carbon double bond of the compound to the α, β-unsaturated carboxylic acid represented by The following general formula (II)
で表される光学活性カルボン酸を製造する。
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ1はハロゲン原子、置換されていてもよ
いアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい炭化水素（不飽和結合を有していてもよい。但し、カルボキシル基を除く。）、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい炭化水素（不飽和結合を有していてもよい。但し、カルボキシル基を除く。）、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す。
The optically active carboxylic acid represented by these is manufactured.
In the general formulas (I) and (II), R 1 is a halogen atom, an optionally substituted amino group, a nitro group, a hydroxy group, or an optionally substituted hydrocarbon (having an unsaturated bond). Except for a carboxyl group), an aryl group which may be substituted or an alkoxy group which may be substituted; R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom or a substituted group. An optionally substituted amino group, a nitro group, a hydroxy group, an optionally substituted hydrocarbon (which may have an unsaturated bond, excluding a carboxyl group), and an optionally substituted aryl group Or the alkoxy group which may be substituted is shown.
ここで、炭化水素としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基が挙げられ、アルキル基としては例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−へキシル基等の炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基が挙げられる。アルキル基の中で、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。アリール基としては、例えば、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等が挙げられる。アルコキ
シ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ターシャリーブトキシ基等が挙げられる。アルコキシ基の中で炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。
Here, examples of the hydrocarbon include an alkyl group, an alkenyl group, and an alkynyl group. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a cyclopropyl group, an n-butyl group, and an isobutyl group. Straight chain, branched chain, and cyclic alkyl groups having 1 to 8 carbon atoms such as a group, tertiary butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, tertiary pentyl group, isoamyl group, and n-hexyl group. It is done. Among the alkyl groups, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is preferable, and a methyl group or an ethyl group is particularly preferable. Examples of the aryl group include a phenyl group, a mesityl group, and a naphthyl group. Examples of the alkoxy group include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, an n-butoxy group, an isobutoxy group, and a tertiary butoxy group. Among the alkoxy groups, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms is preferable.
上記アルキル基、アリール基及びアルコキシ基は置換されていてもよい。置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
したがって、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、置換された炭化水素として具体的には、ベンジル基、フェネチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。置換されたアリール基として具体的には、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。置換されたアルコキシ基として具体的には、ベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基等が挙げられる。
The alkyl group, aryl group and alkoxy group may be substituted. The substituent is not particularly limited as long as it does not adversely affect the reaction. Specifically, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group, a halogen group, a cyano group, an amino group, a nitro group, a carboxyl group, and A hydroxyl group etc. are mentioned.
Therefore, in the general formulas (I) and (II), specific examples of the substituted hydrocarbon include a benzyl group, a phenethyl group, a cyanomethyl group, an aminomethyl group, a hydroxymethyl group, a nitromethyl group, and a methoxymethyl group. It is done. Specific examples of the substituted aryl group include a chlorophenyl group, an aminophenyl group, a hydroxyphenyl group, a nitrophenyl group, and a methoxyphenyl group. Specific examples of the substituted alkoxy group include a benzyloxy group, a phenoxy group, and a trifluoromethoxy group.
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はハロゲン原子であって
もよいが、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のR1は、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であり、より好ましくは炭素数１〜４の置換されていてもよいアルキル基であり、特に好ましくはメチル基、エチル基、ヒドロキシメチル基である。
In the general formulas (I) and (II), R 1 , R 2 and R 3 may be a halogen atom, and examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom and a bromine atom.
R 1 in the general formulas (I) and (II) is preferably an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a benzyl group or a phenyl group, and more preferably an optionally substituted group having 1 to 4 carbon atoms. An alkyl group, particularly preferably a methyl group, an ethyl group, or a hydroxymethyl group.
また、R2およびR3として、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４の置換されていてもよいアルキル基、炭素数１〜４の置換されていてもよいアルコキシ基、ベンジル基またはフェニル基であり、より好ましくは水素原子、炭素数１〜４の置換されていてもよいアルキル基である。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは７５０以下、より好ましくは５００以下のものであり、具体的には、例えば２−ヒドロキシメチル−２−ブテン酸、２−ヒドロキシメチル−２−ペンテン酸、２−ヒドロキシメチル−２−ヘキセン酸、２−ヒドロキシメチル−２−ヘプテン酸、２−ヒドロキシメチル−２−オクテン酸、２−ヒドロキシメチル桂皮酸、チグリン酸、２−メチル−２−ペンテン酸、２−メチル−２−ヘキセン酸、２−メチル−２−ヘプテン酸、２−メチル−２−オクテン酸等が挙げられる。
R 2 and R 3 are preferably a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally substituted amino group, a nitro group, a hydroxy group, an optionally substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or 1 carbon atom. -4 is an optionally substituted alkoxy group, benzyl group or phenyl group, more preferably a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
The compound represented by the general formula (I) has a molecular weight of 1000 or less, preferably 750 or less, more preferably 500 or less. Specifically, for example, 2-hydroxymethyl-2-butenoic acid, 2-hydroxymethyl-2-pentenoic acid, 2-hydroxymethyl-2-hexenoic acid, 2-hydroxymethyl-2-heptenoic acid, 2-hydroxymethyl-2-octenoic acid, 2-hydroxymethylcinnamic acid, tiglic acid, Examples include 2-methyl-2-pentenoic acid, 2-methyl-2-hexenoic acid, 2-methyl-2-heptenoic acid, and 2-methyl-2-octenoic acid.
上記一般式(Ｉ)で表される化合物は、欧州特許第９０６９０１号明細書、欧州特許第９３７７１０号明細書、仏国特許発明第２７７２０２７号明細書、第4版実験化学講座（１
９巻、ｐ６２、１９９２年）等に記載されているような公知の方法に準じてまたはそれらの組み合わせにより、容易に合成することができる。
本発明の方法において、上記一般式（Ｉ）で表される化合物に、後述する微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を作用させ、該化合物の炭素・炭素二重結合を立体選択的に還元し、上記一般式（ＩＩ）で表される化合物を生成させる。
The compounds represented by the above general formula (I) are described in European Patent No. 906901, European Patent No. 937710, French Patent Invention No. 2772027, Fourth Edition Experimental Chemistry Course (1
9 (p. 62, 1992), etc., or can be easily synthesized according to a known method or a combination thereof.
In the method of the present invention, the compound represented by the above general formula (I) is allowed to act on the microorganisms described later, the treated product of the microorganisms and / or the culture solution, and the carbon-carbon double bond of the compound is allowed to react. Stereoselective reduction is performed to produce a compound represented by the above general formula (II).
上記一般式（ＩＩ）で表される化合物としては、具体的には、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチル酪酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチル吉草酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘプタン酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルオクタン酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸、（Ｓ）−２−メチル酪酸、（Ｓ）−２−メチル吉草酸、（Ｓ）−２−メチルヘキサン酸、（Ｓ）−２−メチルヘプタン酸、（Ｓ）−２−メチルオクタン酸等が挙げられる。 Specific examples of the compound represented by the general formula (II) include (R) -2-hydroxymethylbutyric acid, (R) -2-hydroxymethylvaleric acid, and (R) -2-hydroxymethylhexanoic acid. (R) -2-hydroxymethylheptanoic acid, (R) -2-hydroxymethyloctanoic acid, (R) -2-hydroxymethyl-3-phenylpropionic acid, (S) -2-methylbutyric acid, (S) Examples include 2-methylvaleric acid, (S) -2-methylhexanoic acid, (S) -2-methylheptanoic acid, (S) -2-methyloctanoic acid, and the like.
（本発明に用いられる微生物）
本発明に用いることの出来る微生物としては、α,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・
炭素二重結合を立体選択的に還元する能力（以下これを「立体選択的還元活性」と略称することがある。）を有するものであれば特に限定されない。α,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する微生物は、該微生物が有す
る立体選択的還元活性を確認することにより選別することができ、立体選択的還元活性を確認方法としては、例えば、式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸を含む水溶液に対象となる微生物、その菌体処理物又は培養液を作用させ、その反応液を薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーを用い、基質および生成物である式（ＩＩ）の光学活性カルボン酸を定性・定量することによりスクリーニングすることができる。
(Microorganism used in the present invention)
Examples of microorganisms that can be used in the present invention include α, β carbons of α, β-unsaturated carboxylic acids,
There is no particular limitation as long as it has the ability to reduce the carbon double bond in a stereoselective manner (hereinafter sometimes referred to as “stereoselective reduction activity”). Microorganisms capable of stereoselectively reducing α, β-carbon / carbon double bonds of α, β-unsaturated carboxylic acids can be selected by confirming the stereoselective reducing activity of the microorganism. As a method for confirming the stereoselective reduction activity, for example, the target microorganism, its treated cell or culture solution is allowed to act on an aqueous solution containing the α, β-unsaturated carboxylic acid of the formula (I), and the reaction The liquid can be screened by qualitatively quantifying the substrate and the product optically active carboxylic acid of the formula (II) using thin layer chromatography, gas chromatography or liquid chromatography.
本発明に用いることのできる微生物は、上記立体選択的還元活性の確認方法に供し、数時間以上、好ましくは１日以上反応させたときに原料基質の減少が確認しうるもの、具体的には、数時間以上、好ましくは１日以上反応させたときに原料基質が１％以上、好ましくは５％以上減少するものである。
式（Ｉ）の化合物を立体選択的に還元し、式（ＩＩ）の 光学活性カルボン酸を製造す
る能力を有する微生物としては、例えばクロストリジウム(Clostridium)属に属する微生
物が挙げられる。
The microorganism that can be used in the present invention is subjected to the above-described method for confirming the stereoselective reduction activity, and can be confirmed to have a decrease in raw material substrate when reacted for several hours or more, preferably one day or more. When the reaction is carried out for several hours or more, preferably one day or more, the raw material substrate is reduced by 1% or more, preferably 5% or more.
Examples of the microorganism having the ability to stereoselectively reduce the compound of formula (I) and produce the optically active carboxylic acid of formula (II) include microorganisms belonging to the genus Clostridium.
クロストリジウム(Clostridium)属に属する微生物として、好ましくは、クロストリジ
ウム アセチレデュセンス（Clostridium acetireducens） DSM10703等のクロストリジ
ウム アセチレデュセンス（Clostridium acetireducens）、クロストリジウム バラテ
ィ（Clostridium barati） JCM1385等のクロストリジウム バラティ（Clostridium barati）、クロストリジウム バーケリ（Clostridium barkeri） DSM1223等のクロストリジ
ウム バーケリ（Clostridium barkeri）、クロストリジウム カダベリス（Clostridium
cadaveris） JCM1392等のクロストリジウム カダベリス（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム コクレアリウム（Clostridium cochlearium） JCM1396等のクロストリジウム コクレアリウム（Clostridium cochlearium）、クロストリジウム コクレア
タム（Clostridium cocleatum） JCM1397等のクロストリジウム コクレアタム（Clostridium cocleatum）、クロストリジウム ファラクス（Clostridium fallax） JCM1398等のクロストリジウム ファラクス（Clostridium fallax）、クロストリジウム ゴニ（Clostridium ghonii） JCM1400等のクロストリジウム ゴニ（Clostridium ghonii）、ク
ロストリジウム グリコリカム（Clostridium glycolicum） JCM1401等のクロストリジ
ウム グリコリカム（Clostridium glycolicum）、クロストリジウム ヒラノニス（Clostridium hiranonis） JCM10541等のクロストリジウム ヒラノニス（Clostridium hiranonis）、クロストリジウム ハイドロキシベンゾイカム（Clostridium hydroxybenzoicum） DSM7310等のクロストリジウム ハイドロキシベンゾイカム（Clostridium hydroxybenzoicum）、クロストリジウム イレギュラリス（Clostridium irregularis） JCM1425等
のクロストリジウム イレギュラリス（Clostridium irregularis）、クロストリジウム
ラクタティファーメンタンス（Clostridium lactatifermentans） DSM14214等のクロストリジウム ラクタティファーメンタンス（Clostridium lactatifermentans）、クロス
トリジウム レントピュトレセンス（Clostridium lentoputrescens） DSM2153等のクロ
ストリジウム レントピュトレセンス（Clostridium lentoputrescens）、クロストリジ
ウム マレノミナタム（Clostridium malenominatum） JCM1405等のクロストリジウム
マレノミナタム（Clostridium malenominatum）、クロストリジウム マンゲノティ（Clostridium mangenotii） JCM1428等のクロストリジウム マンゲノティ（Clostridium mangenotii）、クロストリジウム マヨンベイ（Clostridium mayombei） DSM6539等のクロストリジウム マヨンベイ（Clostridium mayombei）、クロストリジウム オセアニカム（Clostridium oceanicum） JCM1407等のクロストリジウム オセアニカム（Clostridium oceanicum）、クロストリジウム ペプチディヴォランス（Clostridium peptidivorans） DSM12505等のクロストリジウム ペプチディヴォランス（Clostridium peptidivoran
s）、クロストリジウム プロピオニカム（Clostridium propionicum） JCM1430等のク
ロストリジウム プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロストリジウム ピ
ュトリフィカム（Clostridium putrificum） JCM1410等のクロストリジウム ピュトリ
フィカム（Clostridium putrificum）、クロストリジウム スカトロゲネス（Clostridium scatokogenes） JCM1414等のクロストリジウム スカトロゲネス（Clostridium scatokogenes）、クロストリジウム スティクランディ（Clostridium sticklandii） JCM1433等のクロストリジウム スティクランディ（Clostridium sticklandii）、クロストリジウム サブターミナレ（Clostridium subterminale） JCM1417等のクロストリジウム
サブターミナレ（Clostridium subterminale）、クロストリジウム シンビオサム（Clostridium symbiosum） JCM1297等のクロストリジウム シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム テタノモーファム（Clostridium tetanomorphum） DSM4474等のクロストリジウム テタノモーファム（Clostridium tetanomorphum）などが挙げられる。
As microorganisms belonging to the genus Clostridium, Clostridium acetireducens (Clostridium acetireducens) such as DSM10703, Clostridium acetireducens (Clostridium barati) Clostridium barati (Clostridium barati) (CCM) , Clostridium barkeri DSM1223 and other Clostridium barkeri, Clostridium Cadaberis (Clostridium)
Clostridium cadaveris such as JCM1392, Clostridium cochlearium such as JCM1396, Clostridium cochlearium such as Clostridium cocleatum Clostridium cocleatum fallax Clostridium fallax such as JCM1398, Clostridium ghonii such as JCM1400, Clostridium ghonii such as JCM1400, Clostridium glycolicum such as Clostridium glycolicum (Clostridium glycolicum) Clostridium hiranonis such as JCM10541 Clostridium hydroxybenzoicum DSM7310, etc. Clostridium hydroxybenzoicum, Clostridium irregularis JCM1425, etc. Clostridium lactatifermentans (Clostridium lactatifermentans), Clostridium lentoputrescens DSM2153 (Clostridium lentoputrescens), Clostridium malenominatum (Clostridium malenominatum) JCM1405, etc.
Clostridium malenominatum, Clostridium mangenotii JCM1428, etc. Clostridium mangenotii, Clostridium mayombei DSM6539, etc. Clostridium mayomtridium, 407 Clostridium oceanicum), Clostridium peptidivorans DSM12505, etc. Clostridium peptidivoran
s), Clostridium propionicum JCM1430, etc. Clostridium propionicum, Clostridium putrificum JCM1410 etc., Clostridium putrificum, etc. 414 scatokogenes), Clostridium sticklandii JCM1433 and other Clostridium sticklandii, Clostridium subterminale JCM1417 and other Clostridium
Clostridium subterminale, Clostridium symbiosum JCM1297 etc. Clostridium symbiosum, Clostridium tetanomorphum DSM4474 etc.
尚、上記微生物はJapan Collection of Microorganism(JCM)のインターネットカタログ( HYPERLINK http://www.jcm.riken.go.jp) http://www.jcm.riken.go.jp)、またはDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)のインターネットカタログ(http://www.dsmz.de/)に記載されており、該JCMまたはDSMZから入手することができる。 The above microorganisms can be obtained from Japan Collection of Microorganism (JCM) Internet catalog (HYPERLINK http://www.jcm.riken.go.jp) http://www.jcm.riken.go.jp) or Deutsche Sammlung von It is described in the Internet catalog (http://www.dsmz.de/) of Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) and can be obtained from the JCM or DSMZ.
また、上記微生物は、ＵＶ照射やニトロソグアニジン処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
また、組換え株の発現株としては、もとの菌株の他、大腸菌等のバクテリアや酵母などを用いてもよく、これらの組換え株も上記微生物という概念に含まれる。
The microorganism is any strain such as a mutant obtained by normal mutation treatment such as UV irradiation or nitrosoguanidine treatment, or a recombinant strain induced by a genetic technique such as cell fusion or gene recombination. There may be.
In addition to the original strain, bacteria such as Escherichia coli and yeast may be used as expression strains of the recombinant strain, and these recombinant strains are also included in the concept of the microorganism.
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体、菌体処理物及び／又は培養液として用いられる。
具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体又はその培養液をそのまま用いることや、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、風乾または凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的、化学的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。
In the production method of the present invention, one kind or two or more kinds of the above microorganisms are used as the microbial cells, the treated microbial cells and / or the culture solution.
Specifically, the microbial cells obtained by culturing the above microorganisms or the culture solution thereof are used as they are, or the microbial cells obtained by culturing are treated by a known method, that is, those treated with acetone. In addition, a treated product of cells such as those obtained by air-drying or freeze-drying, or those obtained by physically, chemically or enzymatically disrupting cells can be used.
また、これらの菌体または菌体処理物から、式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸に作用し式（ＩＩ）の光学活性カルボン酸に変換するする能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等を通常の固定化技術を用いて、すなわち、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。 In addition, an enzyme fraction having the ability to act on the α, β-unsaturated carboxylic acid of the formula (I) and convert it to the optically active carboxylic acid of the formula (II) is crudely prepared from these cells or the treated cells. It is also possible to take it out as a product or a purified product. Furthermore, the cells obtained in this way, the treated cells, the enzyme fraction, etc., are used by using a general immobilization technique, that is, those immobilized on a carrier such as polyacrylamide or carrageenan gel. It is also possible. Therefore, in the present specification, the term “bacteria and / or treated product thereof” is used as a concept containing all of the above-mentioned cells, treated product, enzyme fraction, and immobilized products thereof.
また、上記微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については定法通り行うことができる。本微生物の培養の為に用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、サッカロース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、大豆抽出物などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム塩、硝酸アンモニウム塩などの無機窒素源、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。培養はｐＨ約３〜１０、好
ましくはｐＨ６〜８、温度４〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃の適当な範囲に制御しつつ１〜１００時間行う。
Moreover, although the said microorganisms are normally used after culture | cultivation, this culture | cultivation can be performed as usual. The medium used for culturing the microorganism includes a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and the like that can be assimilated by the microorganism. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose and saccharose, polyalcohols such as glycerol, mannitol, xylitol and ribitol, organic acids and the like are appropriately used. As the nitrogen source, organic nitrogen sources such as NZ amine, tryptose, yeast extract, polypeptone, meat extract and soybean extract, or inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate and ammonium nitrate, and the like are appropriately used. As the inorganic ions, phosphate ions, magnesium ions, iron ions, manganese ions, molybdenum ions and others are appropriately used as necessary. The culture is performed for 1 to 100 hours while controlling the pH within a suitable range of about 3 to 10, preferably pH 6 to 8, temperature 4 to 80 ° C, preferably 25 to 60 ° C.
上記微生物がClostridium属のように偏性嫌気性菌の場合は、培地にシステイン、チオ
グリコール酸、Na2Sまたはアスコルビン酸のような還元剤を添加することが効果的であり、培養はCO2やN2気流を通気して酸素を除去する必要がある。上記微生物が通性嫌気性菌
または好気性菌の場合は好気的条件下で培養することにより、培養液あたりの菌体量、酵素活性量を増加することも可能である。
If the microorganism is anaerobic bacteria as Clostridium genus, cysteine medium, thioglycolic acid, it is effective to add a reducing agent such as Na 2 S or ascorbic acid, culturing CO 2 Or it is necessary to ventilate N 2 air flow to remove oxygen. When the microorganism is a facultative anaerobe or aerobic bacterium, it is possible to increase the amount of bacterial cells and the amount of enzyme activity per culture solution by culturing under aerobic conditions.
(製造方法)
次に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
本発明の製造方法は、原料として式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸を用い、これに水性媒体中で上記微生物の菌体、該菌体処理物及び／又は培養液を作用させて、式（ＩＩ）の光学活性カルボン酸を製造するものである。
(Production method)
Next, the production method of the present invention will be specifically described.
The production method of the present invention uses the α, β-unsaturated carboxylic acid of the formula (I) as a raw material, and causes the cells of the microorganism, the treated product of the cells and / or the culture solution to act on this in an aqueous medium. Thus, an optically active carboxylic acid of the formula (II) is produced.
反応の方法としては、ａ)上記培養微生物の菌体、該菌体処理物及び／又は培養液と式
（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸とを水性媒体中で接触させる方法、ｂ) 式（Ｉ）のα,
β-不飽和カルボン酸含有培地を用い、培養と反応を同時に行う方法等が挙げられ、これ
らは適宜用いることができるが、工業的には、微生物増殖に転用されるエネルギーロスが無い方が好ましいため、上記ａ)の方法が好ましい。
As a method of reaction, a) a method of contacting the cells of the above-mentioned cultured microorganism, the treated product of the cells and / or the culture solution with the α, β-unsaturated carboxylic acid of the formula (I) in an aqueous medium, b ) In formula (I),
Examples include a method in which a β-unsaturated carboxylic acid-containing medium is used and culture and reaction are performed simultaneously. These can be used as appropriate, but industrially, it is preferable that there is no energy loss that is diverted to microbial growth. Therefore, the method a) is preferable.
反応系中での式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸の濃度は０．０００１〜５０％(ｗ／
ｖ)、好ましくは０．０１〜５％(ｗ／ｖ)、の範囲が望ましく、必要ならば反応の間、α,β-不飽和カルボン酸は逐次添加してもよい。
上記水性媒体としては、リン酸カリウムやトリス−塩酸塩等を含有する緩衝能力を有する水溶液が一般的には用いられるが、反応中、ｐＨをモニターし、塩酸や水酸化ナトリウム等の酸・アルカリによりｐＨ変化を制御するのであれば緩衝成分を省略することもできる。
The concentration of α, β-unsaturated carboxylic acid of formula (I) in the reaction system is 0.0001-50% (w /
v), preferably in the range of 0.01-5% (w / v), is desired, and the α, β-unsaturated carboxylic acid may be added sequentially during the reaction if necessary.
As the aqueous medium, an aqueous solution having a buffering capacity containing potassium phosphate, tris-hydrochloride or the like is generally used. However, during the reaction, the pH is monitored, and an acid / alkali such as hydrochloric acid or sodium hydroxide is used. If the pH change is controlled by this, the buffer component can be omitted.
また、基質の溶解度を増加させるためメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド等の親水性溶媒を添加してもよいし、同じ目的でTween80や
シュガーエステルのような界面活性剤を添加してもよい。
さらに、基質や生成物による反応阻害を抑えるために反応液の０．１〜１０倍容量程度の酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘキサン、イソプロピルエーテル、四塩化炭素、１―オクタノール等の疎水性溶媒を添加することもできる。
In order to increase the solubility of the substrate, hydrophilic solvents such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetone, dioxane, acetonitrile, tetrahydrofuran, dimethylformamide, and dimethyl sulfoxide may be added. For the same purpose, Tween 80 and sugar A surfactant such as an ester may be added.
In addition, hydrophobic solvents such as ethyl acetate, butyl acetate, hexane, isopropyl ether, carbon tetrachloride, and 1-octanol are added in an amount of 0.1 to 10 times the volume of the reaction solution to suppress reaction inhibition by substrates and products. You can also
反応液中には還元反応のエネルギー源としてグルコース、エタノール、イソプロピルアルコール、蟻酸等が基質の１〜２０倍モル等量含まれていることが好ましい。
また、還元反応において補酵素として利用される酸化型または還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(
ＮＡＤＰ)を０．００１〜０．１％(ｗ／ｖ)、添加すると効果的である。
It is preferable that glucose, ethanol, isopropyl alcohol, formic acid and the like are contained in the reaction solution in an amount of 1 to 20 mole equivalents of the substrate as an energy source for the reduction reaction.
Further, oxidized or reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NAD) used as a coenzyme in the reduction reaction (
It is effective to add NADP) in an amount of 0.001 to 0.1% (w / v).
さらに、補酵素の還元型への再生を促進するために、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、蟻酸脱水素酵素等を添加することも効果的である。
反応条件は、微生物の種類によっても異なるが、通常４〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃、さらに好ましくは２８〜４２℃の範囲で行い、ｐＨは通常３〜１０、好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜８の範囲で行う。
Furthermore, it is also effective to add glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, formate dehydrogenase, etc. in order to promote the regeneration of the coenzyme to the reduced form.
The reaction conditions vary depending on the type of microorganism, but are usually 4 to 70 ° C, preferably 20 to 50 ° C, more preferably 28 to 42 ° C, and the pH is usually 3 to 10, preferably 5 to 9, More preferably, it is performed in the range of 6-8.
反応形態としては、バッチ法でも連続法でも何れでも構わないが、連続法の場合には、
式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸、微生物の培養液、菌体及び／または該菌体処理物を、必要に応じて、適宜添加して行われ、また、目的生成物から分離された菌体をリサイクル使用しても良い。
上記反応で得られた光学活性カルボン酸の採取方法としては、微生物などの固形分を遠心分離、フィルタープレス、限外濾過などの通常の分離装置によりを除去した後に反応液を有機溶媒による抽出、晶析、カラムクロマトグラフィー、濃縮、蒸留などの分離精製手段に供することにより分離することができ、分離精製手段は単独でまたは複数の手段を組み合わせて利用できる。
The reaction form may be either a batch method or a continuous method, but in the case of a continuous method,
The α, β-unsaturated carboxylic acid of the formula (I), the culture solution of the microorganism, the microbial cell and / or the processed microbial cell product are appropriately added as necessary and separated from the target product. Recycled cells may be used.
As a method for collecting the optically active carboxylic acid obtained by the above reaction, solids such as microorganisms are removed by a normal separation device such as centrifugal separation, filter press, and ultrafiltration, and then the reaction solution is extracted with an organic solvent. Separation and purification can be performed by subjecting to separation and purification means such as crystallization, column chromatography, concentration, and distillation, and the separation and purification means can be used alone or in combination of a plurality of means.
抽出に用いる有機溶媒としては、例えばブタノールなどのアルコール類、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン等の炭化水素類、クロロホルム、塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸ノルマルブチルなどのエステル類、ケトン類、エーテル類、これらの混合溶媒などが利用できる。
［実施例］
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
Examples of the organic solvent used for extraction include alcohols such as butanol, hydrocarbons such as hexane, cyclohexane and toluene, halogenated hydrocarbons such as chloroform and methylene chloride, esters such as ethyl acetate and normal butyl acetate, ketones , Ethers, and mixed solvents thereof can be used.
[Example]
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, ordinary changes in the technical field of the present invention can be made without departing from the gist thereof.
＜クロストリジウム属細菌による（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸の生成＞
GAMブイヨン培地（日水製薬社製）にクロストリジウム オセアニカム（Clostridium oceanicum） JCM1407株を接種し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃
で72時間静置して培養した。培養終了後，培養液(５ｍＬ)を集め、遠心分離し菌体を単離した。該菌体を２−ヒドロキシメチル−２−ヘキセン酸 10mM、グルコース20mM、リン酸カリウムバッファー 100mM(pH7.5)からなる反応液200μＬに懸濁し、アネロパック・ケ
ンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で静置して反応させた。反応開始18時間後６Ｎ ＨＣｌを10μＬを添加し、酢酸エチル500μLで抽出後、酢酸エチル層を遠心エバポレーターで乾固させた。得られたサンプルをヒドロキシカルボン酸分析キット（ＹＭＣ社製）で誘導体化し、ＨＰＬＣにて分析を行った。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
<Production of (R) -2-hydroxymethylhexanoic acid by Clostridium bacteria>
GAM bouillon medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) is inoculated with Clostridium oceanicum JCM1407 strain, 37 ° C in Aneropac Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.)
And cultured for 72 hours. After completion of the culture, the culture solution (5 mL) was collected and centrifuged to isolate the cells. The cells were suspended in 200 μL of a reaction solution consisting of 10 mM 2-hydroxymethyl-2-hexenoic acid, 20 mM glucose, and 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), and 37 in Aneropac Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) The reaction was allowed to stand at 0 ° C. 18 hours after the start of the reaction, 10 μL of 6N HCl was added and extracted with 500 μL of ethyl acetate, and then the ethyl acetate layer was dried to dryness with a centrifugal evaporator. The obtained sample was derivatized with a hydroxycarboxylic acid analysis kit (manufactured by YMC) and analyzed by HPLC. The conditions of HPLC are as follows.
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ （ダイセル社製、４．６×２５０ｍｍ、３０℃）
溶離液：Ｈｅｘａｎｅ／２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ ＝ ９０／１０、０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ４００ｎｍ
この結果、本反応での（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸の生成濃度は３．９８ｍMであり、光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
Column: Chiralpak AD-H (manufactured by Daicel Corporation, 4.6 × 250 mm, 30 ° C.)
Eluent: Hexane / 2-Propanol = 90/10, 0.8 ml / min
Detection: UV400nm
As a result, the production concentration of (R) -2-hydroxymethylhexanoic acid in this reaction was 3.98 mM, and the optical purity was 99% e.e. e. That was all.
また、その他のクロストリジウム属細菌の菌株についても同様の試験を行い、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸の収量、光学純度を下記にまとめた。 Moreover, the same test was done about the strain of other Clostridium bacteria, and the yield and optical purity of (R) -2-hydroxymethylhexanoic acid were summarized below.
本結果より、２−ヒドロキシメチル−２−ヘキセン酸から、クロストリジウム属細菌により（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸が効率よく、高光学純度で生成できることが明らかになった。 From this result, it was clarified that (R) -2-hydroxymethylhexanoic acid can be efficiently produced from 2-hydroxymethyl-2-hexenoic acid by a Clostridium bacterium with high optical purity.
＜クロストリジウム属細菌による（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の生成＞
GAMブイヨン培地（日水製薬社製）にクロストリジウム コクレアリウム（Clostridium
cochlearium） JCM1396株を接種し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で72時間静置して培養した。培養終了後，培養液(５ｍＬ)を集め、遠心分離し菌体を
単離した。該菌体を２−ヒドロキシメチル桂皮酸 10mM、グルコース20mM、リン酸カリウムバッファー 100mM(pH7.5)からなる反応液200μＬに懸濁し、アネロパック・ケンキ（
三菱ガス化学社製）中、37℃で静置して反応させた。反応開始18時間後６Ｎ ＨＣｌを10μＬを添加し、酢酸エチル500μLで抽出後、酢酸エチル層を遠心エバポレーターで乾固させた。定量は乾固サンプルの２−プロパノール溶液を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
<Production of (S) -2-hydroxymethyl-3-phenylpropionic acid by Clostridium bacteria>
GAM bouillon medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and Clostridium (Clostridium)
cochlearium) JCM1396 strain was inoculated and cultured in Aneropac Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company) at 37 ° C for 72 hours. After completion of the culture, the culture solution (5 mL) was collected and centrifuged to isolate the cells. The cells were suspended in 200 μL of a reaction solution consisting of 10 mM 2-hydroxymethylcinnamic acid, 20 mM glucose, and 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5).
(Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) and allowed to react at 37 ° C. 18 hours after the start of the reaction, 10 μL of 6N HCl was added and extracted with 500 μL of ethyl acetate, and then the ethyl acetate layer was dried to dryness with a centrifugal evaporator. Quantification was performed by measuring a dry sample of 2-propanol solution using liquid chromatography (HPLC). The conditions of HPLC are as follows.
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５ＰＹＥ （ナカライテスク社製） ４０℃
溶離液：０．０５％（ｖ／ｖ） リン酸水溶液／アセトニトリル＝７０／３０
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
また、２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の光学純度は特開平１１−１０６３６３号公報に記載の方法で測定することができる。
Column: COSMOSIL 5PYE (manufactured by Nacalai Tesque) 40 ° C
Eluent: 0.05% (v / v) phosphoric acid aqueous solution / acetonitrile = 70/30
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV254nm
The optical purity of 2-hydroxymethyl-3-phenylpropionic acid can be measured by the method described in JP-A-11-106363.
この結果、本反応での（S）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の生
成濃度は８．２１ｍMであり、光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
As a result, the production concentration of (S) -2-hydroxymethyl-3-phenylpropionic acid in this reaction was 8.21 mM, and the optical purity was 99% e.e. e. That was all.
＜クロストリジウム属細菌による（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成＞
GAMブイヨン培地（日水製薬社製）にクロストリジウム コクレアリウム（Clostridium
cochlearium） JCM1396株を接種し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で72時間静置して培養した。培養終了後，培養液(５ｍＬ)を集め、遠心分離し菌体を
単離した。該菌体をチグリン酸 50mM、グルコース100mM、リン酸カリウムバッファー 1
00mM(pH7.5)からなる反応液200μＬに懸濁し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で静置して反応させた。反応開始18時間後６Ｎ ＨＣｌを10μＬを添加し、酢酸エチル500μLで抽出後、酢酸エチル層をGCにて分析した。GCの条件は以下の通りである。
<Production of (S) -2-methylbutyric acid by Clostridium bacteria>
GAM bouillon medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and Clostridium (Clostridium)
cochlearium) JCM1396 strain was inoculated and cultured in Aneropac Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company) at 37 ° C for 72 hours. After completion of the culture, the culture solution (5 mL) was collected and centrifuged to isolate the cells. The microbial cells were tiglic acid 50 mM, glucose 100 mM, potassium phosphate buffer 1
The suspension was suspended in 200 μL of a reaction solution consisting of 00 mM (pH 7.5), and allowed to stand at 37 ° C. in Aneropac Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company). 18 hours after the start of the reaction, 10 μL of 6N HCl was added, extracted with 500 μL of ethyl acetate, and the ethyl acetate layer was analyzed by GC. The GC conditions are as follows.
カラム：β−ＤＥＸ１２０ （ＳＵＰＥＬＣＯ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍ ｆｉｌｍ）
キャリア：Ｈｅ １．５ｍｌ／ｍｉｎ、 ｓｐｌｉｔ １／５０
カラム温度：１２０℃
注入温度：２５０℃
検出：ＦＩＤ ２５０℃
ＧＣ：島津ＧＣ−１４Ａ（島津製作所社製）
この結果、本反応での（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成濃度は３９．９ｍMであり、光学
純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
Column: β-DEX120 (SUPELCO, 30 m × 0.25 mm ID, 0.25 μm film)
Carrier: He 1.5 ml / min, split 1/50
Column temperature: 120 ° C
Injection temperature: 250 ° C
Detection: FID 250 ° C
GC: Shimadzu GC-14A (manufactured by Shimadzu Corporation)
As a result, the production concentration of (S) -2-methylbutyric acid in this reaction was 39.9 mM, and the optical purity was 99% e.e. e. That was all.
また、その他の菌株についても同様の試験を行い、（Ｓ）−２−メチル酪酸の収量、光学純度を下記にまとめた。 Moreover, the same test was done about other strains, and the yield and optical purity of (S) -2-methylbutyric acid were summarized below.
本結果より、チグリン酸から、クロストリジウム属細菌により（Ｓ）−２−メチル酪酸
が効率よく、高光学純度で生成できることが明らかになった。
From this result, it was revealed that (S) -2-methylbutyric acid can be efficiently produced from tiglic acid by Clostridium bacteria with high optical purity.
＜クロストリジウム属細菌による（Ｓ）−２−メチル吉草酸の生成＞
GAMブイヨン培地（日水製薬社製）にクロストリジウム コクレアリウム（Clostridium
cochlearium） JCM1396株を接種し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で72時間静置して培養した。培養終了後，培養液(５ｍＬ)を集め、遠心分離し菌体を
単離した。該菌体を２−メチル−２−ペンテン酸 10mM、グルコース20mM、リン酸カリウムバッファー 100mM(pH7.5)からなる反応液200μＬに懸濁し、アネロパック・ケンキ（
三菱ガス化学社製）中、37℃で静置して反応させた。反応開始18時間後６Ｎ ＨＣｌを10μＬを添加し、酢酸エチル500μLで抽出後、酢酸エチル層をGCにて分析した。GCの条件は欧州特許第１２９１４３５号明細書に記載の方法に従った。
<Production of (S) -2-methylvaleric acid by Clostridium bacteria>
GAM bouillon medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and Clostridium (Clostridium)
cochlearium) JCM1396 strain was inoculated and cultured in Aneropac Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company) at 37 ° C for 72 hours. After completion of the culture, the culture solution (5 mL) was collected and centrifuged to isolate the cells. The cells were suspended in 200 μL of a reaction solution consisting of 2-methyl-2-pentenoic acid 10 mM, glucose 20 mM, and potassium phosphate buffer 100 mM (pH 7.5).
(Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) and allowed to react at 37 ° C. 18 hours after the start of the reaction, 10 μL of 6N HCl was added, extracted with 500 μL of ethyl acetate, and the ethyl acetate layer was analyzed by GC. The GC conditions followed the method described in EP 1291435.
この結果、本反応での（Ｓ）−２−メチル吉草酸の生成濃度は３．１１ｍMであり、光
学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
また、その他の菌株についても同様の試験を行い、（Ｓ）−２−メチル吉草酸の収量、光学純度を下記にまとめた。
As a result, the production concentration of (S) -2-methylvaleric acid in this reaction was 3.11 mM, and the optical purity was 99% e.e. e. That was all.
Moreover, the same test was done about other strains, and the yield and optical purity of (S) -2-methylvaleric acid were summarized below.
本結果より、２−メチル−２−ペンテン酸から、クロストリジウム属細菌により（Ｓ）−２−メチル吉草酸が効率よく、高光学純度で生成できることが明らかになった。
From this result, it was revealed that (S) -2-methylvaleric acid can be efficiently produced from 2-methyl-2-pentenoic acid by Clostridium bacteria with high optical purity.
Claims (5)
下記一般式(ＩＩ)
The following general formula (II)
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