JP2005027552A - New method for producing optically active 2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new method for inexpensively and simply producing an optically active (S)-2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid in high optical purity. <P>SOLUTION: The (S)-2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by general formula (II) (R<SB>1</SB>-R<SB>5</SB>are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a hydroxy group, an alkyl group which may be substituted, an aryl group which may be substituted or an alkoxy group which may be substituted) is produced by treating a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative represented by general formula (1) with enoate reductase, a cell containing enoate reductase, a preparation of the cell or a culture solution obtained by culturing the cell. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）
【化４】

で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を生成させることを特徴とする、一般式（ＩＩ）で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸の製造方法（一般式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒ_１〜Ｒ_５はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す）。
（２） エノエートレダクターゼが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質である、（１）の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（３） エノエートレダクターゼを含む細胞が、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞である、（１）の製造方法。
（４） エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換された細胞である、（３）の製造方法。
（５） エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞である、（３）の製造方法。
（６） エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである、（３）〜（５）のいずれかの製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（７） エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に示すＤＮＡである、（３）〜（５）のいずれかの製造方法：
（Ｄ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または
（Ｅ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８） 一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物において、Ｒ_１〜Ｒ_５が全て水素原子であることを特徴とする、（１）〜（７）のいずれかの製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）
【化５】

で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に作用させることにより、該化合物の炭素・炭素二重結合を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）
【化６】

で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を製造する。
【０００９】
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ_１〜Ｒ_５はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す。
【００１０】
ここで、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−へキシル基等の炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基が挙げられる。これらの中で、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。アリール基としては、例えば、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等が挙げられる。また、アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ターシャリーブトキシ基等が挙げられる。これらの中で炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。
【００１１】
上記アルキル基、アリール基及びアルコキシ基は置換されていてもよい。置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。したがって、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、置換されたアルキル基として具体的には、ベンジル基、フェネチル基、トリフルオロメチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。置換されたアリール基として具体的には、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。また、置換されたアルコキシ基として具体的には、ベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基等が挙げられる。
【００１２】
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ_１〜Ｒ_５はそれぞれ独立してハロゲン原子であってもよいが、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
【００１３】
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のＲ_１〜Ｒ_５は、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、より好ましくは水素原子である。
【００１４】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下のものであり、具体的には、例えば２−ヒドロキシメチル桂皮酸等が挙げられる。上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、欧州特許第９０６９０１号明細書、欧州特許第９３７７１０号明細書、仏国特許発明第２７７２０２７号明細書等に記載されているような公知の方法に準じてまたはそれらの組み合わせにより、容易に合成することができる。
【００１５】
上記一般式（ＩＩ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下のものであり、具体的には、（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸等が挙げられる。
【００１６】
エノエートレダクターゼは、一般には、エノエート（ｅｎｏａｔｅ）の炭素・炭素二重結合の還元反応を触媒する酵素をいう（Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２０， ｐ８１７， １９９８）が、本発明においては、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体の炭素・炭素二重結合を不斉還元して（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を生成する活性を有する酵素をいう。ここで、生成する（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸の光学純度は、７０％ ｅ．ｅ．以上であることが好ましく、９０％ ｅ．ｅ．以上であることがより好ましく、９５ ％ ｅ．ｅ．以上であることが特に好ましい。このような活性は、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を基質として含有し、さらにＮＡＤＨを補酵素として含有する反応系において、ＮＡＤＨの減少初速度を測定することにより測定することができる。
【００１７】
本発明の製造方法において用いることのできるエノエートレダクターゼとしては、例えば、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。これらはそれぞれ、ムーレラ サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、クロストリジウム アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のエノエートレダクターゼである。
【００１８】
また、本発明においては、これらのホモログであって、前記の酵素活性を有するものを用いてもよい。ホモログとは、例えば、前記活性を害さない範囲内において配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００１９】
また、前記ホモログは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するタンパク質であってもよい。ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋを対象にＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍによりホモロジー検索を行った結果、配列番号２の配列はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来２−ｅｎｏａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＡＡ７１０８６）と５９％の相同性を示し、配列番号４の配列はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来２−ｅｎｏａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＡＡ７１０８６）と４９％の相同性を示した。また、配列番号２と配列番号４の配列は互いに５０％の相同性を示した。
【００２０】
本発明の製造法に用いるエノエートレダクターゼは、エノエートレダクターゼの一部又は全部をコードする遺伝子の塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、エノエートレダクターゼ活性を有する任意の微生物からエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを単離した後、該ＤＮＡを大腸菌などの宿主に発現させることによって得ることができる。また、エノエートレダクターゼ活性を有する微生物、例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌やムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌の菌体から精製することによって得ることもできる。細菌の菌体からエノエートレダクターゼを取得する方法としては、例えば、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ９７， ｐ１０３（１９７９）に記載の方法を参考に行うことができる。
【００２１】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌としては、例えばクロストリジウム アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４株が、本発明に好適に利用できるエノエートレダクターゼを有しており、ムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌としては、例えばムーレラ サーモオートトロフィカＤＳＭ１９７４株が、本発明に好適に利用できるエノエートレダクターゼを有している。前者はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のオンラインカタログ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）に記載されており、該ＡＴＣＣから入手できる。また、後者はＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ （Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ））のオンラインカタログ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）に記載されており、該ＤＳＭＺから入手可能である。
【００２２】
本発明の製造方法においては、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体をエノエートレダクターゼの精製酵素と反応させてもよいが、エノエートレダクターゼを含む細胞、同細胞の調製物、または同細胞を培養して得られた培養液を、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に反応させて、（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を製造してもよい。エノエートレダクターゼを含む細胞としては、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が好ましい。
【００２３】
この場合、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが挙げられる。また、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番号１または配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。また、本発明製造法においては、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡのホモログであって、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いてもよい。
【００２４】
ここで、ホモログとは、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列に１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなるＤＮＡを含む。ここで数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００２５】
また、ホモログは、配列番号１または３の塩基配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、プローブＤＮＡを用いて、ストリンジェントな条件下で、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を行うことにより得られるＤＮＡを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００２６】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。まず、エノエートレダクターゼを上記の方法等により微生物菌体等から精製した後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析する。Ｎ末端アミノ酸配列解析は、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により精製タンパク質を切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製した後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析して複数のアミノ酸配列を決めることにより行う。決定したアミノ酸配列を元に設計したプライマーを用い、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡの一部（ＤＮＡ断片）を得ることができる。さらに、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから、前記のＤＮＡ断片をプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどを行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
また、前記のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、配列が決定された領域の外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応により環化させたＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｓｅ ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌ． １２０，ｐ６２１−６２３（１９８８））を行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００２８】
なおエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１または配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することによって得ることもできる。
【００２９】
当業者であれば、配列番号１または配列番号３に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ｖｏｌ． １０， ｐ６４８７ （１９８２）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ｖｏｌ． １００， ｐ４４８（１９８３）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＰＣＲ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐ２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより、本発明の製造法に用いることのできるエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることが可能である。
【００３０】
また、配列番号２または４のアミノ酸配列の全部またはその一部や、配列番号１または３の塩基配列の全部または一部を元に、例えばＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株（ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ等から入手可能）からのＰＣＲ等によりエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを手に入れることが可能である。
【００３１】
さらに、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１または３の塩基配列の全部または一部を有するＤＮＡをプローブに用いて、エノエートレダクターゼ活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。ここで、「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００３２】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３３】
上記のようにして単離された、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、エノエートレダクターゼ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換された細胞を培養することにより、エノエートレダクターゼを該細胞から得ることができる。形質転換細胞は、公知の宿主細胞の染色体ＤＮＡにエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３４】
形質転換細胞の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを組み込み、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中にエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００３５】
このとき、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターをエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込む必要がある。さらに、ターミネーターを３’側下流に組み込むことが好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８・遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ． ｖｏｌ． ４３，ｐ７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ｖｏｌ． ８，ｐ４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３６】
本発明のエノエートレダクターゼを発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００３７】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００３８】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００３９】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００４０】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００４１】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００４２】
形質転換細胞作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、「モレキュラークローニング第２版」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、参照）。
【００４３】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００４４】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどが挙げられ、プロモーターとしては、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００４５】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００４６】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ． ２６，ｐ２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００４７】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ｖｏｌ． ３９，ｐ２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４８】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ． １９６，ｐ１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４９】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５０】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ． ６，ｐ８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５１】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． ７，ｐ２８３−２８７（１９８９））。
【００５２】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ． ３１５， ｐ５９２−５９４ （１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００５３】
本発明の製造方法においては、反応基質である２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体にエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞を作用させてもよい。形質転換細胞は、反応液中でそのまま作用させてもよいが、該細胞の調製物、例えば、該細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体細胞調製物、該形質転換細胞中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものを作用させてもよい。
【００５４】
本発明の製造方法においては、反応液に補酵素ＮＡＤ^＋もしくはＮＡＤＨを添加するのが好ましい。添加濃度は、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。これらの補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＨから生成するＮＡＤ^＋をＮＡＤＨへの再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、
（ｉ） 宿主微生物自体のＮＡＤ^＋還元能を利用する方法、
（ｉｉ） ＮＡＤ^＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその調製物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、または
（ｉｉｉ）形質転換細胞を作製するに当たり、ＮＡＤＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子をエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡと同時に宿主に導入する方法、が挙げられる。
【００５５】
このうち、上記（ｉ）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、２−プロパノール、ギ酸などを添加することが好ましい。
【００５６】
また、上記（ｉｉ）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体調製物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の再生酵素を用いても良い。この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のエノエートレダクターゼに比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に対して、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
【００５７】
また、上記（ｉｉｉ）の方法においては、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法、及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００５８】
本発明の製造方法は、例えば、反応基質、本発明の形質転換細胞および／または該形質転換細胞調製物、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する、水性媒体中または該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことができる。
【００５９】
本発明製造法において反応基質となる一般式（Ｉ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いることができる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【００６０】
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高いものを使用することができる。
【００６１】
本発明の方法は例えば、４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行うことができる。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。また、エノエートレダクターゼの酸素による失活を防ぐため、反応液中に亜硫酸ナトリウムを添加したり、反応液を窒素やアルゴンガス等でシールすることにより、酸素の除去を行うことも効果的である。
【００６２】
本発明の方法により生成する（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６４】
（１）ムーレラ サーモオートトロフィカ由来のエノエートレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製
ムーレラ サーモオートトロフィカ由来のエノエートレダクターゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＡＡ７６０８２、配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｙ１６１３６ ＲＥＧＩＯＮ：４７．．２０５０、配列番号１）を元に配列番号５および６に記載のプライマーを合成した。これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ムーレラ サーモオートトロフィカＤＳＭ１９７４のゲノムＤＮＡ ２５ｎｇ、ＫＯＤ −ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ −ｐｌｕｓ− １ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００６５】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製） により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を熱ショック法により形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＭｔＥＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号１の塩基配列と一致した。
【００６６】
（２）クロストリジウム アセトブチリカム由来のエノエートレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製
クロストリジウム アセトブチリカム由来の２−ｅｎｏａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＫ８１３０２、配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＥ００７８３４ ＲＥＧＩＯＮ： ８５９．．２８５３、配列番号４）を元に配列番号７および８に記載のプライマーを合成し、これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、クロストリジウム アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡ ２５ｎｇ 、ＫＯＤ −ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ −ｐｌｕｓ− １ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００６７】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後、回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を熱ショック法により形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＣａＥＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号３の塩基配列と一致した。
【００６８】
（３）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された大腸菌を用いた（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の合成
上記（１）、（２）で得られた形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地でアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）による嫌気条件下、３７℃で３０時間生育させた。得られた菌体ブロス５ｍＬを遠心分離により集菌して菌体を得た後、下記に示す方法により、２−ヒドロキシメチル桂皮酸を基質として該菌体の還元活性を確認した。なお、２−ヒドロキシメチル桂皮酸は公知の方法（欧州特許第９０６９０１号明細書等、参照）により合成して用いた。
【００６９】
上記菌体に２００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ ＮＡＤ^＋（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ グルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、１０ｍＭ ２−ヒドロキシメチル桂皮酸）を添加後、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）による嫌気条件下、３７℃で２０時間反応させた。１０μＬの６Ｎ ＨＣｌを添加して反応を終了し、酢酸エチルで抽出し、濃縮後２−プロパノールに溶解して２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸を定量した。
【００７０】
定量は２−プロパノール溶液を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５ＰＹＥ （ナカライテスク社製） ４０℃
溶離液：０．０５％（ｖ／ｖ） リン酸水溶液／アセトニトリル＝７０／３０
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
また、２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の光学純度は特開平１１−１０６３６３号公報に記載の方法で測定することができる。この結果、ｐＵＣＭｔＥＲ１を形質転換した大腸菌を用いた場合の（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の収量は３５．７μｇであり、光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。また、ｐＵＣＣａＥＲ１を形質転換した大腸菌を用いた場合の（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の収量は１１４μｇであり、光学純度は９９％ ｅ．ｅ．以上であった。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によって、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を高い光学純度で得ることが可能になった。
【００７２】
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to the steric structure of a carbon-carbon double bond of a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative using enoate reductase or a cell containing the same, a preparation of the cell, or a culture solution obtained by culturing the cell. The present invention relates to a method for selectively reducing and producing optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid, which is an industrially useful compound as an intermediate material for pharmaceuticals, agricultural chemicals and the like.
[0002]
[Prior art]
(S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid is an industrially useful compound as an intermediate material for pharmaceuticals, agricultural chemicals and the like. Although it has been reported that (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid is obtained by reducing a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative with an asymmetric catalyst (for example, Patent Document 1 or Non-Patent Document). 1), the optical purity of the product is 30-60% e.e. e. It was low before and after.
[0003]
Enoate reductase is an enzyme that catalyzes a reaction that reduces the carbon-carbon double bond of enoate, but its presence has been reported in microorganisms such as Clostridia (for example, non-patented). Reference 2). Asymmetric reduction of various enoates using microorganisms having enoate reductase activity has been reported (see, for example, Non-Patent Document 3), but 2-hydroxymethyl in which the carbon at the 2-position of enoate is hydroxymethylated. Regarding cinnamic acid derivatives, there was no report of asymmetric reduction using enoate reductase.
[0004]
[Patent Document 1] Japanese Patent Laid-Open No. 2000-229907
[Non-Patent Document 1] Enantiomer, vol. 3, p191, 1998
[Non-Patent Document 2] Journal of Biological Chemistry, vol. 276, no. 8, p5779-5787, 2001
[Non-patent Document 3] Studies in Natural Products Chemistry, vol. 20, p817, 1998
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel method for producing (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid with higher optical purity at low cost and in a simple manner.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors diligently studied a method for producing (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid. As a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 was obtained. It has been found that the protein possessed catalyzes the asymmetric reduction reaction of the 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative as a raw material. Further, a transformed cell into which a gene encoding the protein is introduced is prepared, and the cell, a preparation of the cell, or a culture solution obtained by culturing the cell is used as a raw material, 2-hydroxymethylcinnamic acid It was found that (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid, which is the target product, can be obtained with high optical purity and high concentration by acting on a derivative. Thus, the present invention has been completed.
[0007]
That is, the present invention is as follows.
(1) The following general formula (I)
[Chemical 3]

To the 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative represented by the formula: enoate reductase or a cell containing the same, a preparation of the cell, or a culture solution obtained by culturing the cell, and the following general formula (II)
[Formula 4]

(S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II), characterized in that (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by formula (II) is produced (In general formulas (I) and (II), R ₁ ~ R ₅ Each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group or an optionally substituted alkoxy group).
(2) The production method of (1), wherein the enoate reductase is a protein shown in the following (A), (B) or (C):
(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or
(B) a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative represented by the general formula (I), which comprises an amino acid sequence having 50% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 (II) A protein having an enzyme activity which is converted to (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by (II).
(C) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added, and represented by the general formula (I) 2- A protein having an enzyme activity for converting a hydroxymethylcinnamic acid derivative into an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II).
(3) The production method of (1), wherein the cell containing enoate reductase is a cell transformed with DNA encoding enoate reductase.
(4) The production method of (3), wherein the cell transformed with DNA encoding enoate reductase is a cell transformed by integrating the DNA onto a chromosome.
(5) The production method of (3), wherein the cell transformed with DNA encoding enoate reductase is a cell transformed with a vector containing the DNA.
(6) The production method of any one of (3) to (5), wherein the DNA encoding enoate reductase is a DNA encoding the protein shown in the following (A), (B) or (C):
(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or
(B) A 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative having an amino acid sequence having 50% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and represented by the general formula (I) is generally used A protein having an enzyme activity which is converted to optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the formula (II).
(C) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added, and represented by the general formula (I) 2- A protein having an enzyme activity for converting a hydroxymethylcinnamic acid derivative into an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II).
(7) The production method of any one of (3) to (5), wherein the DNA encoding enoate reductase is the DNA shown in the following (D), (E), or (F):
(D) DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or
(E) a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or a complementary sequence thereof, and represented by the general formula (I) A DNA encoding a protein having an enzyme activity which is converted to an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II).
(F) The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 consists of a nucleotide sequence in which one or several bases are substituted, deleted or added and its complementary strand, and is represented by the general formula (I) A DNA encoding a protein having an enzyme activity for converting a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative into an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II).
(8) In the compounds of the general formulas (I) and (II), R ₁ ~ R ₅ Are all hydrogen atoms, The manufacturing method in any one of (1)-(7) characterized by the above-mentioned.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
In the present invention, enoate reductase or a cell containing the same, a preparation of the cell, or a culture solution obtained by culturing the cell is used as a reaction substrate of the following general formula (I)
[Chemical formula 5]

By acting on a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative represented by formula (II), the carbon-carbon double bond of the compound is asymmetrically reduced.
[Chemical 6]

(S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the formula:
[0009]
In the general formulas (I) and (II), R ₁ ~ R ₅ Each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group or an optionally substituted alkoxy group.
[0010]
Here, examples of the alkyl group include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, cyclopropyl, n-butyl, isobutyl, tertiary butyl, n-pentyl, isopentyl, and neopentyl. And a straight chain, branched chain, or cyclic alkyl group having 1 to 8 carbon atoms such as a group, tertiary pentyl group, isoamyl group, and n-hexyl group. In these, a C1-C4 alkyl group is preferable and a methyl group or an ethyl group is especially preferable. Examples of the aryl group include a phenyl group, a mesityl group, and a naphthyl group. Examples of the alkoxy group include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, an n-butoxy group, an isobutoxy group, and a tertiary butoxy group. Among these, an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms is preferable.
[0011]
The alkyl group, aryl group and alkoxy group may be substituted. The substituent is not particularly limited as long as it does not adversely affect the reaction. Specifically, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group, a halogen group, a cyano group, an amino group, a nitro group, a hydroxyl group, etc. Is mentioned. Accordingly, in the general formulas (I) and (II), as the substituted alkyl group, specifically, benzyl group, phenethyl group, trifluoromethyl group, cyanomethyl group, aminomethyl group, hydroxymethyl group, nitromethyl group, methoxy A methyl group etc. are mentioned. Specific examples of the substituted aryl group include a chlorophenyl group, an aminophenyl group, a hydroxyphenyl group, a nitrophenyl group, and a methoxyphenyl group. Specific examples of the substituted alkoxy group include a benzyloxy group, a phenoxy group, and a trifluoromethoxy group.
[0012]
In the general formulas (I) and (II), R ₁ ~ R ₅ Each independently may be a halogen atom, and examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, and a bromine atom.
[0013]
R in the general formulas (I) and (II) ₁ ~ R ₅ Is preferably a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, more preferably a hydrogen atom.
[0014]
As a compound represented by the said general formula (I), molecular weight is 1000 or less, Preferably it is 500 or less, More preferably, it is 300 or less, Specifically, 2-hydroxymethyl cinnamic acid etc. are mentioned, for example. . The compound represented by the above general formula (I) is prepared by a known method as described in European Patent No. 906901, European Patent No. 937710, French Patent No. 2772027, etc. It can be easily synthesized according to the above or a combination thereof.
[0015]
The compound represented by the general formula (II) has a molecular weight of 1000 or less, preferably 500 or less, more preferably 300 or less. Specifically, (S) -2-hydroxymethyl-3- Examples include phenylpropionic acid.
[0016]
The enoate reductase generally refers to an enzyme that catalyzes the reduction reaction of a carbon-carbon double bond of enoate (Studies in Natural Products Chemistry, vol. 20, p817, 1998). In the present invention, An enzyme having an activity of asymmetrically reducing the carbon-carbon double bond of a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative to produce (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid. Here, the optical purity of the (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid produced is 70% e.e. e. Preferably 90% or more e. e. More preferably, it is 95% e. e. The above is particularly preferable. Such an activity can be measured by measuring the initial reduction rate of NADH in a reaction system containing a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative as a substrate and NADH as a coenzyme.
[0017]
Examples of the enoate reductase that can be used in the production method of the present invention include those having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. These are enoate reductases derived from Moorella thermoautotropica and Clostridium acetobutylicum, respectively.
[0018]
In the present invention, those homologs having the above enzyme activity may be used. Examples of homologs include those having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 within a range that does not impair the activity. be able to. Here, the term “several” specifically means 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 5 or less.
[0019]
The homologue may be a protein having a homology of 35% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. Incidentally, the homology search of the above protein can be performed using programs such as FASTA and BLAST, for example, for GenBank and DNA Database of JAPAN (DDBJ). Using the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and performing a homology search with BLAST program for GenBank, the sequence of SEQ ID NO: 2 is derived from Clostridium tyrolticum 2-enoate reductase (Accession No. CAA71086). It showed 59% homology, and the sequence of SEQ ID NO: 4 showed 49% homology with Clostridium tyrobutyricum-derived 2-enoate reductase (Accession No. CAA71086). Further, the sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 showed 50% homology with each other.
[0020]
The enoate reductase used in the production method of the present invention is obtained from any microorganism having enoate reductase activity using a probe prepared based on the base sequence of a gene encoding part or all of the enoate reductase. After the DNA encoding reductase is isolated, it can be obtained by expressing the DNA in a host such as E. coli. Moreover, it can also obtain by refine | purifying from the microorganisms which have enoate reductase activity, for example, the microbial cell body of Clostridium (Clostridium) genus bacteria and Moorella (Moorella) genus bacteria. As a method for obtaining enoate reductase from bacterial cells, for example, Eur. J. et al. Biochem. Vol. 97, p103 (1979).
[0021]
As a Clostridium bacterium, for example, Clostridium acetobutylicum ATCC824 has an enoate reductase that can be suitably used in the present invention. As a bacterium belonging to the genus Moorella, for example, the Moellera thermoautotrophica DSM1974 strain is And enoate reductase which can be suitably used in the present invention. The former is described in the ATCC (American Type Culture Collection) online catalog (http://www.atcc.org/) and can be obtained from the ATCC. The latter is also available from the online catalog (http: //www.DSM) of the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (available from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). is there.
[0022]
In the production method of the present invention, a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative may be reacted with a purified enzyme of enoate reductase, but a cell containing enoate reductase, a preparation of the cell, or the cell is cultured. The obtained culture solution may be reacted with a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative to produce (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid. The cell containing enoate reductase is preferably a cell transformed with DNA encoding enoate reductase.
[0023]
In this case, DNA encoding enoate reductase includes DNA encoding enoate reductase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. A 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative having an amino acid sequence having 50% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and represented by the general formula (I) is represented by the general formula (II The DNA which codes the protein which has the enzyme activity converted into optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-aryl propionic acid represented by this may be sufficient. Specific examples include DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. In the production method of the present invention, a DNA homologue having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and encoding a protein having enoate reductase activity may be used.
[0024]
Here, the homolog is a base in which one or several bases are deleted, substituted or added to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 as long as it encodes a protein having enoate reductase activity. DNA comprising the sequence and its complementary strand is included. Here, the term “several” means specifically 60 or less, preferably 30 or less, and more preferably 10 or less.
[0025]
In addition, the homolog may be DNA that hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or a complementary strand thereof under stringent conditions and encodes a protein having enoate reductase activity. Here, “DNA that hybridizes under stringent conditions” means that a probe DNA is used to perform colony hybridization, plaque hybridization, Southern blot hybridization, or the like under stringent conditions. For example, in the colony hybridization method and the plaque hybridization method, a colony or plaque-derived DNA or a filter on which the DNA fragment is immobilized is used as the “stringent conditions”. After hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M sodium chloride, 0.1 to 2 × SSC solution (1 × SSC composition is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate) The conditions for washing the filter at 65 ° C. can be mentioned.
[0026]
DNA encoding enoate reductase can be isolated by, for example, the following method. First, enoate reductase is purified from microbial cells by the above method and the like, and then the N-terminal amino acid sequence is analyzed. N-terminal amino acid sequence analysis is performed by cleaving a purified protein with an enzyme such as lysyl endopeptidase or V8 protease, purifying a peptide fragment by reverse phase liquid chromatography, etc., and then analyzing the amino acid sequence with a protein sequencer. It is done by deciding. Using a primer designed based on the determined amino acid sequence and performing PCR using a chromosomal DNA or cDNA library of an enoate reductase-producing microbial strain as a template, a part of the DNA encoding enoate reductase (DNA fragment) is obtained. Obtainable. Furthermore, the above-mentioned DNA fragment is used as a probe from a library or cDNA library obtained by introducing a restriction enzyme digest of chromosomal DNA of an enoate reductase-producing microorganism strain into a phage or plasmid, and transforming E. coli. By performing colony hybridization, plaque hybridization, etc., DNA encoding enoate reductase can be obtained.
[0027]
In addition, the base sequence of the DNA fragment obtained by the above PCR is analyzed, and from the obtained sequence, a PCR primer for extending outside the sequence-determined region is designed, and the enoate reductase-producing microorganism strain Enzyme reductase is encoded by digesting chromosomal DNA with an appropriate restriction enzyme and then performing inves PCR (Genetics vol. 120, p621-623 (1988)) using the DNA cyclized by self-cyclization as a template. It is also possible to obtain DNA.
[0028]
The DNA encoding enoate reductase can also be obtained by chemically synthesizing DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
[0029]
Those skilled in the art will be able to introduce site-directed mutagenesis into the DNA of SEQ ID NO: 1 or 3 (Nucleic Acid Res. Vol. 10, p6487 (1982), Methods in Enzymol. Vol. 100, p448 (1983)). , Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), PCR: A Practical Approach, IRL Press, p200 (1991)), etc. Thus, DNA encoding enoate reductase that can be used in the production method of the present invention can be obtained.
[0030]
Further, a homology search is performed on a database such as GenBank or DDBJ based on all or part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 and all or part of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. It is also possible to obtain the base sequence information of a DNA homolog encoding enoate reductase. A person skilled in the art can obtain DNA encoding enoate reductase by PCR or the like from the deposited strain (available from ATCC, DSMZ, etc.) based on this nucleotide sequence information.
[0031]
Furthermore, DNA encoding enoate reductase is obtained by using a DNA having all or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 as a probe, against colony prepared from any microorganism having enoate reductase activity. It can also be obtained by performing hybridization under stringent conditions by a hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like to obtain a hybridizing DNA. Here, “part” refers to DNA having a sufficient length to be used as a probe, specifically, 15 bp or more, preferably 50 bp or more, more preferably 100 bp or more.
[0032]
Each hybridization was performed using Molecular Cloning 2nd Edt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and the like.
[0033]
An enoate reductase expression vector is provided by inserting the DNA encoding enoate reductase isolated as described above into a known expression vector so as to allow expression. By culturing cells transformed with this expression vector, enoate reductase can be obtained from the cells. A transformed cell can also be obtained by incorporating an enoate reductase-encoding DNA into a chromosomal DNA of a known host cell so that it can be expressed.
[0034]
As a method for producing transformed cells, specifically, DNA encoding enoate reductase is incorporated into a plasmid vector or phage vector stably present in the microorganism, and the constructed expression vector is introduced into the microorganism. Alternatively, it is necessary to introduce DNA encoding enoate reductase directly into the host genome and to transcribe and translate the genetic information.
[0035]
At this time, if the DNA encoding enoate reductase does not contain a promoter that can be expressed in the host microorganism, an appropriate promoter must be incorporated upstream of the DNA strand encoding enoate reductase. Furthermore, it is preferable to incorporate a terminator downstream of the 3 ′ side. The promoter and terminator are not particularly limited as long as they are known to function in microorganisms used as hosts, and vectors, promoters and terminators that can be used in these various microorganisms are, for example, “ Microbiology Basic Course 8, Genetic Engineering, Kyoritsu Shuppan ", especially regarding yeast, Adv. Biochem. Eng. vol. 43, p75-102 (1990), Yeast vol. 8, p423-488 (1992).
[0036]
The host microorganism to be transformed to express the enoate reductase of the present invention is not particularly limited as long as the host itself does not adversely affect this reaction, and specifically, as shown below Mention may be made of microorganisms.
[0037]
Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacter, Streptococcus b Bacteria with established host vector systems belonging to the genus.
[0038]
Actinomycetes with established host vector systems belonging to the genus Rhodococcus, the genus Streptomyces, and the like.
[0039]
Saccharomyces (genus), Kluyveromyces (genus), Schizosaccharomyces (genus), Zygosaccharomyd (genus) Yeast with established host vector systems belonging to the genus Hansenula, Pichia, Candida and the like.
[0040]
Molds with established host vector systems belonging to the genera Neurospora, Aspergillus, Cephalosporia, Trichoderma, and the like.
[0041]
Among the microorganisms, the host is preferably the genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Brevibacterium, the genus Corynebacterium, and particularly preferably the genus Escherichia, It belongs to the genus Corynebacterium.
[0042]
The procedure for preparing transformed cells, the construction of a recombinant vector suitable for the host, and the method for culturing the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering ( See, for example, “Molecular Cloning 2nd Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
[0043]
Specific examples of preferred host microorganisms, preferred transformation techniques in each microorganism, vectors, promoters, terminators and the like are given below, but the present invention is not limited to these examples.
[0044]
In the genus Escherichia, especially Escherichia coli, plasmid vectors include pBR and pUC plasmids, and promoters include lac (β-galactosidase), trp (tryptophan operon), tac, trc ( lac, trp fusion), promoters derived from λ phage PL, PR, and the like. Examples of the terminator include trpA-derived, phage-derived, and rrnB ribosomal RNA-derived terminators.
[0045]
In the genus Bacillus, examples of the vector include a pUB110-type plasmid and a pC194-type plasmid, and can also be integrated into a chromosome. As the promoter and terminator, promoters and terminators of enzyme genes such as alkaline protease, neutral protease, α-amylase and the like can be used.
[0046]
In the genus Pseudomonas, vectors include general host vector systems established in Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, plasmids involved in degradation of toluene compounds, and TOL plasmids. A basic broad host range vector (including genes necessary for autonomous replication derived from RSF1010 and the like) pKT240 (Gene, vol. 26, p273-82 (1983)) can be mentioned.
[0047]
In the genus Brevibacterium, in particular, Brevibacterium lactofermentum, examples of the vector include plasmid vectors such as pAJ43 (Gene vol. 39, p281 (1985)). As the promoter and terminator, various promoters and terminators used in E. coli can be used.
[0048]
In the genus Corynebacterium, particularly Corynebacterium glutamicum, as the vector, pCS11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799), pCB101 (Mol. Gen. Genet. Vol. 196, p175 (1984) ) And the like.
[0049]
In the genus Saccharomyces, particularly in Saccharomyces cerevisiae, vectors include YRp, YEp, YCp, and YIp plasmids. In addition, promoters and terminators of various enzyme genes such as alcohol dehydrogenase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, acid phosphatase, β-galactosidase, phosphoglycerate kinase, and enolase can be used.
[0050]
In the genus Schizosaccharomyces, the vector is Mol. Cell. Biol. vol. 6, p80 (1986), and a plasmid vector derived from Schizosaccharomyces pombe. In particular, pAUR224 is commercially available from Takara Shuzo and can be easily used.
[0051]
In the genus Aspergillus, Aspergillus niger and Aspergillus oryzae are the most studied among molds, and integration into plasmids and chromosomes is available. Promoters derived from external proteases or amylases can be used (Trends in Biotechnology vol. 7, p283-287 (1989)).
[0052]
In addition to the above, host vector systems corresponding to various microorganisms have been established, and these can be used as appropriate. In addition to microorganisms, various host / vector systems have been established in plants and animals, especially in animals such as insects using moths (Nature vol. 315, p592-594 (1985)), rapeseed, corn, A system for expressing a heterogeneous protein in a large amount in a plant such as potato and a system using a cell-free protein synthesis system such as an E. coli cell-free extract or wheat germ have been established and can be suitably used.
[0053]
In the production method of the present invention, cells transformed with DNA encoding enoate reductase may be allowed to act on a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative which is a reaction substrate. The transformed cell may be allowed to act as it is in the reaction solution, but the cell preparation, for example, the cell treated with an organic solvent such as acetone, dimethyl sulfoxide (DMSO), toluene or a surfactant, Bacterial cell preparations such as those freeze-dried, physically or enzymatically disrupted, those obtained by removing the enzyme fraction of the present invention from the transformed cells as crude or purified products, and these May be allowed to act on a carrier such as polyacrylamide gel or carrageenan gel.
[0054]
In the production method of the present invention, the coenzyme NAD is added to the reaction solution. ⁺ Alternatively, NADH is preferably added. The addition concentration is 0.001 mM to 100 mM, preferably 0.01 to 10 mM. When these coenzymes are added, NAD produced from NADH ⁺ Is preferably recycled to NADH to improve production efficiency.
(I) NAD of the host microorganism itself ⁺ A method of using the reducing ability,
(Ii) NAD ⁺ Microorganisms or their preparations capable of producing NADH from glucose, glucose dehydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, organic acid dehydrogenase (malate dehydrogenase, etc.), etc. A method of adding an enzyme (regenerative enzyme) that can be used to regenerate NADH in the reaction system, or
(Iii) In producing a transformed cell, a method of introducing a gene for the above-mentioned regenerating enzyme, which is an enzyme that can be used for NADH regeneration, into a host simultaneously with DNA encoding enoate reductase can be mentioned.
[0055]
Among these, in the method (i), it is preferable to add glucose, ethanol, 2-propanol, formic acid or the like to the reaction system.
[0056]
In the above method (ii), a microorganism preparation containing a regenerative enzyme, a microorganism prepared by treating the microorganism with acetone, freeze-dried, physically or enzymatically disrupted, etc. In addition, a product obtained by removing the enzyme fraction as a crude product or a purified product, a product obtained by immobilizing the enzyme fraction on a carrier represented by polyacrylamide gel, carrageenan gel, or the like may be used. May be used. In this case, the amount of the regenerative enzyme used is specifically about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times the enzyme activity as compared with the enoate reductase of the present invention. Added. Addition of compounds that serve as substrates for the regenerative enzyme, such as glucose when using glucose dehydrogenase, formic acid when using formate dehydrogenase, ethanol or isopropanol when using alcohol dehydrogenase, etc. However, the addition amount is 0.1 to 20 times molar equivalent, preferably 1 to 5 times molar equivalent to the 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative which is the reaction raw material.
[0057]
In the method (iii), a method for incorporating DNA encoding enoate reductase and a DNA for the regenerative enzyme into a chromosome, a method for transforming a host by introducing both DNAs into a single vector, Alternatively, the method of transforming the host after separately introducing both DNAs into the vector can be used, but in the case of the method of transforming the host after separately introducing both DNAs into the vector, there is no problem between the two vectors. It is necessary to select a vector in consideration of compatibility. When introducing multiple genes into a single vector, methods such as linking promoter-terminator-related regions such as promoters and terminators to each gene, or expressing them as an operon containing multiple cistrons such as the lactose operon. Is possible.
[0058]
The production method of the present invention includes, for example, an aqueous medium containing a reaction substrate, the transformed cell of the present invention and / or the transformed cell preparation, and various coenzymes added as necessary and a regeneration system thereof. In or in a mixture of the aqueous medium and an organic solvent.
[0059]
The compound represented by the general formula (I) which is a reaction substrate in the production method of the present invention usually has a substrate concentration of 0.01 to 90% w / v, preferably 0.1 to 30% w / v. Can be used. The reaction substrate may be added all at once at the start of the reaction. However, from the viewpoint of reducing the effects when there is enzyme substrate inhibition and improving the accumulated concentration of the product, it is continuous or intermittent. It is desirable to add to.
[0060]
Examples of the aqueous medium include water or a buffer, and examples of the organic solvent include those having high solubility of the reaction substrate such as ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, n-hexane, dimethyl sulfoxide, and the like. be able to.
[0061]
The method of the present invention can be carried out, for example, at a reaction temperature of 4 to 60 ° C., preferably 10 to 45 ° C., and pH 3 to 11, preferably pH 5 to 8. It is also possible to use a membrane reactor or the like. In addition, in order to prevent inactivation of enoate reductase by oxygen, it is also effective to remove oxygen by adding sodium sulfite to the reaction solution or sealing the reaction solution with nitrogen or argon gas. .
[0062]
(S) -2-Hydroxymethyl-3-arylpropionic acid produced by the method of the present invention, after completion of the reaction, after separating cells and proteins in the reaction solution by centrifugation, membrane treatment, etc., ethyl acetate, Purification can be performed by appropriately combining extraction with an organic solvent such as toluene, distillation, column chromatography, crystallization, and the like.
【Example】
[0063]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in more detail, this invention is not limited to this.
[0064]
(1) Preparation of transformed cells transformed with enoate reductase gene from Muellera thermoautotrophica
SEQ ID NOs: 5 and 6 based on the DNA sequence (Accession No. Y16136 REGION: 47.2050, SEQ ID NO: 1) encoding enoate reductase (Accession No. CAA76082, SEQ ID NO: 2) derived from Murella thermoautotrophica The described primers were synthesized. 15 pmol each of these primers, 10 nmol each of dNTP, 25 ng of genomic DNA of Moellera Thermoautotropica DSM 1974, 10 μl buffer for KOD-plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), 5 μL, KOD-plus-1 unit (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) PTC-200 (manufactured by MJ Research) in 30 cycles of denaturation (94 ° C., 15 seconds), annealing (57 ° C., 30 seconds), extension (68 ° C., 2 minutes) A PCR reaction was performed using As a result of analyzing a part of the PCR reaction solution by agarose gel electrophoresis, a band considered to be specific could be detected.
[0065]
The reaction solution was purified with MinElute PCR Purification kit (Qiagen). The purified DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and XbaI, and subjected to agarose gel electrophoresis. The target band portion was excised, and purified and collected by Qiagen Gel Extraction kit (manufactured by Qiagen). The obtained DNA fragment was ligated to pUC118 digested with EcoRI and XbaI using Ligation high (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and Escherichia coli JM109 strain was transformed by the heat shock method. The transformed cells were grown on an LB agar medium containing ampicillin (50 μg / mL), and colony direct PCR was performed to confirm the size of the inserted fragment. Transformed cells that are considered to have the target DNA fragment inserted are cultured in LB medium containing 50 μg / mL ampicillin, and the plasmid is purified using QIAPrepSpin Mini Prep kit (manufactured by Qiagen) to obtain pUCMTER1 . When the base sequence of the DNA inserted into the plasmid was analyzed by the dye terminator method, the inserted DNA fragment was identical to the base sequence of SEQ ID NO: 1.
[0066]
(2) Production of transformed cells transformed with enoate reductase gene derived from Clostridium acetobutylicum
The DNA sequence (Accession No. AE007834 REGION: 859.2853, SEQ ID NO: 4) encoding 2-enoate reductase (Accession No. AAK81302, SEQ ID NO: 2) derived from Clostridium acetobutylicum is described in SEQ ID NOs: 7 and 8 Primers were synthesized, and 15 pmol of each, 10 nmol each of dNTP, 25 ng of genomic DNA of Clostridium acetobutylicum ATCC824, 10 × buffer for KOD-plus- (manufactured by Toyobo), 5 μL, KOD-plus-1 unit (Toyobo) PTC-200 (M) was used in 30 cycles of denaturation (94 ° C., 15 seconds), annealing (57 ° C., 30 seconds), elongation (68 ° C., 2 minutes). PCR was carried out using a made Research Co., Ltd.). As a result of analyzing a part of the PCR reaction solution by agarose gel electrophoresis, a band considered to be specific could be detected.
[0067]
The reaction solution was purified with MinElute PCR Purification kit (Qiagen). The purified DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and XbaI, and subjected to agarose gel electrophoresis. The target band portion was excised, purified and collected by Qiagen Gel Extraction kit (manufactured by Qiagen). The obtained DNA fragment was ligated to pUC118 digested with EcoRI and XbaI using Ligation high (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and Escherichia coli JM109 strain was transformed by the heat shock method. The transformed cells were grown on an LB agar medium containing ampicillin (50 μg / mL), and colony direct PCR was performed to confirm the size of the inserted fragment. Transformed cells that are considered to have the target DNA fragment inserted are cultured in LB medium containing 50 μg / mL ampicillin, and the plasmid was purified using QIAPrepSpin Mini Prep kit (manufactured by Qiagen) to obtain pUCCaER1. . When the base sequence of the DNA inserted into the plasmid was analyzed by the dye terminator method, the inserted DNA fragment was identical to the base sequence of SEQ ID NO: 3.
[0068]
(3) Synthesis of (S) -2-hydroxymethyl-3-phenylpropionic acid using E. coli transformed with DNA encoding enoate reductase
The transformed cells obtained in (1) and (2) above were subjected to aneropack kenki (Mitsubishi Gas) in an LB medium containing ampicillin (50 μg / mL) and 0.1 mM isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). It was grown at 37 ° C. for 30 hours under anaerobic conditions by Chemicals). The obtained bacterial broth (5 mL) was collected by centrifugation to obtain bacterial cells, and then the reducing activity of the bacterial cells was confirmed by the following method using 2-hydroxymethylcinnamic acid as a substrate. 2-Hydroxymethylcinnamic acid was synthesized and used by a known method (see European Patent No. 906901, etc.).
[0069]
200 μL of reaction solution (0.6 g / L NAD ⁺ (Additional oriental yeast), 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 100 mM glucose, 0.2 g / L glucose dehydrogenase (Amano Pharmaceutical, 76 unit / mg), 10 mM 2-hydroxymethylcinnamic acid) The reaction was carried out at 37 ° C. for 20 hours under anaerobic conditions by Aneropac Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company). The reaction was terminated by adding 10 μL of 6N HCl, extracted with ethyl acetate, concentrated and dissolved in 2-propanol to quantify 2-hydroxymethyl-3-phenylpropionic acid.
[0070]
The quantification was performed by measuring a 2-propanol solution using liquid chromatography (HPLC). The conditions of HPLC are as follows.
Column: COSMOSIL 5PYE (manufactured by Nacalai Tesque) 40 ° C
Eluent: 0.05% (v / v) phosphoric acid aqueous solution / acetonitrile = 70/30
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV254nm
The optical purity of 2-hydroxymethyl-3-phenylpropionic acid can be measured by the method described in JP-A-11-106363. As a result, when using Escherichia coli transformed with pUCMTER1, the yield of (S) -2-hydroxymethyl-3-phenylpropionic acid was 35.7 μg, and the optical purity was 99% e.e. e. That was all. In addition, when using E. coli transformed with pUCCaER1, the yield of (S) -2-hydroxymethyl-3-phenylpropionic acid was 114 μg, and the optical purity was 99% e. e. That was all.
[0071]
【The invention's effect】
The present invention makes it possible to obtain optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid, which is an industrially useful compound as an intermediate material for pharmaceuticals, agricultural chemicals and the like, with high optical purity.
[0072]
[Sequence Listing]

Claims (8)

The following general formula (I)

To the 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative represented by the formula: enoate reductase or a cell containing the same, a preparation of the cell, or a culture solution obtained by culturing the cell, and the following general formula (II)

(S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II), characterized in that (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by formula (II) is produced (In general formulas (I) and (II), R _{1 to} R ₅ are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a nitro group, a hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, An aryl group which may be substituted or an alkoxy group which may be substituted). The production method according to claim 1, wherein the enoate reductase is a protein represented by the following (A), (B), or (C):
(A) a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or (B) an amino acid sequence having 50% or more homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, And an enzyme activity for converting a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative represented by the general formula (I) into an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II). Protein. (C) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added, and represented by the general formula (I) 2- A protein having an enzyme activity for converting a hydroxymethylcinnamic acid derivative into an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II). The production method according to claim 1, wherein the cell containing enoate reductase is a cell transformed with DNA encoding enoate reductase. The production method according to claim 3, wherein the cell transformed with DNA encoding enoate reductase is a cell transformed by integrating the DNA on a chromosome. The production method according to claim 3, wherein the cell transformed with DNA encoding enoate reductase is a cell transformed with a vector containing the DNA. The production method according to any one of claims 3 to 5, wherein the DNA encoding enoate reductase is a DNA encoding a protein shown in the following (A), (B) or (C):
(A) a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or (B) an amino acid sequence having 50% or more homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, And an enzyme activity for converting a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative represented by the general formula (I) into an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II). Protein.
(C) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added, and represented by the general formula (I) 2- A protein having an enzyme activity for converting a hydroxymethylcinnamic acid derivative into an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II). The production method according to any one of claims 3 to 5, wherein the DNA encoding enoate reductase is the following DNA (D), (E) or (F):
(D) Hybridizes under stringent conditions with DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or (E) DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 or its complementary sequence And an enzyme activity for converting a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative represented by the general formula (I) into an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II) DNA encoding a protein having
(F) The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 consists of a nucleotide sequence in which one or several bases are substituted, deleted or added and its complementary strand, and is represented by the general formula (I) A DNA encoding a protein having an enzyme activity for converting a 2-hydroxymethylcinnamic acid derivative into an optically active (S) -2-hydroxymethyl-3-arylpropionic acid represented by the general formula (II). In the compound of general formula (I) and (II), R < ₁ > -R < ₅ > is all hydrogen atoms, The manufacturing method as described in any one of Claims 1-7 characterized by the above-mentioned.