JP4545513B2 - Neurite outgrowth promoting polypeptide - Google Patents
Neurite outgrowth promoting polypeptide Download PDFInfo
- Publication number
- JP4545513B2 JP4545513B2 JP2004228693A JP2004228693A JP4545513B2 JP 4545513 B2 JP4545513 B2 JP 4545513B2 JP 2004228693 A JP2004228693 A JP 2004228693A JP 2004228693 A JP2004228693 A JP 2004228693A JP 4545513 B2 JP4545513 B2 JP 4545513B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- present
- ngc
- amino acid
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は新規な神経突起伸長促進ポリペプチドに関し、詳しくは、ニューログリカンＣをベースとする神経突起伸長促進ポリペプチドに関する。また本発明は、前記ポリペプチドを有効成分とする神経突起伸展促進剤に関する。 The present invention relates to a novel neurite outgrowth promoting polypeptide, and in particular to a neurite outgrowth promoting polypeptide based on neuroglycan C. The present invention also relates to a neurite outgrowth promoter comprising the polypeptide as an active ingredient.
まず、本明細書中で用いた略号について説明する。
ＣＳ：コンドロイチン硫酸（chondroitin sulfate）
ＥＧＦ：上皮成長因子（epidermal growth factor）
ＧＡＢＡ：γ−アミノ酪酸（γ-aminobutyric acid）
ＧＳＴ：グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（glutathione S-transferase）
ＩＰＴＧ：イソプロピルチオガラクトシド（isopropylthiogalactoside）
ＬＢ培地：ルリア-ベルターニ培地 (Luria-Bertani's medium)
ＭＡＰ２：微小管関連タンパク質２（microtubule-associated protein 2）
ＮＧＣ：ニューログリカンＣ（neuroglycan C）
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline）
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ｔａｕ：τタンパク質（tau protein）
ＴＭ：膜貫通
ラットＮＧＣ：ラット由来のＮＧＣ
ヒトＮＧＣ：ヒト由来のＮＧＣ
ＮＧＣは、脳に特異的なＣＳプロテオグリカンである。既にラット、ヒト及びマウスにおいてそのクローニングがなされており、「ＡＡドメイン」、「ＥＧＦ様ドメイン」、「膜貫通ドメイン（ＴＭドメイン）」等のドメイン構造が見出されている（非特許文献１、２、３）。
First, abbreviations used in this specification will be described.
CS: chondroitin sulfate
EGF: epidermal growth factor
GABA: γ-aminobutyric acid
GST: glutathione S-transferase
IPTG: isopropylthiogalactoside
LB medium: Luria-Bertani's medium
MAP2: microtubule-associated protein 2
NGC: Neuroglycan C
PBS: phosphate buffered saline
PCR: Polymerase chain reaction
tau: tau protein
TM: Transmembrane rat NGC: Rat-derived NGC
Human NGC: Human-derived NGC
NGC is a CS proteoglycan specific to the brain. It has already been cloned in rats, humans and mice, and domain structures such as “AA domain”, “EGF-like domain”, “transmembrane domain (TM domain)” have been found (Non-patent
本発明は、ＮＧＣをベースにした新規な神経突起伸長促進ポリペプチド及びその用途を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel neurite outgrowth promoting polypeptide based on NGC and its use.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＮＧＣのＡＡドメイン及びＥＧＦドメインの少なくとも一方を保持する部分ポリペプチドの製造に成功し、さらにこれが神経突起伸長を促進する活性を有することを見出し、本発明に至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have succeeded in producing a partial polypeptide that retains at least one of the AGC domain and the EGF domain of NGC, and this has an activity of promoting neurite outgrowth. As a result, they have reached the present invention.
すなわち本発明は、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を少なくとも保持し、かつ、１２〜４００アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチド（以下、「本発明ポリペプチド１」という。）を提供する。
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
（XaaはGlu残基又はAsp残基を示す。）
本発明ポリペプチド１は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるものが好ましい。また本発明ポリペプチド１は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるものも好ましい。また本発明ポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものも好ましい。
That is, the present invention provides a polypeptide (hereinafter referred to as “the
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
(Xaa represents a Glu residue or an Asp residue.)
The
また本発明は、下記のアミノ酸配列（配列番号５）を少なくとも保持し、かつ、３９〜４００アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチド（以下、「本発明ポリペプチド２」という。）を提供する。
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys
本発明ポリペプチド２は、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
以下、本発明ポリペプチド１及び２を併せて「本発明ポリペプチド」という。
The present invention also provides a polypeptide (hereinafter referred to as “the polypeptide 2 of the present invention”) having at least the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) and comprising 39 to 400 amino acid residues. provide.
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys
The polypeptide 2 of the present invention preferably has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
Hereinafter, the
また本発明は、本発明ポリペプチドに、他のポリペプチドが結合していることを特徴とする、融合ポリペプチド（以下、「本発明融合ポリペプチド」という。）を提供する。この「他のポリペプチド」はＧＳＴであることが好ましい。 The present invention also provides a fusion polypeptide (hereinafter referred to as “the fusion polypeptide of the present invention”), wherein another polypeptide is bound to the polypeptide of the present invention. This “other polypeptide” is preferably GST.
また本発明は、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドをコードする核酸（以下、「本発明核酸」という。）を提供する。 The present invention also provides a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention (hereinafter referred to as “the nucleic acid of the present invention”).
さらに本発明は、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドを有効成分とする、神経突起伸展促進剤（以下、「本発明促進剤」という。）を提供する。 Furthermore, the present invention provides a neurite outgrowth promoting agent (hereinafter referred to as “the present invention promoting agent”) comprising the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention as an active ingredient.
本発明ポリペプチドは神経突起の伸展促進作用を有することから、神経突起伸展促進剤等の用途に利用することができ極めて有用である。また本発明融合ポリペプチドは、本発明ペプチドの精製等をより簡便なものとすることができ極めて有用である。また本発明核酸は、このようなポリペプチドの大量生産ツール等として利用することができ極めて有用である。また本発明促進剤は、試薬用途のみならず、神経突起の伸展、神経回路形成の促進等が望まれる疾患等に対する医薬等としても利用しうるものであり、極めて有用である。 Since the polypeptide of the present invention has a neurite extension promoting action, it can be used for applications such as a neurite extension promoter and is extremely useful. In addition, the fusion polypeptide of the present invention is extremely useful because it makes it easier to purify the peptide of the present invention. The nucleic acid of the present invention can be used as a tool for mass production of such a polypeptide and is extremely useful. The promoter of the present invention is extremely useful because it can be used not only as a reagent but also as a medicine for diseases and the like for which neurite outgrowth and promotion of neural circuit formation are desired.
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
＜１＞本発明ポリペプチド
（１）本発明ポリペプチド１
本発明ポリペプチド１は、下記のアミノ酸配列（配列番号１）を少なくとも保持し、かつ、１２〜４００アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチドである。
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
（XaaはGlu残基又はAsp残基を示す。）
上記のアミノ酸配列（配列番号１）は、ＮＧＣの「ＡＡドメイン」に相当する部分のアミノ酸配列である。そして本発明ポリペプチドは、このアミノ酸配列を少なくとも保持しており、かつ、１２〜４００アミノ酸残基から構成されている限りにおいて、他のアミノ酸配列を保持していてもよい。
Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the invention.
<1> Polypeptide of the present invention (1) Polypeptide of the
The
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
(Xaa represents a Glu residue or an Asp residue.)
The amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) is an amino acid sequence of a portion corresponding to the “AA domain” of NGC. The polypeptide of the present invention retains at least this amino acid sequence and may retain other amino acid sequences as long as it is composed of 12 to 400 amino acid residues.
本発明ポリペプチド１の好ましい例示としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（２）本発明ポリペプチド２
本発明ポリペプチド２は、下記のアミノ酸配列（配列番号５）を少なくとも保持し、かつ、３９〜４００アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチドである。
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys
上記のアミノ酸配列（配列番号５）は、ＮＧＣの「ＥＧＦドメイン」に相当する部分のアミノ酸配列である。そして本発明ポリペプチドは、このアミノ酸配列を少なくとも保持しており、かつ、３９〜４００アミノ酸残基から構成されている限りにおいて、他のアミノ酸配列を保持していてもよい。
Preferred examples of the
(2) Polypeptide 2 of the present invention
The polypeptide 2 of the present invention is a polypeptide having at least the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) and comprising 39 to 400 amino acid residues.
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys
The amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) is the amino acid sequence of the portion corresponding to the “EGF domain” of NGC. The polypeptide of the present invention retains at least this amino acid sequence and may retain other amino acid sequences as long as it is composed of 39 to 400 amino acid residues.
本発明ポリペプチド２の好ましい例示としては、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
＜２＞本発明融合ポリペプチド
本発明融合ポリペプチドは、本発明ポリペプチドに、他のポリペプチドが結合していることを特徴とする融合ポリペプチドである。
Preferred examples of polypeptide 2 of the present invention include, but are not limited to, a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
<2> Fusion polypeptide of the present invention The fusion polypeptide of the present invention is a fusion polypeptide characterized in that another polypeptide is bound to the polypeptide of the present invention.
ここにいう「他のポリペプチド」はペプチドをも含む概念であり、その種類も特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。融合ポリペプチドを製造する目的としては、ポリペプチドを細胞外に分泌させたり、分離や精製を容易にしたり、検出を容易にしたり、複数のポリペプチドの活性を併有させたりすること等が例示されるが、これらに限定されるものではない。「他のタンパク質」の例示については、後述の「本発明核酸」に関する説明を参照されたいが、なかでもＧＳＴであることが好ましい。 The “other polypeptide” herein is a concept including a peptide, and the type thereof is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples of the purpose of producing a fusion polypeptide include secreting the polypeptide outside the cell, facilitating separation and purification, facilitating detection, and combining the activities of multiple polypeptides. However, it is not limited to these. For examples of “other proteins”, refer to the description regarding “the nucleic acid of the present invention” described later, and among these, GST is preferable.
本発明ポリペプチド及び本発明融合ポリペプチドは、保持すべき必須のアミノ酸配列が本発明によって特定されたことから、これに基づいて化学的に合成することも、遺伝子工学的に製造することもできる。遺伝子工学的に製造する方法の具体例については、後述の実施例１を参照されたい。 Since the essential amino acid sequence to be retained is specified by the present invention, the polypeptide of the present invention and the fusion polypeptide of the present invention can be synthesized chemically or genetically engineered based on this. . For a specific example of the method for producing by genetic engineering, see Example 1 described later.
本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドを化学的に合成する場合には、公知の化学合成法（例えば液相合成法や固相合成法等；泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇 道典、「ペプチド合成の基礎と実験」1985、丸善（株）参照）によって製造することができる。 In the case of chemically synthesizing the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention, a known chemical synthesis method (for example, liquid phase synthesis method or solid phase synthesis method; Nobuo Izumiya, Tetsuo Kato, Tohiko Aoyagi, Michi Wakido , “Basics and Experiments of Peptide Synthesis”, 1985, Maruzen Co., Ltd.).
製造された本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドは、タンパク質化学の分野において一般に知られているタンパク質の単離、精製方法によって精製することができる。具体的には、例えば抽出、再結晶、硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配等や、これらの組合せ等の処理操作が挙げられる。 The produced polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention can be purified by protein isolation and purification methods generally known in the field of protein chemistry. Specifically, for example, extraction, recrystallization, salting out with ammonium sulfate (ammonium sulfate) or sodium sulfate, centrifugation, dialysis, ultrafiltration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, normal phase chromatography Processing operations such as chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, countercurrent distribution, and combinations thereof.
例えば、本発明融合ポリペプチドにおける「他のポリペプチド」としてＧＳＴを用いた場合には、グルタチオンが固相化された担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製することができる。 For example, when GST is used as “another polypeptide” in the fusion polypeptide of the present invention, it can be easily purified by affinity chromatography using a carrier on which glutathione is immobilized.
本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドが合成又は製造等されたか否かは、得られたポリペプチドのアミノ酸配列（又はこれをコードする核酸の塩基配列）等を分析し、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチド（又は本発明核酸）の配列と比較することによって容易に判別することができる。 Whether the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention has been synthesized or produced is analyzed by analyzing the amino acid sequence of the obtained polypeptide (or the base sequence of the nucleic acid encoding the polypeptide), etc. It can be easily discriminated by comparing with the sequence of the fusion polypeptide of the present invention (or the nucleic acid of the present invention).
本発明ポリペプチド及び本発明融合ポリペプチドは、後述する実施例の記載からも明らかな通り、高い神経突起伸長促進活性を示すことから、後述する本発明促進剤等の有効成分として用いることができる。
＜３＞本発明核酸
本発明核酸は、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドをコードする核酸である。本発明核酸の種類は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても良いが、その安定性の観点からはＤＮＡであることが好ましい。
The polypeptide of the present invention and the fusion polypeptide of the present invention exhibit high neurite outgrowth promoting activity, as will be apparent from the description of Examples described later, and therefore can be used as active ingredients such as the promoter of the present invention described later. .
<3> Nucleic acid of the present invention The nucleic acid of the present invention is a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention. The nucleic acid of the present invention may be DNA or RNA, but DNA is preferred from the viewpoint of stability.
本発明核酸は、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドをコードしている限りにおいてその具体的な塩基配列は限定されない。 The specific base sequence of the nucleic acid of the present invention is not limited as long as it encodes the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention.
例えば、本発明ポリペプチドの一例として下記のアミノ酸配列（配列番号１）からなるポリペプチドが例示される。
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
（XaaはGlu残基又はAsp残基を示す。）
そして、これをコードする核酸（ＤＮＡ）としては、例えば、配列番号８における塩基番号８４７〜８８２で示される塩基配列からなるＤＮＡ及び配列番号１０における塩基番号８２３〜８５８で示される塩基配列からなるＤＮＡが例示される。
For example, a polypeptide comprising the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) is exemplified as an example of the polypeptide of the present invention.
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
(Xaa represents a Glu residue or an Asp residue.)
The nucleic acid (DNA) encoding this is, for example, DNA consisting of the base sequence shown by base numbers 847 to 882 in SEQ ID NO: 8 and DNA consisting of the base sequence shown by base numbers 823 to 858 in SEQ ID NO: 10. Is exemplified.
また、本発明ポリペプチドの一例として下記のアミノ酸配列（配列番号５）からなるポリペプチドも例示することができる。
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys
そして、これをコードする核酸（ＤＮＡ）としては、例えば、配列番号８における塩基番号１１４７〜１２６３で示される塩基配列からなるＤＮＡが例示される。
Moreover, the polypeptide which consists of the following amino acid sequence (sequence number 5) can also be illustrated as an example of polypeptide of this invention.
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys
And as a nucleic acid (DNA) which codes this, DNA which consists of a base sequence shown by base number 1147 to 1263 in
しかし、これら本発明ポリペプチドをコードするＤＮＡが、これらの塩基配列からなるものに限定されないことは、遺伝暗号の縮重を考慮すれば容易に理解することができる。すなわち、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有する核酸も本発明核酸に包含されることは当業者であれば容易に理解されるところである。 However, it can be easily understood that the DNA encoding the polypeptide of the present invention is not limited to those consisting of these base sequences in view of the degeneracy of the genetic code. That is, it is easily understood by those skilled in the art that nucleic acids having different base sequences due to the degeneracy of the genetic code are also encompassed by the nucleic acid of the present invention.
また「本発明核酸」には、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドをコードする塩基配列に相補的な配列からなる核酸も包含される。 The “nucleic acid of the present invention” also includes a nucleic acid comprising a sequence complementary to the base sequence encoding the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention.
以下、本発明ポリペプチドの一例とともに、これをコードする本発明核酸を例示する。
・配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド：配列番号８における塩基番号１０３〜１２９０で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
・配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド：配列番号８における塩基番号７８４〜１０２０で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
・配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド：配列番号８における塩基番号７８４〜１２９０で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
・配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド：配列番号８における塩基番号１０３０〜１２９０で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
Hereinafter, together with an example of the polypeptide of the present invention, the nucleic acid of the present invention encoding it will be exemplified.
Polypeptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2: DNA consisting of the base sequence shown by base numbers 103 to 1290 in SEQ ID NO: 8.
-Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3: DNA consisting of the base sequence shown by base numbers 784 to 1020 in SEQ ID NO: 8.
Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4: DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 784 to 1290 in SEQ ID NO: 8.
Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6: DNA consisting of the base sequence represented by base numbers 1030 to 1290 in SEQ ID NO: 8.
本発明核酸は、例えばGenBank Accession No. U33553又はNM_006574で特定されるDNAクローンを入手し、所望の塩基配列となるように、適宜、制限酵素を用いた切断や、他のポリペプチドをコードする核酸との連結を行うことによって製造することができる。製造された本発明核酸は、ＰＣＲ等によって増幅させてもよい。 The nucleic acid of the present invention is obtained by obtaining a DNA clone specified by, for example, GenBank Accession No. U33553 or NM_006574, and appropriately using a restriction enzyme or a nucleic acid encoding another polypeptide so that a desired base sequence is obtained. It can manufacture by connecting with. The produced nucleic acid of the present invention may be amplified by PCR or the like.
また本発明核酸を用いて、遺伝子工学的に本発明ポリペプチドを製造することもできる。本発明核酸（ｃＤＮＡ）を発現ベクターに組み込む。ここで用いる発現ベクターは、用いる宿主に応じて適宜選択することができる。例えば宿主細胞として真核細胞を使用する場合には真核細胞用の発現ベクターを選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には原核細胞用の発現ベクターを選択すればよい。 The polypeptide of the present invention can also be produced by genetic engineering using the nucleic acid of the present invention. The nucleic acid (cDNA) of the present invention is incorporated into an expression vector. The expression vector used here can be appropriately selected according to the host used. For example, when eukaryotic cells are used as host cells, eukaryotic expression vectors are selected. When prokaryotic cells are used as host cells, prokaryotic expression vectors are selected.
また、この発現ベクターは、本発明核酸がコードするポリペプチドの単離・精製が容易となるように構築されているものが好ましい。特に、本発明融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築すると、ポリペプチドの単離・精製が容易となるため好ましい。 The expression vector is preferably constructed so that the polypeptide encoded by the nucleic acid of the present invention can be easily isolated and purified. In particular, it is preferable to construct an expression vector so that it is expressed in the form of the fusion polypeptide of the present invention, since the polypeptide can be easily isolated and purified.
このような「他のタンパク質」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のN末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内で機能している15〜30アミノ酸残基からなるペプチド：例えばOmpA、OmpT、Dsb等）、プロテインキナーゼA、プロテインA（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタンパク質）、ＧＳＴ、Hisタグ（ヒスチジン残基を6〜10個並べて配した配列）、mycタグ（cMycタンパク質由来の13アミノ酸配列）、FLAGペプチド（8アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、T7タグ（gene10タンパク質の最初の11アミノ酸残基からなる）、Sタグ（膵臓RNaseA由来の15アミノ酸残基からなる）、HSVタグ、pelB（大腸菌外膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列）、HAタグ（ヘマグルチニン由来の10アミノ酸残基からなる）、Trxタグ（チオレドキシン配列）、CBPタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、CBDタグ（セルロース結合ドメイン）、CBRタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β-lac/blu（βラクタマーゼ）、β-gal（β-ガラクトシダーゼ）、luc（ルシフェラーゼ）、HP-Thio（His-patchチオレドキシン）、HSP（熱ショックペプチド）、Lnγ（ラミニンγペプチド）、Fn（フィブロネクチン部分ペプチド）、GFP（緑色蛍光ペプチド）、YFP（黄色蛍光ペプチド）、CFP（シアン蛍光ペプチド）、BFP（青色蛍光ペプチド）、DsRed、DsRed2（赤色蛍光ペプチド）、MBP（マルトース結合ペプチド）、LacZ（ラクトースオペレーター）、IgG（免疫グロブリンG）、アビジン、プロテインG等のペプチドが挙げられる。その中でも、特にＧＳＴが好ましい。 Such “other proteins” include, for example, signal peptides (residues of 15 to 30 amino acids that are present at the N-terminus of many proteins and function intracellularly for protein selection in the intracellular membrane permeation mechanism). Peptides consisting of groups: For example, OmpA, OmpT, Dsb, etc.), protein kinase A, protein A (a component of S. aureus cell wall and molecular weight of about 42,000), GST, His tag (6-10 histidine residues arranged side by side) Sequence), myc tag (13 amino acid sequence derived from cMyc protein), FLAG peptide (analysis marker consisting of 8 amino acid residues), T7 tag (consisting of the first 11 amino acid residues of gene10 protein), S tag ( Pancreatic RNaseA-derived 15 amino acid residues), HSV tag, pelB (22 amino acid sequence of E. coli outer membrane protein pelB), HA tag (10 amino acid residues derived from hemagglutinin) ), Trx tag (thioredoxin sequence), CBP tag (calmodulin-binding peptide), CBD tag (cellulose-binding domain), CBR tag (collagen-binding domain), β-lac / blu (β-lactamase), β-gal (β -Galactosidase), luc (luciferase), HP-Thio (His-patch thioredoxin), HSP (heat shock peptide), Lnγ (laminin γ peptide), Fn (fibronectin partial peptide), GFP (green fluorescent peptide), YFP (yellow) Fluorescent peptide), CFP (cyan fluorescent peptide), BFP (blue fluorescent peptide), DsRed, DsRed2 (red fluorescent peptide), MBP (maltose binding peptide), LacZ (lactose operator), IgG (immunoglobulin G), avidin, protein Peptides such as G are mentioned. Among these, GST is particularly preferable.
ここでは、宿主細胞として大腸菌を、ベクターとしてpGEX-4T1（アマシャムバイオサイエンス社製）を選択することが好ましい。このベクターにはＧＳＴをコードする配列が保持されており、ＧＳＴが前記ポリペプチドのＮ末端側に結合した形でポリペプチド（前記ポリペプチドとＧＳＴとの融合ポリペプチド）が発現されるようにｃＤＮＡの組込みを行うことがより好ましい。 Here, it is preferable to select Escherichia coli as the host cell and pGEX-4T1 (manufactured by Amersham Bioscience) as the vector. This vector retains a sequence encoding GST, and cDNA is expressed so that the polypeptide (a fusion polypeptide of the polypeptide and GST) is expressed in a form in which GST is bound to the N-terminal side of the polypeptide. It is more preferable to perform the incorporation.
所望のｃＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを所望の宿主細胞に通常の方法で導入して培養する。培養の条件は、ベクター・宿主細胞の種類、目的等によって適宜選択することができる。所望のｃＤＮＡが導入された宿主細胞を培養し、その培養物を採取することにより、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドを製造することができる。必要に応じて、タンパク質の公知の抽出・精製方法を用いてさらに精製してもよい。
＜４＞本発明促進剤
本発明促進剤は、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドを有効成分とする神経突起伸展促進剤である。本発明ポリペプチドや本発明融合ポリペプチドは神経突起伸展促進作用を有することから、これを本発明促進剤として応用したものである。
An expression vector incorporating the desired cDNA is introduced into a desired host cell by a conventional method and cultured. The culture conditions can be appropriately selected depending on the type and purpose of the vector / host cell. The polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention can be produced by culturing host cells into which a desired cDNA has been introduced and collecting the culture. If necessary, the protein may be further purified using a known protein extraction / purification method.
<4> Promoter of the Present Invention The promoter of the present invention is a neurite extension promoter containing the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention as an active ingredient. Since the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention has a neurite outgrowth promoting action, it is applied as a promoter of the present invention.
本発明促進剤の有効成分である「本発明ポリペプチド」又は「本発明融合ポリペプチド」の説明については前記と同様である。前記のようにして製造された本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドをそのまま本発明促進剤として提供してもよく、また医薬や試薬等の分野においての通常用いられる方法によって製剤化して提供してもよい。 The description of “the polypeptide of the present invention” or “the fusion polypeptide of the present invention” which is an active ingredient of the promoter of the present invention is the same as described above. The polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention produced as described above may be provided as the promoter of the present invention as it is, and is provided by being formulated by a method usually used in the field of medicines and reagents. May be.
本発明促進剤は、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドを有効成分として含有し、かつ本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドの神経突起伸展促進作用を実質的に害しない限りにおいて、さらに他の成分を含有していてもよい。ここにいう「他の成分」としては、医薬や試薬等の分野において通常使用されるような担体や、生理活性を有する成分等が例示される。 As long as the promoter of the present invention contains the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention as an active ingredient and does not substantially impair the neurite outgrowth promoting action of the polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention, Other components may be contained. Examples of the “other components” herein include carriers that are usually used in the field of medicines and reagents, components having physiological activity, and the like.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
＜実施例１＞ 本発明ポリペプチドの製造
ラットＮＧＣのコアタンパク質のアミノ酸配列をベースとして、以下のポリペプチドを製造した。ＮＧＣコアタンパク質のドメイン構造と、それぞれのポリペプチドとの位置的な対応関係を図１に示す。
（１）ＡＡドメイン部分を保持するポリペプチド（本発明ポリペプチド）
・ＮＧＣect（配列番号２）（配列番号９におけるアミノ酸番号３１〜４２６に相当；ＥＧＦドメインも保持している）
・ＮＧＣＡＡ（配列番号３）（配列番号９におけるアミノ酸番号２５８〜３３６に相当）
・ＮＧＣＡＥ（配列番号４）（配列番号９におけるアミノ酸番号２５８〜４２６に相当；ＥＧＦドメインも保持している）
（２）ＥＧＦドメイン部分を保持するポリペプチド（本発明ポリペプチド）
・ＮＧＣＥＧＦ（配列番号６）（配列番号９におけるアミノ酸番号３４０〜４２６に相当）
（３）ＡＡ及びＥＧＦドメイン部分のいずれをも保持しないペプチド
・ＮＧＣＣＳ（配列番号７）（配列番号９におけるアミノ酸番号３３〜２５９に相当）
これらのポリペプチドをコードする以下の塩基配列を保持するｃＤＮＡ断片を、各々ベクター（pGEX-4T1；アマシャムバイオサイエンス社製）に組み込んだ。このベクターにはＧＳＴをコードする配列が保持されており、ＧＳＴが前記ポリペプチドのＮ末端側に結合した形でポリペプチド（前記ポリペプチドとＧＳＴとの融合ポリペプチド）が発現されるよう、ｃＤＮＡの組込みを行った。
・ＮＧＣect：配列番号８における塩基番号１０３〜１２９０で示される塩基配列
・ＮＧＣＡＡ：配列番号８における塩基番号７８４〜１０２０で示される塩基配列
・ＮＧＣＡＥ：配列番号８における塩基番号７８４〜１２９０で示される塩基配列
・ＮＧＣＥＧＦ：配列番号８における塩基番号１０３０〜１２９０で示される塩基配列
・ＮＧＣＣＳ：配列番号８における塩基番号１０９〜７８９で示される塩基配列
ｃＤＮＡが組み込まれたベクターを大腸菌（BL21）に導入し、その大腸菌を、アンピシリン存在下でＬＢ培地を用いて、600 nm の吸光度が 0.6 以上になるまで３７℃で培養した。その後、IPTGを終濃度 1 mM になるように加え、３０℃でさらに４時間培養することによってポリペプチドを発現させた。菌体を回収してBugBuster protein Extraction Reagent（Novagen社製）で可溶化した後、グルタチオン−セファロース４Ｂ（glutathione-Sepharose 4B；アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラムを用いて精製し、前記の各ポリペプチドを得た。
＜実施例２＞ 神経突起伸長促進活性の測定
（１）ＮＧＣectを用いた試験
胎生１６日目のWistarラット大脳皮質からニューロン（Ｅ１６）を採取し、これをポリ−Ｌ−リジンでコートした２４ウエルのプレートに播接した（1 x 104個／ウエル、１ウエル＝500μl）。播種の１時間後にＰＢＳ（25μl）、ＧＳＴ（20μg／ml；NGCectと等モル量）又はNGCect (50μg/ml)を添加して３７℃で２４時間インキュベートした。その後、ショ糖を含有する３％パラホルムアルデヒド溶液を用いて一晩固定した。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
<Example 1> Production of polypeptide of the present invention The following polypeptide was produced based on the amino acid sequence of the core protein of rat NGC. FIG. 1 shows the positional correspondence between the NGC core protein domain structure and each polypeptide.
(1) Polypeptide having AA domain portion (polypeptide of the present invention)
NGCect (SEQ ID NO: 2) (corresponding to amino acid numbers 31 to 426 in SEQ ID NO: 9; also holds EGF domain)
NGC AA (SEQ ID NO: 3) (corresponding to amino acid numbers 258 to 336 in SEQ ID NO: 9)
NGC AE (SEQ ID NO: 4) (corresponds to amino acid numbers 258 to 426 in SEQ ID NO: 9; also retains EGF domain)
(2) Polypeptide having EGF domain portion (polypeptide of the present invention)
NGC EGF (SEQ ID NO: 6) (corresponding to amino acid numbers 340 to 426 in SEQ ID NO: 9)
(3) Peptide / NGC CS that does not retain any of AA and EGF domain part (SEQ ID NO: 7) (corresponding to amino acid numbers 33 to 259 in SEQ ID NO: 9)
CDNA fragments retaining the following base sequences encoding these polypeptides were each incorporated into a vector (pGEX-4T1; manufactured by Amersham Biosciences). This vector retains a sequence encoding GST, so that the polypeptide (a fusion polypeptide of the polypeptide and GST) is expressed in a form in which GST is bound to the N-terminal side of the polypeptide. Was incorporated.
NGCect: base sequence represented by base numbers 103 to 1290 in SEQ ID NO: 8 NGC AA : base sequence represented by base numbers 784 to 1020 in SEQ ID NO: 8 NGC AE : represented by base numbers 784 to 1290 in SEQ ID NO: 8 NGC EGF : base sequence represented by base numbers 1030 to 1290 in SEQ ID NO: 8 NGC CS : base sequence represented by base numbers 109 to 789 in SEQ ID NO: 8 A vector in which a cDNA is incorporated is E. coli (BL21) The Escherichia coli was cultured at 37 ° C. using LB medium in the presence of ampicillin until the absorbance at 600 nm reached 0.6 or more. Thereafter, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the polypeptide was expressed by further culturing at 30 ° C. for 4 hours. Bacterial cells were collected and solubilized with BugBuster protein Extraction Reagent (Novagen), and then purified using a glutathione-Sepharose 4B (glutathione-Sepharose 4B; Amersham Biosciences) column. Got.
<Example 2> Measurement of neurite outgrowth promoting activity (1) Test using NGCect Neuron (E16) was collected from Wistar rat cerebral cortex on embryonic day 16 and coated with poly-L-lysine in 24 wells. (1 × 10 4 cells / well, 1 well = 500 μl). One hour after seeding, PBS (25 μl), GST (20 μg / ml; equimolar amount with NGCect) or NGCect (50 μg / ml) was added and incubated at 37 ° C. for 24 hours. Thereafter, it was fixed overnight using a 3% paraformaldehyde solution containing sucrose.
固定後、ニューロンの形態を位相差顕微鏡（２００倍）で観察することにより、神経突起の伸長の程度を評価した。神経突起の伸長の程度は、１ウエルあたり任意の１０視野を選択して写真撮影し、（ａ）最も長い神経突起の長さが、ニューロンの細胞体の直径の３倍以上である細胞数の割合、及び（ｂ）細胞体の中心から最も長い神経突起の先端までの直線距離を測定し、４ウエル分の平均値±標準偏差（S.D.）を求めることによって評価した。（ａ）及び（ｂ）の概念図を図２に示す。図２中の左側（「Percentage of cells with long neurites（％）」と表示したもの）が（ａ）の方法の、右側（「Mean neurite length （μｍ）」）と表示したものが（ｂ）の方法の概念図である。 After fixation, the degree of neurite outgrowth was evaluated by observing the morphology of neurons with a phase contrast microscope (200 times). The degree of neurite outgrowth is selected and photographed by selecting 10 fields of view per well, and (a) the number of cells whose length of the longest neurite is more than 3 times the diameter of the cell body of the neuron. The ratio and (b) the linear distance from the center of the cell body to the tip of the longest neurite were measured and evaluated by calculating the average value ± standard deviation (SD) for 4 wells. The conceptual diagram of (a) and (b) is shown in FIG. The left side of Fig. 2 (displayed as “Percentage of cells with long neurites (%))” is the method of (a), and the right side (“Mean neurite length (μm)”) is displayed as of (b). It is a conceptual diagram of a method.
（ａ）についての結果を図３に、（ｂ）についての結果を図４に示す。なお図中の「ｒＮＧＣ」はNGCectを用いた結果を示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。 The results for (a) are shown in FIG. 3, and the results for (b) are shown in FIG. In the figure, “rNGC” indicates the result using NGCect, and “**” indicates that there is a significant difference at p <0.01.
図３及び図４から、NGCectが神経突起伸長促進活性を有することが示された。
（２）各種ポリペプチドを用いた試験
上記（１）のサンプルに加え、NGCEGF（27μｇ/ml）、NGCCS（38μg/ml）、NGCAA（26μg/ml）及びNGCAE（33μg/ml）を用いて、上記（１）と同様に試験した。上記（ａ）についての結果を図５に、上記（ｂ）についての結果を図６にそれぞれ示す。なお図中の「Ｇ」、「ｅｃｔ」、「ＥＧＦ」、「ｃｓ」、「ＡＡ」及び「ＡＥ」は、それぞれＧＳＴ、NGCect、NGCEGF、NGCCS、NGCAA及びNGCAEを用いた結果を示す。また「＊＊」はｐ＜０．０１で、「＊＊＊」はｐ＜０．００１でそれぞれ有意差があることを示す。また「n.s.」は有意差がないことを示す。
図５及び図６から、NGCectのみならず、NGCEGF、NGCAA及びNGCAEにも神経突起伸長促進活性が認められた。しかし、ＡＡ及びＥＧＦドメイン部分のいずれをも保持しない
NGCCSにおいては、この活性は認められなかった。
3 and 4 show that NGCect has neurite outgrowth promoting activity.
(2) Tests using various polypeptides In addition to the samples in (1) above, NGC EGF (27 μg / ml), NGC CS (38 μg / ml), NGC AA (26 μg / ml) and NGC AE (33 μg / ml) Were tested in the same manner as in (1) above. The results for (a) are shown in FIG. 5, and the results for (b) are shown in FIG. “G”, “ect”, “EGF”, “cs”, “AA” and “AE” in the figure are the results using GST, NGCect, NGC EGF , NGC CS , NGC AA and NGC AE , respectively. Show. “**” indicates p <0.01, and “***” indicates p <0.001 indicating a significant difference. “Ns” indicates no significant difference.
From FIG. 5 and FIG. 6, not only NGCect but also NGC EGF , NGC AA and NGC AE showed neurite outgrowth promoting activity. However, it retains neither AA nor EGF domain part
This activity was not observed in NGC CS .
この結果から、ＮＧＣにおけるＡＡドメイン及びＥＧＦドメインの少なくとも一方を保持していれば、神経突起伸長促進活性を発揮することが示された。
（３）伸長した神経突起の数の解析
上記（２）において、最も長い神経突起の長さがニューロンの細胞体の直径の３倍以上であるとされた細胞について、一つの細胞体から出ている神経突起の数を測定した。測定は、１ウエルあたり任意の１０視野を選択し、４ウエル分（計４０視野）について行った。ヒストグラムとして表した結果を図７に示す。
From these results, it was shown that if at least one of the AA domain and EGF domain in NGC is retained, neurite outgrowth promoting activity is exhibited.
(3) Analysis of the number of elongated neurites In the above (2), for the cells in which the length of the longest neurite is 3 times the diameter of the cell body of the neuron, The number of neurites present was measured. The measurement was performed for 4 wells (40 visual fields in total) by selecting 10 visual fields per well. The results expressed as a histogram are shown in FIG.
図７から、NGCEGFを作用させると１本の神経突起を持つ細胞が、NGCAAを作用させると数本の神経突起をもつ細胞が、NGCect又はNGCAEを作用させるとこれらの中間的な細胞がそれぞれ多く観察された。この結果から、NGCEGFは軸索様の神経突起を伸長させる傾向が、NGCAAは樹状突起様の神経突起を伸長させる傾向が高いことが示唆された。
（４）ポリペプチドの濃度による影響
サンプルとしてNGCEGFのみを用い、その濃度を変えて前記（２）と同様に試験した。前記（ａ）及び（ｂ）についての結果をまとめて図８に示す。図８中の白丸は前記（ａ）についての結果を（単位：％）、黒丸は前記（ｂ）についての結果を（単位：μｍ）それぞれ示す。
Fig. 7 shows that cells with one neurite when NGC EGF is applied, cells with several neurites when NGC AA is applied, and intermediate cells when NGCect or NGC AE are applied. Many were observed. These results suggest that NGC EGF tends to elongate axon-like neurites and NGC AA tends to elongate dendritic-like neurites.
(4) Influence of polypeptide concentration Using only NGC EGF as a sample, the concentration was changed and the test was performed in the same manner as in (2) above. The results for (a) and (b) are shown together in FIG. The white circles in FIG. 8 indicate the results for (a) (unit:%), and the black circles indicate the results for (b) (unit: μm).
その結果、前記ポリペプチドによる神経突起伸長促進活性は、濃度依存的であることが示された。
（５）ＧＡＢＡ陽性ニューロンに対する活性
２４ウエルプレートのウエルにポリ−Ｌ−リジンでコートした直径13mmのカバーガラスを沈める点以外は、前記（２）と同様に試験した。ただしサンプルはＧＳＴ、NGCect、NGCEGF、NGCCS、NGCAA及びＰＢＳとした。また、インキュベート後の細胞は３％パラホルムアルデヒド、0.1％グルタールアルデヒド及び１％ショ糖を含有するＰＢＳ溶液を用いて１時間固定し、固定後にモノクローナル抗ＭＡＰ２抗体（ＢＤバイオサイエンスファーミンジェン社製）及びポリクローナル抗ＧＡＢＡ抗体（シグマ社製）で細胞を処理した（ＭＡＰ２は樹状突起の分子マーカーであり、抗ＭＡＰ２抗体によってニューロン全体が染色される）。モノクローナル抗体は、ビオチン化抗マウスIgG抗体（ベクター社製）を反応させた後、アレキサフルオル488で標識したストレプトアビジン（モレキュラープローブス社製）を用いて、またポリクローナル抗体は Cy3 で標識した抗ウサギIgG (H + L) 抗体（ジャクソンイムノリサーチラボ製）を用いて検出した。
As a result, it was shown that the neurite outgrowth promoting activity by the polypeptide is concentration-dependent.
(5) Activity against GABA positive neurons The test was conducted in the same manner as in (2) except that a cover glass with a diameter of 13 mm coated with poly-L-lysine was submerged in a well of a 24-well plate. However, samples were GST, NGCect, NGC EGF , NGC CS , NGC AA and PBS. The cells after incubation were fixed for 1 hour using a PBS solution containing 3% paraformaldehyde, 0.1% glutaraldehyde and 1% sucrose, and after fixation, monoclonal anti-MAP2 antibody (manufactured by BD Biosciences Farmingen) ) And polyclonal anti-GABA antibody (manufactured by Sigma) (MAP2 is a molecular marker of dendrites, and whole neurons are stained with anti-MAP2 antibody). Monoclonal antibody was reacted with biotinylated anti-mouse IgG antibody (Vector), then streptavidin (Molecular Probes) labeled with Alexa Fluor 488 was used. Polyclonal antibody was anti-rabbit IgG labeled with Cy3. Detection was performed using (H + L) antibody (manufactured by Jackson ImmunoResearch Lab).
測定は、抗ＧＡＢＡ抗体で染色された「ＧＡＢＡ陽性ニューロン」（抑制性ニューロン）のみを対象として行った。胎生１６日目頃の大脳皮質におけるＧＡＢＡ陽性ニューロンは、ニューロン全体（ＭＡＰ２陽性細胞）の約１０％とかなり少数なので、１ウエルで検出される全てのＧＡＢＡ陽性ニューロンを測定対象とし、４ウエル分の平均値±標準偏差（S.D.）を求めることによって評価した。前記（ａ）についての結果を図９に、前記（ｂ）についての結果を図１０にそれぞれ示す。なお図中の「ｅｃｔ」、「ＥＧＦ」、「ｃｓ」及び「ＡＡ」は、それぞれNGCect、NGCEGF、NGCCS及びNGCAAを用いた結果を示す。また「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを示す。また「n.s.」は有意差がないことを示す。 The measurement was performed only on “GABA positive neurons” (inhibitory neurons) stained with an anti-GABA antibody. The number of GABA positive neurons in the cerebral cortex around day 16 is about 10% of the total neurons (MAP2 positive cells). Therefore, all GABA positive neurons detected in one well are targeted for measurement. Evaluation was carried out by calculating the mean ± standard deviation (SD). FIG. 9 shows the results for (a), and FIG. 10 shows the results for (b). In the figure, “ect”, “EGF”, “cs”, and “AA” indicate the results using NGCect, NGC EGF , NGC CS, and NGC AA , respectively. “***” indicates that there is a significant difference at p <0.001. “Ns” indicates no significant difference.
その結果、NGCect及びNGCEGFはＧＡＢＡ陽性ニューロンに対しても神経突起伸長促進活性を発揮したが、NGCAAについてはこの活性を検出できなかった。
（６）伸長した神経突起の性質
サンプルとしてNGCectを用い、抗ＧＡＢＡ抗体に代えてポリクローナル抗tau抗体（シグマ社製）を用いた以外は、上記（５）と同様に試験した。tauは軸索の分子マーカーである。
As a result, NGCect and NGC EGF exerted neurite outgrowth promoting activity on GABA positive neurons, but NGC AA could not detect this activity.
(6) Properties of elongated neurites Tested in the same manner as in (5) above except that NGCect was used as a sample and a polyclonal anti-tau antibody (manufactured by Sigma) was used instead of the anti-GABA antibody. tau is a molecular marker for axons.
その結果、長い神経突起は、抗tau抗体を用いると非常に強く染色されたが、抗ＭＡＰ２抗体を用いるとそれほど強く染色されなかった。この結果から、長い神経突起は、軸索の又はこれに極めて近い特性を有していることが示唆された。 As a result, long neurites were stained very strongly using anti-tau antibody, but not so strongly using anti-MAP2 antibody. This result suggests that long neurites have axon or very similar properties.
また、ＮＧＣect、ＮＧＣＡＡ、ＮＧＣＡＥ及びＮＧＣＥＧＦは、いずれも配列番号１１に示されるヒトＮＧＣのアミノ酸配列の一部と完全に同一であるか、又は極めて近似しているため、ヒトに対しても同様の効果を奏することが示唆される。 Also, NGCect, NGC AA , NGC AE and NGC EGF are all identical or very close to part of the amino acid sequence of human NGC shown in SEQ ID NO: 11, Is also suggested to have the same effect.
本発明ポリペプチドや本発明融合ポリペプチドは、神経突起伸展促進剤等の有効成分として利用することができる。本発明核酸は、このようなポリペプチドの大量生産ツール等として利用することができる。また本発明促進剤は、試薬用途のみならず、神経突起の伸展、神経回路形成の促進等が望まれる疾患等に対する医薬等としても利用することができる。 The polypeptide of the present invention or the fusion polypeptide of the present invention can be used as an active ingredient such as a neurite extension promoter. The nucleic acid of the present invention can be used as a tool for mass production of such polypeptides. The promoter of the present invention can be used not only as a reagent, but also as a medicine for diseases and the like for which neurite extension, promotion of neural circuit formation, and the like are desired.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004228693A JP4545513B2 (en) | 2004-08-04 | 2004-08-04 | Neurite outgrowth promoting polypeptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004228693A JP4545513B2 (en) | 2004-08-04 | 2004-08-04 | Neurite outgrowth promoting polypeptide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006042684A JP2006042684A (en) | 2006-02-16 |
| JP4545513B2 true JP4545513B2 (en) | 2010-09-15 |
Family
ID=36021932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004228693A Expired - Fee Related JP4545513B2 (en) | 2004-08-04 | 2004-08-04 | Neurite outgrowth promoting polypeptide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4545513B2 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09194502A (en) * | 1995-11-13 | 1997-07-29 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | New chondroitin sulfate proteoglycan, its core protein, dna coding the same and antibody to the same |
| JP2000095795A (en) * | 1998-09-18 | 2000-04-04 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Polypeptide of core protein of proteoglycan and dna encoding the same |
-
2004
- 2004-08-04 JP JP2004228693A patent/JP4545513B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09194502A (en) * | 1995-11-13 | 1997-07-29 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | New chondroitin sulfate proteoglycan, its core protein, dna coding the same and antibody to the same |
| JP2000095795A (en) * | 1998-09-18 | 2000-04-04 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Polypeptide of core protein of proteoglycan and dna encoding the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006042684A (en) | 2006-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| MacRae | Towards an understanding of microtubule function and cell organization: an overview | |
| US11613778B2 (en) | Long lifetime alpha-hemolysin nanopores | |
| Holcroft et al. | Identification of amelotin‐and ODAM‐interacting enamel matrix proteins using the yeast two‐hybrid system | |
| CN111320684B (en) | Expression of GluN1/GluN2A tetramer of human N-methyl-D-aspartate receptor and application thereof | |
| US20200393458A1 (en) | Engineered red blood cell-based biosensors | |
| CN106715709A (en) | Compositions and methods for modulating mtorc1 | |
| Liu et al. | Protein Oligomer Engineering: A New Frontier for Studying Protein Structure, Function, and Toxicity | |
| WO2010007724A1 (en) | Peptide capable of binding to epcam | |
| TW201309720A (en) | Peptide library | |
| US20030170726A1 (en) | Peptides sequences comprising one or several protein binding units of the ena/vasp family and the uses thereof | |
| JP2023139090A (en) | Peptide that specifically binds to drebrin, and method for detecting drebrin using the same | |
| JP4545513B2 (en) | Neurite outgrowth promoting polypeptide | |
| KR101670188B1 (en) | Botulinum neurotoxin type E-specific polypeptides and uses thereof | |
| EP1362910B1 (en) | Lectins for analyzing sugar chains and method of using the same | |
| EP1541679B1 (en) | Method of analyzing organelle-localized protein and materials for analysis | |
| JP6257054B2 (en) | Method for producing compound containing heterocycle | |
| KR20130065627A (en) | Polypeptide binding cardiac troponin i specifically and use thereof | |
| US20050266498A1 (en) | Method for screening biomolecule activity regulator | |
| KR100868248B1 (en) | Novel peptide probes for diagnosing anthrax infection | |
| CN107073093A (en) | Rabphilin Rab and application thereof | |
| KR101729469B1 (en) | Peptide Probe for Detection of Salmonella Enteritidis | |
| WO2021164665A1 (en) | Arginine fluorescent probe, preparation method therefor and application thereof | |
| EP1130030A1 (en) | Human erythroid differentiation related factor | |
| KR101965481B1 (en) | Peptide for detecting shigella flexneri and salmonella enteritidis | |
| CN1829737B (en) | Novel peptide interacting with anti-apoptotic proteins of a bcl-2 family |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070531 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100407 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100607 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100625 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100630 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130709 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4545513 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |