JP4000263B2 - Preparation of (3R, 5S)-(E) -7- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dihydroxyhept-6-enoic acid esters Method - Google Patents

Description

また、特開平８−９２２１７号公報には、光学活性なシッフ塩基を用いて製造する方法も報告されている。
【０００４】
またさらに、特開平８−１２７５８５号公報には、(R)-3-tert-ブチルジメチルシリルオキシ−６−ジメトキシホスフィニルー５−オキソヘキサン酸メチルエステルを用いて極低温にて製造する方法も報告されている。
【０００５】
一方、微生物の菌体及び／または該菌体処理物を用いてケト基を有する化合物を立体選択的に還元し、光学活性なアルコール体を生成する方法としては、例えば、ケト基の側鎖にキノリン骨格を有する化合物を用いるものとして、Appl. Microbiol. Biotechnol.(1998)49:ｐ．709-717に、以下に示す反応をミクロバクテリウム キャンポクエマドエンシス（Microbacterium campoquemadoensis）MB5614株を用いて行えることが記載されている。
【０００６】
【化１１】

また、Bioorg. Med. Chem. Lett., vol8, p1403-(1998)には、以下に示す反応をパン酵母を用いて行えることが記載されている。
【０００７】
【化１２】

しかしながら、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６−エン酸エステル類のように、カルボニル基のα位にオレフィンが存在する上に、カルボニル基が連続して存在する化合物については、微生物を用いて立体選択的に還元できるという例は知られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、（３Ｒ，５Ｓ）−（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類を工業的に安価に製造できる新規な製造方法を新たに開発することが望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、微生物反応を利用したケト基の立体選択的還元反応による、（３Ｒ，５Ｓ）−（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類の製造方法について、鋭意、検討した結果、下記化合物（Ｉ）〜（ＩＩＩ）および（ＩＩ'）〜（ＩＩＩ'）で示される化合物を原料として用いた場合に、高い光学純度で目的物が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は、下記式(I)
【００１０】
【化１３】

（式中、Ｒは水素原子、アルキル基またはアリール基を示す）で表される化合物、下記式(II)
【００１１】
【化１４】

（式中、Ｒは前記と同義である）で表される化合物、及び、下記式（III）
【００１２】
【化１５】

（式中、Ｒは前記と同義である）で表される化合物からなる群より選ばれる化合物を、ケト基を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させて還元することを特徴とする下記式(IＶ)
【００１３】
【化１６】

（式中、Ｒは前記と同義である）で表される化合物の製造方法に存する。
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の（３Ｒ，５Ｓ）−（Ｅ）−７−［2−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類の製造方法は、下記式(I)
【００１６】
【化１７】

（式中、Ｒは水素原子、アルキル基またはアリール基を示す）
で表される化合物、下記式(II)
【００１７】
【化１８】

（式中、Ｒは前記と同義である）
で表される化合物、及び、下記式（III）
【００１８】
【化１９】

（式中、Ｒは前記と同義である）
で表される化合物からなる群より選ばれる化合物を、ケト基を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物を作用させて還元することを特徴とする。
【００１９】
本発明の製造方法に用いられる原料である、上記式（I）〜（III）で表される化合物において、Ｒは、水素原子、アルキル基またはアリール基を示す。
【００２０】
アルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、シクロヘキシル基、ベンジル基、フェネチル基等の、アルキル基またはアリール基で置換されていてもよい直鎖、分岐若しくは環状のアルキル基である。
【００２１】
アリール基としては、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等の、アルキル基で置換されていても良いフェニル基又はナフチル基が挙げられる。
【００２２】
上記Ｒとして好ましくは、Ｃ₁〜Ｃ₄のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であり、より好ましくはＣ₁〜Ｃ₄のアルキル基であり、特に好ましくはメチル基又はエチル基である。
【００２３】
本発明の製造方法において、上記式（II）および（III）で表される化合物は下記式（II'）および下記式（III'）で表される光学活性体であってもよい。
【００２４】
【化２０】

（式中、Ｒは前記と同義である）
【００２５】
【化２１】

（式中、Ｒは前記と同義である）
式（Ｉ）〜（III）及び（II'）〜（III'）で表される化合物は、特開平１−２７９８６６号公報、特開平８−１２７５８５号公報、特開平５−１７８８４１号公報等に記載された方法と公知の方法を組み合わせることによって、任意に製造することができる。
【００２６】
本発明では、上記式（I）〜（III）で表される化合物を微生物の菌体及び／又は該菌体処理物を用い、ケト基を立体選択的に還元することを特徴とする。
【００２７】
本発明に用いられる微生物としては、ケト基を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物であれば特に限定されない。
【００２８】
具体的には、メシニコウィア プルケリマ（Metschnikowia pulcherrima）、メシニコウィア ビクスピダタ（Metschnikowia bicuspidata）、メシニコウィア レウカウフィ（Metschnikowia reukaufii）及びメシニコウィア ルナタ(Metschnikowia lunata)等のメシニコウィア（Metschnikowia）属に属する微生物；
クリプトコッカス クルバタス（Cryptococcus curvatus）、クリプトコッカス フラバス（Cryptococcus flavus）、クリプトコッカス フミコラス（Cryptococcus humicolus）及びクリプトコッカス ロウレンティ（Cryptococcus laurentii）等のクリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物；
キャンディダ アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ アジマ（Candida azyma）、キャンディダ インターメディア（ Candida intermedia）、キャンディダ ソラニ（Candida solani）、キャンディダ ファマタ（Candida famata）、キャンディダ ギリエモンディ（Candida guilliermondii）、 キャンディダ パラプシロシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ ルゴサ（Candida rugosa）、キャンディダ トロピカリス（Candida tropicalis）及びキャンディダ モリシアナ（Candida molischiana）等のキャンディダ（Candida）属に属する微生物；
フィロバシディウム カプサリゲナム（Filobasidium capsuligenum）等のフィロバシディウム（Filobasidium）属に属する微生物；
オガタエア グリコザイマ（Ogataea glucozyma）及びオガタエア ミヌタ（Ogataea minuta）等のオガタエア（Ogataea）属に属する微生物；
シテロマイセス マトリテンシス（Citeromyces matritensis）等のシテロマイセス(Citeromyces)属に属する微生物；
ヤロウィア リポティカ（Yarrowia lipolytica）等のヤロウィア(Yarrowia)属に属する微生物；
ロドトルラ グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ オウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）及びロドトルラ ムシラギノサ（Rhodotorula mucilaginosa）等のロドトルラ(Rhodotorula)属に属する微生物；
エキソフィアラ デルマティティヂス（Exophiala dermatitidis）等のエキソフィアラ（Exophiala）属に属する微生物；
トリゴノプシス バリアビリス（Trigonopsis variabilis）等のトリゴノプシス(Trigonopsis)属に属する微生物；
シゾサッカロマイセス ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス(Shizosaccharomyces)属に属する微生物；
ウィケルハミエラ ドメルキー（Wickerhamiella domercqii）等のウィケルハミエラ(Wickerhamiella)属に属する微生物；
ピキア ピタルソニ（Pichia petersonii）及びピキア アノマラ（Pichia anomala）等のピキア(Pichia)属に属する微生物；
サッカロマイコプシス フィブリゲラ(Saccharomycopsis fibuligera)及びサッカロマイコプシス クラタエゲンシス(Saccharomycopsis crataegensis)等のサッカロマイコプシス (Saccharomycopsis)属に属する微生物；
サイトエラ コンプリカタ(Saitoella complicata) 等のサイトエラ(Saitoella)属に属する微生物；
サッカロマイセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae) 等のサッカロマイセス (Saccharomyces)属に属する微生物；
ロドスポリジウム トルロイデス(Rhodosporidium toruloides) 等のロドスポリジウム (Rhodosporidium)属に属する微生物；
アシネトバクター カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)等のアシネトバクター属(Acinetobacter) に属する微生物；
ブレビバクテリウム リネンス(Brevibacterium linens) 及びブレビバクテリウム サッカロリティカム(Brevibacterium sacchrolyticum)等のブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物；
セルロモナス ゲリダ(Cellulomonas gelida)、セルロモナス フラビゲナ(Cellulomonas flavigena) 、セルロモナス ウダ(Cellulomonas uda)等のセルロモナス(Cellulomonas) 属に属する微生物；
コリネバクテリウム アンモニアジェネス (Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム ビタルミニス (Corynebacterium vitaeruminis)及びコリネバクテリウム バリアビル (Corynebacterium variabile)等のコリネバクテリウム (Corynebacterium)属に属する微生物；
クルトバクテリウム フラカムファシエンス(Curtobacterium flaccumfaciens) 等のクルトバクテリウム(Curtobacterium)属に属する微生物が挙げられる。
【００２９】
上記微生物の好ましい具体例としては、メシニコウィア プルケリマ（Metschnikowia pulcherrima）ＩＦＯ ０８６３株、メシニコウィア プルケリマ（Metschnikowia pulcherrima）ＩＡＭ １２１９６株、メシニコウィア プルケリマ（Metschnikowia pulcherrima）ＩＡＭ １２１９７株、メシニコウィア プルケリマ（Metschnikowia pulcherrima）ＩＦＯ １４０７株、メシニコウィア プルケリマ（Metschnikowia pulcherrima）ＩＦＯ １０７９６株、メシニコウィア ビクスピダタ（Metschnikowia bicuspidata）ＩＦＯ １４０８株、メシニコウィア レウカウフィ（Metschnikowia reukaufii）ＩＦＯ １０７９８及びメシニコウィア ルナタ(Metschnikowia lunata) ＩＦＯ １６０５株；
クリプトコッカス クルバタス（Cryptococcus curvatus）ＩＦＯ １１５９株、クリプトコッカス フミコラス（Cryptococcus humicolus）ＩＦＯ １０２５０株、クリプトコッカス フラバス（Cryptococcus flavus）ＩＦＯ ０４０７株、クリプトコッカス ロウレンティ（Cryptococcus laurentii）ＩＦＯ ０６０９株、クリプトコッカス ロウレンティ（Cryptococcus laurentii）ＩＦＯ１３７６株、クリプトコッカス 変種ロウレンティ（Cryptococcus laurentii var laurentii）ＣＢＳ ５５３９株、クリプトコッカス ロウレンティ変種ロウレンティ（Cryptococcus laurentii var laurentii）ＣＢＳ ２１７４株、クリプトコッカス ロウレンティ変種ロウレンティ（Cryptococcus laurentii var laurentii）ＣＢＳ ５７４６株、クリプトコッカス ロウレンティ変種ロウレンティ（Cryptococcus laurentii var laurentii）ＣＢＳ ７１４０株及びクリプトコッカス ロウレンティ変種ロウレンティ（Cryptococcus laurentii var laurentii）ＣＢＳ ７２３５株；
キャンディダ アルビカンス（Candida albicans）ＩＦＯ １５９４株、キャンディダ アジマ（Candida azyma）ＪＣＭ １６９１株、キャンディダ インターメディア（Candida intermedia）ＩＦＯ ０７６１株、キャンディダ ソラニ（Candida solani）ＩＦＯ ０７６２株、キャンディダ ファマタ（Candida famata）ＲＩＦＹ ７４５５株（同菌株はＩＦＯ ０８５６株としても入手できる）、キャンディダ ギリエモンディ（Candida guilliermondii）ＩＦＯ ０５６６株、キャンディダ パラプシロシス（Candida parapsilosis）ＣＢＳ ０６０４株、キャンディダ ルゴサ（Candida rugosa）ＩＦＯ ０５９１株、キャンディダ トロピカリス（Candida tropicalis）ＩＦＯ ０６１８株、キャンディダ トロピカリス（Candida tropicalis）ＩＦＯ １４０４株、キャンディダ トロピカリス（Candida tropicalis）ＩＦＯ １６４７株及びキャンディダ
モリシアナ（Candida molischiana）ＩＦＯ １０２９６株；
フィロバシディウム カプサリゲナム（Filobasidium capsuligenum）ＩＦＯ１１１９株及びフィロバシディウム カプサリゲナム（Filobasidium capsuligenum）ＩＦＯ １１８５株；
オガタエア グリコザイマ（Ogataea glucozyma）ＩＦＯ １４７２株及びオガタエア ミヌタ 変種ノンファーメンタス（Ogataea minuta var nonfermentans）ＩＦＯ １４７３株；
シテロマイセス マトリテンシス（Citeromyces matritensis）ＩＦＯ ０６５１株及びシテロマイセス マトリテンシス（Citeromyces matritensis）ＩＦＯ ０９５４株；
ヤロウィア リポティカ（Yarrowia lipolytica）ＩＦＯ １２０９株；
ロドトルラ グルティニス変種ダイレネンシス（Rhodotorula glutinis var dairenensis）ＩＦＯ ０４１５株、ロドトルラ グルティニス変種グルティニス（Rhodotorula glutinis var glutinis）ＩＦＯ ０３９５株、ロドトルラ オウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）ＩＦＯ ０７５４株、ロドトルラ ムシラギノサ（Rhodotorula mucilaginosa）ＩＦＯ ０００３株；
エキソフィアラ デルマティティヂス（Exophiala dermatitidis）ＩＦＯ ６４２１株及びエキソフィアラ デルマティティヂス（Exophiala dermatitidis）ＩＦＯ ８１９３株；
トリゴノプシス バリアビリス（Trigonopsis variabilis）ＣＢＳ １０４０株及びトリゴノプシス バリアビリス（Trigonopsis variabilis）ＩＦＯ ０６７１株；
シゾサッカロマイセス ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）ＩＦＯ ０３４４株及びシゾサッカロマイセス ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）ＩＦＯ １６２８株；
ウィケルハミエラ ドメルキー（Wickerhamiella domercqii）ＩＦＯ １８５７株；
ピキア ピタソニー（Pichia petersonii）ＩＦＯ １３７２株及びピキア アノマラ（Pichia anomala）ＩＦＯ ０１１８株；
サッカロマイコプシス フィブリゲラ(Saccharomycopsis fibuligera)ＩＦＯ０１０５株及びサッカロマイコプシス クラタエゲンシスＩＦＯ １７０８株(Saccharomycopsis crataegensis)；
サイトエラ コンプリカタ(Saitoella complicata) ＩＡＭ １２９６３株；
サッカロマイセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae) ＪＣＭ １８１８株、サッカロマイセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae) ＩＦＯ ０５６５株及びサッカロマイセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae) ＩＦＯ ０３０５株；
ロドスポリジウム トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)ＩＦＯ ０５５９株；
アシネトバクター カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)ＩＦＯ １２５５２株；
ブレビバクテリウム リネンス(Brevibacterium linens)ＪＣＭ １３２８株及びブレビバクテリウム サッカロリティカム(Brevibacterium sacchrolyticum) ＡＴＣＣ １４０６６株；
セルロモナス ゲリダ(Cellulomonas gelida)ＪＣＭ １４８９株、セルロモナス フラビゲナ(Cellulomonas flavigena）ＪＣＭ １４９０株及びセルロモナス ウダ(Cellulomonas uda)ＪＣＭ １４９２株；
コリネバクテリウム アンモニアジェネス (Corynebacterium ammoniagenes)ＪＣＭ １３０５株、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) ＪＣＭ １３０７株、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ １２８１３株、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ １３０３２株、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ １３８２６株、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ＡＴＣＣ １４０６７株、コリネバクテリウム アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum) ＡＴＣＣ １３８７０株、コリネバクテリウム ビタルミニス (Corynebacterium vitaeruminis)ＪＣＭ １３２３株及びコリネバクテリウム バリアビル (Corynebacterium variabile)ＪＣＭ ２１５４株；
クルトバクテリウム フラカムファシエンス(Curtobacterium flaccumfaciens) ＡＴＣＣ １２８１３株が挙げられる。
【００３０】
上記微生物として好ましくは、メシニコウィア（Metschnikowia）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キャンディダ（Candida）属、フィロバシディウム（Filobasidium）属、オガタエア（Ogataea）属、シテロマイセス(Citeromyces)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、エキソフィアラ（Exophiala）属、シゾサッカロマイセス(Shizosaccharomyces)属、ウィケルハミエラ（Wickerhamiella）属、ピキア(Pichia)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、サイトエラ(Saitoella)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属又はコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属するものである。
【００３１】
また、上記メシニコウィア（Metschnikowia）属に属する微生物として好ましくは、メシニコウィア プルケリマ（Metschnikowia pulcherrima）、及びメシニコウィア レウカウフィ（Metschnikowia reukaufii）が挙げられる。
【００３２】
クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物として好ましくは、クリプトコッカス フラバス（Cryptococcus flavus）、クリプトコッカス フミコラス（Cryptococcus humicolus）、及びクリプトコッカス ロウレンティ（Cryptococcus laurentii）が挙げられる。
【００３３】
キャンディダ（Candida）属に属する微生物として好ましくは、キャンディダインターメディア（Candida intermedia）、キャンディダ ソラニ（Candida solani）、キャンディダ ファマタ（Candida famata）及びキャンディダ モリシアナ（Candida molischiana）が挙げられる。
【００３４】
フィロバシディウム（Filobasidium）属に属する微生物として好ましくは、フィロバシディウム カプサリゲナム（Filobasidium capsuligenum）が挙げられる。
【００３５】
オガタエア（Ogataea）属に属する微生物として好ましくは、オガタエア グリコザイマ（Ogataea glucozyma）及びオガタエア ミヌタ（Ogataea minuta）が挙げられる。
【００３６】
シテロマイセス(Citeromyces)属に属する微生物として好ましくは、シテロマイセス マトリテンシス（Citeromyces matritensis）が挙げられる。
【００３７】
ロドトルラ(Rhodotorula)属に属する微生物として好ましくは、ロドトルラ グルティニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ オウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）及びロドトルラ ムシラギノサ（Rhodotorula mucilaginosa）が挙げられる。
【００３８】
エキソフィアラ （Exophiala）属に属する微生物として好ましくは、エキソフィアラ デルマティティヂス（Exophiala dermatitidis）が挙げられる。
【００３９】
シゾサッカロマイセス(Shizosaccharomyces)属に属する微生物として好ましくは、シゾサッカロマイセス ポンベ（Shizosaccharomyces pombe）が挙げられる。
【００４０】
ウィケルハミエラ（Wickerhamiella）属に属する微生物として好ましくは、ウィケルハミエラ ドメルキー（Wickerhamiella domercqiae）が挙げられる。
【００４１】
ピキア(Pichia)属に属する微生物として好ましくは、ピキア ピタルソニ（Pichia petersonii）及びピキア アノマラ（Pichia anomala）が挙げられる。
【００４２】
サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属に属する微生物として好ましくは、サッカロマイコプシス フィブリゲラ(Saccharomycopsis fibuligera)が挙げられる。
【００４３】
サイトエラ(Saitoella)属に属する微生物として好ましくは、サイトエラ コンプリカタ(Saitoella complicata) が挙げられる。
【００４４】
サッカロマイセス (Saccharomyces)属に属する微生物として好ましくは、サッカロマイセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。
【００４５】
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属に属する微生物として好ましくは、ロドスポリジウム トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）が挙げられる。
【００４６】
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物として好ましくは、ブレビバクテリウム サッカロリティカム(Brevibacterium sacchrolyticum)が挙げられる。
【００４７】
コリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物として好ましくは、コリネバクテリウム アンモニアジェネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)及びコリネバクテリウム ビタルミニス (Corynebacterium vitaeruminis)等が挙げられる。
【００４８】
又、原料として、式（I）で表される化合物を用いて式（IＶ）で表される化合物を製造する場合には、その製造中間体として、式（II'）で表される化合物を経由する場合と、式（III'）で表される化合物を経由する場合がある。
【００４９】
ついては、式（Ｉ）で表される化合物から、あらかじめ式（II'）で表される化合物及び式（III'）で表される化合物を製造し、それを単離してから、さらに式（IＶ）で表される化合物へ誘導してもよいし、式（II'）で表される化合物及び式（III'）で表される化合物を単離することなく、そのまま式（IＶ）で表される化合物を製造してもよい。
【００５０】
加えて、原料として、式（Ｉ）で表される化合物を用いる場合には、１種の微生物を用いて式（IＶ）で表される化合物を製造してもよいし、２種以上の微生物を組み合わせて製造してもよい。
【００５１】
原料として、式（Ｉ）で表される化合物を用いる場合に特に好ましい微生物としては、
クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キャンディダ（Candida）属、フィロバシディウム（Filobasidium）属、オガタエア（Ogataea）属、ヤロウィア(Yarrowia)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、エキソフィアラ（Exophiala）属及びトリゴノプシス(Trigonopsis)属に属する微生物であり、さらに好ましくはクリプトコッカス（Cryptococcus）属、キャンディダ（Candida）属、フィロバシディウム（Filobasidium）属、オガタエア（Ogataea）属及びロドトルラ(Rhodotorula)属に属する微生物であり、最も好ましくはオガタエア（Ogataea）属に属する微生物である。
【００５２】
原料として、式(II)で表される化合物を用いる場合に特に好ましい微生物としては、
メシニコウィア（Metschnikowia）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キャンディダ（Candida）属、フィロバシディウム（Filobasidium）属、オガタエア（Ogataea）属、シテロマイセス(Citeromyces)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、エキソフィアラ（Exophiala）属、トリゴノプシス(Trigonopsis)属、シゾサッカロマイセス(Shizosaccharomyces)属、ウィケルハミエラ(Wickerhamiella)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、サイトエラ（Saitoella）属、ピキア(Pichia)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属及びクルトバクテリウム（Curtobacterium）属に属する微生物である。
【００５３】
上記微生物のうちより好ましくはメシニコウィア（Metschnikowia）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キャンディダ（Candida）属、フィロバシディウム（Filobasidium）属、オガタエア（Ogataea）属、シテロマイセス(Citeromyces)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、シゾサッカロマイセス(Shizosaccharomyces)属、ウィケルハミエラ(Wickerhamiella)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、サイトエラ（Saitoella）属、ピキア(Pichia)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属又はコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物であり、さらに好ましくはメシニコウィア（Metschnikowia）属、キャンディダ（Candida）属、オガタエア（Ogataea）属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、シゾサッカロマイセス(Shizosaccharomyces)属、ウィケルハミエラ(Wickerhamiella)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、サイトエラ（Saitoella）属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属又はコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物である。最も好ましくはメシニコウィア（Metschnikowia）属、キャンディダ（Candida）属、オガタエア（Ogataea）属、シゾサッカロマイセス(Shizosaccharomyces)属、サイトエラ（Saitoella）属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属及びコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物である。
【００５４】
原料として、式(III)で表される化合物を用いる場合に特に好ましい微生物としては、
クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キャンディダ（Candida）属、フィロバシディウム（Filobasidium）属、ロドトルラ(Rhodotorula)属及びピキア（Pichia）属に属する微生物であり、より好ましくは、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キャンディダ（Candida）属及びロドトルラ(Rhodotorula)属に属する微生物である。
【００５５】
尚、上記微生物のうち、ＩＦＯ番号の付された微生物は（財）発酵研究所（ＩＦＯ）発行のインターネットカタログ（http://www.ifo.or.jp）に記載されており、該ＩＦＯから入手することができる。
【００５６】
ＣＢＳ番号の付された微生物はThe Centraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）のインターネットカタログ（http://www.cbs.knaw.nl）に記載されており、該ＣＢＳから入手することができる。
【００５７】
ＡＴＣＣ番号の付された微生物はAmerican Type Culture Collection（ATCC）のインターネットカタログ（http://www.atcc.org）に記載されており、該ＡＴＣＣから入手することができる。
【００５８】
ＩＡＭ番号の付された微生物は、IAM Culture Collection（IAM）のインターネットカタログ（http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/misyst/ColleBOX/IAMcollection.html）に記載されており、該IAMから入手することができる。
【００５９】
ＪＣＭ番号の付された微生物はJapan Collection of Microorganism（JCM）のインターネットカタログ（http://www.jcm.riken.go.jp）に記載されており、該ＪＣＭから入手することができる。
【００６０】
ＲＩＦＹ番号の付された微生物はResearch Institute of Fermentation, Yamanashi Univ. Kofu Japan（RIFY）のカタログに記載されており、該ＲＩＦＹから入手することができる。
【００６１】
上記微生物は野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株を用いてもよい。
【００６２】
あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
【００６３】
また、組換え株の発現株としては、もとの菌株の他、大腸菌等のバクテリアや酵母などを用いてもよく、これらの組換え株も上記微生物という概念に含まれる。
【００６４】
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が、菌体及び／または菌体処理物として反応に供される。
【００６５】
具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体または菌体処理物から還元能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等を通常の固定化技術を用いて、すなわち、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００６６】
次に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
【００６７】
本発明の製造方法において微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については定法通り行うことができる。本微生物の培養の為に用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、サッカロース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、キシリトール等のポリアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、大豆抽出物などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム塩、硝酸アンモニウム塩などの無機窒素源、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。更に、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドその他のビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。
【００６８】
培地中における上記炭素源、窒素源、無機イオン及びビタミンの量としては、菌株培養において一般的に用いられる範囲であれば特に限定されないが、炭素源及び窒素源は、それぞれ通常０．００１〜５０ｗｔ％、好ましくは０．１〜５ｗｔ％添加される。無機イオンは、通常０．０００１〜５ｗｔ％、好ましくは０．００１〜１ｗｔ％添加される。ビタミンは、通常０．００００１〜１０ｗｔ％、好ましくは０．００１〜１ｗｔ％添加される。
【００６９】
培養は、好気的条件下で、ｐＨ約３〜１１、温度約４〜５０℃の適当な範囲に制御しつつ、１〜１００時間行う。
【００７０】
反応方法としては、本微生物を培養し、それにより得られた菌体及び／または該菌体処理物を含有する水性媒体に式（I）〜（III）で表される化合物またはそれらの混合物を添加し、目的とする式（IV）で表される化合物を得る方法、培地に式（I）〜（III）で表される化合物またはそれらの混合物を添加し微生物を培養しながら反応を行う方法、培養終了後、そのままの培地に、式（I）〜（III）で表される化合物またはそれらの混合物を添加して、引き続いて反応を行う方法、あるいは、式（Ｉ）で表される化合物を上述のいずれかの方法に供し、ある程度反応が進んだところで、系内の式（I）〜（III）で表される化合物の含有量に応じ、別途培養した微生物を追添加する方法等を適宜用いることができる。
【００７１】
上記水性媒体としては、リン酸ナトリウムやリン酸カリウムなどを用いた緩衝液、及び、その緩衝液に有機溶媒や界面活性剤などを適宜加えたものを示す。
【００７２】
有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の水溶性溶媒や酢酸ブチルやヘキサン等の非水溶性有機溶媒などが挙げられる。界面活性剤としてはＴｗｅｅｎ８０やシュガーエステルなどが挙げられる。
【００７３】
緩衝液の濃度としては１Ｍ以下、好ましくは０．２Ｍ以下の濃度で用いるのがよい。
【００７４】
反応は温度４〜７０℃、好ましくは１５〜５０℃の範囲で行い、ｐＨは２〜９、好ましくは４〜８の範囲で行う。
【００７５】
式（I）〜（III）で表される化合物またはそれらの混合物の濃度としては、反応液に対して、０．０００１〜１０ｗｔ％、好ましくは０．００１〜５ｗｔ％の範囲が望ましく、必要ならば、式（I）〜（III）で表される化合物またはそれらの混合物は、反応の間、追補添加してもよい。
【００７６】
また、反応を促進するために補酵素、補酵素とその再生システム、あるいは炭素源を適宜添加してもよい。
【００７７】
補酵素としては、通常、β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide, Reduced Form(以下ＮＡＤＨと略す)あるいはβ-Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, Reduced Form（以下ＮＡＤＰＨと略す）が挙げられる。添加量としては反応基質の１００万分の１当量〜１０当量、好ましくは１万分の１当量〜１０当量である。
【００７８】
補酵素の再生システムとしては、蟻酸脱水素酵素等のβ-Nicotinamide Adenine Dinucleotide(以下ＮＡＤと略す)をＮＡＤＨに還元する能力を有する酵素とその酵素基質（蟻酸）の組み合わせやグルコース脱水素酵素等のβ-Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate（以下ＮＡＤＰと略す）をＮＡＤＰＨに還元する能力を有する酵素とその酵素基質（グルコースなど）の組み合わせ等が挙げられる。補酵素を再生するこれらの酵素は市販のものでもよいし、補酵素の再生能を有する微生物の菌体及び／または該菌体処理物でもかまわない。これらシステムの添加量は反応基質の量にあわせて適宜決定される。
【００７９】
上記反応を促進するための炭素源としては、反応に用いる菌体及び／または該菌体処理物が補酵素を再生するために利用しうる炭素源であればいずれでもかまわないが、例えばグルコース、フルクトース、サッカロース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、キシリトール等のポリアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。添加量としては０．０００１〜５０ｗｔ％、好ましくは０．０１〜１０ｗｔ％である。
【００８０】
上記の通り、反応は水性媒体を用いて行われるが、式（I）〜（III）で表される化合物は、水に対しての溶解度が低いため、有機溶媒や界面活性剤等にあらかじめ溶解あるいは懸濁して添加する事により反応系中に均一に分散させる方が好ましい。
【００８１】
上記製造方法で得られる式（IV）で表される化合物は、通常、反応液から有機溶媒で抽出した後に、通常の精製方法、すなわちクロマトグラフィーや晶析技術を用いて不純物を除去することにより、精製された式（IV）で表される化合物を得ることができる。具体的には、式（IV）で表される化合物を有機溶媒などで可溶化した後に微生物などの固形分を遠心分離、フィルタープレス、限外濾過などの通常の分離装置により除去することで、式（IV）で表される化合物を含有する液体を得る。得られた液体を通常の方法で、すなわちクロマトグラフィーや晶析技術を用いることで不純物を除去し、精製された式（IV）で表される化合物を得ることができる。
【００８２】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
【００８３】
尚、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類（以後、「ＤＯＬＥ」と略記する）は、目的とする３Ｒ，５Ｓ体の他に異性体として、３Ｓ，５Ｒ体、３Ｒ，５Ｒ体及び３Ｓ，５Ｓ体が存在し、その構造式は以下の通りである。
【００８４】
３Ｓ，５Ｒ−ＤＯＬＥ及び３Ｒ，５Ｓ−ＤＯＬＥはシン（Ｓｙｎ）体のＤＯＬＥであり、 ３Ｓ，５Ｓ−ＤＯＬＥ及び３Ｒ，５Ｒ−ＤＯＬＥはアンチ（ａｎｔｉ）体のＤＯＬＥである。
【００８５】
実施例中、目的生成物である３Ｒ，５Ｓ体の純度をジアステレオマー過剰率及びエナンチオマー過剰率で示すことがあるが、本明細書では、ジアステレオマー過剰率を（syn-DOLE − anti-DOLE）／（syn-DOLE ＋ anti-DOLE）で、エナンチオマー過剰率を（3R,5S体 − 3S,5R体）／（3R,5S体 ＋ 3S,5R体）で示した。
【００８６】
【化２２】

〈製造例１〉（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジオキソヘプト−６−エン酸エチルエステル（以後、ＤＯＸＥと略す）の合成
攪拌機、滴下ロートおよび温度計を付けた５００ｍＬの四つ口フラスコに、（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−５−ヒドロキシ−３−オキソヘプト−６−エン酸エチルエステル（以後、５−ＭＯＬＥと略す）５．０２ｇ（１１．２２ｍｍｏｌ）およびアセトン４２０ｍＬを加え攪拌する。調製されたＪｏｎｅｓ酸化剤（濃硫酸３ｍＬと酸化クロム３．３５ｇを混合させた後、水で２５ｍＬまで希釈することにより得られた試剤）１０．５ｍＬを０℃で２０分を要して滴下し、氷冷下で２時間攪拌を行った後、メタノール１０ｍＬをゆっくり加えて反応を停止した。次に反応混合液を減圧下、アセトンを留去させた後、酢酸エチル２５０ｍＬを加え、得られた溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液６０ｍＬで２回、引き続き飽和食塩水溶液６０ｍＬで２回抽出・分液した後、酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製して、標記化合物３．０３ｇ（収率：６０．６％）を得た。
【００８７】
¹H-NMR(300MHz, CDCl₃, δppm): 7.79-7.19(8H, m), 7.71(1H, d), 6.03(1H, d), 5.51(1H,s), 4.21(2H, q), 3.40(2H, s), 2.35-2.40(1H, m), 1.39-1.41 (2H, m), 1.28(3H, t) ,1.07-1.09(2H, m).
〈製造例２〉５Ｓ-（Ｅ）-７-［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−５−ヒドロキシ−３−オキソヘプト−６−エン酸エチルエステル（以後、５Ｓ−ＭＯＬＥと略す）の合成
減圧下加熱乾燥した後に窒素ガスを導入したシュレンク管に、（Ｓ）−２−［Ｎ−（３，５−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ブチルサリチリデン）アミノ］−３−メチル−１−ブタノ−ル０．８７ｇ（３．３ｍｍｏｌ）、塩化メチレン５ｍｌおよびチタンテトラエトキシド０．６３ｍｌ（６．０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で１時間攪拌混合した。該シュレンク管を−５０℃に冷却後、（Ｅ）−３−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−プロプ−２−エン−１−ア−ル０．９５ｇ（３．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２ｍｌに溶解して滴下し、５分間攪拌した後、更にジケテン０．５１ｇ（６ｍｍｏｌ）を添加し、−５０℃を保ちながら２２時間攪拌して反応させた。得られた反応混合液を、塩化メチレン２５ｍｌと０．２４Ｍ重曹水２５ｍｌの混合溶液中に添加し、２時間、室温で激しく攪拌し２層溶液を得た。得られた２層溶液は分液し、水層については塩化メチレン１０ｍｌで抽出を２回行った。塩化メチレン層と塩化メチレン抽出液とを合わせて塩化メチレン溶液を得た。該塩化メチレン溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した後、シリカゲルクロマトグラフィ−（溶出溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）で精製して、５Ｓ-（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−５−ヒドロキシ−３−オキソヘプト−６−エン酸エチルエステル０．７５ｇを得た（光学純度：７３％ｅｅ、（Ｅ）−３−[２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル]−プロプ−２−エン−１−ア−ルに対する収率：５６％）。
【００８８】
〈実施例１〉ＤＯＸＥからのＤＯＬＥの製造
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇ／Ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）５ｇ／Ｌ，麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）３ｇ／Ｌ、グルコース（日本食品加工社製）２０ｇ／Ｌの組成からなる液体培地２．５ｍＬに、表１に示した各種の菌株を接種し、３０℃で２１時間好気的に培養した。得られた培養液を１ｍＬづつとり遠心分離し、菌体を集めた。この菌体に化合物（Ｉ）（式中、Ｒ＝エチル基の化合物：ＤＯＸＥ）を含む反応液を０．２５ｍＬ加え、３０℃で２０時間好気的に反応させた。
【００８９】
尚、上記反応液の組成は、ＤＯＸＥを０．３ｇ／Ｌ、グルコース（日本食品加工社製）２０ｇ／Ｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（キシダ化学社製）２０ｍＬ／Ｌ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）である。
【００９０】
反応終了後、反応液に酢酸エチルを０．５ｍＬ加え激しく混合し、遠心分離にて有機層と水層とに分離した。有機層を別の容器に移し、溶媒を濃縮遠心機で留去し、乾固された生成物を酢酸エチル０．０１ｍＬで溶解し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をおこなった。ＴＬＣはシリカゲルプレート（メルク社製silica gel 60 F ₂₅₄)を用い、展開溶媒はヘキサン／酢酸エチル＝１／１を用いた。
【００９１】
展開終了後、ＵＶランプにて生成物の確認をした。化合物（Ｉ）はＲｆ＝０．７６〜０．８６、化合物（II）および化合物（III）は０．５４〜０．６１、化合物（IV）（式中、Ｒ＝エチル基の化合物：ＤＯＬＥ）はＲｆ＝０．３３である。ＤＯＬＥのＴＬＣ上のスポットを掻き取りイソプロパノール０．２５ｍＬで溶出し、遠心分離後上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度およびＴＬＣ掻き取りサンプルの濃度を分析した。
【００９２】
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：CHIRALCEL AD（ダイセル化学工業株式会社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール＝９／１
流速 ：0.5ml/min
検出 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：室温
結果を表１に示す。
【００９３】
【表１】

〈実施例２〉ＤＯＸＥからのＤＯＬＥの製造
実施例１と同組成の液体培地２．５ｍＬに、オガタエア ミヌタ変種ノンファーメンタス IFO1473を接種し、２７℃で２４時間と４８時間とそれぞれ時間を変えて好気的に培養した。得られた培養液を１ｍｌづつとり遠心分離し、菌体を集めた。この菌体に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを加え完全に懸濁後、５０％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液を２０μl、５ｇ／ＬのＤＯＸＥ（ＤＭＳＯ溶液）を５０μl添加し、よく攪拌後、２７℃で２０時間反応させた。
【００９４】
反応終了後、実施例１と同様に酢酸エチル抽出およびＴＬＣを行い、ＤＯＬＥのＴＬＣのスポットを掻き取りイソプロパノール２００μlで溶出し、遠心分離後、上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度およびＤＯＬＥの生成量を分析した。
【００９５】
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：CHIRALCEL AD（ダイセル化学工業株式会社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール＝９５／５
流速 ：１ml/min
検出 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：室温
結果を表２に示す。
【００９６】
【表２】

また、上記ＴＬＣを行った際に、５−ＭＯＬＥもしくは３−ＭＯＬＥに相当するＲｆのスポットがあったので、２４時間培養のものについてのみ同様に掻き取り、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて生成量の分析を行った。
【００９７】
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ２ＭＧＭ（４．６ｘ１５０ｍｍ）（三菱化学社製）
溶離液：メタノール／アセトニトリル／水／リン酸＝８００／１００／１００／０．５
流速 ：０．６ml/min
検出 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：６０℃
本ＨＰＬＣ条件では５−ＭＯＬＥはリテンションタイムは４．７３であり、３−ＭＯＬＥは５．４７であったところ、５−ＭＯＬＥの上記ＴＬＣ掻き取りサンプル濃度は、２５．２ｍｇ／Ｌであり、３−ＭＯＬＥのサンプル濃度は２．２ｍｇ／Ｌであった。
ちなみに、上記分析条件におけるＤＯＬＥのリテンションタイムは４．０２であり、ＤＯＸＥは８．０２である。
【００９８】
〈実施例３〉ＤＯＸＥからのＭＯＬＥの製造
実施例１と同組成の液体培地２．５ｍＬに、ロドトルラ オウランティアカ IFO 0754及びロドトルラ グルティニス変種ダイレネンシス IFO 0415をそれぞれ接種して、２７℃で、ロドトルラ オウランティアカは２４時間、ロドトルラ グルティニス変種ダイレネンシスは４８時間、それぞれ好気的に培養した。それぞれ得られた培養液を１ｍｌづつとり遠心分離し、菌体を集めた。この菌体に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを加え完全に懸濁後、５０％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液を２０μl、２ｇ／ＬのＮＡＤＰとＮＡＤ混合液を２０μl、１０ｇ／ＬのＤＯＸＥ（ＤＭＳＯ溶液）を３０μl添加し、よく攪拌後、２７℃で１２時間好気的に反応させた。
【００９９】
反応終了後、実施例１と同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行い、５−ＭＯＬＥもしくは３−ＭＯＬＥに相当するＲｆのスポット部分とＤＯＬＥに相当するＲｆのスポット部分とをそれぞれ掻き取った。
【０１００】
その後、ＤＯＬＥについては、
カラム：CHIRALCEL AD（ダイセル化学工業株式会社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール＝９５／５
流速 ：１ml/min
検出 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：室温
の条件で、ＭＯＬＥについては、
カラム：ＭＣＩＧＥＬ ＣＨＰ２ＭＧＭ（４．６ｘ１５０ｍｍ）（三菱化学社製）
溶離液：メタノール／アセトニトリル／水／：リン酸＝８００／１００／１００／０．５
流速 ： ０．６ml/min
検出 ： ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ： ６０℃
の条件でそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析を行った。
【０１０１】
結果を表３に示す。
【０１０２】
【表３】

〈実施例４〉ＤＯＸＥからの３−ＭＯＬＥの製造
実施例１と同組成の液体培地２．５ｍＬに、キャンディダ インターメディア IFO 0761を接種して、２７℃で２４時間培養後、実施例２と同様の操作でＤＯＸＥと反応させ、反応後同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行い、スポットのＨＰＬＣ分析を行ったところ、３−ＭＯＬＥのＴＬＣ掻き取りサンプルの濃度は156.9mg/Lであった。
【０１０３】
〈実施例５〉ＤＯＸＥからの３−ＭＯＬＥの製造
実施例１と同組成の液体培地２Ｌに、フィロバシディウム カプサリゲナム（Filobasidium capsuligenum）ＩＦＯ １１８５株を接種し、３０℃で２１時間好気的に培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集めた。１０％（ｗ／ｖ）の菌体懸濁液を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いて作製し、この懸濁液１２ｍＬを３０φの試験管６本に取り、それぞれに１０％（ｗ／ｖ）のＤＯＸＥ（ＤＭＳＯ溶液）０．１ｍＬおよび５０％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液０．１５ｍＬを加え、３０℃で２０時間好気的に反応させた。
【０１０４】
反応終了後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出物は、実施例１と同条件でＴＬＣを行い、化合物（III）を含む部分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルから酢酸エチルにて抽出し、サンプルを¹Ｈ−ＮＭＲにて分析した。
【０１０５】
¹H-NMR(４00MHz, CDCl₃, δppm):１．０２（ｄｔ，Ｊ＝６．４，３．２Ｈｚ，２Ｈ）、１．２１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、１．３３（ｄｔ，Ｊ＝６．４，３．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．２６（ｍ，１Ｈ）、２．４３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．６０−２．６６（ｄｄ，Ｊ＝６．４，６．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．３７（ｍ，１Ｈ）、４．１１（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、４．３４−４．４１（ｍ，１Ｈ）、６．２７（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．０６−７．３６（ｍ，６Ｈ）、７．５２−７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．６０（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．９０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）
この結果から３−ＭＯＬＥが生成したことが確認された。
【０１０６】
さらに、以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度を分析したところ、化合物（III'）が光学純度は８７．３％ｅｅで得られたことがわかった。
【０１０７】
なお、本例におけるＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：CHIRALCEL AD（ダイセル化学工業株式会社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸＝９００／１００／１
流速 ：１ml/min
検出 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：室温
〈実施例６〉ＤＯＸＥからのＤＯＬＥ及び３Ｒ−ＭＯＬＥの製造
実施例１と同組成の液体培地が５０ｍＬ入った５００ｍｌフラスコを１２０℃で２０分滅菌した。このフラスコ８本に、オガタエア ミヌタ変種ノンファーメンタス IFO1473を接種し、２８℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液をイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ／Ｌ，麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）６ｇ／Ｌ、グルコース（日本食品加工社製）（別殺菌）２０ｇ／Ｌの組成からなる液体培地２０Ｌが入った３０Ｌジャーファーメンター２台に４本分づつ植菌し、２８℃で２４時間培養した。培養後、培養液を遠心分離し、菌体を集めた。
【０１０８】
この菌体を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）９Ｌに加え完全に懸濁後、３等分し、それぞれ５Ｌジャーファーメンターに入れた。各ファーメンターにグルコース（日本食品加工社製）を５３ｇ、ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母社製）を２ｇ、１．６６ｇのＤＯＸＥを１３０ｍｌのＤＭＳＯに溶かした溶液を添加し、４０℃で６時間好気的に反応させた。ＮＡＤＰＨはさらに２ｇづつ、反応１時間後に再添加した。反応後、各ファーメンターの反応液を一部取り、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて生成量を分析したところＤＯＬＥは全部で３．４３ｇ生成されていた。（収率７１％）
反応液をそれぞれ遠心分離し、沈殿物を集めた。沈殿物に各６００ｍｌのアセトニトリルを添加し、十分に攪拌後、遠心を行い上清と沈殿に分け、沈殿側にはさらに２００ｍｌのアセトニトリル２００ｍｌで再懸濁と遠心を行った。上清をすべてあわせてエバポレーターにて濃縮を行い、濃縮後、酢酸エチル６００ｍｌを加え溶解後水５０ｍｌで２回洗浄した。
【０１０９】
酢酸エチル層を濃縮し、シリカゲルクロマトによる精製を行った。シリカゲル４００ｍｌ分をカラムに入れ、ヘキサン：酢酸エチル＝２：１の液で予め平衡化しておいた。濃縮されたサンプルをアプライしヘキサン：酢酸エチル＝２：１の展開溶媒を２Ｌ流した後、ヘキサン：酢酸エチル＝３：２に展開溶媒を変更しさらに２Ｌ流しながら溶出させた。
【０１１０】
溶出された液は２００ｍｌづつの画分とし（全２０）、各画分をＴＬＣで確認した。ＤＯＬＥが検出された画分を集め濃縮したところ３．４ｇのオイル状のＤＯＬＥが得られ、純度換算したところ２．５ｇのＤＯＬＥが得られた。
【０１１１】
光学純度を上記実施例２に記載の条件でＨＰＬＣ分析した所、面積比で３Ｓ，５Ｒ体：３Ｒ，５Ｒ体：３Ｒ，５Ｓ体：３Ｓ，５Ｓ体＝０．３：０．２：９８．９：０．６であった。（98.4%de、99.4%ee）
一方、カラム精製の画分で３−ＭＯＬＥが主成分として検出された所を集めたところ、１．５ｇのオイル状のものが得られたので、再度シリカゲルカラムにかけ、再精製したところ、０．７ｇの３Ｒ−ＭＯＬＥが得られた。
【０１１２】
光学純度を実施例２と同様に分析したところ９８％eeであった。
【０１１３】
〈実施例７〉５−ＭＯＬＥからのＤＯＬＥの製造
表４に示した各種の菌株を用い、反応基質としてＤＯＸＥの代わりにＲ−５ＭＯＬＥとＳ−５ＭＯＬＥが１：１の比で含まれる５−ＭＯＬＥを用いた以外は実施例１と同様の操作で反応を行った。
【０１１４】
ここで、生成物のＤＯＬＥのうち、３Ｓ，５Ｒ体及び３Ｒ，５Ｒ体は５Ｒ−ＭＯＬＥから生成され、３Ｒ，５Ｓ体及び３Ｓ，５Ｓ体は５Ｓ−ＭＯＬＥから生成される。
【０１１５】
反応終了後、実施例１と同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行った後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度および生成量の分析を行った。
【０１１６】
結果を表４に示す。
【０１１７】
【表４】

〈実施例８〉５−ＭＯＬＥからのＤＯＬＥの製造
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）８ｇ／Ｌ，大豆エキス ハイニュートＳＭＳ（不二製油社製）７ｇ／Ｌ、グルコース（日本食品加工社製）５ｇ／Ｌ、グリセロール（キシダ化学社製）１０ｇ／Ｌ、リン酸一カリウム（和光純薬社製）１ｇ／Ｌ、リン酸２カリウム（和光純薬社製）３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム（キシダ化学社製）０．５ｇ／Ｌ、塩化マンガン（和光純薬社製）１０ｍｇ／Ｌの組成からなる液体培地２．５ｍＬに、表５に示した各種の菌株を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を１ｍｌづつとり遠心分離し、菌体を集めた。この菌体に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを加え完全に懸濁後、５０％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液を１０μl、２ｇ／ＬのＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）とＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）の混合液を１０μl、Ｒ−５ＭＯＬＥとＳ−５ＭＯＬＥが１：１の比で含まれる５−ＭＯＬＥの５ｇ／Ｌ ＤＭＳＯ溶液を１０μl添加し、よく攪拌後、３０℃で２０時間好気的に反応させた。
【０１１８】
反応終了後、実施例１と同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行った。ＤＯＬＥのＴＬＣのスポットを掻き取りイソプロパノール２００μlで溶出し、遠心分離後上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度および生成量を分析した。
【０１１９】
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：CHIRALCEL AD（ダイセル化学工業株式会社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール＝９５／５
流速 ：１ml/min
検出 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：室温
結果を表５に示す。
【０１２０】
【表５】

〈実施例９〉５−ＭＯＬＥからのＤＯＬＥの製造
実施例１と同組成の液体培地２．５ｍＬに、表６に示した各種の菌株を接種し、２７℃で４８時間好気的に培養した。得られた培養液を１ｍｌづつとり遠心分離し、菌体を集めた。この菌体に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを加え完全に懸濁後、５０％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液を２０μl、Ｒ−５ＭＯＬＥとＳ−５ＭＯＬＥが１：１の比で含まれる５−ＭＯＬＥの５ｇ／Ｌ ＤＭＳＯ溶液を５０μl添加し、よく攪拌後、２７℃で２０時間反応させた。
【０１２１】
反応終了後、実施例８と同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行った後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度および生成量の分析を行った。
【０１２２】
結果を表６に示す。
【０１２３】
【表６】

〈実施例１０〉５−ＭＯＬＥからのＤＯＬＥの製造
酵母エキス（ＤＩｆｃｏ社製）１０ｇ／Ｌ、ニュートリエントブロス（ＤＩｆｃｏ社製）５ｇ／Ｌ，大豆エキス ハイニュートＳＭＳ（不二製油社製）３ｇ／Ｌ、グルコース（日本食品加工社製）１５ｇ／Ｌの組成からなる液体培地２ｍＬに、表７に示した各種の菌株を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を１ｍｌづつとり遠心分離し、菌体を集めた。この菌体に反応基質としてＤＯＸＥの代わりにＲ−５ＭＯＬＥとＳ−５ＭＯＬＥが１：１の比で含まれる５−ＭＯＬＥを用いた以外は実施例１と同様の操作で反応を行った。
【０１２４】
反応終了後、実施例１と同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行った後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度および生成量の分析を行った。結果を表７に示す。
【０１２５】
【表７】

〈実施例１１〉５Ｓ−ＭＯＬＥからのＤＯＬＥの製造
表８に示した各種の菌株を実施例１と同様に培養を行い、得られた培養液を１ｍｌづつとり遠心分離し、菌体を集めた。この菌体にグルコース（日本食品加工社製）を５ｇ／Ｌ、ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）を６０μｇ／Ｌ、グルコースデヒドロゲナーゼ（アマノ製薬社製：７３unit/mg）を２０μｇ／Ｌ含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を０．２５ｍｌ加え、よく懸濁した。
この懸濁液に製造例２で得られた光学純度が７３．０％eeの５Ｓ−ＭＯＬＥを１０ｇ／Ｌ含むＤＭＳＯを１０μl添加し、３０℃で２０時間好気的に反応させた。
【０１２６】
反応終了後、実施例１と同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行った後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度および生成量の分析を行った。
【０１２７】
結果を表８に示す。
【０１２８】
【表８】

【０１２９】
反応終了後、実施例８と同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度および生成量の分析を行った。
【０１３０】
結果を表９に示す。
【０１３１】
【表９】

〈実施例１３〉３Ｒ−ＭＯＬＥからのＤＯＬＥの製造
実施例１と同組成の液体培地２．５ｍＬに、表１０に示した各種の菌株を接種し、２７℃で４８時間好気的に培養した。得られた培養液を１ｍｌづつとり遠心分離し、菌体を集めた。この菌体に１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを加え完全に懸濁後、２ｇ／ＬのＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）とＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）混合液を１０μl、イソプロパノールを２０μl、実施例６で得られた３Ｒ−ＭＯＬＥの５ｇ／Ｌ ＤＭＳＯ溶液を２０μl添加し、よく攪拌後、２７℃で２０時間反応させた。
【０１３２】
反応終了後、実施例８と同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度および生成量の分析を行った。
【０１３３】
結果を表１０に示す。
【０１３４】
【表１０】

〈実施例１４〉ＤＯＸＥからのＤＯＬＥの製造
実施例１と同組成の液体培地２．５ｍＬに、ロドトルラ グルティニス変種ダイレネンシス IFO 0415を接種し、２７℃で４８時間好気的に培養した。得られた培養液１ｍｌを遠心分離し、菌体を集めた。
【０１３５】
また、実施例８と同組成の液体培地２．５ｍＬに、コリネバクテリウム グルタミカムATCC13826を接種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液１ｍｌを遠心分離し、菌体を集めた。
【０１３６】
両者をあわせ１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを加え完全に懸濁後、２ｇ／ＬのＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）とＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）混合液を１０μl、５０％（ｗ／ｖ）のグルコース溶液を１０μl、２０ｇ／ＬのＤＯＸＥ（ＤＭＳＯ溶液）を３０μl添加し、よく攪拌後、２７℃で１８時間反応させた。
【０１３７】
反応終了後、実施例１と同様に酢酸エチル抽出及びＴＬＣを行った後、実施例８と同様の条件で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度および生成量の分析を行ったところ、本反応では３Ｒ，５Ｓ−ＤＯＬＥのみが得られ、ＴＬＣ掻き取りサンプルの濃度は９．５ｍｇ／Ｌであった。
【０１３８】
〈実施例１５〉ＤＯＸＥからのＤＣＯＯＨの製造
表１１に示した各種の菌株を実施例１と同様に培養と反応を行い、ＴＬＣ上の化合物（IV）（式中、Ｒ＝水素の化合物：以下、ＤＣＯＯＨと略す）に相当するスポット（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、Ｒｆ＝０）を掻き取り、イソプロパノール０．２５ｍＬで溶出し、遠心分離後、上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した。
【０１３９】
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：CHIRALCEL AD（ダイセル化学工業株式会社製）
溶離液：ヘキサン／エタノール／トリフルオロ酢酸＝９００／１００／１
流速 ：１ml/min
検出 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：室温
結果を表１１に示す。
【０１４０】
【表１１】

〈実施例１６〉５−ＭＯＬＥからのＤＣＯＯＨの製造
表１２に示した各種の菌株を実施例１と同様に培養を行い、ＤＯＸＥの代わりに５−ＭＯＬＥを用いて同様に反応を行い、ＴＬＣ上の化合物（IV）（式中、Ｒ＝水素の化合物：以下、ＤＣＯＯＨと略す）に相当するスポット（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、Ｒｆ＝０）を掻き取り、イソプロパノール０．２５ｍＬで溶出し、遠心分離後、上清を実施例１５と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて光学純度を分析した。結果を表１２に示す。
【０１４１】
【表１２】

【０１４２】
【発明の効果】
本発明によれば、３Ｒ，５Ｓ−（Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類を光学純度よく、かつ、効率的に製造することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to (3R, 5S)-(E) -7- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dihydroxyhept-6-enoic acid The present invention relates to a novel method for producing esters. The compound is useful as a synthetic intermediate of “3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase inhibitor” described in JP-A-1-279866 as being useful as a blood cholesterol lowering agent. is there.
[0002]
[Prior art]
As a method for chemically producing (E) -7- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dihydroxyhept-6-enoic acid esters For example, the following production route is known in JP-A-1-279866.
[0003]
[Chemical Formula 10]

Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-92217 also reports a production method using an optically active Schiff base.
[0004]
Furthermore, JP-A-8-127585 also discloses a process for producing at a very low temperature using (R) -3-tert-butyldimethylsilyloxy-6-dimethoxyphosphinyl-5-oxohexanoic acid methyl ester. It has been reported.
[0005]
On the other hand, as a method of stereoselectively reducing a compound having a keto group using a microorganism cell and / or a processed product of the cell to produce an optically active alcohol, for example, a side chain of the keto group is used. As a compound using a compound having a quinoline skeleton, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1998) 49: p. It is described in 709-717 that the following reactions can be carried out using Microbacterium campoquemadoensis MB5614 strain.
[0006]
Embedded image

Bioorg. Med. Chem. Lett., Vol8, p1403- (1998) describes that the reaction shown below can be performed using baker's yeast.
[0007]
Embedded image

However, like (E) -7- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dioxohept-6-enoic acid esters, There has been no known example that a compound in which an olefin is present at a position and a carbonyl group is continuously present can be stereoselectively reduced using a microorganism.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, (3R, 5S)-(E) -7- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dihydroxyhept-6-enoic acid esters It has been desired to newly develop a new production method that can be produced industrially at low cost.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have made (3R, 5S)-(E) -7- [2-cyclopropyl-4- (2) by a stereoselective reduction reaction of a keto group using a microbial reaction. 4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dihydroxyhept-6-enoic acid esters were intensively studied and, as a result, the following compounds (I) to (III) and (II) When the compounds represented by ') to (III') were used as raw materials, it was found that the desired product was obtained with high optical purity, and the present invention was completed. That is, the gist of the present invention is the following formula (I)
[0010]
Embedded image

(Wherein R represents a hydrogen atom, an alkyl group or an aryl group), a compound represented by the following formula (II)
[0011]
Embedded image

(Wherein, R is as defined above), and the following formula (III)
[0012]
Embedded image

(Wherein R is as defined above), a microorganism selected from the group consisting of compounds represented by the following formula: a microorganism having the ability to stereoselectively reduce a keto group and / or treatment of the microorganism The following formula (IV) characterized by reduction by acting
[0013]
Embedded image

(Wherein R is as defined above).
[0014]
The present invention is described in detail below.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(3R, 5S)-(E) -7- [2-Cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dihydroxyhept-6-enoic acid ester of the present invention The production method of the following formula (I)
[0016]
Embedded image

(In the formula, R represents a hydrogen atom, an alkyl group or an aryl group)
A compound represented by the following formula (II):
[0017]
Embedded image

(Wherein R is as defined above)
And a compound represented by the following formula (III)
[0018]
Embedded image

(Wherein R is as defined above)
A compound selected from the group consisting of compounds represented by the formula: wherein a microbial cell having the ability to stereoselectively reduce a keto group and / or a treated product of the microbial cell is reduced. .
[0019]
In the compounds represented by the above formulas (I) to (III), which are raw materials used in the production method of the present invention, R represents a hydrogen atom, an alkyl group or an aryl group.
[0020]
The alkyl group is substituted with an alkyl group or an aryl group such as a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group, a cyclopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a t-butyl group, a cyclohexyl group, a benzyl group, or a phenethyl group. Or a linear, branched or cyclic alkyl group.
[0021]
Examples of the aryl group include a phenyl group or a naphthyl group which may be substituted with an alkyl group, such as a phenyl group, a mesityl group, or a naphthyl group.
[0022]
R is preferably C ₁ ~ C _Four Alkyl group, benzyl group or phenyl group, more preferably C ₁ ~ C _Four And particularly preferably a methyl group or an ethyl group.
[0023]
In the production method of the present invention, the compounds represented by the above formulas (II) and (III) may be optically active substances represented by the following formula (II ′) and the following formula (III ′).
[0024]
Embedded image

(Wherein R is as defined above)
[0025]
Embedded image

(Wherein R is as defined above)
Compounds represented by formulas (I) to (III) and (II ′) to (III ′) are disclosed in JP-A-1-279866, JP-A-8-127585, JP-A-5-178411, and the like. It can be arbitrarily produced by combining the described method and a known method.
[0026]
The present invention is characterized in that the compounds represented by the above formulas (I) to (III) are used to reduce the keto group stereoselectively by using the microbial cells and / or the processed microbial cells.
[0027]
The microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism having an ability to reduce a keto group stereoselectively.
[0028]
Specifically, the genus Metschnikowia pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima), Metschnikowia bicuspidata, Metschnikowia reukaufii and Metschwiowia lunata (Metschnikowia lunata), etc.
Cryptococcus curvatus, Cryptococcus flavus, Cryptococcus humicolus and Cryptococcus laurentii, etc.
Candida albicans, Candida azyma, Candida intermedia, Candida solani, Candida famata, Candida guilliermondii, candy Microorganisms belonging to the genus Candida such as Candida parapsilosis, Candida rugosa, Candida tropicalis and Candida molischiana;
Microorganisms belonging to the genus Filobasidium such as Filobasidium capsuligenum;
Microorganisms belonging to the genus Ogataea, such as Ogataea glucozyma and Ogataea minuta;
Microorganisms belonging to the genus Citeromyces such as Citeromyces matritensis;
Microorganisms belonging to the genus Yarrowia such as Yarrowia lipolytica;
Microorganisms belonging to the genus Rhodotorula such as Rhodotorula glutinis, Rhodotorula aurantiaca and Rhodotorula mucilaginosa;
Microorganisms belonging to the genus Exophiala such as Exophiala dermatitidis;
Microorganisms belonging to the genus Trigonopsis such as Trigonopsis variabilis;
Microorganisms belonging to the genus Shizosaccharomyces, such as Shizosaccharomyces pombe;
Microorganisms belonging to the genus Wickerhamiella such as Wickerhamiella domercqii;
Microorganisms belonging to the genus Pichia such as Pichia petersonii and Pichia anomala;
Microorganisms belonging to the genus Saccharomycopsis such as Saccharomycopsis fibuligera and Saccharomycopsis crataegensis;
Microorganisms belonging to the genus Saitoella such as Saitoella complicata;
Microorganisms belonging to the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae;
Microorganisms belonging to the genus Rhodosporidium such as Rhodosporidium toruloides;
Microorganisms belonging to the genus Acinetobacter such as Acinetobacter calcoaceticus;
Microorganisms belonging to the genus Brevibacterium such as Brevibacterium linens and Brevibacterium sacchrolyticum;
Microorganisms belonging to the genus Cellulomonas, such as Cellulomonas gelida, Cellulomonas flavigena, Cellulomonas uda;
Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium vitaeruminis, and Corynebacterium variabile (Corynebacterium variabile) Microorganisms belonging to the genus Corynebacterium;
Examples include microorganisms belonging to the genus Curtobacterium such as Kurtobacterium flaccumfaciens.
[0029]
Preferred examples of the microorganism include Metschnikowia pulcherrima IFO 0863 strain, Metschnikowia pulcherrim IAM 12196 strain, Metschnikowia pulcherrima strain IAM 12196 strain, Metschnikowia pulcherrima strain IAM 1296 Metschnikowia pulcherrima IFO 10796, Metschnikowia bicuspidata IFO 1408, Metschnikowia reukaufii IFO 10798 and Metschnikowia Oluna 160
Cryptococcus curvatus IFO 1159, Cryptococcus humicolus IFO 10250, Cryptococcus flavus IFO 0407, Cryptococcus humicolus Cryptoculi Cryptococcus laurentii var laurentii CBS 5539 strain, Cryptococcus laurentii var laurentii CBS 2174 strain, Cryptococcus laurentii laur ti lenti CBS 71 0 strain and Cryptococcus Rourenti variants Rourenti (Cryptococcus laurentii var laurentii) CBS 7235 strain;
Candida albicans IFO 1594, Candida azyma JCM 1691, Candida intermedia IFO 0761, Candida solani IFO 0762, Candida phanata famata) RIFY 7455 strain (the same strain is also available as IFO 0856 strain), Candida guilliermondii IFO 0666 strain, Candida parapsilosis CBS 0604 strain, Candida rugosa strain IFO 0591 Candida tropicalis IFO 0618 strain, Candida tropicalis IFO 1404 strain, Candida tropicalis IFO 1647 shares and Candida
Candida molischiana IFO 10296 strain;
Filobasidium capsuligenum IFO 1119 strain and Philobasidium capsuligenum IFO 1185 strain;
Ogataea glucozyma IFO 1472 strain and Ogataea minuta var nonfermentans IFO 1473 strain;
Citeromyces matritensis IFO 0651 strain and Citeromyces matritensis IFO 0954 strain;
Yarrowia lipolytica IFO 1209 strain;
Rhodotorula glutinis var dairenensis IFO 0415 strain, Rhodotorula glutinis var glutinis IFO 0395 strain, Rhodotorula aurantiaca4 strain Rhodotorula aurantiaca
Exophiala dermatitidis IFO 6421 strain and Exophiala dermatitidis IFO 8193 strain;
Trigonopsis variabilis CBS 1040 strain and Trigonopsis variabilis IFO 0671 strain;
Shizosaccharomyces pombe IFO 0344 strain and Shizosaccharomyces pombe IFO 1628 strain;
Wickerhamiella domercqii IFO 1857 strain;
Pichia petersonii IFO 1372 strain and Pichia anomala IFO 0118 strain;
Saccharomycopsis fibuligera IFO0105 strain and Saccharomycopsis kratagensis IFO 1708 strain (Saccharomycopsis crataegensis);
Saitoella complicata IAM 12963 strain;
Saccharomyces cerevisiae JCM 1818 strain, Saccharomyces cerevisiae IFO 0565 strain and Saccharomyces cerevisiae IFO 0305 strain;
Rhodosporidium toruloides IFO 0559 strain;
Acinetobacter calcoaceticus IFO 12552 strain;
Brevibacterium linens JCM 1328 strain and Brevibacterium sacchrolyticum ATCC 14066 strain;
Cellulomonas gelida JCM 1489 strain, Cellulomonas flavigena JCM 1490 strain and Cellulomonas uda JCM 1492 strain;
Corynebacterium ammoniagenes JCM 1305, Corynebacterium glutamicum JCM 1307, Corynebacterium glutamicum ATCC 12813, Corynebacterium glutamicum ATCC 130, ATCC 130 Corynebacterium glutamicum ATCC 13826 strain, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 strain, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 strain, Corynebacterium vitamin 13 strain Corynebacterium variabile JCM 2154 strain;
Examples include the Kurtobacterium flaccumfaciens ATCC 12813 strain.
[0030]
The microorganism is preferably a genus Metschnikowia, a genus Cryptococcus, a genus Candida, a genus Filobasidium, a genus Ogataea, a genus Citeromyces, or Rhodotorula. Genus, Exophiala genus, Shizosaccharomyces genus, Wickerhamiella genus, Pichia genus, Saccharomycopsis genus, Saitoella genus, Saccharomyces genus , Belonging to the genus Rhodosporidium, Brevibacterium or Corynebacterium.
[0031]
The microorganism belonging to the genus Metschnikowia preferably includes Metschnikowia pulcherrima and Metschnikowia reukaufii.
[0032]
Preferred microorganisms belonging to the genus Cryptococcus include Cryptococcus flavus, Cryptococcus humicolus, and Cryptococcus laurentii.
[0033]
Preferred microorganisms belonging to the genus Candida include Candida intermedia, Candida solani, Candida famata, and Candida molischiana.
[0034]
As a microorganism belonging to the genus Filobasidium (Filobasidium), Filobasidium capsuligenum (Filobasidium capsuligenum) is preferable.
[0035]
The microorganisms belonging to the genus Ogataea are preferably Ogataea glucozyma and Ogataea minuta.
[0036]
A preferred microorganism belonging to the genus Citeromyces is Citeromyces matritensis.
[0037]
Preferred microorganisms belonging to the genus Rhodotorula include Rhodotorula glutinis, Rhodotorula aurantiaca, and Rhodotorula mucilaginosa.
[0038]
The microorganism belonging to the genus Exophiala is preferably Exophiala dermatitidis.
[0039]
As a microorganism belonging to the genus Shizosaccharomyces, Shizosaccharomyces pombe is preferable.
[0040]
As a microorganism belonging to the genus Wickerhamiella, Wickerhamiella domercqiae is preferable.
[0041]
Preferable microorganisms belonging to the genus Pichia include Pichia petersonii and Pichia anomala.
[0042]
The microorganism belonging to the genus Saccharomycopsis is preferably Saccharomycopsis fibuligera.
[0043]
A preferred example of the microorganism belonging to the genus Saitoella is Saitoella complicata.
[0044]
A preferred microorganism belonging to the genus Saccharomyces is Saccharomyces cerevisiae.
[0045]
A preferred microorganism belonging to the genus Rhodosporidium is Rhodosporidium toruloides.
[0046]
The microorganism belonging to the genus Brevibacterium is preferably Brevibacterium sacchrolyticum.
[0047]
The microorganisms belonging to the genus Corynebacterium are preferably Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum and Corynebacterium vitalminis ( Corynebacterium vitaeruminis) and the like.
[0048]
Moreover, when manufacturing the compound represented by Formula (IV) using the compound represented by Formula (I) as a raw material, the compound represented by Formula (II ') is used as the production intermediate. There may be a case of passing through a compound represented by the formula (III ′).
[0049]
Thus, from the compound represented by the formula (I), a compound represented by the formula (II ′) and a compound represented by the formula (III ′) are produced in advance and then isolated, and then the compound represented by the formula (IV ) Or a compound represented by formula (II ′) and a compound represented by formula (III ′) without isolation, May be produced.
[0050]
In addition, when the compound represented by the formula (I) is used as a raw material, the compound represented by the formula (IV) may be produced using one kind of microorganism, or two or more kinds of microorganisms May be manufactured in combination.
[0051]
As a particularly preferable microorganism when using a compound represented by the formula (I) as a raw material,
Cryptococcus genus, Candida genus, Filobasidium genus, Ogataea genus, Yarrowia genus, Rhodotorula genus, Exophiala genus and Trigonopsis genus Trigonopsis ) A microorganism belonging to the genus, more preferably a microorganism belonging to the genus Cryptococcus, the genus Candida, the genus Filobasidium, the genus Ogataea and the genus Rhodotorula, Most preferred is a microorganism belonging to the genus Ogataea.
[0052]
As a particularly preferable microorganism when using a compound represented by the formula (II) as a raw material,
Metschnikowia, Cryptococcus, Candida, Filobasidium, Ogataea, Citeromyces, Yarrowia, Rhodotorula Genus, Exophiala genus, Trigonopsis genus, Shizosaccharomyces genus, Wickerhamiella genus, Saccharomycopsis genus, Saitoella genus, Pichia genus , Saccharomyces, Rhodosporidium, Acinetobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Corynebacterium, and Curtobacterium It is a microorganism belonging to
[0053]
Among the above microorganisms, more preferably, the genus Metschnikowia, the genus Cryptococcus, the genus Candida, the genus Filobasidium, the genus Ogataea, the genus Citeromyces, and the Rhodotorula ), Shizosaccharomyces, Wickerhamiella, Saccharomycopsis, Saitoella, Pichia, Saccharomyces, Rhodosporidium ) Genus, Brevibacterium genus or Corynebacterium genus, more preferably Metschnikowia genus, Candida genus, Ogataea genus, Rhodotorula genus Genus, Shizosaccharomyces A microorganism belonging to the genus Wickerhamiella, Saccharomycopsis, Saitoella, Rhodosporidium, Brevibacterium or Corynebacterium is there. Most preferably, the genera Metschnikowia, Candida, Ogataea, Shizosaccharomyces, Saitoella, Rhodosporidium, Brevibacterium ) And microorganisms belonging to the genus Corynebacterium.
[0054]
As a particularly preferable microorganism when using a compound represented by the formula (III) as a raw material,
Microorganisms belonging to the genus Cryptococcus, Candida, Filobasidium, Rhodotorula and Pichia, more preferably, the genus Cryptococcus and candy It is a microorganism belonging to the genus Candida and the genus Rhodotorula.
[0055]
Among the above microorganisms, microorganisms with IFO numbers are described in the Internet Catalog (http://www.ifo.or.jp) published by the Fermentation Research Institute (IFO). It can be obtained.
[0056]
Microorganisms with CBS numbers are described in the Internet catalog (http://www.cbs.knaw.nl) of The Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) and can be obtained from the CBS.
[0057]
Microorganisms with ATCC numbers are described in the American Type Culture Collection (ATCC) Internet catalog (http://www.atcc.org) and can be obtained from the ATCC.
[0058]
Microorganisms with IAM numbers are listed in the IAM Culture Collection (IAM) Internet catalog (http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/misyst/ColleBOX/IAMcollection.html) Available from IAM.
[0059]
Microorganisms with a JCM number are described in the Japan Collection of Microorganism (JCM) Internet catalog (http://www.jcm.riken.go.jp) and can be obtained from the JCM.
[0060]
Microorganisms with RIFY numbers are described in the catalog of Research Institute of Fermentation, Yamanashi Univ. Kofu Japan (RIFY), and can be obtained from the RIFY.
[0061]
The microorganism may be not only a wild strain, but also a mutant obtained by normal mutation treatment such as UV irradiation or NTG treatment.
[0062]
Alternatively, any strain such as a recombinant strain derived by a genetic technique such as cell fusion or gene recombination may be used.
[0063]
In addition to the original strain, bacteria such as Escherichia coli and yeast may be used as expression strains of the recombinant strain, and these recombinant strains are also included in the concept of the microorganism.
[0064]
In the production method of the present invention, one or more of the above microorganisms are subjected to the reaction as cells and / or treated cells.
[0065]
Specifically, the cells obtained by culturing the above microorganisms as they are, or those obtained by culturing the cells obtained by culturing by a known method, that is, those treated with acetone, those obtained by freeze-drying, Processed microbial cells such as those obtained by physically or enzymatically disrupting microbial cells can be used. Moreover, it is also possible to take out the enzyme fraction which has a reducing ability from these microbial cells or a microbial cell processed material as a crude product or a refined product, and to use it. Furthermore, the cells obtained in this manner, the treated cells, the enzyme fraction, etc., are used by using a general immobilization technique, that is, those immobilized on a carrier such as polyacrylamide or carrageenan gel. It is also possible. Therefore, in the present specification, the term “bacteria and / or treated product thereof” is used as a concept containing all of the above-mentioned cells, treated product, enzyme fraction, and their immobilized products.
[0066]
Next, the production method of the present invention will be specifically described.
[0067]
In the production method of the present invention, the microorganism is usually used after being cultured, but this culture can be carried out as usual. The medium used for culturing the microorganism includes a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and the like that can be assimilated by the microorganism. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose and saccharose, polyalcohols such as glycerol, mannitol and xylitol, organic acids and the like are appropriately used. As the nitrogen source, organic nitrogen sources such as NZ amine, tryptose, yeast extract, polypeptone, meat extract and soybean extract, or inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate and ammonium nitrate, and the like are appropriately used. As the inorganic ions, phosphate ions, magnesium ions, iron ions, manganese ions, molybdenum ions and others are appropriately used as necessary. Furthermore, it is effective to add inositol, pantothenic acid, nicotinamide and other vitamins as necessary.
[0068]
The amount of the carbon source, nitrogen source, inorganic ions and vitamins in the medium is not particularly limited as long as it is a range generally used in strain culture, but the carbon source and nitrogen source are usually 0.001 to 50 wt. %, Preferably 0.1 to 5 wt% is added. Inorganic ions are usually added in an amount of 0.0001 to 5 wt%, preferably 0.001 to 1 wt%. Vitamins are usually added at 0.00001 to 10 wt%, preferably 0.001 to 1 wt%.
[0069]
Cultivation is carried out for 1 to 100 hours under aerobic conditions while controlling the pH within a suitable range of about 3 to 11 and temperature of about 4 to 50 ° C.
[0070]
As a reaction method, the compound represented by the formulas (I) to (III) or a mixture thereof is added to an aqueous medium containing the microbial cells obtained by culturing the present microorganism and / or the processed microbial cells. A method of adding the desired compound represented by formula (IV), a method of adding a compound represented by formulas (I) to (III) or a mixture thereof to a medium, and performing a reaction while culturing microorganisms After completion of the culture, a method of adding a compound represented by the formulas (I) to (III) or a mixture thereof to the medium as it is, and subsequently reacting, or a compound represented by the formula (I) When the reaction has progressed to some extent, depending on the content of the compounds represented by formulas (I) to (III) in the system, It can be used as appropriate.
[0071]
As said aqueous medium, the buffer solution using sodium phosphate, potassium phosphate, etc., and the thing which added the organic solvent, surfactant, etc. to the buffer solution suitably are shown.
[0072]
Examples of the organic solvent include water-soluble solvents such as dimethyl sulfoxide (DMSO) and tetrahydrofuran (THF), and water-insoluble organic solvents such as butyl acetate and hexane. Examples of the surfactant include Tween 80 and sugar ester.
[0073]
The buffer solution may be used at a concentration of 1M or less, preferably 0.2M or less.
[0074]
The reaction is carried out at a temperature of 4 to 70 ° C., preferably 15 to 50 ° C., and at a pH of 2 to 9, preferably 4 to 8.
[0075]
The concentration of the compounds represented by the formulas (I) to (III) or a mixture thereof is preferably 0.0001 to 10 wt%, preferably 0.001 to 5 wt% with respect to the reaction solution. For example, the compounds represented by formulas (I) to (III) or a mixture thereof may be supplemented during the reaction.
[0076]
In order to accelerate the reaction, a coenzyme, a coenzyme and its regeneration system, or a carbon source may be added as appropriate.
[0077]
Examples of the coenzyme include β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide, Reduced Form (hereinafter abbreviated as NADH) and β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, Reduced Form (hereinafter abbreviated as NADPH). The amount added is from 1 to 1 million equivalents to 10 equivalents, preferably from 1 to 10,000 equivalents to 10 equivalents of the reaction substrate.
[0078]
The coenzyme regeneration system includes a combination of an enzyme having the ability to reduce β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide (hereinafter abbreviated as NAD) such as formate dehydrogenase to NADH and its enzyme substrate (formic acid), glucose dehydrogenase, etc. Examples thereof include a combination of an enzyme having the ability to reduce β-Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (hereinafter abbreviated as NADP) to NADPH and its enzyme substrate (such as glucose). These enzymes that regenerate the coenzyme may be commercially available, or may be microbial cells having the ability to regenerate the coenzyme and / or treated products thereof. The addition amount of these systems is appropriately determined according to the amount of the reaction substrate.
[0079]
The carbon source for promoting the reaction may be any carbon source that can be used to regenerate the coenzyme by the cells used in the reaction and / or the processed cells of the cells, such as glucose, Carbohydrates such as fructose and saccharose, polyalcohols such as glycerol, mannitol and xylitol, organic acids and the like are used as appropriate. The addition amount is 0.0001 to 50 wt%, preferably 0.01 to 10 wt%.
[0080]
As described above, the reaction is performed using an aqueous medium, but the compounds represented by the formulas (I) to (III) have low solubility in water, and thus are dissolved in advance in an organic solvent or a surfactant. Alternatively, it is preferable to disperse and add uniformly in the reaction system.
[0081]
The compound represented by the formula (IV) obtained by the above production method is usually extracted from the reaction solution with an organic solvent, and then the impurities are removed by a usual purification method, that is, chromatography or crystallization technique. A purified compound represented by the formula (IV) can be obtained. Specifically, by solubilizing the compound represented by the formula (IV) with an organic solvent or the like, the solids such as microorganisms are removed by a normal separation device such as centrifugation, filter press, ultrafiltration, A liquid containing the compound represented by the formula (IV) is obtained. Impurities are removed from the obtained liquid by a usual method, that is, using a chromatography or a crystallization technique, and a purified compound represented by the formula (IV) can be obtained.
[0082]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, ordinary changes in the technical field of the present invention can be made without departing from the gist thereof.
[0083]
Incidentally, (E) -7- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dihydroxyhept-6-enoic acid esters (hereinafter referred to as “DOLE”) In addition to the target 3R and 5S isomers, there are 3S, 5R, 3R, 5R and 3S, 5S isomers as the isomers, and the structural formula is as follows.
[0084]
3S, 5R-DOLE and 3R, 5S-DOLE are syn-DOLE, and 3S, 5S-DOLE and 3R, 5R-DOLE are anti-DOLE.
[0085]
In the examples, the purity of the target product 3R, 5S may be indicated by the diastereomeric excess and the enantiomeric excess, but in this specification, the diastereomeric excess is expressed as (syn-DOLE-anti-anti- (DOLE) / (syn-DOLE + anti-DOLE), and the enantiomeric excess was expressed as (3R, 5S-form-3S, 5R-form) / (3R, 5S-form + 3S, 5R-form).
[0086]
Embedded image

<Production Example 1> (E) -7- [2-Cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dioxohept-6-enoic acid ethyl ester (hereinafter referred to as DOXE) Abbreviated)
To a 500 mL four-necked flask equipped with a stirrer, a dropping funnel and a thermometer, add (E) -7- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -5-hydroxy- Add 5.02 g (11.22 mmol) of 3-oxohept-6-enoic acid ethyl ester (hereinafter abbreviated as 5-MOLE) and 420 mL of acetone and stir. 10.5 mL of Jones oxidant prepared (reagent obtained by mixing 3 mL of concentrated sulfuric acid and 3.35 g of chromium oxide and then diluting to 25 mL with water) was added dropwise at 0 ° C. over 20 minutes. After stirring for 2 hours under ice cooling, 10 mL of methanol was slowly added to stop the reaction. Next, acetone was distilled off from the reaction mixture under reduced pressure, 250 mL of ethyl acetate was added, and the resulting solution was extracted twice with 60 mL of saturated aqueous sodium bicarbonate solution, and then twice with 60 mL of saturated aqueous sodium chloride solution. The ethyl acetate solution was dried over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off, and the residue was purified by silica gel chromatography (elution solvent; hexane: ethyl acetate = 2: 1) to give 3.03 g (yield) of the title compound. : 60.6%).
[0087]
¹ H-NMR (300MHz, CDCl _Three , δppm): 7.79-7.19 (8H, m), 7.71 (1H, d), 6.03 (1H, d), 5.51 (1H, s), 4.21 (2H, q), 3.40 (2H, s), 2.35- 2.40 (1H, m), 1.39-1.41 (2H, m), 1.28 (3H, t), 1.07-1.09 (2H, m).
<Production Example 2> 5S- (E) -7- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -5-hydroxy-3-oxohept-6-enoic acid ethyl ester ( (Hereinafter abbreviated as 5S-MOLE)
A Schlenk tube into which nitrogen gas was introduced after heating and drying under reduced pressure was added to (S) -2- [N- (3,5-di-tert-butylsalicylidene) amino] -3-methyl-1-butanol. After adding 0.87 g (3.3 mmol), 5 ml of methylene chloride and 0.63 ml (6.0 mmol) of titanium tetraethoxide, the mixture was stirred and mixed at room temperature for 1 hour. After cooling the Schlenk tube to −50 ° C., (E) -3- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -prop-2-en-1-al 0.95 g (3.0 mmol) dissolved in 2 ml of methylene chloride was added dropwise and stirred for 5 minutes. Then, 0.51 g (6 mmol) of diketene was added, and the mixture was stirred for 22 hours while maintaining at −50 ° C. for reaction. It was. The obtained reaction mixture was added to a mixed solution of 25 ml of methylene chloride and 25 ml of 0.24M aqueous sodium bicarbonate, and vigorously stirred at room temperature for 2 hours to obtain a two-layer solution. The obtained two-layer solution was separated, and the aqueous layer was extracted twice with 10 ml of methylene chloride. The methylene chloride layer and the methylene chloride extract were combined to obtain a methylene chloride solution. The methylene chloride solution was dried over anhydrous magnesium sulfate, the solvent was distilled off, and the residue was purified by silica gel chromatography (elution solvent; hexane: ethyl acetate = 3: 2) to give 5S- (E) -7- [2 -Cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -5-hydroxy-3-oxohept-6-enoic acid ethyl ester was obtained (optical purity: 73% ee, (E ) -3- [2-Cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -prop-2-en-1-al: 56%).
[0088]
<Example 1> Production of DOLE from DOXE
Liquid medium comprising 5 g / L of yeast extract (Difco), 5 g / L of polypeptone (Nippon Pharmaceutical), 3 g / L of malt extract (Difco), 20 g / L of glucose (Nippon Food Processing) Into 2.5 mL, various strains shown in Table 1 were inoculated and aerobically cultured at 30 ° C. for 21 hours. 1 mL of the obtained culture solution was taken and centrifuged to collect the cells. To this microbial cell, 0.25 mL of a reaction solution containing Compound (I) (wherein R = ethyl group compound: DOXE) was added and reacted aerobically at 30 ° C. for 20 hours.
[0089]
The composition of the reaction solution is as follows: DOXE 0.3 g / L, glucose (manufactured by Nippon Food Processing Co., Ltd.) 20 g / L, dimethyl sulfoxide (DMSO) (manufactured by Kishida Chemical) 20 mL / L, 100 mM potassium phosphate buffer (PH 7.0).
[0090]
After completion of the reaction, 0.5 mL of ethyl acetate was added to the reaction solution, vigorously mixed, and separated into an organic layer and an aqueous layer by centrifugation. The organic layer was transferred to another container, the solvent was distilled off with a concentration centrifuge, the dried product was dissolved in 0.01 mL of ethyl acetate, and thin layer chromatography (TLC) was performed. TLC is a silica gel plate (silica gel 60 F manufactured by Merck) ₂₅₄ ) And hexane / ethyl acetate = 1/1 was used as the developing solvent.
[0091]
After the completion of development, the product was confirmed with a UV lamp. Compound (I) has Rf = 0.76 to 0.86, Compound (II) and Compound (III) have 0.54 to 0.61, Compound (IV) (wherein R = ethyl group compound: DOLE) Rf = 0.33. The spot on DOL TLC was scraped and eluted with 0.25 mL of isopropanol. After centrifugation, the supernatant was analyzed for optical purity and TLC scraped sample concentration using high performance liquid chromatography (HPLC).
[0092]
The conditions of HPLC are as follows.
Column: CHIRALCEL AD (manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.)
Eluent: Hexane / ethanol = 9/1
Flow rate: 0.5ml / min
Detection: UV254nm
Temperature: Room temperature
The results are shown in Table 1.
[0093]
[Table 1]

<Example 2> Production of DOLE from DOXE
Ogata Air Minuta Variant Non-Farmamentus IFO1473 was inoculated into 2.5 mL of a liquid medium having the same composition as in Example 1, and aerobically cultured at 27 ° C. for 24 hours and 48 hours, respectively. 1 ml of the obtained culture broth was collected and centrifuged to collect bacterial cells. After adding 0.2 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) to this microbial cell and completely suspending it, 20 μl of 50% (w / v) glucose solution and 50 μl of 5 g / L DOXE (DMSO solution) After adding and stirring well, it was made to react at 27 degreeC for 20 hours.
[0094]
After completion of the reaction, extraction with ethyl acetate and TLC were carried out in the same manner as in Example 1. The TLC spot of DOLE was scraped off and eluted with 200 μl of isopropanol. After centrifugation, the supernatant was optically analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC). The purity and the amount of DOLE produced were analyzed.
[0095]
The conditions of HPLC are as follows.
Column: CHIRALCEL AD (manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.)
Eluent: hexane / ethanol = 95/5
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV254nm
Temperature: Room temperature
The results are shown in Table 2.
[0096]
[Table 2]

In addition, when the TLC was performed, there was an Rf spot corresponding to 5-MOLE or 3-MOLE, so that only the ones cultured for 24 hours were scraped in the same manner, and high performance liquid chromatography (HPLC) was used. The amount produced was analyzed.
[0097]
The conditions of HPLC are as follows.
Column: MCIGEL CHP2MGM (4.6 × 150 mm) (Mitsubishi Chemical Corporation)
Eluent: methanol / acetonitrile / water / phosphoric acid = 800/100/100 / 0.5
Flow rate: 0.6ml / min
Detection: UV254nm
Temperature: 60 ° C
Under this HPLC condition, 5-MOLE had a retention time of 4.73 and 3-MOLE was 5.47, and the above TLC scraped sample concentration of 5-MOLE was 25.2 mg / L. -The sample concentration of MOLE was 2.2 mg / L.
Incidentally, the DOLE retention time under the above analysis conditions is 4.02, and the DOXE is 8.02.
[0098]
<Example 3> Production of MOLE from DOXE
The liquid medium having the same composition as in Example 1 was inoculated with Rhodotorula urantiaca IFO 0754 and Rhodotorula glutinis varieties direnensis IFO 0415, respectively, at 27 ° C. Each was cultured aerobically for 48 hours. 1 ml of each obtained culture solution was collected and centrifuged to collect the cells. After adding 0.2 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) to the cells and completely suspending them, 20 μl of 50% (w / v) glucose solution and 20 μl of 2 g / L NADP and NAD mixed solution are used. 30 μl of 10 g / L DOXE (DMSO solution) was added, stirred well, and allowed to react aerobically at 27 ° C. for 12 hours.
[0099]
After completion of the reaction, extraction with ethyl acetate and TLC were performed in the same manner as in Example 1, and the spot portion of Rf corresponding to 5-MOLE or 3-MOLE and the spot portion of Rf corresponding to DOLE were scraped off.
[0100]
After that, about DOLE,
Column: CHIRALCEL AD (manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.)
Eluent: hexane / ethanol = 95/5
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV254nm
Temperature: Room temperature
With respect to MOLE,
Column: MCIGEL CHP2MGM (4.6 × 150 mm) (Mitsubishi Chemical Corporation)
Eluent: methanol / acetonitrile / water /: phosphoric acid = 800/100/100 / 0.5
Flow rate: 0.6ml / min
Detection: UV254nm
Temperature: 60 ° C
The analysis by high performance liquid chromatography (HPLC) was performed on each condition.
[0101]
The results are shown in Table 3.
[0102]
[Table 3]

Example 4 Production of 3-MOLE from DOXE
Inoculate Candida Intermedia IFO 0761 in 2.5 mL of a liquid medium having the same composition as in Example 1, and after culturing at 27 ° C. for 24 hours, react with DOXE in the same manner as in Example 2. When ethyl acetate extraction and TLC were performed and HPLC analysis of the spot was performed, the concentration of the TLC scraped sample of 3-MOLE was 156.9 mg / L.
[0103]
Example 5 Production of 3-MOLE from DOXE
2 L of a liquid medium having the same composition as that of Example 1 was inoculated with a strain of Filobasidium capsuligenum IFO 1185 and cultured aerobically at 30 ° C. for 21 hours. The obtained culture broth was centrifuged to collect microbial cells. A 10% (w / v) cell suspension was prepared using 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7), and 12 mL of this suspension was placed in six 30φ test tubes. W / v) DOXE (DMSO solution) (0.1 mL) and 50% (w / v) glucose solution (0.15 mL) were added and reacted aerobically at 30 ° C. for 20 hours.
[0104]
After completion of the reaction, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate. The extract was subjected to TLC under the same conditions as in Example 1. The portion containing compound (III) was scraped off, extracted from the scraped silica gel with ethyl acetate, and a sample was extracted. ¹ Analysis by H-NMR.
[0105]
¹ H-NMR (400MHz, CDCl _Three , δ ppm): 1.02 (dt, J = 6.4, 3.2 Hz, 2H), 1.21 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.33 (dt, J = 6.4). 3.2 Hz, 2H), 2.26 (m, 1H), 2.43 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 2.60-2.66 (dd, J = 6.4, 6.4 Hz) , 2H), 3.37 (m, 1H), 4.11 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 4.34-4.41 (m, 1H), 6.27 (d, J = 16). .8 Hz, 1H), 7.06-7.36 (m, 6H), 7.52-7.62 (m, 1H), 7.60 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 7.90. (D, J = 8.4Hz, 1H)
From this result, it was confirmed that 3-MOLE was produced.
[0106]
Furthermore, when the optical purity was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions, it was found that the compound (III ′) was obtained with an optical purity of 87.3% ee.
[0107]
The HPLC conditions in this example are as follows.
Column: CHIRALCEL AD (manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.)
Eluent: hexane / ethanol / trifluoroacetic acid = 900/100/1
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV254nm
Temperature: Room temperature
Example 6 Production of DOLE and 3R-MOLE from DOXE
A 500 ml flask containing 50 ml of a liquid medium having the same composition as in Example 1 was sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. Eight of these flasks were inoculated with Ogata Air Minuta Variant Non-Fermentus IFO1473 and cultured aerobically at 28 ° C. for 24 hours. Yeast extract (Difco) 10g / L, polypeptone (Nippon Pharmaceutical) 10g / L, malt extract (Difco) 6g / L, glucose (Nippon Food Processing) (separate sterilization) ) Inoculated four by two into two 30 L jar fermenters containing 20 L of liquid medium having a composition of 20 g / L, and cultured at 28 ° C. for 24 hours. After culturing, the culture solution was centrifuged to collect microbial cells.
[0108]
The cells were added to 9 L of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), completely suspended, divided into 3 equal parts, and each was placed in a 5 L jar fermenter. A solution prepared by dissolving 53 g of glucose (manufactured by Nippon Food Processing Co., Ltd.), 2 g of NADPH (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.), and 1.66 g of DOXE in 130 ml of DMSO was added to each fermenter and aerobic at 40 ° C. for 6 hours. To react. NADPH was added again every 2 g, 1 hour after the reaction. After the reaction, a part of the reaction solution of each fermenter was taken and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). As a result, 3.43 g of DOLE was generated in total. (Yield 71%)
Each reaction solution was centrifuged to collect a precipitate. 600 ml of acetonitrile was added to the precipitate, and after sufficient stirring, the mixture was centrifuged to separate the supernatant and the precipitate. The precipitate was further resuspended and centrifuged with 200 ml of 200 ml of acetonitrile. All the supernatants were combined and concentrated with an evaporator. After concentration, 600 ml of ethyl acetate was added, dissolved, and washed twice with 50 ml of water.
[0109]
The ethyl acetate layer was concentrated and purified by silica gel chromatography. 400 ml of silica gel was placed in a column and previously equilibrated with a solution of hexane: ethyl acetate = 2: 1. The concentrated sample was applied, and 2 L of a developing solvent of hexane: ethyl acetate = 2: 1 was allowed to flow. Then, the developing solvent was changed to hexane: ethyl acetate = 3: 2, and further elution was performed while flowing 2 L.
[0110]
The eluted solution was divided into 200 ml fractions (20 in total), and each fraction was confirmed by TLC. When the fractions in which DOLE was detected were collected and concentrated, 3.4 g of oily DOLE was obtained, and 2.5 g of DOLE was obtained when the purity was converted.
[0111]
When the optical purity was analyzed by HPLC under the conditions described in Example 2 above, the area ratio was 3S, 5R: 3R, 5R: 3R, 5S: 3S, 5S = 0.3: 0.2: 98. 9: 0.6. (98.4% de, 99.4% ee)
On the other hand, when the portions where 3-MOLE was detected as a main component were collected in the column purification fraction, 1.5 g of an oil-like product was obtained. 7 g of 3R-MOLE was obtained.
[0112]
When the optical purity was analyzed in the same manner as in Example 2, it was 98% ee.
[0113]
<Example 7> Production of DOLE from 5-MOLE
Using the various strains shown in Table 4, and using 5-MOLE containing R-5MOLE and S-5MOLE at a ratio of 1: 1 instead of DOXE as a reaction substrate, the same operation as in Example 1 was performed. Reaction was performed.
[0114]
Here, among the product DOLE, 3S, 5R and 3R, 5R isomers are generated from 5R-MOLE, and 3R, 5S and 3S, 5S isomers are generated from 5S-MOLE.
[0115]
After completion of the reaction, ethyl acetate extraction and TLC were performed in the same manner as in Example 1, and then optical purity and production amount were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC).
[0116]
The results are shown in Table 4.
[0117]
[Table 4]

<Example 8> Production of DOLE from 5-MOLE
Yeast extract (Difco) 10g / L, Polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 8g / L, Soybean extract High New SMS (Fuji Oil Co., Ltd.) 7g / L, Glucose (Nippon Food Processing Co., Ltd.) 5g / L, Glycerol (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) 10 g / L, monopotassium phosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 g / L, dipotassium phosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 3 g / L, magnesium sulfate (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) 0 .5 g / L, Manganese chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 mg / L liquid culture medium 2.5 mL is inoculated with various strains shown in Table 5 and cultured aerobically at 30 ° C. for 24 hours did. 1 ml of the obtained culture broth was collected and centrifuged to collect bacterial cells. After adding 0.2 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) to this microbial cell and completely suspending it, 10 μl of a 50% (w / v) glucose solution, 2 g / L NADP (manufactured by Oriental Yeast) And 10 μl of a mixed solution of NAD (manufactured by Oriental Yeast), 10 μl of 5-MOLE 5 g / L DMSO solution containing R-5MOLE and S-5MOLE at a ratio of 1: 1, and after stirring well, 30 ° C. For 20 hours.
[0118]
After completion of the reaction, extraction with ethyl acetate and TLC were performed as in Example 1. The TLC spot of DOLE was scraped off and eluted with 200 μl of isopropanol. After centrifugation, the supernatant was analyzed for optical purity and yield using high performance liquid chromatography (HPLC).
[0119]
The conditions of HPLC are as follows.
Column: CHIRALCEL AD (manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.)
Eluent: hexane / ethanol = 95/5
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV254nm
Temperature: Room temperature
The results are shown in Table 5.
[0120]
[Table 5]

<Example 9> Production of DOLE from 5-MOLE
Various strains shown in Table 6 were inoculated into 2.5 mL of a liquid medium having the same composition as in Example 1, and aerobically cultured at 27 ° C. for 48 hours. 1 ml of the obtained culture broth was collected and centrifuged to collect bacterial cells. After adding 0.2 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) to the cells and completely suspending them, 20 μl of a 50% (w / v) glucose solution, R-5MOLE and S-5MOLE were 1: 1. 50 μl of a 5 g / L DMSO solution of 5-MOLE contained in the ratio was added, and after stirring well, the mixture was reacted at 27 ° C. for 20 hours.
[0121]
After completion of the reaction, ethyl acetate extraction and TLC were performed in the same manner as in Example 8, and then optical purity and production amount were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC).
[0122]
The results are shown in Table 6.
[0123]
[Table 6]

<Example 10> Production of DOLE from 5-MOLE
Yeast extract (Difco) 10g / L, Nutrient broth (Difco) 5g / L, Soybean extract High New SMS (Fuji Oil) 3g / L, Glucose (Japan Food Processing) 15g / L The various strains shown in Table 7 were inoculated into 2 mL of a liquid medium having the composition described above and cultured aerobically at 30 ° C. for 24 hours. 1 ml of the obtained culture broth was collected and centrifuged to collect bacterial cells. The reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that 5-MOLE containing R-5MOLE and S-5MOLE at a ratio of 1: 1 was used as a reaction substrate instead of DOXE.
[0124]
After completion of the reaction, ethyl acetate extraction and TLC were performed in the same manner as in Example 1, and then optical purity and production amount were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 7.
[0125]
[Table 7]

<Example 11> Production of DOLE from 5S-MOLE
Various strains shown in Table 8 were cultured in the same manner as in Example 1, and 1 ml of the obtained culture solution was collected and centrifuged to collect bacterial cells. 100 mM sodium phosphate containing 5 g / L of glucose (manufactured by Nippon Food Processing Co., Ltd.), 60 μg / L of NADP (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.), and 20 μg / L of glucose dehydrogenase (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd .: 73 unit / mg). 0.25 ml of buffer solution (pH 6.5) was added and well suspended.
To this suspension, 10 μl of DMSO containing 10 g / L of 5S-MOLE having an optical purity of 73.0% ee obtained in Production Example 2 was added and reacted aerobically at 30 ° C. for 20 hours.
[0126]
After completion of the reaction, ethyl acetate extraction and TLC were performed in the same manner as in Example 1, and then optical purity and production amount were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC).
[0127]
The results are shown in Table 8.
[0128]
[Table 8]

[0129]
After completion of the reaction, extraction with ethyl acetate and TLC were performed in the same manner as in Example 8, and optical purity and production amount were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC).
[0130]
The results are shown in Table 9.
[0131]
[Table 9]

<Example 13> Production of DOLE from 3R-MOLE
Various liquid strains shown in Table 10 were inoculated into 2.5 mL of a liquid medium having the same composition as Example 1, and cultured aerobically at 27 ° C. for 48 hours. 1 ml of the obtained culture broth was collected and centrifuged to collect bacterial cells. After adding 0.2 ml of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) to this microbial cell and completely suspending it, 10 μl of a 2 g / L NADP (made by Oriental Yeast) and NAD (made by Oriental Yeast), 20 μl of isopropanol and 20 μl of 5 g / L DMSO solution of 3R-MOLE obtained in Example 6 were added, and after stirring well, the mixture was reacted at 27 ° C. for 20 hours.
[0132]
After completion of the reaction, extraction with ethyl acetate and TLC were performed in the same manner as in Example 8, and optical purity and production amount were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC).
[0133]
The results are shown in Table 10.
[0134]
[Table 10]

<Example 14> Production of DOLE from DOXE
A liquid culture medium having the same composition as in Example 1 was inoculated with Rhodotorula glutinis varieties Direnensis IFO 0415 and aerobically cultured at 27 ° C. for 48 hours. 1 ml of the obtained culture broth was centrifuged to collect bacterial cells.
[0135]
Further, 2.5 mL of a liquid medium having the same composition as in Example 8 was inoculated with Corynebacterium glutamicum ATCC13826 and cultured aerobically at 30 ° C. for 24 hours. 1 ml of the obtained culture broth was centrifuged to collect bacterial cells.
[0136]
Both were combined, 0.2 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) was added and completely suspended, and then 10 μl, 50 g of 2 g / L of NADP (Oriental Yeast) and NAD (Oriental Yeast) were mixed. 10 μl of% (w / v) glucose solution and 30 μl of 20 g / L DOXE (DMSO solution) were added, and after stirring well, the mixture was reacted at 27 ° C. for 18 hours.
[0137]
After completion of the reaction, ethyl acetate extraction and TLC were performed in the same manner as in Example 1, and then optical purity and production amount were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC) under the same conditions as in Example 8. In this reaction, only 3R, 5S-DOLE was obtained, and the concentration of the TLC scraped sample was 9.5 mg / L.
[0138]
Example 15 Production of DCOOH from DOXE
Various strains shown in Table 11 were cultured and reacted in the same manner as in Example 1. Spots corresponding to compound (IV) on TLC (where R = hydrogen compound: hereinafter abbreviated as DCOOH) (development) Solvent; hexane: ethyl acetate = 1: 1, Rf = 0) was scraped off and eluted with 0.25 mL of isopropanol. After centrifugation, the supernatant was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC).
[0139]
The conditions of HPLC are as follows.
Column: CHIRALCEL AD (manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.)
Eluent: hexane / ethanol / trifluoroacetic acid = 900/100/1
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV254nm
Temperature: Room temperature
The results are shown in Table 11.
[0140]
[Table 11]

Example 16 Production of DCOOH from 5-MOLE
Various strains shown in Table 12 were cultured in the same manner as in Example 1, reacted in the same manner using 5-MOLE instead of DOXE, and compound (IV) on TLC (where R = hydrogen A spot (developing solvent; hexane: ethyl acetate = 1: 1, Rf = 0) corresponding to a compound: hereinafter abbreviated as DCOOH is scraped off, eluted with 0.25 mL of isopropanol, centrifuged, and the supernatant is used as an example. The optical purity was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC) under the same conditions as in No. 15. The results are shown in Table 12.
[0141]
[Table 12]

[0142]
【The invention's effect】
According to the present invention, 3R, 5S- (E) -7- [2-cyclopropyl-4- (4-fluorophenyl) -quinolin-3-yl] -3,5-dihydroxyhept-6-enoic acid Esters can be produced efficiently with high optical purity.

Claims (7)

Formula (I)

(Wherein, R represents a hydrogen indicating the atom or an alkyl group) Table is a compound of, a microorganism having an ability capable of stereoselectively reducing the keto group, Cryptococcus (Cryptococcus) genus Candida (Candida) genus, Philo Basi di um (Filobasidium) genus Ogataea (Ogataea) genus, and Rhodotorula (Rhodotorula) cells of a microorganism belonging to the genus genus or we selected and / or be reduced by the action of microbial cells treated The following formula (IV)

(Wherein R represents a hydrogen atom or an alkyl group). The following formula (II)

(Wherein R represents a hydrogen atom or an alkyl group), a microorganism having the ability to reduce a keto group stereoselectively, which is a genus Metschnikowia, a genus Cryptococcus, Candida genus, Filobasidium genus, Ogataea genus, Citeromyces genus, Yarrowia genus, Rhodotorula genus, Exophiala genus, Trigonopsis ), Shizosaccharomyces, Wickerhamiella, Saccharomycopsis, Saitoella, Pichia, Saccharomyces, Rhodosporidium ), Acinetobacter, Brevibacterium, Cellulomona It is characterized by acting and reducing a microbial cell selected from the group consisting of (Cellulomonas), Corynebacterium, and Curtobacterium, and / or a processed product thereof. The following formula (IV)

(Wherein R represents a hydrogen atom or an alkyl group). Formula (III) below

(Wherein R represents a hydrogen atom or an alkyl group), a microorganism having the ability to reduce the keto group stereoselectively, and belonging to the genus Cryptococcus and Candida Characterized by the action of a microbial cell belonging to the genus selected from the genus Rhodotorula, the genus Philobasidium and the genus Pichia and / or a treated product thereof The following formula (IV)

(Wherein R represents a hydrogen atom or an alkyl group). The compounds represented by formula (II) and formula (III) are each represented by the following formula (II ′)

(Wherein R represents a hydrogen atom or an alkyl group) and the following formula (III ′)

4. The production method according to claim 2, wherein the optically active substance is represented by the formula (wherein R represents a hydrogen atom or an alkyl group). The production method according to claim 4, wherein the compounds represented by the formula (II ') and the formula (III') are each obtained from a compound represented by the formula (I). The microorganisms are genus Metschnikowia, genus Cryptococcus, genus Candida, genus Filobasidium, genus Ogataea, genus Citeromyces, genus Rhodotorula, The genus Sizcharocyomyces (Shizosaccharomyces), the genus Wickerhamiella, the genus Saccharomycopsis, the genus Saitoella, the genus Pichia, the genus Saccharomyces, the genus Rhodosporidium, The production method according to claim 2, wherein the method belongs to the genus Brevibacterium or Corynebacterium. Following formula (I)

A compound represented by the formula (wherein R represents an alkyl group) is a microorganism having the ability to stereoselectively reduce a keto group, (Yarrowia) Genus and Trigonopsis (Trigonopsis) The following formula, which is reduced by acting a microbial cell belonging to a genus selected from the genus and / or a treated product thereof: (I V )

(Wherein R represents a hydrogen atom).