JP4549185B2 - 硫酸基転移酵素阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は硫酸基転移酵素の阻害剤に関し、更に詳細にはグリコサミノグリカンの一種であるコンドロイチン硫酸の基本骨格に含まれる４−硫酸化ガラクトサミン残基の６位炭素原子に結合したヒドロキシル基を硫酸化する活性を有する硫酸基転移酵素（以下「ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６ＳＴ」ともいう）の該活性を阻害する阻害剤に関する。

コンドロイチン硫酸は、グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンとが１−３グリコシド結合で結合した二糖が１−４グリコシド結合で連なった骨格（本明細書中においては「基本骨格」とも記載する）を有し、硫酸基を有する多糖である、グリコサミノグリカンの一種である。
このようなコンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカンをはじめ、プロテオグリカン、糖タンパク質及び糖脂質は硫酸基を有しているものが多く、その生合成には多くの硫酸基転移酵素が関与している。特にＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４３８９４−４３９００（２００１）に記載された酵素や、それによって生ずるいわゆるコンドロイチン硫酸Ｅ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１４９１６−１４９２２（１９８９））等は、免疫系・神経系又は炎症反応に深く関与していることが示唆されており、当該酵素の阻害剤は免疫抑制剤（例えばアトピー性皮膚炎、喘息、クローン病の治療薬等）や神経調節剤・疾患治療剤（神経症、アルツハイマー、躁鬱症、精神病、自律神経失調症、神経性腸炎等の治療薬、神経修復調節剤、抗炎症剤等）に応用できる可能性が高い（米国特許第６２６５１９２号、第６３６５３６５号等）。
このような硫酸基転移酵素の阻害剤としては例えばＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５０，３４２−３４８（１９８８）に記載されたｃｈｌｏｒａｔｅやＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，８８０２−８８０６（１９９２）に記載されたｂｒｅｆｅｌｄｉｎＡ等が存在する。しかし、前者は硫酸基転移酵素による硫酸基転移に対して非特異的な拮抗作用を示すことにより、後者は糖鎖合成の場であるゴルジ体を破壊することにより、コンドロイチン硫酸のみならず他のグリコサミノグリカンや糖タンパク質の生合成までも強力に阻害してしまう働きがあるため、治療薬として利用できる可能性が極めて低かった。
そこで、特定の硫酸基転移酵素に対して特異性の高い阻害活性を有する新規の化合物、及びそれを用いた新たな硫酸基転移酵素阻害剤が求められていた。

本発明は以下の（１）〜（１１）に関する。
（１）下記式（１）で表されるガラクトサミン誘導体。

式中Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_５は各々独立にＳＯ_３ ⁻又はＨを示し、少なくとも何れかはＳＯ_３ ⁻を示し、
Ｒ_３はＨ、アセチル基又はＳＯ_３ ⁻を示し、
Ｒ_４はＨ、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のアルキニル基、置換又は無置換のアシル基、置換又は無置換のアリール基、又は置換又は無置換のアラルキル基を示し、
ＸはＯ、Ｓ、ＮＨ、又はＣＨ_２を示し、

（２）Ｒ_１及びＲ_２がＨであり、Ｒ_３がアセチル基であり、Ｒ_４が置換又は無置換のアリール基であり、Ｒ_５がＳＯ_３ ⁻である、（１）記載のガラクトサミン誘導体。
（３）Ｒ_１がＳＯ_３ ⁻であり、Ｒ_２及びＲ_５がＨであり、Ｒ_３がアセチル基であり、Ｒ_４が置換又は無置換のアリール基である、（１）記載のガラクトサミン誘導体。
（４）Ｒ_１及びＲ_５がＨであり、Ｒ_２がＳＯ_３ ⁻であり、Ｒ_３がアセチル基であり、Ｒ_４が置換又は無置換のアリール基である、（１）記載のガラクトサミン誘導体。
（５）（１）〜（４）何れか１項記載のガラクトサミン誘導体を含む、硫酸基転移酵素阻害剤。
（６）コンドロイチン硫酸の基本骨格中の４−硫酸化ガラクトサミン残基の６位炭素原子に結合したヒドロキシル基へ硫酸基を転移する活性を有する硫酸基転移酵素の前記活性を阻害する、（５）記載の硫酸基転移酵素阻害剤。
（７）（１）〜（４）何れか１項記載のガラクトサミン誘導体を硫酸基転移酵素による酵素反応系に存在させることを含む、硫酸基転移酵素の活性を阻害する方法。
（８）（１）〜（４）何れか１項記載のガラクトサミン誘導体の硫酸基転移酵素阻害剤としての使用。
（９）（１）〜（４）何れか１項記載のガラクトサミン誘導体の硫酸基転移酵素阻害剤の製造のための使用。
（１０）（１）〜（４）何れか１項記載のガラクトサミン誘導体を有効成分として含有する、硫酸基転移酵素の活性を阻害することに基づく医薬。
（１１）（１）〜（４）何れか１項記載のガラクトサミン誘導体を有効成分として含有する、硫酸基転移酵素の活性の亢進に起因する疾病の治療又は予防のための医薬。

第１図は、本発明物質１及び本発明物質２のＧａｌＮＡｃ４Ｓ６ＳＴに対する阻害活性を示す図である。それぞれの使用量において、左のカラムは本発明物質１を示し、右のカラムは本発明物質２を示す。
第２図は、本発明物質３及び本発明物質４のＧａｌＮＡｃ４Ｓ６ＳＴに対する阻害活性を示す図である。それぞれの使用量において、左のカラムは本発明物質３を示し、右のカラムは本発明物質４を示す。
第３図は、本発明物質５及び本発明物質６のＧａｌＮＡｃ４Ｓ６ＳＴに対する阻害活性を示す図である。それぞれの使用量において、左のカラムは本発明物質５を示し、右のカラムは本発明物質６を示す。

本発明者等は上記課題の解決のために鋭意検討した結果、「３位、４位及び／又は６位炭素原子が硫酸化されたガラクトサミン」のアノメリック炭素にグリコシド結合でアグリコン分子が結合してなる「ガラクトサミン誘導体」が硫酸基転移酵素、特にＧａｌＮＡｃ４Ｓ６ＳＴに対して優れた阻害活性を有することを見いだし、本発明を完成した。
以下、発明の実施の形態により本発明を詳説する。
（１）本発明物質
本発明物質は下記式（１）で表されることを特徴とするガラクトサミン誘導体である。
式中Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_５は各々独立にＳＯ_３ ⁻（硫酸基）又はＨ（水素原子）を示し、そのうち少なくとも一つはＳＯ_３ ⁻であり、Ｒ_３はＨ、アセチル基又はＳＯ_３ ⁻を示し、Ｒ_４はＨ、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のアルキニル基、置換又は無置換のアシル基、置換又は無置換のアリール基、又は置換又は無置換のアラルキル基を示し、ＸはＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ_２を示

本発明物質である式（１）で示される硫酸化ガラクトサミン誘導体を構成する硫酸化ガラクトサミン残基部分（上記式中「硫酸化ガラクトサミン残基部分」と示した部分）は、硫酸化ガラクトサミン残基の２位のアミノ基がアセチル化又は硫酸化されていても良く、特にアセチル化されていることが好ましい。すなわちＲ_３はＨ、アセチル基又はＳＯ_３ ⁻が挙げられ、特にアセチル基であることが好ましい。
また、硫酸化ガラクトサミン残基の３位、４位及び６位炭素原子に結合しているヒドロキシル基の水素原子が各々独立にＳＯ_３ ⁻に置換していても良く、これら炭素原子の何れかが少なくとも硫酸化されていることが必要である。すなわち、上記式中Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_５は各々独立にＳＯ_３ ⁻又はＨを示し、少なくとも何れかはＳＯ_３ ⁻であることが必要である。最も好ましくは、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_５の何れか１つのみがＳＯ_３ ⁻であり、他はＨである。
式（１）で示されるＲ_４の部分は水素原子（Ｈ）又は一般に糖の修飾や保護に用いるアグリコン分子を示し、アグリコン分子の方が水素原子よりも好ましい。そのようなアグリコン分子としては置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のアルキニル基、置換又は無置換のアシル基、置換又は無置換のアリール基、又は置換又は無置換のアラルキル基が挙げられるが、置換又は無置換のアリール基及びアラルキル基が好ましく、特に置換又は無置換のアリール基が好ましい。
上記アルキル基としては例えば炭素数１〜２３、好ましくは２〜２０の直鎖又は分枝を有するアルキル基が挙げられ、炭素数２〜１８の直鎖のアルキル基が好ましいアルキル基として挙げられる。また、アルキル基は、下記式（２）で示すようなアルキルグリセロール由来の骨格を有するアルコキシアルキル基又はアシルグリセロール由来の骨格を有するアシルオキシアルキル基でも良い（下記構造式中ｌ、ｍは各々独立に０〜１８の整数を示し、Ｚは各々独立にメチレン基又はカルボニル基を示す）。

上記アルケニル基及びアルキニル基は、炭素数１〜２３、好ましくは２〜２０であることが好ましく、炭素原子同士の二重結合、三重結合を複数有していても良い。
上記アシル基とは、一般に−ＣＯ−Ｒで表される基であれば何れでも良いが、Ｒで表される部分の炭素数は１〜２３、好ましくは２〜２０である。尚、上記一般式においてＲは上述したアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、後述のアリール基、アラルキル基から選択されるいずれかの基である。
アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アシル基は、更に、ヒドロキシル基（ＯＨ）、オキソ基、ハロゲン原子、置換又は無置換のアリール基、置換又は無置換の複素環基、ニトロ基、置換又は無置換のアミノ基、トリフルオロメチル基、置換又は無置換のアルキルチオ基、置換又は無置換のアリールオキシ基、置換又は無置換のカルバモイル基、メルカプト基、シアノ基等で置換されていてもよい。なおここで置換複素環基、置換アミノ基、置換アルキルチオ基、置換アリールオキシ基、置換カルバモイル基の置換基としては、ヒドロキシル基（ＯＨ）、オキソ基、ハロゲン原子が挙げられる。また、複素環基とは、例えば、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む３〜８員の複素環基が挙げられる。
上記アリール基とは例えばフェニル基、ナフチル基等の芳香族炭化水素残基、又はこれらの芳香族炭化水素残基において更にアルキル基、アシル基、ヒドロキシル基（ＯＨ）、ハロゲン原子（フッ素原子（Ｆ）、塩素原子（Ｃｌ）、臭素原子（Ｂｒ）、ヨウ素原子（Ｉ）等）、ニトロ基（ＮＯ_２）、硫酸基（ＳＯ_３ ⁻）、オキソ基等の置換基が芳香環の水素原子に置換している芳香族残基（例えばアルコキシフェニル基、トリル基等）が例示され、この中でも特にフェニル基及びナフチル基が好ましく、特にフェニル基が好ましい。
上記アラルキル基とは、前記置換又は無置換のアリール基（Ａｒ）にアルキル基が結合したＡｒ−（ＣＨ_２）_ｎ−を一般式として表される残基であり、前記ｎは１〜２０が好ましく、２〜１８がより好ましい。このようなアラルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、α−メチルベンジル基等が例示される。
上記式（１）における、「硫酸化ガラクトサミン残基部分」とＲ_４との結合は、「硫酸化ガラクトサミン残基部分」の硫酸化ガラクトサミン誘導体残基の１位炭素原子を介したグリコシド結合であり、これはα−グリコシド結合であって

また、本発明におけるグリコシド結合とは、例えば通常のグリコサミノグリカンの基本骨格に存在するＯ−グリコシド結合の他、Ｏ（酸素原子）部分がＳ（硫黄原子）、ＮＨ（イミノ基）、又はＣＨ_２（メチレン基）に各々置換したＳ−グリコシド結合、Ｎ−グリコシド結合、及びＣ−グリコシド結合も包含する。しかし、本発明物質においては特にＯ−グリコシド結合であることが好ましい。すなわち、上記式中ＸはＯ、Ｓ、ＮＨ及びＣＨ_２が例示されるが、Ｏが最も好ましい。なお、糖を構成する六員環はフネ型とイス型の何れもが存在しうるが、本発明物質においては安定性の面からイス型が好ましい。しかしこれに限定はされない。
従って、最も好ましい硫酸化ガラクトサミングリコシド誘導体の例示としては、下記式（３）、式（４）、式（５）及び式（６）等で各々示される物質が挙げられる。

ン残基部分へのグリコシド結合の様式であるα及びβを示す。便宜上α結合している上記式（３）で表される本発明物質を「本発明物質１」と表記し、β結合している上記式（３）で表される本発明物質を「本発明物質２」と記載する。また同様にα結合している上記式（４）で表される本発明物質を「本発明物質３」と、β結合している上記式（４）で表される本発明物質を「本発明物質４」と、α結合している上記式（５）で表される物質を「本発明物質５」と、β結合している上記式（５）で表される物質を「本発明物質６」と記載する。
本発明物質１及び２は以下の方法で調製することができる。
すなわち、フェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノシドを乾燥ピリジンに溶解し、これに三酸化硫黄ピリジン錯体を添加して反応させ、６位ヒドロキシル基を選択的に硫酸化することによって合成することができる。反応後、イオン交換を行い、これを濃縮することで本発明物質１又は２を得ることができる。上記反応後、必要に応じ、イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーやゲル濾過法等の分子量により化合物を分離する方法を用いて精製することが可能である。
また、本発明物質３及び４は以下の方法で調製することができる。すなわち、２−アセトアミド４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノシドを乾燥ピリジンに溶解し、三酸化硫黄ピリジン錯体を加え、これを例えば５０℃で加熱しながら４時間以上撹拌して、３位ヒドロキシル基を硫酸化した後、メタノールを加えた後、濃縮して反応生成物を得、この反応生成物を、エタノール水溶液に溶解し、この溶液にパラジウム触媒を加え、水素ガス雰囲気下で反応させてベンジリデン基を除去し、その後、セライト等を使用して濾過した後、常法に従って精製して調製することができる。
さらに、本発明物質５及び６は、フェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−スルホニル−６−Ｏ−ベンジル−Ｄ−ガラクトピラノシドをエタノール水溶液等に溶解し、パラジウム触媒を添加し、水素ガス雰囲気下で反応させて６位ベンジル基を除去することによって合成することができる。反応混合物をセライト等で濾過した後、常法に従って精製して得ることができる。
このようにして得られる本発明物質は、硫酸基転移酵素（特にＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４３８９４−４３９００（２００１）記載の硫酸基転移酵素）及び当該酵素の基質（硫酸基供与体及び硫酸基受容体）と共存させて、硫酸基転移酵素の酵素活性を測定することにより、下記本発明阻害剤としての作用を確認することができる。
（２）本発明阻害剤
本発明阻害剤は本発明物質を含み、硫酸基転移酵素の活性を阻害する作用を有する。
本発明阻害剤が活性を阻害する硫酸基転移酵素とは硫酸基供与体から硫酸基受容体に硫酸基を転移する活性を有する酵素であり、コンドロイチンの基本骨格に存在するガラクトサミンの４位炭素原子に結合したヒドロキシル基を硫酸化する働きを有する酵素又はグリコサミノグリカンの基本骨格に存在するヘキソサミン残基の６位ヒドロキシル基に対して硫酸基を転移する酵素であることが好ましく、特に後者の酵素が好ましい。このような酵素としては特開平１０−３３１６８号、特開２００１−５７８８２号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４３８９４−４３９００（２００１）、特開２０００−６０５６６号、ＷＯ０２／００８８９、特開２００１−６１４８１号、特開平８−３３４８３号記載の酵素が例示され、その中でも特にコンドロイチン硫酸に存在するガラクトサミン残基に対して硫酸基を転移する酵素であるコンドロイチン６−硫酸基転移酵素（特開平１０−３３１６８号、特開２００１−５７８８２号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４３８９４−４３９００（２００１））が好ましく、最も好ましくはＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４３８９４−４３９００（２００１）記載の酵素（コンドロイチン硫酸に存在する４−硫酸化ガラクトサミン残基の６位ヒドロキシル基に対して硫酸基を転移する活性を有する酵素：ＧａｌＮＡｃ４Ｓ６ＳＴが例示される。
本発明阻害剤において「酵素活性の阻害活性」とは、本発明阻害剤を添加しない反応系（対照）での酵素活性を１００％、酵素を添加しない系（陰性対照）での酵素活性を０％とした場合に、対照と比べて酵素活性が５％以上低下する場合を指称する。本発明阻害剤は特に後述の実施例２記載の阻害活性の測定方法に従って阻害活性を測定した際に、２．５ｍＭの阻害剤濃度での反応時において５％以上、好ましくは１０％以上、最も好ましくは１５％以上の阻害活性を示す。
本発明阻害剤は、コンドロイチンの基本骨格に対して硫酸基を転移する酵素、特にＧａｌＮＡｃ４Ｓ６ＳＴの活性が亢進して発症する疾病又はＧａｌＮＡｃ４Ｓ６ＳＴの活性を抑制することで症状の進行の遅延、症状の改善、予防が可能な疾病に対する予防薬、治療薬として使用することが可能である。具体的には、例えばアレルギー、炎症、神経失調、神経疾患等の予防薬や治療薬等に利用することが可能である。従って、本発明阻害剤を公知の抗アレルギー剤や抗炎症剤、神経失調治療剤、神経疾患治療剤等と混合して使用することも可能である。
また、本発明阻害剤は、薬理学的に許容される一つ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供することが可能である。そのような担体としては、具体的には、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、界面活性剤等、通常医薬に用いられる成分が挙げられる。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または鼻、粘膜、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度で１回〜数回投与する。

本発明物質の調製
（１）本発明物質１の調製

フェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物１）２１．７ｍｇ（０．０７３ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン１．５ｃｍ^３に溶解し、三酸化硫黄ピリジン錯体２０．１ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ）を添加して室温で６時間撹拌した。反応混合液にメタノールを１．５ｃｍ^３添加し、イオン交換樹脂Ｎａ^＋型（ＰＡＲＴＩＳＩＬ１０ＳＡＸ：Ｗｈａｔｍａｎ社製）を通過させ、溶出液を減圧濃縮し、化合物２（本発明物質１）３４．４ｍｇを得た。化合物２をイオン交換樹脂（ＰＡＲＴＩＳＩＬ１０ＳＡＸ：Ｗｈａｔｍａｎ社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及びゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０カラムを使用：ファルマシアバイオテック社製）により精製した。このようにして調製した本発明物質１を^１Ｈ−ＮＭＲで分析した。なお、上記化学式中「Ｐｈ」はフェニル基を示す。
（化合物２）
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）
δ（ｐｐｍ）：１．９２（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ _３），３．９７−４．１０（ｍ，４Ｈ），４．２３−４．２７（ｍ，２Ｈ），５．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，α−Ｈ−１），７．００−７．０４（ｍ，３Ｈ），７．２４−７．２８（ｍ，２Ｈ）
（２）本発明物質２の調製

フェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物３）４０．４ｍｇ（０．１３５８ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン２．０ｃｍ^３に溶解し、三酸化硫黄ピリジン錯体４４．５ｍｇ（０．２７８１ｍｍｏｌ）を添加して２４℃で６時間撹拌した。反応混合液にメタノールを１．５ｃｍ^３添加し、イオン交換樹脂Ｎａ^＋型（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ：ダウケミカル社製）を通過させた。溶出液を遠心分離して不用物を除去した後、減圧濃縮し、化合物４（本発明物質２）５．０ｍｇを得た。化合物４をイオン交換樹脂（ＰＡＲＴＩＳＩＬ１０ＳＡＸ：Ｗｈａｔｍａｎ社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及びゲル濾過（Ｓｕｐａｅｒｄｅｘ３０カラムを使用：ファルマシアバイオテック社製）により精製した。このようにして調製した本発明物質２を^１Ｈ−ＮＭＲで分析した。なお、上記化学式中「Ｐｈ」はフェニル基を示す。
（化合物４）
収率：９％
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）
δ（ｐｐｍ）：１．８８（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ _３），３．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，Ｈ−３），３．９３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−４），３．９７−４．１５（ｍ，４Ｈ，Ｈ−６，Ｈ−５，Ｈ−２），４．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，β−Ｈ−１），６．９４−７．０３（ｍ，３Ｈ），７．２２−７．２８（ｍ，２Ｈ）
（３）本発明物質３の調製

２−アセトアミド４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物５）３０．４ｍｇ（０．０７８８ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン２．０ｃｍ^３に溶解し、三酸化硫黄・ピリジン錯体１３４．３ｍｇ（０．８３９５ｍｍｏｌ）を加えた。これを５０℃で加熱しながら２０時間撹拌した後、メタノールを２．０ｃｍ^３を加えた。反応後、イオン交換樹脂Ｎａ^＋型に通過させ、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
この精製物１８．５ｍｇ（０．０３７９ｍｍｏｌ）を、エタノール水溶液２．０ｃｍ^３に溶解し、この溶液にパラジウム触媒（パラジウム−炭）２１．２ｍｇを加え、水素ガス雰囲気下、４０℃で加熱しながら３３時間撹拌した。反応後、セライトで濾過した後、電気泳動、ゲル濾過によって精製し、化合物６（本発明物質３）を得た（３．９ｍｇ）。なお、上記化学式中「Ｐｈ」はフェニル基を示す。
（化合物６）
収率：２６％
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）
δ（ｐｐｍ）：１．９１（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ _３），３．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，Ｈ−６），４．０１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，Ｈ−５），４．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｈ−４），４．４３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｈ−２），４．６２−４．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），５．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，α−Ｈ−１），６．９９−７．０６（ｍ，３Ｈ），７．２４−７．２６（ｍ，２Ｈ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００．４ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）
δ（ｐｐｍ）：２４．８２，５０．６５，６３．７５，７４．４１，７８．５０，９９．０９，１２０．０３，１２６．０６，１３２．７２，１５８．７５，１７７．６１
（３）本発明物質６の調製

フェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−スルホニル−６−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物７）１６．２ｍｇ（０．０２７９ｍｍｏｌ）をエタノール水溶液２．０ｃｍ^３に溶解し、パラジウム触媒（パラジウム−炭）３０．４ｍｇを添加した。水素ガス雰囲気下、４０℃で加熱しながら２１時間撹拌した。反応混合物をセライトで濾過した後、イオン交換樹脂及びゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製した。このようにして調製した化合物８（本発明物質６）を５．２ｍｇを得た。なお、上記化学式中「Ｂｎ」はベンジル基を示し、「Ｐｈ」はフェニル基を示す。
（化合物８）
収率：４７％
（４）その他の本発明物質の調製

化合物９（Ｄ−ガラクトサミン誘導体）１０３．２ｍｇ（０．３１５ｍｍｏｌ）と乾燥ジクロロメタン１．５５ｃｍ^３を混同し、ピリジン１．０５ｃｍ^３を加えた。この混合物を０℃に冷却した後、ピバロイルクロリド０．１２５ｃｍ^３（ｄ＝０．９７９，１．０１４９ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５．５時間撹拌した。さらに反応混合物にピバロイルクロリド０．１０ｃｍ^３（０．８１２ｍｍｏｌ）を追加して室温で７時間撹拌した後、クロロホルム５０ｃｍ^３に溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１５ｃｍ^３で３回、飽和食塩水１５ｃｍ^３で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン）で分離精製し、無色オイル状の化合物１０を１０２．６ｍｇ（０．２０７ｍｍｏｌ）得た。
（化合物１０）
収率：６６％
Ｒｆ＝０．２７８（５０％酢酸エチル−ヘキサン１回展開）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ（ｐｐｍ）：１．０８（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ _３）_３），１．２１（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ _３）_３），１．９３（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ _３），３．７５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３），４．０３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），４．１３−４．２１（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５ ａｎｄ Ｈ−６ａ），４．３３（ｄｄ，Ｊ_{６ａ，６ｂ}＝１１．０Ｈｚ，Ｊ_５，６ｂ＝３．９Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），４．８３（ｄｄｄ，Ｊ_２，３＝１１．０Ｈｚ，Ｊ_２，ＮＨ＝１０．２Ｈｚ，Ｊ_１，２＝３．６Ｈｚ，Ｈ−２），５．３０（ｄｄ，Ｊ_２，３＝１１．０Ｈｚ，Ｊ_３，４＝３．２Ｈｚ，Ｈ−３），５．４３（ｄ，Ｊ_１，２＝３．６Ｈｚ，Ｈ−１），５．７６（ｄ，Ｊ_２，ＮＨ＝１０．２Ｈｚ，ＮＨ），６．７８−６．８２（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍ．Ｈ），６．９６−７．００（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍ．Ｈ）
^１３Ｃ ＮＭＲ（１００．４ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ（ｐｐｍ）：２３．２６（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ_３），２７．０３（ｑ，Ｃ（ＣＨ_３）_３），２７．０７（ｑ，Ｃ（ＣＨ_３）_３），３８．６５（ｓ，Ｃ（ＣＨ_３）_３），３９．０９（ｓ，Ｃ（ＣＨ_３）_３），４７．４２（ｄ，Ｃ−２），５５．６８（ｑ，ＯＣＨ_３），６３．３０（ｔ，Ｃ−６），６７．７２（ｄ，Ｃ−４），６９．１０（ｄ，Ｃ−５），７０．３１（ｄ，Ｃ−３），９７．１９（ｄ，Ｃ−１），１１４．７５（ｄ，ａｒｏｍ．ＣＨ），１１７．７６（ｄ，ａｒｏｍ．ＣＨ），１５０．１０（ｓ，ａｒｏｍ．Ｃ），１５５．３５（ｓ，ａｒｏｍ．Ｃ），１６９．８６（ｓ，ＮＨＣＯＣＨ_３），１７８．３２（ｓ，Ｏ＝ＣＣ（ＣＨ_３）_３），１７８．５６（ｓ，Ｏ＝ＣＣ（ＣＨ_３）_３）

５３．９ｍｇ（０．１０８ｍｍｏｌ）の化合物１０を乾燥ピリジン５ｃｍ^３と混合し、三酸化硫黄・ピリジン錯体３８．４ｍｇ（０．２４１ｍｍｏｌ）を加えた。４０℃で６時間撹拌した後、反応混合物にメタノール１ｃｍ^３を加え、Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ Ｘ８（２００〜４００メッシュ）Ｎａ^＋型に通過させた。通過液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン）で分離精製し、無色結晶の化合物１１（２９．８ｍｇ：０．０４９９ｍｍｏｌ）を単離した。
（化合物１１）
収率：４６％
Ｒｆ＝０．６２５（３０％メタノール−クロロホルム１回展開）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ（ｐｐｍ）：１．０１（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ _３）_３），１．１６（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ _３）_３），１．９３（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ _３），３．７１（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３），４．１４（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６ａ），４．３１（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），４．４９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６ｂ），４．７５（ｔｄ，Ｊ_２，３＝Ｊ_２，ＮＨ＝１０．５Ｈｚ，Ｊ_１，２＝３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），５．０２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），５．２７（ｄｄ，Ｊ_２，３＝１０．５Ｈｚ，Ｊ_３，４＝１．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），５．４３（ｄ，Ｊ_１，２＝３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１），６．２５（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ，ａｒｏｍ．Ｈ）
６．８７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ，ａｒｏｍ．Ｈ）
^１３Ｃ ＮＭＲ（１００．４ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）
δ（ｐｐｍ）：２３．２１（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ_３），２６．９８（ｑ，Ｃ（ＣＨ_３）_３），２７．０６（ｑ，Ｃ（ＣＨ_３）_３），３８．６６（ｓ，Ｃ（ＣＨ_３）_３），３９．０１（ｓ，Ｃ（ＣＨ_３）_３），４７．８２（ｄ，Ｃ−２），５５．５８（ｑ，ＯＣＨ_３），６４，４６（ｔ，Ｃ−６），６９．１２（ｄ，Ｃ−３），６９．１２（ｄ，Ｃ−５），７３．２０（ｄ，Ｃ−４），９７．２７（ｄ，Ｃ−１），１１４．５６（ｄ，ａｒｏｍ．ＣＨ），１１８．４２（ｄ，ａｒｏｍ．ＣＨ），１５０．３１（ｓ，ａｒｏｍ．Ｃ），１５５．２７（ｓ，ａｒｏｍ．Ｃ），１７０．５１（ｓ，ＮＨＣＯＣＨ_３），１７９．３０（ｓ，Ｏ＝ＣＣ（ＣＨ_３）_３），１７９．６３（ｓ，Ｏ＝ＣＣ（ＣＨ_３）_３）

２９．８ｍｇ（０．０４９９ｍｍｏｌ）の化合物１１と乾燥メタノール１．０ｃｍ^３とを混合し、１．０ｍｏｌ／ｄｍ^３ナトリウムメトキシドメタノール溶液０．１０ｃｍ^３を加えた。室温で４８時間撹拌した後、反応混合物をアンバーライトＩＲＣ ５０ Ｈ^＋型で中和し、減圧濃縮した。残留物をゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０）で精製し、無色結晶の化合物１２（本発明物質）１１．３ｍｇ（０．０２６６ｍｍｏｌ）を得た。
（化合物１２）
収率：５３％
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ（ｐｐｍ）：１．９４（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ _３），３．６３（ｄｄ，Ｊ_６ａ，_６ｂ＝１１．８Ｈｚ，Ｊ_５，６ａ＝７．９Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．６８（ｄｄ，Ｊ_{６ａ，６ｂ}＝１１．８Ｈｚ，Ｊ_５，６ｂ＝４．４Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．６９（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ_３），４．１２−４．１６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３ ａｎｄ Ｈ−５），４．２２（ｄｄ，Ｊ_２，３＝１１．１Ｈｚ，Ｊ_１，２＝３．７Ｈｚ，Ｈ−２），４．６９−４．７２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），５．４１（ｄ，Ｊ_１，２＝３．７Ｈｚ，Ｈ−１），６．８４−６．８８（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍ．Ｈ），６．９７−７．０１（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍ．Ｈ）
^１３Ｃ ＮＭＲ（１００．４ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）
δ（ｐｐｍ）：２４．７６（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ_３），５３．０５（ｄ，Ｃ−２），５８．６７（ｑ，ＯＣＨ_３），６３．９３（ｔ，Ｃ−６），６９．５６（ｄ，Ｃ−３），７３．９８（ｄ，Ｃ−５），７９．４７（ｄ，Ｃ−４），９９．９２（ｄ，Ｃ−１），１１７．９２（ｄ，ａｒｏｍ．ＣＨ），１２１．７０（ｄ，ａｒｏｍ．ＣＨ），１５３．３０（ｓ，ａｒｏｍ．Ｃ）１５７．５６（ｓ，ａｒｏｍ．Ｃ），１７７．６０（ｓ，ＮＨＣＯＣＨ_３）

酵素活性の測定はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４３８９４−４３９００（２００１）記載の方法を改変して行なった。標準反応液は５０μｌ中に、２．５μｍｏｌのイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．５μｍｏｌのＣａＣｌ_２、１μｍｏｌの還元型グルタチオン、ガラクトサミン換算で２５ｎｍｏｌのコンドロイチン硫酸Ａ（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、５０ｐｍｏｌの［^３５Ｓ］ＰＡＰＳ（活性硫酸：約５．０×１０^５ｃｐｍ：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４８，３０３−３１０（１９８５）に従って調製した）、及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４３８９４−４３９００（２００１）記載の方法で調製したヒト由来のＧａｌＮＡｃ４Ｓ６ＳＴを添加した。この反応系に本発明物質１、本発明物質２、本発明物質３、本発明物質４、本発明物質５、本発明物質６を各々最終濃度５０ｎｍｏｌ、１２５ｎｍｏｌ、及び２５０ｎｍｏｌとなるように添加して反応を開始した。
反応は、反応液を３７℃で２０分間インキュベートして行い、反応の停止は１分間反応チューブを沸騰水中で加熱して行なった。反応停止後、１．３％酢酸カリウムを含むエタノールを３倍量添加し、^３５Ｓラベルされたグリコサミノグリカンを沈殿させ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２１９６８−２１９７４（１９９３）に記載された方法で高速脱塩カラムを用いたゲルクロマトグラフィーを行って、その後、シンチレーションカウンターで放射能を測定した。陰性対照として酵素を添加しない反応系を用いた。
本発明物質を添加しない系の酵素活性を陽性対象として１００％とし、本発明物質を添加した系での酵素反応の相対値を算出した（本発明物質１及び本発明物質２：第１図、本発明物質３及び本発明物質４：第２図、本発明物質５及び本発明物質６：第３図）。
その結果、本発明物質１、本発明物質２共に阻害活性が観察され、特に本発明物質２の阻害活性が強かった。また本発明物質３〜６に関しても、何れも阻害活性が観察されたが、本発明物質３（α型）と本発明物質４（β型）とでは本発明物質３の方が強い阻害活性を示し、本発明物質５（α型）と本発明物質６（β型）とでは本発明物質６の方が強い阻害活性を示した。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである
本出願は、２００２年７月１０日および２００２年１２月２７日出願の日本特許出願（特願２００２−２０１８４３および特願２００２−３８２１２２）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

本発明により硫酸基転移酵素の阻害活性を有するガラクトサミン誘導体及びそれを用いる硫酸基転移酵素阻害剤が提供される。

Claims (7)

1. 下記式（１）で表されるガラクトサミン誘導体を含む、硫酸基転移酵素阻害剤（医薬の形態を除く）。
   

   

   式中Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_５は各々独立にＳＯ_３ ⁻又はＨを示し、少なくとも何れかはＳＯ_３ ⁻を示し、
   Ｒ_３はアセチル基を示し、
   Ｒ_４はヒドロキシル基、ハロゲン原子、ニトロ基及び硫酸基から選ばれる少なくとも１つの置換基を有するアリール基又は無置換アリール基を示し、
   ＸはＯを示し、
   

   
2. 下記式（１）で表されるガラクトサミン誘導体を含む、硫酸基転移酵素阻害剤（医薬の形態を除く）。
   

   

   式中Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_５は各々独立にＳＯ_３ ⁻又はＨを示し、少なくとも何れかはＳＯ_３ ⁻を示し、
   Ｒ_３はアセチル基を示し、
   Ｒ_４はフェニル基又はメトキシフェニル基を示し、
   ＸはＯを示し、
   

   
3. Ｒ_４がフェニル基である請求項２に記載の硫酸基転移酵素阻害剤。
4. Ｒ_１及びＲ_５がＨであり、Ｒ_２がＳＯ_３ ⁻であり、
   

   

   又は、Ｒ_１がＳＯ_３ ⁻であり、Ｒ_２及びＲ_５がＨであり、
   

   

   請求項３に記載の硫酸基転移酵素阻害剤。
5. Ｒ_２がＳＯ_３ ⁻であり、Ｒ_１及びＲ_５がＨであり、
   

   

   請求項４に記載の硫酸基転移酵素阻害剤。
6. Ｒ_１がＳＯ_３ ⁻であり、Ｒ_２及びＲ_５がＨであり、
   

   

   請求項４に記載の硫酸基転移酵素阻害剤。
7. コンドロイチン硫酸の基本骨格中の４−硫酸化ガラクトサミン残基の６位炭素原子に結合したヒドロキシル基へ硫酸基を転移する活性を有する硫酸基転移酵素の前記活性を阻害する、請求項１から６のいずれか１項記載の硫酸基転移酵素阻害剤。

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