JP2023139090A - Peptide that specifically binds to drebrin, and method for detecting drebrin using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ドレブリンに特異的に結合するペプチド、及びそのペプチドを用いたドレブリンの検出方法に関する。本願は、２０１８年５月８日に出願された日本国特許出願第２０１８－０８９９２９号に対し優先権を主張し、その内容をここに援用する。 The present invention relates to a peptide that specifically binds to drebrin, and a method for detecting drebrin using the peptide. This application claims priority to Japanese Patent Application No. 2018-089929 filed on May 8, 2018, the contents of which are incorporated herein.
ドレブリンは、脳に多く存在するシナプスタンパク質であり、神経細胞の発達にとって重要な役割を担っているタンパク質である。ドレブリンには成熟型アイソフォームのＡタイプ（ドレブリンＡ）と幼弱型アイソフォームのＥタイプ（ドレブリンＥ）が存在する。神経細胞の発達に伴い、ドレブリンＥの発現が減少し、ドレブリンＡが発現する。このドレブリンＡの発現が正常に行われることにより、神経細胞において樹状突起スパインの形成が促進され、神経回路が正常に形成される。 Drebrin is a synaptic protein that is abundant in the brain and plays an important role in the development of nerve cells. Drebrin has a mature isoform, type A (drebrin A), and an immature isoform, type E (drebrin E). As neurons develop, the expression of drebrin E decreases and drebrin A is expressed. Normal expression of drebrin A promotes the formation of dendritic spines in nerve cells, resulting in the normal formation of neural circuits.
発明者らは、アルツハイマー病等の痴呆性疾患において、樹状突起スパインのドレブリンが広範囲に消失していることを報告している（非特許文献１）。また、ドレブリンの定量的な解析から、ドレブリンの集積量と認知能力との相関が認められている（非特許文献２）。つまり、ドレブリンは神経科学分野において、非常に有用な生体内物質であることがわかっている。 The inventors have reported that drebrin in dendritic spines is extensively lost in dementing diseases such as Alzheimer's disease (Non-Patent Document 1). Furthermore, quantitative analysis of drebrin has shown that there is a correlation between the amount of drebrin accumulated and cognitive ability (Non-Patent Document 2). In other words, drebrin has been found to be a very useful in-vivo substance in the field of neuroscience.
さらに、近年では、ドレブリンは神経科学分野のみならず、癌や感染症分野にまで広く関与していることがわかっており（非特許文献３、４）、それらの分野の疾患においても、疾患の初期発生過程から疾患の進行状態を把握するためのバイオマーカーとしての役割への期待が高まっている。 Furthermore, in recent years, it has been found that drebrin is widely involved not only in the field of neuroscience but also in the fields of cancer and infectious diseases (Non-patent Documents 3, 4), and it has been found that drebrin is involved in a wide range of diseases in these fields as well. There are growing expectations for its role as a biomarker for understanding the progress of a disease from its early developmental stages.
これまでに、抗ドレブリン抗体を用いて、ドレブリンを特異的に検出し定量することについては既に行われており、そのようなドレブリンを特異的に検出し定量する方法としては、組織切片染色法やウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法等が用いられている（特許文献１）。 To date, anti-drebrin antibodies have been used to specifically detect and quantify drebrin, and methods for specifically detecting and quantifying drebrin include tissue section staining and Western blotting, ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), and the like are used (Patent Document 1).
しかしながら、これまでドレブリンに特異的に結合できるペプチドのアミノ酸配列はわかっておらず、既存の市販されている抗ドレブリン抗体はＩｇＧ抗体であり、約１６０ｋＤａの分子量を有する。そのため、分子量の大きさに起因して、抗体の細胞内移行性が悪く、ドレブリンの細胞内イメージングが困難であるという問題点があり、既存の抗ドレブリン抗体のみを用いた場合において、ドレブリンの動態を探るのには限界があった。 However, the amino acid sequence of a peptide that can specifically bind to drebrin has not been known so far, and the existing commercially available anti-drebrin antibodies are IgG antibodies and have a molecular weight of about 160 kDa. Therefore, due to the large molecular weight, the antibody has poor cellular penetration, making intracellular imaging of drebrin difficult. There were limits to what could be explored.
また、既存の抗ドレブリン抗体は、組織切片染色法やウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法といった検出方法に利用できるが、これらの検出方法では生体から採取した試料中のドレブリンを検出及び定量することに留まっており、細胞内におけるドレブリンの動態を探ることはできなかった。 In addition, existing anti-drebrin antibodies can be used in detection methods such as tissue section staining, Western blotting, and ELISA, but these detection methods are limited to detecting and quantifying drebrin in samples collected from living organisms. Therefore, it was not possible to investigate the dynamics of drebrin within the cell.
ここで、細胞内で発現させることができるドレブリン結合ペプチドを用いることができれば、そのペプチドを用いた細胞内イメージングによりドレブリンの細胞内動態を探ることが可能となる。その結果、シナプスの作動メカニズムを解明することができ、神経細胞の成熟におけるドレブリンの役割を詳細に知ることができる。そしてそれは、神経科学分野における神経難病の病態解明のみならず、癌及び感染症の分野においてもそれらの病態解明に寄与することが可能である。 Here, if a drebrin-binding peptide that can be expressed intracellularly can be used, it will be possible to explore the intracellular dynamics of drebrin through intracellular imaging using that peptide. As a result, we will be able to elucidate the operating mechanism of synapses and learn more about the role of drebrin in neuronal maturation. This can contribute not only to the elucidation of the pathophysiology of intractable neurological diseases in the field of neuroscience, but also to the elucidation of the pathophysiology of cancer and infectious diseases.
かかる状況に鑑みて、本発明は、ドレブリンと特異的に結合できるアミノ酸配列を有するペプチドであって、ドレブリンの細胞内イメージングにも応用可能であるペプチドを提供すること、及び当該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供すること、さらにそのペプチドを用いたドレブリンの検出方法を提供することを課題とする。 In view of this situation, the present invention provides a peptide having an amino acid sequence capable of specifically binding to drebrin, which is also applicable to intracellular imaging of drebrin, and a polypeptide encoding the peptide. It is an object of the present invention to provide a vector containing a nucleotide, and also to provide a method for detecting drebrin using the peptide.
本発明者らは、上記課題を解決するためにＶＨＨ抗体作成法を用いて、鋭意研究を行った結果、細胞内イメージングに応用可能である、ドレブリンに特異的に結合するアミノ酸配列を有するペプチドを同定することに成功した。さらに、そのペプチドを利用することで、ドレブリンを効率よく検出できることを見いだし、発明を完成させた。 In order to solve the above problems, the present inventors conducted intensive research using the VHH antibody production method, and as a result, they discovered a peptide having an amino acid sequence that specifically binds to drebrin, which can be applied to intracellular imaging. We succeeded in identifying it. Furthermore, they discovered that drebrin could be detected efficiently by using this peptide, and completed the invention.
すなわち、本発明は以下の事項により特定されるとおりのものである。
〔１〕以下の（１）若しくは（２）に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするドレブリン結合ペプチド又はその機能性断片。
（１）配列番号１６～２４のいずれかで示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１６～２４のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列；
〔２〕マーカータンパク質及び／若しくはペプチドタグを融合したことを特徴とする上記〔１〕に記載のペプチド又はその機能性断片。
〔３〕マーカータンパク質が蛍光タンパク質であり、ペプチドタグがＦｌａｇであることを特徴とする上記〔２〕に記載のペプチド又はその機能性断片。
〔４〕検出可能な標識を付加したことを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
〔５〕標識が、酵素、蛍光物質、ジゴキシゲニン、若しくはビオチンであることを特徴とする上記〔４〕に記載のペプチド又はその機能性断片。
〔６〕細胞内移行ペプチドを付加したことを特徴とする上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片。
〔７〕上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片に、ＩｇＧ－Ｆｃ領域を融合させたことを特徴とする抗体。
〔８〕上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔７〕に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
〔９〕配列番号８～１１のいずれかで示される塩基配列を含むか、又は配列番号８～１１のいずれかで示される塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする上記〔７〕に記載のポリヌクレオチド。
〔１０〕上記〔８〕又は〔９〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔１１〕上記〔８〕又は〔９〕に記載のポリヌクレオチド、或いは上記〔１０〕に記載のベクターが導入されたことを特徴とする、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔７〕に記載の抗体を発現する細胞。
〔１２〕上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔７〕に記載の抗体を用いた、被検試料中のドレブリンの検出方法であって、前記ペプチド又は抗体を前記被検試料に添加又は導入する工程を含む方法。
〔１３〕上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のペプチド又はその機能性断片、或いは上記〔７〕に記載の抗体を、発色又は発光により検出する工程をさらに含むことを特徴とする上記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕検出する工程が、発光に基づく画像解析法であることを特徴とする上記〔１３〕に記載の方法。
That is, the present invention is as specified by the following matters.
[1] A drebrin-binding peptide or a functional fragment thereof, characterized by comprising the amino acid sequence described in (1) or (2) below.
(1) Amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 16 to 24;
(2) an amino acid sequence in which one or several amino acids have been inserted, deleted, substituted, and/or added to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 16 to 24;
[2] The peptide or functional fragment thereof according to [1] above, which is fused with a marker protein and/or a peptide tag.
[3] The peptide or functional fragment thereof according to [2] above, wherein the marker protein is a fluorescent protein and the peptide tag is Flag.
[4] The peptide or functional fragment thereof according to any one of [1] to [3] above, characterized in that it has a detectable label added thereto.
[5] The peptide or functional fragment thereof according to [4] above, wherein the label is an enzyme, a fluorescent substance, digoxigenin, or biotin.
[6] The peptide or functional fragment thereof according to any one of [1] to [5] above, characterized in that it has a cell internalization peptide added thereto.
[7] An antibody characterized in that an IgG-Fc region is fused to the peptide according to any one of [1] to [6] above or a functional fragment thereof.
[8] A polynucleotide encoding the peptide or functional fragment thereof according to any one of [1] to [6] above, or the antibody according to [7] above.
[9] Hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide containing the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 11 or having a complementary sequence to the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 11. The polynucleotide according to [7] above, characterized in that:
[10] A vector comprising the polynucleotide according to [8] or [9] above.
[11] The polynucleotide according to any one of [1] to [6] above, characterized in that the polynucleotide according to [8] or [9] above, or the vector according to [10] above is introduced. A cell expressing a peptide or a functional fragment thereof, or the antibody described in [7] above.
[12] A method for detecting drebrin in a test sample using the peptide or functional fragment thereof according to any one of [1] to [6] above, or the antibody according to [7] above, comprising: A method comprising the step of adding or introducing the peptide or antibody to the test sample.
[13] The method further comprises the step of detecting the peptide or functional fragment thereof according to any one of [1] to [6] above, or the antibody according to [7] above, by color development or luminescence. The method described in [12] above.
[14] The method according to [13] above, wherein the detecting step is an image analysis method based on luminescence.
本発明により、ドレブリンに特異的に結合できるペプチド、当該ペプチドと蛍光タンパク質等のマーカータンパク質やペプチドタグを含む融合ペプチド、及びそれらのペプチドや融合タンパク質を利用したドレブリンの検出方法が提供される。
本発明に係るペプチドはシングルドメイン構造であるため、マーカータンパク質、ペプチドタグ、及び抗体のＦｃ領域等の他の分子を結合させることが容易に行える。
本発明に係るペプチドは低分子量であり、細胞内で効率よく発現させることができるので、ドレブリンの細胞内イメージングにも応用可能である。
The present invention provides a peptide capable of specifically binding to drebrin, a fusion peptide containing the peptide and a marker protein such as a fluorescent protein or a peptide tag, and a method for detecting drebrin using these peptides and fusion proteins.
Since the peptide according to the present invention has a single domain structure, other molecules such as marker proteins, peptide tags, and Fc regions of antibodies can be easily bound thereto.
Since the peptide according to the present invention has a low molecular weight and can be efficiently expressed within cells, it can also be applied to intracellular imaging of drebrin.
本発明の第一の態様は、ドレブリンに特異的に結合できるペプチド（以下、「ドレブリン結合ペプチド」ともいう）であって、以下の（１）若しくは（２）から選択されるペプチド又はその機能性断片である。
（１）配列番号１６～２４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むペプチド；
（２）配列番号１６～２４のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチド；
ここで、機能性断片とは、ドレブリン結合能を失わない範囲で、ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸残基を除去して得られたペプチドをいう。
A first aspect of the present invention is a peptide capable of specifically binding to drebrin (hereinafter also referred to as "drebrin-binding peptide"), which is selected from the following (1) or (2) or its functionality. It is a fragment.
(1) A peptide comprising the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 16 to 24;
(2) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are inserted, deleted, substituted, and/or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 16 to 24;
Here, the functional fragment refers to a peptide obtained by removing amino acid residues at the N-terminus and/or C-terminus of the peptide to the extent that drebrin binding ability is not lost.
ここで、１若しくは数個とは、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個である。１若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチドとは、そのペプチドがドレブリンに特異的に結合できる機能を有する限り、特に限定されない。 Here, one or several pieces means 1 to 10 pieces, preferably 1 to 5 pieces, and more preferably 1 to 3 pieces. A peptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are inserted, deleted, substituted, and/or added is not particularly limited as long as the peptide has the ability to specifically bind to drebrin.
ここで、これらの挿入、欠失、置換、及び／又は付加等のアミノ酸変異は天然に生じる変異でもよいし、人工的に導入される変異でもよい。
例えば、アミノ酸変異は部位特異的変異導入法や、Error prone PCR法等のランダム変異導入法により導入することができる。また、変異導入された配列を有するペプチドがドレブリン結合能を有していることは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットやアフィニティクロマトグラフィー等の方法で確認できる。変異が導入される部位は抗体におけるフレームワーク領域（ＦＲ）に相当する領域でもよいし、相補性決定領域（以下、ＣＤＲという）に相当する領域でもよい。ＣＤＲに相当する領域における変異が結合性を増加させる場合もある。
Here, these amino acid mutations such as insertions, deletions, substitutions, and/or additions may be naturally occurring mutations or artificially introduced mutations.
For example, amino acid mutations can be introduced by a site-directed mutagenesis method or a random mutagenesis method such as an error prone PCR method. Furthermore, the ability of a peptide having a mutated sequence to bind drebrin can be confirmed by methods such as ELISA, Western blotting, and affinity chromatography. The site into which a mutation is introduced may be a region corresponding to a framework region (FR) in an antibody, or a region corresponding to a complementarity determining region (hereinafter referred to as CDR). Mutations in regions corresponding to CDRs may also increase binding.
また、前記アミノ酸配列は、ペプチドがドレブリンと特異的に結合できる限り、前記配列番号１６～２４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するものであってよい。 Further, the amino acid sequence is 80%, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 16 to 24, as long as the peptide can specifically bind to drebrin. Preferably, they may have an identity of 98% or more.
本発明の第二の態様は、前記第一の態様のペプチドに、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを融合させたペプチドである。これらは前記第一の態様のペプチドのＮ末端側に融合させてもよいし、Ｃ末端側に融合させてもよい。 A second aspect of the present invention is a peptide in which a marker protein and/or a peptide tag is fused to the peptide of the first aspect. These may be fused to the N-terminal side or the C-terminal side of the peptide of the first aspect.
前記マーカータンパク質としては、特に限定されないが、例えば、アルカリフォスファターゼ（以下、ＡＰという）、西洋わさび過酸化酵素（以下、ＨＲＰという）等の酵素、抗体のＦｃ領域、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)等の蛍光タンパク質を挙げることができる。また、前記ペプチドタグとしては、特に限定されないが、例えば、ＨＡ（ヘマグルチニン）、Ｆｌａｇ、Ｍｙｃ等のエピトープタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アビジン、Ｖ５（GKPIPNPLLGLDST：配列番号５）のペプチドタグが挙げられる。 The marker protein is not particularly limited, but includes, for example, enzymes such as alkaline phosphatase (hereinafter referred to as AP), horseradish peroxidase (hereinafter referred to as HRP), the Fc region of antibodies, green fluorescent protein (GFP), etc. Mention may be made of fluorescent proteins. The peptide tags are not particularly limited, but include, for example, epitope tags such as HA (hemagglutinin), Flag, Myc, glutathione S-transferase (GST), histidine (His), avidin, V5 (GKPIPNPLLGLLDST: SEQ ID NO: 5 ) peptide tags.
上記マーカータンパク質及び／又はペプチドタグの融合は、制限酵素やＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等を利用した通常の遺伝子組み換え技術により行うことができる。なお、上記マーカータンパク質及び／又はペプチドタグは前記第一の態様のペプチドに直接融合させてもよいが、融合タンパク質においてドレブリン結合能が維持される限り、他のアミノ酸配列（例えば、１～１０アミノ酸又は１～５アミノ酸）を介して融合させてもよい。 The above-mentioned fusion of the marker protein and/or peptide tag can be performed by ordinary genetic recombination techniques using restriction enzymes, PCR (Polymerase Chain Reaction), and the like. Note that the above marker protein and/or peptide tag may be directly fused to the peptide of the first aspect, but as long as the fusion protein maintains drebrin binding ability, other amino acid sequences (for example, 1 to 10 amino acids) may be used. or 1 to 5 amino acids).
本発明の第三の態様に係るペプチドは、前記マーカータンパク質が蛍光タンパク質であり、前記ペプチドタグがＦｌａｇである、前記ペプチドである。 The peptide according to the third aspect of the present invention is the peptide, wherein the marker protein is a fluorescent protein and the peptide tag is Flag.
本発明の第四の態様に係るペプチドは、前記第一の態様乃至第三の態様のペプチドに検出可能な標識を付加したペプチドである。 The peptide according to the fourth aspect of the present invention is a peptide obtained by adding a detectable label to the peptides of the first to third aspects.
上記標識としては、特に限定されないが、例えば、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ又はβガラクトシダーゼ等）、蛍光物質（フルオレセイン、ルシフェラーゼ等）、ジゴキシゲニン、ビオチンが挙げられる。 Examples of the above-mentioned labels include, but are not limited to, enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, β-galactosidase, etc.), fluorescent substances (fluorescein, luciferase, etc.), digoxigenin, and biotin.
すなわち、本発明の第五の態様に係るペプチドは、前記標識が、酵素、蛍光物質、ジゴキシゲニン又はビオチンである、前記ペプチドである。 That is, the peptide according to the fifth aspect of the present invention is the peptide in which the label is an enzyme, a fluorescent substance, digoxigenin, or biotin.
本発明の第六の態様は、前記第一の態様乃至第五の態様のペプチドにＩｇＧ－Ｆｃ領域を融合させた抗体である。具体的には、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインをこの順で含む哺乳類（好ましくはヒト）ＩｇＧ－Ｆｃ領域のヒンジドメインに、前記第一の態様又は第二の態様のペプチドをそのＣ末端を介して融合させた抗体のことである。
また、前記抗体は二量体化させることも可能である。
本発明の第六の態様に係るＩｇＧ－Ｆｃ領域を融合させた抗体及びその二量体化抗体は、後述の実施例のようにして作製することができる。
A sixth aspect of the present invention is an antibody in which an IgG-Fc region is fused to the peptides of the first to fifth aspects. Specifically, the peptide of the first aspect or the second aspect is added to the hinge domain of a mammalian (preferably human) IgG-Fc region containing a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain in this order. This refers to an antibody fused via a
Further, the antibody can also be dimerized.
The IgG-Fc region fused antibody and its dimerized antibody according to the sixth aspect of the present invention can be produced as in the Examples below.
本発明の第七の態様は、前記第一の態様乃至第五の態様のペプチド又は前記第六の態様の抗体をコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡやＲＮＡが例示されるが、好ましくはＤＮＡである。 A seventh aspect of the present invention is a polynucleotide encoding the peptide of the first to fifth aspects or the antibody of the sixth aspect. Examples of polynucleotides include DNA and RNA, with DNA being preferred.
本発明の第七の態様に係るポリヌクレオチドとしては、配列番号１６～２４の何れかのアミノ酸配列、又は、配列番号１６～２４のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列、をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが好ましく、例えば、配列番号８～１１のいずれかで示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は、配列番号８～１１のいずれかで示される塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、サザンブロット法におけるハイブリダイゼーション後の洗浄に使用される条件が挙げられ、具体的には、０．１×ＳＳＣの塩濃度及び摂氏６０度の温度で洗浄を行う条件が挙げられる。
The polynucleotide according to the seventh aspect of the present invention has an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 16 to 24, or an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 16 to 24, in which one or several amino acids are present. A polynucleotide comprising a base sequence encoding an inserted, deleted, substituted, and/or added amino acid sequence is preferred, for example, a polynucleotide comprising a base sequence shown in any of SEQ ID NOS: 8 to 11, or Examples include polynucleotides that hybridize under stringent conditions with a polynucleotide having a complementary sequence to the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 8 to 11.
Here, the stringent conditions include, for example, the conditions used for washing after hybridization in Southern blotting, specifically, a salt concentration of 0.1 x SSC and a temperature of 60 degrees Celsius. Conditions for performing cleaning include.
本発明の第八の態様は、前記第七の態様に係るポリヌクレオチドを含むベクターである。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等が例示され、前記ポリヌクレオチドを導入する宿主の種類によって適宜選択される。ベクターはヒト細胞等の哺乳動物で発現させるためのベクターであってもよいし、大腸菌等の原核細胞や酵母等の真核細胞で発現させるためのベクターであってもよい。
ベクターは、必要に応じて、宿主細胞における発現のためのプロモーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列等を含んでもよい。
An eighth aspect of the present invention is a vector comprising the polynucleotide according to the seventh aspect. Examples of vectors include plasmid vectors, phage vectors, and virus vectors, which are appropriately selected depending on the type of host into which the polynucleotide is introduced. The vector may be a vector for expression in mammals such as human cells, or a vector for expression in prokaryotic cells such as E. coli or eukaryotic cells such as yeast.
The vector may contain a promoter sequence, an enhancer sequence, a terminator sequence, etc. for expression in a host cell, as necessary.
本発明の第九の態様は、前記第七の態様に係るポリヌクレオチド又は前記第八の態様に係るベクターが導入された細胞である。細胞は、真核細胞でもよいし、原核細胞でもよいが、内在性のドレブリンを発現する細胞が好ましく、内在性のドレブリンを発現する、神経細胞等の哺乳動物細胞が好ましい。 A ninth aspect of the present invention is a cell into which the polynucleotide according to the seventh aspect or the vector according to the eighth aspect has been introduced. The cells may be eukaryotic cells or prokaryotic cells, but cells that express endogenous drebrin are preferred, and mammalian cells such as nerve cells that express endogenous drebrin are preferred.
ここで、前記第七の態様に係るポリヌクレオチド又は前記第八の態様に係るベクターの細胞内への導入は、公知のマイクロインジェクション法、又はリポフェクション法やエレクトロポレーション法等の形質転換法によって行うことができる。 Here, the polynucleotide according to the seventh aspect or the vector according to the eighth aspect is introduced into cells by a known microinjection method or a transformation method such as a lipofection method or an electroporation method. be able to.
本発明の第十の態様は、前記第一乃至第五の態様に係るペプチド、又は第六の態様に係る抗体を用いた、被検試料中のドレブリンの検出方法である。この検出方法は、前記ペプチド又は抗体を前記被検試料に添加又は導入する工程を含む。 A tenth aspect of the present invention is a method for detecting drebrin in a test sample using the peptide according to the first to fifth aspects or the antibody according to the sixth aspect. This detection method includes the step of adding or introducing the peptide or antibody to the test sample.
検出対象のドレブリンは哺乳動物由来のドレブリンが挙げられ、ヒト由来のドレブリンであることが好ましい。 The drebrin to be detected includes mammalian-derived drebrin, preferably human-derived drebrin.
被検試料はドレブリンを含む限り特に限定されないが、哺乳動物由来の被検対象が挙げられ、ヒト由来であることが好ましい。例えば、脳組織の生検試料、神経細胞、脳脊髄液、血液、血漿、血清、組織液、リンパ液、体腔液、尿、又はそれらのタンパク質抽出液が挙げられる。 The test sample is not particularly limited as long as it contains drebrin, but examples include mammalian-derived test samples, and human-derived test samples are preferred. Examples include a biopsy sample of brain tissue, nerve cells, cerebrospinal fluid, blood, plasma, serum, tissue fluid, lymph fluid, body cavity fluid, urine, or protein extracts thereof.
前記ペプチド又は抗体を前記被検試料に添加する態様について、例を挙げて説明する。
例えば、免疫組織染色法により検出を行う態様として、前記ペプチド又は抗体を含む溶液を適当な倍率に希釈し、被検試料である組織切片や固定化培養細胞に添加する態様が挙げられる。
また、ウェスタンブロット法により検出を行う態様として、前記被検試料であるタンパク質抽出液を用いてゲル電気泳動等でタンパク質を分離し、分離されたタンパク質に対して前記ペプチド又は抗体を含む溶液を適当な倍率に希釈して添加する態様が挙げられる。
The mode of adding the peptide or antibody to the test sample will be explained by giving an example.
For example, an embodiment in which detection is carried out by immunohistochemical staining includes an embodiment in which a solution containing the peptide or antibody is diluted to an appropriate ratio and added to a tissue section or fixed cultured cell as a test sample.
In addition, as an embodiment in which detection is performed by Western blotting, proteins are separated by gel electrophoresis using the protein extract as the test sample, and a solution containing the peptide or antibody is applied to the separated protein as appropriate. An example is an embodiment in which the compound is diluted to a certain ratio and added.
前記ペプチド又は抗体を前記被検試料である細胞に導入する態様について、例を挙げて説明する。
前記ペプチド又は抗体を細胞内に導入するには、マイクロインジェクション等で直接細胞内に注入してもよいが、前記ペプチド又は抗体をコードするポリヌクレオチドを、ベクター等を用いて細胞内に導入し、前記ペプチド又は抗体を細胞内で発現させることによって導入してもよい。発現は一過的な発現でも恒常的な発現でもよい。
The mode of introducing the peptide or antibody into the cells serving as the test sample will be explained by giving examples.
In order to introduce the peptide or antibody into the cell, it is possible to directly inject it into the cell by microinjection or the like, but it is also possible to introduce the polynucleotide encoding the peptide or antibody into the cell using a vector or the like, The peptide or antibody may be introduced by intracellular expression. Expression may be transient or constant.
また、一態様において、前記ペプチド又は抗体は、低分子量の一本鎖ペプチドであるため、細胞内移行ペプチドを用いて細胞内に導入してもよい。細胞内移行ペプチドとしては、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ蛋白質のアミノ酸配列４８－６０位に対応するペプチド配列（Ｔａｔペプチド）やオリゴアルギニン、ショウジョウバエのアンテナペディア蛋白質由来ペプチド（penetratin）、神経ペプチドgalaninとハチ毒mastoparanのキメラペプチドであるtransportan、分泌シグナルペプチド由来ペプチドＭＴＳ（Mitochondrial targeting signal）等が挙げられる。細胞内移行ペプチドは、ドレブリン結合ペプチドのＮ末端又はＣ末端にペプチド結合により結合してもよく、非共有結合により複合体を形成させてもよい。 Furthermore, in one embodiment, the peptide or antibody is a low molecular weight single chain peptide, and therefore may be introduced into cells using a cell internalization peptide. Examples of intracellular peptides include a peptide sequence corresponding to amino acid positions 48-60 of the HIV-1 Tat protein (Tat peptide), oligoarginine, a peptide derived from the Drosophila antennapedia protein (penetratin), the neuropeptide galanin, and bee venom mastoparan. Examples include transportan, a chimeric peptide, and a secretion signal peptide-derived peptide MTS (mitochondrial targeting signal). The cellular internalization peptide may be bound to the N-terminus or C-terminus of the drebrin-binding peptide through a peptide bond, or may form a complex through a non-covalent bond.
本発明の第十一の態様は、本発明の第十の態様に係る被検試料中のドレブリンの検出方法において、さらに被検試料中のドレブリンに結合したペプチド又は抗体を発色又は発光により検出する工程を含む、方法である。 An eleventh aspect of the present invention is the method for detecting drebrin in a test sample according to the tenth aspect of the present invention, further comprising detecting the peptide or antibody bound to drebrin in the test sample by color development or luminescence. A method comprising steps.
この態様において、ドレブリンの検出は、例えば、以下のようにして行うことができる。
前記ペプチドが蛍光タンパク質と融合されている場合は、前記ペプチドが被検試料中のドレブリンと結合することで、被検試料中のドレブリンの量に依存した蛍光が発せられるので、当該蛍光強度に基づいて被検試料中のドレブリンを検出し、定量することができる。特に、前記ペプチドを細胞内に導入する態様においては、蛍光タンパク質と融合されている前記ペプチドを用いることで細胞内のドレブリンの挙動を検出することができる。
In this embodiment, detection of drebrin can be performed, for example, as follows.
When the peptide is fused with a fluorescent protein, the peptide binds to drebrin in the test sample, emitting fluorescence that depends on the amount of drebrin in the test sample. drebrin in a test sample can be detected and quantified using this method. In particular, in embodiments in which the peptide is introduced into cells, the behavior of drebrin in cells can be detected by using the peptide fused to a fluorescent protein.
また、前記ペプチドがＦｌａｇ等のペプチドタグと融合されている場合は、前記ペプチドを被検試料中のドレブリンと結合させた後、当該ペプチドタグに対する抗体であって、発色物質や発光物質又はそれらの物質を生じさせる酵素等で標識された抗体を反応させることで、被検試料中のドレブリンを検出し、定量することができる。 In addition, when the peptide is fused with a peptide tag such as Flag, after binding the peptide to drebrin in the test sample, an antibody against the peptide tag, such as a coloring substance, a luminescent substance, or their Drebrin in a test sample can be detected and quantified by reacting an antibody labeled with an enzyme or the like that produces the substance.
また、前記ペプチドがＩｇＧ－Ｆｃ領域を融合させた抗体である場合は、前記抗体を被検試料中のドレブリンと結合させた後、当該Ｆｃ領域に対する抗体であって、発色物質や発光物質又はそれらの物質を生じさせる酵素等で標識された抗体を反応させることで、被検試料中のドレブリンを検出し、定量することができる。 In addition, when the peptide is an antibody fused with an IgG-Fc region, after binding the antibody to drebrin in the test sample, the antibody against the Fc region, such as a coloring substance, a luminescent substance, or Drebrin in a test sample can be detected and quantified by reacting an antibody labeled with an enzyme or the like that produces a substance.
なお、前記ペプチド自体が発色物質や発光物質又はそれらの物質を生じさせる酵素等で標識されていてもよい。
定量の際は、例えば、予め既知の濃度の試料で検量線（標準曲線）を作成しておき、測定値を検量線に照合して試料中のドレブリン濃度を算出することができる。
Note that the peptide itself may be labeled with a coloring substance, a luminescent substance, or an enzyme that produces such a substance.
For quantitative determination, for example, a calibration curve (standard curve) can be created in advance using a sample with a known concentration, and the concentration of drebrin in the sample can be calculated by comparing the measured values with the calibration curve.
本発明の第十二の態様は、本発明の第十一の態様に係る被検試料中のドレブリンの検出方法において、前記検出方法が蛍光に基づく画像解析法である、方法である。
この態様においては、前記ペプチド又は抗体が蛍光タンパク質との融合タンパク質として細胞内に導入されるので、前記ペプチド又は抗体が細胞内の内在性ドレブリンと結合することで、蛍光タンパク質が発する蛍光を画像解析することにより内在性ドレブリンの挙動をリアルタイムでモニターすることができる。内在性ドレブリンの挙動としては、ドレブリンの細胞内局在性、細胞内での量の変動等が挙げられる。内在性ドレブリンの挙動をリアルタイムでモニターすることにより、シナプスの作動メカニズムを解明することができ、神経細胞の成熟におけるドレブリンの役割を詳細に知ることができる。
A twelfth aspect of the present invention is a method for detecting drebrin in a test sample according to the eleventh aspect of the present invention, wherein the detection method is an image analysis method based on fluorescence.
In this embodiment, the peptide or antibody is introduced into the cell as a fusion protein with a fluorescent protein, so that the peptide or antibody binds to endogenous drebrin in the cell, and the fluorescence emitted by the fluorescent protein is analyzed by image analysis. By doing so, the behavior of endogenous drebrin can be monitored in real time. Behaviors of endogenous drebrin include intracellular localization of drebrin, intracellular amount fluctuations, and the like. By monitoring the behavior of endogenous drebrin in real time, we can elucidate the operating mechanism of synapses and learn in detail the role of drebrin in neuronal maturation.
蛍光に基づく画像解析法は特に制限されないが、蛍光顕微鏡等を用いた画像解析が挙げられる。健常人由来の神経細胞と神経疾患患者由来の神経細胞において、内在性ドレブリンの挙動を蛍光に基づく画像解析により比較することで、神経疾患におけるドレブリンの関与を調べることができる。また、細胞に薬剤を加えて、内在性ドレブリンの挙動を蛍光に基いて画像解析することで、神経疾患に対する薬剤の評価等を行うこともできる。 Image analysis methods based on fluorescence are not particularly limited, but include image analysis using a fluorescence microscope or the like. The involvement of drebrin in neurological diseases can be investigated by comparing the behavior of endogenous drebrin in nerve cells derived from healthy individuals and those derived from neurological disease patients using fluorescence-based image analysis. Furthermore, by adding drugs to cells and performing image analysis of the behavior of endogenous drebrin based on fluorescence, it is also possible to evaluate drugs for neurological diseases.
以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。 The present invention will be explained in more detail with reference to Examples below, but it goes without saying that the scope of the present invention is not limited only to the Examples.
１．ドレブリン結合ペプチドの単離
（Ａ）ＶＨＨ抗体提示ファージライブラリーの調製
実施例２及び３に用いたドレブリン結合ペプチドを以下の手順で作成した。
市販されているプラスミドｐＵＣ１１９（例えば、タカラバイオ株式会社より入手可能）由来のＶｅｃｔｏｒ１に、制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトを挿入し、制限酵素ＳｆｉＩによりＶｅｃｔｏｒ１を処理し、ベクターの断片を得た。制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトは、GGCCCAGCCGGCC（配列番号６）又はGGCCTCTGCGGCC（配列番号７）により表されるＤＮＡ配列からなる。
1. Isolation of drebrin-binding peptide (A) Preparation of VHH antibody-displaying phage library The drebrin-binding peptide used in Examples 2 and 3 was prepared according to the following procedure.
A restriction enzyme SfiI cleavage site was inserted into Vector 1 derived from commercially available plasmid pUC119 (for example, available from Takara Bio Inc.), and Vector 1 was treated with restriction enzyme SfiI to obtain a vector fragment. The restriction enzyme SfiI cleavage site consists of a DNA sequence represented by GGCCCAGCCGGCC (SEQ ID NO: 6) or GGCCTCTGCGGCC (SEQ ID NO: 7).
同様に、ＰＣＲ法によって獲得したラクダのＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリも制限酵素ＳｆｉＩにより処理し、ＶＨＨ抗体の遺伝子断片を得た。 Similarly, a camel VHH antibody gene library obtained by PCR was also treated with the restriction enzyme SfiI to obtain a VHH antibody gene fragment.
制限酵素処理したＶｅｃｔｏｒ１及びＶＨＨ抗体の遺伝子断片を、１：２の割合で混合し、ライゲーション試薬（東洋紡株式会社より入手、商品名：Ligation High ver.2、以下同じ）を注入した。この混合液を摂氏１６度の温度で２時間静置することで、ＶＨＨ抗体の遺伝子断片をＶｅｃｔｏｒ１にライゲーションした。 Restriction enzyme-treated Vector 1 and VHH antibody gene fragments were mixed at a ratio of 1:2, and a ligation reagent (obtained from Toyobo Co., Ltd., trade name: Ligation High ver. 2, same hereinafter) was injected. The VHH antibody gene fragment was ligated to Vector 1 by allowing this mixture to stand at a temperature of 16 degrees Celsius for 2 hours.
このＶＨＨ抗体の遺伝子断片をライゲーションしたＶｅｃｔｏｒ１を用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：HST02）にトランスフェクションした。 Escherichia coli (obtained from Takara Bio Inc., trade name: HST02) was transfected using Vector 1 in which this VHH antibody gene fragment was ligated.
次いで、このトランスフェクションした大腸菌を、１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリン含有２ＹＴ培地で１５時間培養した。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる遺伝子断片由来のペプチドを提示するファージのライブラリを得た。 The transfected E. coli was then cultured for 15 hours in 2YT medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg/mL. In this way, a library of phages displaying peptides derived from gene fragments included in the VHH antibody gene library was obtained.
（Ｂ）ドレブリン抗原の固定化
ドレブリン（群馬大学神経薬理学分野から入手）をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳという）と混合し、ドレブリン溶液を調製した。ドレブリンの濃度は１μｇ／ｍＬであった。３ｍＬのドレブリン溶液を、イムノチューブ（Nunc社より購入）に注入し、ドレブリン溶液をイムノチューブ内で摂氏４度の温度で一晩静置することで、イムノチューブ内部にドレブリンを固定した。
(B) Immobilization of drebrin antigen Drebrin (obtained from the Department of Neuropharmacology, Gunma University) was mixed with phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS) to prepare a drebrin solution. The concentration of drebrin was 1 μg/mL. 3 mL of drebrin solution was injected into an immunotube (purchased from Nunc), and the drebrin solution was allowed to stand overnight in the immunotube at a temperature of 4 degrees Celsius, thereby fixing drebrin inside the immunotube.
次いで、イムノチューブ内部を、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。 The inside of the immunotube was then washed three times with PBS.
３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）含有ＰＢＳをイムノチューブに満たすことで、イムノチューブ内部のブロッキング処理を行った。 The inside of the immunotube was blocked by filling the immunotube with PBS containing 3% skim milk (obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
イムノチューブを、室温にて１時間静置し、イムノチューブの内部を、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。 The immunotube was left standing at room temperature for 1 hour, and the inside of the immunotube was washed three times with PBS.
（Ｃ）パニング
ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリ（濃度：およそ１０Ｅ＋１１/ｍＬ）を、３ｍＬの３％スキムミルク含有ＰＢＳと混合し、混合液を調製した。この混合液を、ドレブリン抗原を固定化したイムノチューブに注入した。
(C) Panning A library of phages displaying VHH antibodies (concentration: approximately 10E+11/mL) was mixed with 3 mL of PBS containing 3% skim milk to prepare a mixed solution. This mixture was injected into the immunotube on which the drebrin antigen had been immobilized.
イムノチューブにパラフィルムからなる蓋を取り付け、ローテーターを用いて１０分間転倒しながら回転した。 A lid made of parafilm was attached to the immunotube, and the tube was rotated for 10 minutes while being inverted using a rotator.
イムノチューブを、室温にて３０分間静置した。 The immunotube was left standing at room temperature for 30 minutes.
イムノチューブ内部を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）で１０回洗浄した。 The inside of the immunotube was washed 10 times with PBS containing 0.05% Tween 20 (hereinafter referred to as "PBST").
ドレブリン抗原に結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを抽出するために、１ｍＬの１００ｍＭトリメチルアミン溶液をイムノチューブに注入した。 To extract phage displaying VHH antibodies bound to drebrin antigen, 1 mL of 100 mM trimethylamine solution was injected into the immunotube.
イムノチューブにパラフィルムからなる蓋を取り付け、ローテーターを用いて、１０分間転倒しながら回転した。 A lid made of parafilm was attached to the immunotube, and the tube was rotated upside down for 10 minutes using a rotator.
溶液を中和するため、溶液を１ｍＬの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）を注入したチューブに移した。再度、１ｍＬの１００ｍＭトリメチルアミン溶液を用いたファージの抽出を繰り返し、３ｍＬの抽出液を得た。 To neutralize the solution, it was transferred to a tube filled with 1 mL of 0.5 M Tris-HCl (pH: 6.8). Phage extraction was repeated again using 1 mL of 100 mM trimethylamine solution to obtain 3 mL of extract.
３ｍＬの抽出液を、１２ｍＬの大腸菌ＴＧ－１と混合した。混合液を、摂氏３０度の温度で１時間静置した。 3 mL of the extract was mixed with 12 mL of E. coli TG-1. The mixture was allowed to stand at a temperature of 30 degrees Celsius for 1 hour.
コロニーを計数するため、大腸菌ＴＧ－１を含有する１５ｍＬの混合液１５μＬを、２ＹＴＡＧ培地（Bacto Tryptone 1.6%、Bacto Yeast Extract 1.0%、NaCl 0.5%、Glucose 2.0%、Ampicillin 0.01%）を含むアガープレート（１０ｍＬ/プレート）に播種した。摂氏３０度の温度で一晩静置し、コロニー数を計数することで抽出液に含まれていたファージのタイターを測定した。 To count colonies, 15 μL of a 15 mL mixture containing E. coli TG-1 was placed on an agar plate containing 2YTAG medium (Bacto Tryptone 1.6%, Bacto Yeast Extract 1.0%, NaCl 0.5%, Glucose 2.0%, Ampicillin 0.01%). (10 mL/plate). The titer of the phages contained in the extract was determined by standing overnight at a temperature of 30 degrees Celsius and counting the number of colonies.
残りの混合液を遠心分離した。上澄み液を捨て、沈殿物を小プレート３枚（５ｍＬ／プレート）の２ＹＴＡＧ培地に播種した。これらの３枚のプレートを、摂氏３０度の温度で一晩静置した。このようにして、１回目のパニングを行った。 The remaining mixture was centrifuged. The supernatant was discarded, and the precipitate was plated on three small plates (5 mL/plate) of 2YTAG medium. These three plates were left undisturbed overnight at a temperature of 30 degrees Celsius. In this way, the first panning was performed.
１回目のパニングの手順と全く同様に、２回目、３回目とパニングを繰り返し行った。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージを精製した。 Panning was repeated a second and third time in exactly the same manner as the first panning procedure. In this way, monoclonal phages displaying VHH antibodies were purified.
３回目のパニングの後、大腸菌のコロニーを爪楊枝でピックアップした。ピックアップした１つのコロニーを、２００μＬの２ＹＴＡＧ培地を注入した９６穴平底プレートの１つのウェルに置き、この操作を繰り返した。 After the third panning, E. coli colonies were picked up with a toothpick. One picked colony was placed in one well of a 96-well flat bottom plate injected with 200 μL of 2YTAG medium, and this operation was repeated.
ウェル内の溶液を、摂氏３０度の温度で１６０ｒｐｍの回転数で撹拌した。 The solution in the well was stirred at a temperature of 30 degrees Celsius and a rotation speed of 160 rpm.
５０μＬの増殖した大腸菌を含む溶液を回収し、この溶液をプレート上で５０μＬの２ＹＴＡＧ培地と混合した。２ＹＴＡＧ培地には、感染多重度（ＭＯＩ）が２０になるようなヘルパーファージを含有させた。そして、溶液を、摂氏３０度の温度で４５分間静置した。 A solution containing 50 μL of grown E. coli was collected and mixed with 50 μL of 2YTAG medium on the plate. The 2YTAG medium contained helper phage to give a multiplicity of infection (MOI) of 20. The solution was then allowed to stand at a temperature of 30 degrees Celsius for 45 minutes.
２ＹＴＡＧ培地を含むプレートを、４０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を捨てた。大腸菌を含む沈殿物を、２００μＬの２ＹＴＡＧ培地と混合した。混合液を、摂氏３０度の温度で一晩１６０ｒｐｍの回転数で撹拌した。 The plate containing 2YTAG medium was centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes and the supernatant was discarded. The precipitate containing E. coli was mixed with 200 μL of 2YTAG medium. The mixture was stirred at a rotation speed of 160 rpm overnight at a temperature of 30 degrees Celsius.
その後、混合液は、４０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、大腸菌を含む上清を回収した。 Thereafter, the mixture was centrifuged at 4000 rpm for 5 minutes, and the supernatant containing E. coli was collected.
（Ｄ）ＥＬＩＳＡによるファージ提示ＶＨＨ抗体及び抗原の定性評価
９６ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific社より購入、商品名：Maxisorp（登録商標））の各ウェルに、１μｇ／ｍＬの濃度を有するドレブリン溶液を抗原として５０μＬずつ添加した。９６ウェルプレートを、摂氏４度の温度で一晩静置し、ドレブリン抗原を各ウェルに固定した。
(D) Qualitative evaluation of phage-displayed VHH antibodies and antigens by ELISA A drebrin solution with a concentration of 1 μg/mL was added to each well of a 96-well plate (purchased from Thermo Fisher Scientific, trade name: Maxisorp (registered trademark)). 50 μL each was added. The 96-well plate was left undisturbed overnight at a temperature of 4 degrees Celsius to immobilize drebrin antigen in each well.
各ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）含有ＰＢＳを各ウェルに注入し（２００μＬ／ウェル）、９６ウェルプレートを、室温で１時間放置することで、各ウェルのブロッキング処理を行った。その後、各ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄した。 Each well was washed three times with PBS. Next, PBS containing 3% skim milk (obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was injected into each well (200 μL/well), and the 96-well plate was left at room temperature for 1 hour to carry out blocking treatment for each well. . Each well was then washed three times with PBS.
ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージ（Ｍ１３バクテリオファージ）を、各ウェルに注入し（５０μＬ／ウェル）、９６ウェルプレートを１時間静置した。このようにして、ファージをドレブリン抗原と反応させた後、各ウェルを、 ＰＢＳＴで５回洗浄し、抗Ｍ１３抗体（GEヘルスケア社より入手、型番：27942101、10000倍希釈）を各ウェルに添加した（５０μＬ／ウェル）。次いで、各ウェルをＰＢＳＴで６回洗浄した。 A monoclonal phage (M13 bacteriophage) displaying VHH antibody was injected into each well (50 μL/well), and the 96-well plate was left standing for 1 hour. After reacting the phage with the drebrin antigen in this way, each well was washed five times with PBST, and anti-M13 antibody (obtained from GE Healthcare, model number: 27942101, diluted 10,000 times) was added to each well. (50 μL/well). Each well was then washed six times with PBST.
各ウェルに発色剤（和光純薬工業社より入手、型番：155-02161）を注入し（５０μＬ／ウェル）、９６ウェルプレートを１０分間静置することで、発色剤を抗体と反応させた。反応後、硫酸水溶液（１規定）を５０μＬ／ウェルの濃度で各ウェルに添加し、反応を停止させ、４９０ｎｍの波長での溶液の吸光度を測定した。 A coloring agent (obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd., model number: 155-02161) was injected into each well (50 μL/well), and the 96-well plate was allowed to stand for 10 minutes to allow the coloring agent to react with the antibody. After the reaction, an aqueous sulfuric acid solution (1N) was added to each well at a concentration of 50 μL/well to stop the reaction, and the absorbance of the solution at a wavelength of 490 nm was measured.
良好な吸光度測定の結果を有する４つのウェルを選択し、それらのウェル上のファージに含まれるＤＮＡ配列を解析した。ＤＮＡ配列の解析結果は以下の通りであり、４つのＤＮＡ配列を見いだすことができた。 Four wells with good absorbance measurement results were selected and the DNA sequences contained in the phages on those wells were analyzed. The results of DNA sequence analysis are as follows, and four DNA sequences were found.
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTGGTGCGCGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCACTGGACGCACCTTCAGTGCCTATACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGTGAGTTTGTGGCAGCGGTTACCAGGAGTAGTACCAGCACATACTATGCAGGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGAACAACCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCCATGCCCGCAGGCCTTCGACAACGGGGCACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC（配列番号８） CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTGGTGCGCGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCACTGGACGCACCTTCAGTGCCTATACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGTGAGTTTGTGGCAGCGGTTACCAGGAGTAGTACCAGCACATACTATGCAGGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGAACAACC TGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCCATGCCCGCAGGCCTTCGACAACGGGGCACTGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC (SEQ ID NO: 8)
GAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAAACTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCACTGGAAGCATCTTCAGCTTCAGCGCCGTGGGCTGGTACCGCCAGGTTCCAGGGAAGCAGCGCGAAATGGTCGCATCTGTTACTAAGACCACTGGCACGAACTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGGGAGCGCCAAGAACCAGATCCACCTCCGGATGAACGACCTCAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAGCGCGAACAGTTGGATGAGGCCAGACTACTACTATTGGGGCCCGGGGGTCCAGGTCACCGTTTCTTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCACGGCC（配列番号９） GAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAAACTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCACTGGAAGCATCTTCAGCTTCAGCGCCGTGGGCTGGTACCGCCAGGTTCCAGGGAAGCAGCGCGAAATGGTCGCATCTGTTACTAAGACCACTGGCACGAACTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGGGAGCGCCAAGAACCAGATCCACCTCCGGATGAACGACC TCAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAGCGCGAACAGTTGGATGAGGCCAGACTACTACTATTGGGGCCCGGGGGTCCAGGTCACCGTTTCTTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCACGGCC (SEQ ID NO: 9)
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTGCAGACCGGGGGGTCTCTACGACTCTCCTGTGTAACTTCTGTCCGAATTACCAGTATCTTTGCCATGGGCTGGTATCGCCAGACTCCAGGGAAGAAGCGCGAGGTAGTCGCGGCGATGTATTCTGATGGTAGAGGTACTGTTGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAACCTGAAACCAGAGGACACGGCCGTGTACTACTGTACGAACGTTAGATGGCACGAACCCCGGGGCCAGGGGACCCAGGTTACCGTCTCTTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC（配列番号１０） CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTGCAGACCGGGGGGTCTCTACGACTCTCCTGTGTAACTTCTGTCCGAATTACCAGTATCTTTGCCATGGGCTGGTATCGCCAGACTCCAGGGAAGAAGCGCGAGGTAGTCGCGGCGATGTATTCTGATGGTAGAGGTACTGTTGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAACCTGAAA CCAGAGGACACGGCCGTGTACTACTGTACGAACGTTAGATGGCACGAACCCCGGGGCCAGGGGACCCAGGTTACCGTCTCTTCGGAACCCAAGACACCAAACCACAATCGGCC (SEQ ID NO: 10)
GAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGCGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGAAGCCTCTGGATTCAGCTTCGGACTCTTTGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCAGCTACTAATAGTGGTGGCGATAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACACGATGTATCTGCAAATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTCATGCAGATCGACTGAATAGAGACTATACCATATCGCAATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC（配列番号１１） GAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGCCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGAAGCCTCTGGATTCAGCTTCGGACTCTTTGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCAGCTACTAATAGTGGTGGCGATAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACACGATGTATCTGCAAATGAACAGC CTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTCATGCAGATCGACTGAATAGAGACTATACCATATCGCAATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCC (SEQ ID NO: 11)
配列番号８により表されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
QVQLVESGGGLVRAGGSLRLSCAATGRTFSAYTMGWFRQAPGKEREFVAAVTRSSTSTYYAGSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLEPEDTAVYYCHARRPSTTGHWGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号１）
The amino acid sequence encoded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 8 is as follows.
QVQLVESGGGLVRAGGSLRLSCAATGRTFSAYTMGWFRQAPGKEREFVAAVTRSSTSTYYAGSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLEPEDTAVYYCHARRPSTTGHWGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA (SEQ ID NO: 1)
配列番号９により表されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
ELQLVESGGGLVQTGGSLRLSCTATGSIFSFSAVGWYRQVPGKQREMVASVTKTTGTNYGDSVKGRFTISRGSAKNQIHLRMNDLKPEDTAVYYCSANSWMRPDYYYWGPGVQVTVSSAHHSEDPTA（配列番号２）
The amino acid sequence encoded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 9 is as follows.
ELQLVESGGGLVQTGGSLRLSCTATGSIFSFSAVGWYRQVPGKQREMVASVTKTTGTNYGDSVKGRFTISRGSAKNQIHLRMNDLKPEDTAVYYCSANSWMRPDYYYWGPGVQVTVSSAHHSEDPTA (Sequence number 2)
配列番号１０により表されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
QVQLVESGGGVVQTGGSLRLSCVTSVRITSIFAMGWYRQTPGKKREVVAAMYSDGRGTVANSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAVYYCTNVRWHEPRGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号３）
The amino acid sequence encoded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 10 is as follows.
QVQLVESGGGVVQTGGSLRLSCVTSVRITSIFAMGWYRQTPGKKREVVAAMYSDGRGTVANSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAVYYCTNVRWHEPRGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA (SEQ ID NO: 3)
配列番号１１により表されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
ELQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHADRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA（配列番号４）
The amino acid sequence encoded by the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 11 is as follows.
ELQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHADRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQSA (SEQ ID NO: 4)
配列番号１～４のうち、Ｃ末端側から約１０残基にある「ＳＳ」に引き続く配列は、Ｆｃのヒンジ領域の一部であり、ドレブリンの結合に関わる配列ではない。したがって、ドレブリン結合ペプチドは、以下の配列番号１６～１９で表されるアミノ酸配列を含むペプチドである。 Among SEQ ID NOs: 1 to 4, the sequence following "SS" located about 10 residues from the C-terminus is part of the Fc hinge region and is not a sequence involved in binding of drebrin. Therefore, drebrin-binding peptides are peptides containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 16 to 19 below.
配列番号１６は、配列番号１のＮ末端側１１７アミノ酸残基である。
QVQLVESGGGLVRAGGSLRLSCAATGRTFSAYTMGWFRQAPGKEREFVAAVTRSSTSTYYAGSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLEPEDTAVYYCHARRPSTTGHWGQGTQVTVSS（配列番号１６）
SEQ ID NO: 16 is the N-terminal 117 amino acid residues of SEQ ID NO: 1.
QVQLVESGGGLVRAGGSLRLSCAATGRTFSAYTMGWFRQAPGKEREFVAAVTRSSTSTYYAGSVKGRFTISRDNAKNMVYLQMNNLEPEDTAVYYCHARRPSTTGHWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 16)
配列番号１７は、配列番号２のＮ末端側１１８アミノ酸残基である。
ELQLVESGGGLVQTGGSLRLSCTATGSIFSFSAVGWYRQVPGKQREMVASVTKTTGTNYGDSVKGRFTISRGSAKNQIHLRMNDLKPEDTAVYYCSANSWMRPDYYYWGPGVQVTVSS（配列番号１７）
SEQ ID NO: 17 is the N-terminal 118 amino acid residues of SEQ ID NO: 2.
ELQLVESGGGLVQTGGSLRLSCTATGSIFSFSAVGWYRQVPGKQREMVASVTKTTGTNYGDSVKGRFTISRGSAKNQIHLRMNDLKPEDTAVYYCSANSWMRPDYYYWGPGVQVTVSS (Sequence number 17)
配列番号１８は、配列番号３のＮ末端側１１４アミノ酸残基である。
QVQLVESGGGVVQTGGSLRLSCVTSVRITSIFAMGWYRQTPGKKREVVAAMYSDGRGTVANSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAVYYCTNVRWHEPRGQGTQVTVSS（配列番号１８）
SEQ ID NO: 18 is the N-terminal 114 amino acid residues of SEQ ID NO: 3.
QVQLVESGGGVVQTGGSLRLSCVTSVRITSIFAMGWYRQTPGKKREVVAAMYSDGRGTVANSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAVYYCTNVRWHEPRGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 18)
配列番号１９は、配列番号４のＮ末端側１２１アミノ酸残基である。
ELQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHADRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号１９）
SEQ ID NO: 19 is the N-terminal 121 amino acid residues of SEQ ID NO: 4.
ELQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHADRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 19)
（Ｅ）ドレブリン結合ペプチドの発現
市販されているｐＥＴ２２ｂ（＋）（Merck Millipore株式会社より入手可能）由来のプラスミドＶｅｃｔｏｒ２に、制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトと３ｘＦｌａｇタグを挿入し、Ｖｅｃｔｏｒ２を制限酵素ＳｆｉＩで処理した。制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトは、GGCCCAGCCGGCC（配列番号６）若しくはGGCCTCTGCGGCC（配列番号７）により表されるＤＮＡ配列からなる。
(E) Expression of drebrin-binding peptide A restriction enzyme SfiI cleavage site and a 3xFlag tag were inserted into plasmid Vector2 derived from commercially available pET22b(+) (available from Merck Millipore Co., Ltd.), and Vector2 was treated with restriction enzyme SfiI. did. The restriction enzyme SfiI cleavage site consists of a DNA sequence represented by GGCCCAGCCGGCC (SEQ ID NO: 6) or GGCCTCTGCGGCC (SEQ ID NO: 7).
一方、配列番号８～１１により表されるＤＮＡ配列を有するドレブリン結合ペプチドをコードする遺伝子断片をライゲーションしたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１を制限酵素ＳｆｉＩにより処理した。 On the other hand, plasmid Vector1, in which a gene fragment encoding a drebrin-binding peptide having the DNA sequences represented by SEQ ID NOs: 8 to 11 was ligated, was treated with restriction enzyme SfiI.
制限酵素処理した遺伝子断片を、電気泳動法により回収した。回収した遺伝子断片（配列番号１２～１５）を、制限酵素ＳｆｉＩにより処理したＶｅｃｔｏｒ２断片に、１：２の割合で混合した。混合液に、ライゲーション試薬を注入した。混合液を摂氏１６度の温度で２時間静置し、ドレブリン結合ペプチドをコードする遺伝子断片をＶｅｃｔｏｒ２断片にライゲーションした。 The gene fragments treated with restriction enzymes were recovered by electrophoresis. The recovered gene fragments (SEQ ID NOs: 12 to 15) were mixed at a ratio of 1:2 with the Vector 2 fragment treated with the restriction enzyme SfiI. A ligation reagent was injected into the mixture. The mixture was allowed to stand at a temperature of 16 degrees Celsius for 2 hours, and the gene fragment encoding the drebrin-binding peptide was ligated to the Vector2 fragment.
5’-CGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTGGTGCGCGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCACTGGACGCACCTTCAGTGCCTATACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGTGAGTTTGTGGCAGCGGTTACCAGGAGTAGTACCAGCACATACTATGCAGGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGAACAACCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCCATGCCCGCAGGCCTTCGACAACGGGGCACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTG-3’ （配列番号１２） 5’-CGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTGGTGCGCGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCACTGGACGCACCTTCAGTGCCTATACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGAGCGTGAGTTTGTGGCAGCGGTTACCAGGAGTAGTACCAGCACATACTATGCAGGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACATGG TGTATCTGCAAATGAACAACCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGCCATGCCCGCAGGCCTTCGACAACGGGGCACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTG-3' (SEQ ID NO: 12)
5’-CGGCCATGGCTGAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAAACTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCACTGGAAGCATCTTCAGCTTCAGCGCCGTGGGCTGGTACCGCCAGGTTCCAGGGAAGCAGCGCGAAATGGTCGCATCTGTTACTAAGACCACTGGCACGAACTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGGGAGCGCCAAGAACCAGATCCACCTCCGGATGAACGACCTCAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAGCGCGAACAGTTGGATGAGGCCAGACTACTACTATTGGGGCCCGGGGGTCCAGGTCACCGTTTCTTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCACGGCCTCTG-3’ （配列番号１３） 5’-CGGCCATGGCTGAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAAACTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCACTGGAAGCATCTTCAGCTTCAGCGCCGTGGGCTGGTACCGCCAGGTTCCAGGGAAGCAGCGCGAAATGGTCGCATCTGTTACTAAGACCACTGGCACGAACTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGGAGCGCCAAGAACCAGATCC ACCTCCGGATGAACGACCTCAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAGCGCGAACAGTTGGATGAGGCCAGACTACTACTATTGGGGCCCGGGGGTCCAGGTCACCGTTTCTTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCACGGCCTCTG-3' (SEQ ID NO: 13)
5’-CGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTGCAGACCGGGGGGTCTCTACGACTCTCCTGTGTAACTTCTGTCCGAATTACCAGTATCTTTGCCATGGGCTGGTATCGCCAGACTCCAGGGAAGAAGCGCGAGGTAGTCGCGGCGATGTATTCTGATGGTAGAGGTACTGTTGCAAACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAACCTGAAACCAGAGGACACGGCCGTGTACTACTGTACGAACGTTAGATGGCACGAACCCCGGGGCCAGGGGACCCAGGTTACCGTCTCTTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCTCTG-3’ （配列番号１４） 5’-CGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTGCAGACCGGGGGGTCTCTACGACTCTCCTGTGTAACTTCTGTCCGAATTACCAGTATCTTTGCCATGGGCTGGTATCGCCAGACTCCAGGGAAGAAGCGCGAGGTAGTCGCGGCGATGTATTCTGATGCAAGTAGAGGTACTGTTGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAGATGAACAACCTGAACCAGAGGACACGGCCGTGTACTACTGTACGAACGTTAGATGGCACGAACCCCGGGGCCAGGGGACCCAGGTTACCGTCTCTTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCTCTG-3' (SEQ ID NO: 14)
5’-CGGCCATGGCTGAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGCGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTAAGCCTCTGGATTCAGCTTCGGACTCTTTGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCAGCTACTAATAGTGGTGGCGATAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACACGATGTATCTGCAAATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTCATGCAGATCGACTGAATAGAGACTATACCATATCGCAATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTG-3’ （配列番号１５） 5’-CGGCCATGGCTGAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGCGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTAAGCCTCTGGATTCAGCTTCGGACTCTTTGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCCCGAGTGGGTCTCAGCTACTAATAGTGGTGGCGATAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGACAACGCCAAGAACACGAT GTATCTGCAAATGAACAGCCTGGAACCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTCATGCAGATCGACTGAATAGAGACTATACCATATCGCAATACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAATCGGCCTCTG-3' (SEQ ID NO: 15)
このようにしてライゲーションしたプラスミドＶｅｃｔｏｒ２を用いて、大腸菌（Competent Cell BL21 (DE3) ,New England Biolabsより入手）にトランスフェクションした。 The thus ligated plasmid Vector 2 was used to transfect Escherichia coli (Competent Cell BL21 (DE3), obtained from New England Biolabs).
次いで、大腸菌をプレート上に１００μｇ／ｍＬの濃度を有するアンピシリン含有２ＹＴ（２ＹＴＡ）培地で１５時間培養して、ドレブリン結合ペプチドを発現する大腸菌株を得た。 E. coli was then cultured on the plate in 2YT (2YTA) medium containing ampicillin with a concentration of 100 μg/mL for 15 hours to obtain an E. coli strain expressing drebrin-binding peptide.
２ＹＴＡＧ培地を含むアガープレートに形成されたコロニーの中から、１つのコロニーを選択し、爪楊枝でピックアップした。ピックアップしたコロニーを、２ｍＬの２ＹＴＡ培地中で、６００ｎｍの波長での混合液の吸光度が２．０になるまで２００ｒｐｍで振とうしながら摂氏３７度の温度で培養した。 One colony was selected from among the colonies formed on the agar plate containing 2YTAG medium and picked up with a toothpick. The picked colonies were cultured in 2 mL of 2YTA medium at a temperature of 37 degrees Celsius with shaking at 200 rpm until the absorbance of the mixture at a wavelength of 600 nm was 2.0.
さらに、２ｍＬの培養液を２００ｍＬの２ＹＴＡ培地に混合した。６００ｎｍの波長での混合液の吸光度が０．８になるまで、混合液を２００ｒｐｍで振とうしながら摂氏３７度の温度で培養した。 Furthermore, 2 mL of culture solution was mixed with 200 mL of 2YTA medium. The mixture was incubated at a temperature of 37 degrees Celsius with shaking at 200 rpm until the absorbance of the mixture at a wavelength of 600 nm was 0.8.
吸光度が０．８になった後、イソプロピルチオガラクトシド溶液を混合液に添加した。イソプロピルチオガラクトシド溶液の最終濃度は１０μＭであった。混合液に含有される大腸菌を、摂氏２５度の温度で１５時間培養した。培養した大腸菌を回収するため、混合液を８０００ｒｐｍで５分間遠心した。 After the absorbance reached 0.8, the isopropylthiogalactoside solution was added to the mixture. The final concentration of isopropylthiogalactoside solution was 10 μM. E. coli contained in the mixture was cultured at a temperature of 25 degrees Celsius for 15 hours. To recover the cultured E. coli, the mixture was centrifuged at 8000 rpm for 5 minutes.
回収した大腸菌を、４５ｍＬのＰＢＳに混合し、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。このようにして、大腸菌を洗浄し、混合液に含有される大腸菌を、超音波を用いて破砕した。大腸菌を含む破砕液を、８０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清を、０．８μｍフィルタを用いて濾過した。 The collected E. coli was mixed with 45 mL of PBS and stirred using a vortex mixer. In this manner, the E. coli was washed, and the E. coli contained in the mixed solution was disrupted using ultrasound. The disrupted solution containing E. coli was centrifuged at 8000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected. The collected supernatant was filtered using a 0.8 μm filter.
濾液を、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（GE Healthcare社より入手）を用いて推奨プロトコルに従って精製した。精製は４５ｍＬの濾液に対して、３ｍＬの溶出液を用いた。溶出液に含有される緩衝液を、透析によってＰＢＳに置換した。置換は３ｍＬの溶出液に対して、１．５ＬのＰＢＳを用いた。このようにして、ドレブリン結合ペプチドを含有する溶液を得た。 The filtrate was purified using Ni Sepharose 6 Fast Flow (obtained from GE Healthcare) according to the recommended protocol. For purification, 3 mL of eluate was used for 45 mL of filtrate. The buffer contained in the eluate was replaced with PBS by dialysis. For substitution, 1.5 L of PBS was used for 3 mL of eluate. In this way, a solution containing drebrin-binding peptide was obtained.
このようにして得られた溶液に含有されるドレブリン結合ペプチドを、吸光度計（島津製作所より入手、商品名：BioSpec-nano）を用いて、２８０ｎｍでの波長での吸収測定値に基づいて定量した。 The drebrin-binding peptide contained in the solution thus obtained was quantified based on absorption measurements at a wavelength of 280 nm using an absorbance meter (obtained from Shimadzu Corporation, trade name: BioSpec-nano). .
（Ｆ）ドレブリン結合ペプチド－ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合抗体の発現
市販されているｐｃＤＮＡ３．１（＋）（例えば、Thermo Fisher Scientific株式会社より入手可能）由来のプラスミドＶｅｃｔｏｒ３に、制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトとヒトＩｇＧ－Ｆｃ領域を挿入し、Ｖｅｃｔｏｒ３を制限酵素ＳｆｉＩにより処理した。制限酵素ＳｆｉＩ切断サイトは、GGCCCAGCCGGCC（配列番号６）若しくはGGCCTCTGCGGCC（配列番号７）により表されるＤＮＡ配列からなる。また、このヒトＩｇＧ－Ｆｃ領域は、Ｎ末端側がヒンジ領域の一部をなしており、このヒンジ領域の一部がＶＨＨと結合する。
(F) Expression of drebrin-binding peptide-human IgG Fc fusion antibody Plasmid Vector3 derived from commercially available pcDNA3.1(+) (for example, available from Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was injected with restriction enzyme SfiI cleavage site and human IgG. -Fc region was inserted and Vector 3 was treated with restriction enzyme SfiI. The restriction enzyme SfiI cleavage site consists of a DNA sequence represented by GGCCCAGCCGGCC (SEQ ID NO: 6) or GGCCTCTGCGGCC (SEQ ID NO: 7). Furthermore, the N-terminal side of this human IgG-Fc region forms part of a hinge region, and a part of this hinge region binds to VHH.
一方、ドレブリン結合ペプチドをコードする遺伝子断片をライゲーションしたプラスミドＶｅｃｔｏｒ１を、制限酵素ＳｆｉＩで処理し電気泳動法により遺伝子断片を回収した。遺伝子断片（配列番号１２～１５）を、制限酵素ＳｆｉＩにより処理したＶｅｃｔｏｒ３に、１：２の割合で混合した。混合液に、ライゲーション試薬を注入した。混合液を摂氏１６度の温度で２時間静置し、ドレブリン結合ペプチドをコードする遺伝子断片をプラスミドＶｅｃｔｏｒ３にライゲーションした。 On the other hand, plasmid Vector 1 in which a gene fragment encoding a drebrin-binding peptide was ligated was treated with restriction enzyme SfiI, and the gene fragment was recovered by electrophoresis. The gene fragments (SEQ ID NOs: 12 to 15) were mixed in Vector 3 treated with restriction enzyme SfiI at a ratio of 1:2. A ligation reagent was injected into the mixture. The mixture was allowed to stand at a temperature of 16 degrees Celsius for 2 hours, and the gene fragment encoding the drebrin-binding peptide was ligated to plasmid Vector3.
このようにしてライゲーションしたプラスミドＶｅｃｔｏｒ３を用いて、ヒト培養細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）にトランスフェクションした。 Plasmid Vector 3 thus ligated was used to transfect a human cultured cell line (HEK293T).
トランスフェクションは、遺伝子導入試薬（ＨｉｌｙＭａｘ、同人化学社製）を用いて推奨プロトコルに従って行われた。培養液中に、ドレブリン結合ペプチド－ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合抗体を産生した。このようにして、ドレブリン結合ペプチド－ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合抗体を含有する溶液を得た。 Transfection was performed using a gene transfer reagent (HilyMax, manufactured by Dojin Kagaku Co., Ltd.) according to the recommended protocol. A drebrin-binding peptide-human IgG Fc fusion antibody was produced in culture. In this way, a solution containing the drebrin-binding peptide-human IgG Fc fusion antibody was obtained.
２．配列番号１のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド－ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合抗体を用いたウェスタンブロット法によるドレブリン検出
図１は、Ｍｙｃ－ｄｒｅｂｒｉｎ Ａ（エピトープタグであるＭｙｃが融合したドレブリン、以下同じ）を発現しているＨＥＫ２９３細胞抽出物についてのウェスタンブロット法によるドレブリン検出の結果を示している。なお、マーカーの単位はｋＤａ（キロダルトン）である。ＨＥＫ２９３細胞抽出物のＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、アクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜へタンパク質の転写を行った後、各種抗体又はペプチドを用いてドリブレンを検出した。
2. Drebrin binding peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 - Detection of drebrin by Western blotting using a human IgG Fc fusion antibody The results of drebrin detection by Western blotting on HEK293 cell extracts shown in FIG. Note that the unit of the marker is kDa (kilodalton). After SDS-PAGE of HEK293 cell extracts and protein transfer from acrylamide gel to PVDF membrane, Dribrene was detected using various antibodies or peptides.
一次抗体には、以下の抗体又はペプチドを用いた。図１の左から第１レーン～第８レーンとして説明する。
第１レーン：抗Ｍｙｃ抗体（抗Ｍｙｃ）
第２、５、６レーン：抗ドレブリンモノクローナル抗体（Ｍ２Ｆ６、株式会社医学生物学研究所より入手）
第３レーン：配列番号１のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド（＃１、以下＃１ペプチドという）
第４、７、８レーン：＃１ペプチドをヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合したドレブリン結合ペプチド－ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合抗体（＃１Ｆｃ、以下＃１Ｆｃ抗体という）
The following antibodies or peptides were used as primary antibodies. Lanes will be explained as first to eighth lanes from the left in FIG.
1st lane: anti-Myc antibody (anti-Myc)
Lanes 2, 5, and 6: Anti-drebrin monoclonal antibody (M2F6, obtained from Medical and Biological Research Institute, Inc.)
3rd lane: Drebrin-binding peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (#1, hereinafter referred to as #1 peptide)
Lanes 4, 7, and 8: Drebrin-binding peptide-human IgG Fc fusion antibody (#1Fc, hereinafter referred to as #1Fc antibody) in which #1 peptide is fused to the Fc region of human IgG antibody
＃１ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドに３つのＦｌａｇ配列を融合して発現させたものであり、２次抗体としてＨＲＰ標識抗Ｆｌａｇ抗体を用いることにより検出できる。＃１Ｆｃ抗体は配列番号１のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドにヒト免疫グロブリンＧのＦｃ領域が融合してあり二量体を形成している。＃１Ｆｃ抗体は、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体を用いることによって検出できる。 #1 peptide is expressed by fusing three Flag sequences to the drebrin-binding peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and can be detected by using an HRP-labeled anti-Flag antibody as a secondary antibody. #1 Fc antibody is a drebrin-binding peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 fused to the Fc region of human immunoglobulin G to form a dimer. #1Fc antibody can be detected by using HRP-labeled anti-human immunoglobulin G antibody as a secondary antibody.
抗Ｍｙｃ抗体及びＭ２Ｆ６がドレブリンに特異的に結合することは既に証明されており、ドレブリンの分子量が１４０ｋＤａであることが分かった(図１の第１レーン及び第２レーンを参照)。そして、＃１ペプチド及び＃１Ｆｃ抗体を一次抗体としてＭｙｃ－ｄｒｅｂｒｉｎ Ａと反応させた結果、１４０ｋＤａの位置でバンドを確認できたため、＃１ペプチド及び＃１Ｆｃ抗体がドレブリンに特異的に結合することが分かった。 It has already been proven that the anti-Myc antibody and M2F6 specifically bind to drebrin, and the molecular weight of drebrin was found to be 140 kDa (see first and second lanes in FIG. 1). Then, as a result of reacting #1 peptide and #1 Fc antibody with Myc-drebrin A as a primary antibody, a band was confirmed at the 140 kDa position, indicating that #1 peptide and #1 Fc antibody specifically bind to drebrin. Do you get it.
さらに、ドレブリンノックアウトマウス（以下、ＫＯ。図１同じ）、野生型マウス（以下、ＷＴ。図１同じ）の大脳皮質抽出物を用いてウェスタンブロット法を行った。そうしたところ、＃１Ｆｃ抗体を一次抗体として反応させた結果、Ｍ２Ｆ６を一次抗体として反応させた場合と同様に、ＷＴの１４０ｋＤａの位置にのみバンドが現れることが確認できた。また、ＫＯにおいては同位置にバンドが確認できなかったため、＃１Ｆｃ抗体が特異的に野生型マウスのドレブリンを認識していることが分かった（第５～８レーン）。 Furthermore, Western blotting was performed using cerebral cortex extracts from drebrin knockout mice (hereinafter referred to as KO; the same as in Figure 1) and wild-type mice (hereinafter referred to as WT; the same as in Figure 1). As a result of reacting with #1 Fc antibody as the primary antibody, it was confirmed that a band appeared only at the 140 kDa position of WT, similar to when reacting with M2F6 as the primary antibody. Furthermore, since no band was observed at the same position in KO, it was found that the #1 Fc antibody specifically recognized drebrin of wild type mice (lanes 5 to 8).
３．配列番号２～４により表されるアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドを用いたウェスタンブロット法によるドレブリン検出
図２は、実施例２と同様に、Ｍｙｃ－ｄｒｅｂｒｉｎ Ａを発現しているＨＥＫ２９３細胞抽出物についてウェスタンブロット法によりドレブリン検出を行った結果を示している。なお、マーカーの単位はｋＤａ（キロダルトン）である。ＨＥＫ２９３細胞抽出物のＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、アクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜へタンパク質の転写を行った後、各種抗体又はペプチドを用いてドリブレンを検出した。
3. Detection of drebrin by Western blotting using drebrin-binding peptides having amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 4. Figure 2 shows the results of HEK293 cell extracts expressing Myc-drebrin A, as in Example 2. The results of drebrin detection by Western blotting are shown. Note that the unit of the marker is kDa (kilodalton). After SDS-PAGE of HEK293 cell extracts and protein transfer from acrylamide gel to PVDF membrane, Dribrene was detected using various antibodies or peptides.
一次抗体には、以下の抗体又はペプチドを用いた。図２の左から第１レーン～第８レーンとして説明する。
第１レーン：抗Ｍｙｃ抗体（抗Ｍｙｃ）
第２レーン：抗ドレブリンモノクローナル抗体（Ｍ２Ｆ６）
第３レーン：配列番号２のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド（＃２、以下＃２ペプチドという）
第４レーン：配列番号３のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド（＃３、以下＃３ペプチドという）
第５レーン：配列番号４のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチド（＃４、以下＃４ペプチドという）
第６レーン：＃２ペプチドをヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合した抗体（＃２Ｆｃ、以下＃２Ｆｃ抗体という）
第７レーン：＃３ペプチドをヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合した抗体（＃３Ｆｃ、以下＃３Ｆｃ抗体という）
第８レーン：＃４ペプチドをヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合した抗体（＃４Ｆｃ、以下＃４Ｆｃ抗体という）
The following antibodies or peptides were used as primary antibodies. The lanes will be explained as first to eighth lanes from the left in FIG.
1st lane: anti-Myc antibody (anti-Myc)
2nd lane: anti-drebrin monoclonal antibody (M2F6)
3rd lane: drebrin-binding peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (#2, hereinafter referred to as #2 peptide)
4th lane: drebrin-binding peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (#3, hereinafter referred to as #3 peptide)
5th lane: Drebrin-binding peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (#4, hereinafter referred to as #4 peptide)
Lane 6: Antibody in which #2 peptide is fused with the Fc region of human IgG antibody (#2Fc, hereinafter referred to as #2Fc antibody)
Lane 7: Antibody in which #3 peptide is fused with the Fc region of human IgG antibody (#3Fc, hereinafter referred to as #3Fc antibody)
8th lane: Antibody in which #4 peptide is fused with the Fc region of human IgG antibody (#4Fc, hereinafter referred to as #4Fc antibody)
＃２ペプチド～＃４ペプチドは、それぞれ配列番号２、３、４のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドに３つのＦｌａｇ配列を融合して発現させたものであり、２次抗体としてＨＲＰ標識抗Ｆｌａｇ抗体を用いることにより検出できる。＃２Ｆｃ抗体～＃４Ｆｃ抗体は、それぞれ配列番号２、３、４のアミノ酸配列を有するドレブリン結合ペプチドにヒト免疫グロブリンＧのＦｃ領域が融合してあり二量体を形成している。＃２Ｆｃ抗体～＃４Ｆｃ抗体は、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体を用いることによって検出できる。 #2 peptide to #4 peptide are expressed by fusing three Flag sequences to drebrin-binding peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, and 4, respectively, and HRP-labeled anti-Flag antibody was used as a secondary antibody. It can be detected by using #2Fc antibody to #4Fc antibody form a dimer in which the Fc region of human immunoglobulin G is fused to drebrin-binding peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, and 4, respectively. #2Fc antibody to #4Fc antibody can be detected by using HRP-labeled anti-human immunoglobulin G antibody as a secondary antibody.
抗Ｍｙｃ抗体及びＭ２Ｆ６がドレブリンに特異的に結合することは既に証明されており、図２よりドレブリンの分子量が１４０ｋＤａであることが分かった(図２の第１レーン及び第２レーンを参照)。そして、Ｍｙｃ－ｄｒｅｂｒｉｎ Ａを＃２ペプチド～＃４ペプチド及び＃２Ｆｃ抗体～＃４Ｆｃ抗体を一次抗体として反応させた結果、１４０ｋＤａの位置でバンドを確認できたため、＃２ペプチド～＃４ペプチド及び＃２Ｆｃ抗体～＃４Ｆｃ抗体がドレブリンに特異的に結合することが分かった。 It has already been proven that the anti-Myc antibody and M2F6 specifically bind to drebrin, and it was found from FIG. 2 that the molecular weight of drebrin is 140 kDa (see the first and second lanes of FIG. 2). Then, as a result of reacting Myc-drebrin A with #2 peptide to #4 peptide and #2Fc antibody to #4Fc antibody as primary antibodies, a band was confirmed at the 140 kDa position. It was found that 2Fc antibody to #4Fc antibody specifically bind to drebrin.
４．ドレブリン結合ペプチドを用いた海馬神経細胞の免疫蛍光染色
固定後の初代培養海馬神経細胞にドレブリン結合ペプチド（＃４Ｆｃ）を特異的に結合させ、ヒト抗体を認識する二次抗体（蛍光標識：画像上では白で表示）を使って本ペプチドの分布を同定した（図３左）。蛍光がスパインに局在していることから本ペプチドがドレブリンに特異的に結合していることがわかる。このことよりドレブリンの局在の検出法として、現在市販のマウスモノクローナル抗体Ｍ２Ｆ６（図３右）と比べて、同等であることがわかる。
4. Immunofluorescence staining of hippocampal neurons using drebrin-binding peptide Drebrin-binding peptide (#4Fc) was specifically bound to primary cultured hippocampal neurons after fixation, and a secondary antibody (fluorescent labeling: on the image (shown in white) was used to identify the distribution of this peptide (Figure 3 left). The fact that the fluorescence is localized in the spine indicates that this peptide specifically binds to drebrin. This shows that this method is equivalent to the currently commercially available mouse monoclonal antibody M2F6 (Fig. 3, right) as a method for detecting the localization of drebrin.
５．ＧＦＰ・Ｆｃ－融合ドレブリン結合ペプチドによる、ドレブリンの神経細胞内イメージング
初代培養海馬神経細胞に、Ｎ末端にＧＦＰを融合したＧＦＰ・Ｆｃ－融合ドレブリン結合ペプチド（ＧＦＰ－＃４Ｆｃ）を強制発現させた。図４の蛍光画像により、発現したペプチドの集積部位（Ａの矢印）とマウスモノクローナル抗体Ｍ２Ｆ６により明らかとされた内在性ドレブリンの集積部位（Ｂの矢印）が一致していることがわかる。
5. Intraneuronal imaging of drebrin using a GFP/Fc-fused drebrin-binding peptide A GFP/Fc-fused drebrin-binding peptide (GFP-#4Fc), which has GFP fused to its N-terminus, was forcefully expressed in primary cultured hippocampal neurons. The fluorescence image in FIG. 4 shows that the accumulation site of the expressed peptide (arrow in A) matches the accumulation site of endogenous drebrin (arrow in B) revealed by the mouse monoclonal antibody M2F6.
なお、ＧＦＰ・Ｆｃ－融合ドレブリン結合ペプチドの強制発現は、以下のようにして作製したｐＥＧＦＰ－Ｃ１－＃４Ｆｃを初代培養海馬神経細胞に導入することにより行った。
ｐＥＧＦＰ－Ｃ１ベクター（GenBank Accession #: U55763 Clontech社より入手）のマルチクローニングサイトに存在するBglII、EcoRIサイトを制限酵素で切断後、アガロースゲルで電気泳動を行い、クローニングベクターの精製を行った。また、当該ペプチド＃４Ｆｃをコードする、配列番号１１で示される配列を含む核酸フラグメントをBglII、EcoRIサイトを有するプライマーを用いたＰＣＲで増幅し、同様に制限酵素処理及びアガロースゲル電気泳動を行い、挿入核酸の精製を行った。上記のクローニングベクターと挿入核酸のライゲーションを行い、目的のＧＦＰ融合ペプチド発現ベクターを作製した。
Note that forced expression of the GFP/Fc-fused drebrin-binding peptide was performed by introducing pEGFP-C1-#4Fc prepared as follows into primary cultured hippocampal neurons.
After cutting the BglII and EcoRI sites present in the multi-cloning site of pEGFP-C1 vector (GenBank Accession #: U55763 from Clontech) with restriction enzymes, electrophoresis was performed on agarose gel to purify the cloning vector. In addition, a nucleic acid fragment containing the sequence shown in SEQ ID NO: 11, which encodes the peptide #4Fc, was amplified by PCR using primers having BglII and EcoRI sites, and similarly subjected to restriction enzyme treatment and agarose gel electrophoresis. The inserted nucleic acid was purified. The above cloning vector and the inserted nucleic acid were ligated to produce the desired GFP fusion peptide expression vector.
６．ランダム変異ライブラリによるドレブリン結合ペプチドの作製
実施例１で得られたドレブリン結合ペプチド遺伝子に対するランダム変異により、ドレブリン結合ペプチドのスクリーニングを行った。
6. Production of drebrin-binding peptide using random mutation library Drebrin-binding peptide was screened by random mutation of the drebrin-binding peptide gene obtained in Example 1.
（Ａ）ランダム変異ライブラリの構築
配列番号１９（配列番号４から、Ｃ末端側Ｆｃヒンジ領域を除去したもの）のドレブリン結合ペプチドをコードする配列番号１１の遺伝子に対してError Prone PCRを行ってランダム変異を挿入し、ファージミドベクターへと連結させた。作製したファージミドベクターを大腸菌へと形質転換することで約１．０×１０８の多様性を有するランダム変異ライブラリを構築した。
(A) Construction of random mutation library Error Prone PCR was performed on the gene of SEQ ID NO: 11, which encodes the drebrin-binding peptide of SEQ ID NO: 19 (from SEQ ID NO: 4, with the C-terminal Fc hinge region removed). The mutations were inserted and ligated into a phagemid vector. A random mutation library having a diversity of approximately 1.0×10 8 was constructed by transforming the prepared phagemid vector into E. coli.
（Ｂ）ランダム変異ライブラリを用いたドレブリン結合ペプチドのスクリーニング
実施例１（Ｃ）に記載の方法により、２ラウンドのパニングを行った。単離した８６クローンの結合活性を配列番号１９のドレブリン結合ペプチドと比較するため、実施例１（Ｄ）に記載の方法によりＥＬＩＳＡを行ったところ、ほぼ全てのクローンで結合活性の上昇が確認できた。特に結合活性の高かった１０クローン（Ｚ０１～Ｚ１０）の結合活性を図５に示す。１０クローンのうち、Ｚ０２～Ｚ１０の９クローンは独立していた。
(B) Screening for drebrin-binding peptides using random mutation library Two rounds of panning were performed by the method described in Example 1(C). In order to compare the binding activity of the 86 isolated clones with the drebrin-binding peptide of SEQ ID NO: 19, ELISA was performed according to the method described in Example 1 (D), and an increase in binding activity was confirmed in almost all clones. Ta. FIG. 5 shows the binding activity of 10 clones (Z01 to Z10) that had particularly high binding activity. Among the 10 clones, 9 clones Z02 to Z10 were independent.
（Ｃ）ランダム変異により得られたドレブリン結合ペプチド－ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合抗体の、ＥＬＩＳＡ法によるドレブリン結合活性評価
実施例１（Ｆ）に記載の方法により、Ｚ０２～Ｚ１０を有するドレブリン結合ペプチド－ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合抗体発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ドレブリン結合ペプチド－ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合抗体を一過性に培養上清中に発現させ、ＥＬＩＳＡで結合活性を評価した。
(C) Evaluation of drebrin-binding peptide-human IgG Fc fusion antibody obtained by random mutation by ELISA method Drebrin-binding peptide-human IgG having Z02 to Z10 was determined by the method described in Example 1(F). An Fc fusion antibody expression vector was created. The prepared expression vector was transfected into HEK293T cells, the drebrin-binding peptide-human IgG Fc fusion antibody was transiently expressed in the culture supernatant, and the binding activity was evaluated by ELISA.
結果を図６に示す。オリジナルである配列番号１９のアミノ酸配列を含むペプチドの結合活性に比べて、ランダム変異クローンはどれも結合活性が低く、上記実施例６（Ｂ）とは異なる結果が得られた。この理由は明らかではなく、ランダム変異クローンは大腸菌内での発現に適した変異が加えられて生産性が高まり、ＶＨＨ提示ファージにおけるＶＨＨの提示量が増加した結果、実施例６（Ｂ）のＥＬＩＳＡでは結合活性が高く測定されたのみであって、ペプチドの結合活性自体は低下した可能性がある。一方で、ランダム変異クローンは、Ｆｃ融合抗体にすると結合活性が低下するが、ペプチドの結合活性自体は上がっている可能性もあるため、ランダム変異クローン全てについてさらなる解析を行った。なお、Ｚ０３、Ｚ０７は、ｃＤＮＡを単離することができなかった。 The results are shown in FIG. Compared to the binding activity of the original peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, all of the random mutation clones had lower binding activity, and different results from Example 6(B) were obtained. The reason for this is not clear, but the random mutation clones had mutations suitable for expression in E. coli, increasing their productivity and increasing the amount of VHH displayed by the VHH-displaying phage. In this case, only a high binding activity was measured, and the binding activity of the peptide itself may have decreased. On the other hand, the binding activity of randomly mutated clones decreases when used as an Fc fusion antibody, but the peptide binding activity itself may increase, so further analysis was performed on all randomly mutated clones. Note that cDNA could not be isolated for Z03 and Z07.
７．ドレブリン結合ペプチドによる、ドレブリンの神経細胞内イメージング
上記実施例６（Ｃ）で得られた各クローンについて、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクター（GenBank Accession #: U55762 Clontech社より入手）に組み入れてＣ末端側にＧＦＰを融合したコンストラクトを作製し、実施例５と同様の方法により初代培養海馬神経細胞にＧＦＰ・Ｆｃ－融合ドレブリン結合ペプチドを発現させ、蛍光画像を取得した。また、ヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合していないドレブリン結合ペプチドについても、同様の方法でＣ末端側にＧＦＰを融合したコンストラクトを作製し、実施例５と同様の方法により初代培養海馬神経細胞にＧＦＰ－融合ドレブリン結合ペプチドを発現させ、蛍光画像を取得した。
7. Intraneuronal imaging of drebrin using drebrin-binding peptide Each clone obtained in Example 6 (C) above was inserted into pEGFP-N1 vector (GenBank Accession #: U55762 obtained from Clontech) and GFP was added to the C-terminal side. A fused construct was prepared, and the GFP/Fc-fused drebrin-binding peptide was expressed in primary cultured hippocampal neurons by the same method as in Example 5, and fluorescence images were obtained. In addition, for the drebrin-binding peptide that is not fused to the Fc region of a human IgG antibody, a construct in which GFP is fused to the C-terminus was prepared using the same method as in Example 5, and the primary cultured hippocampal neurons were A GFP-fused drebrin-binding peptide was expressed in the cells, and fluorescence images were obtained.
結果を図７に示す。図７Ａは、ＧＦＰ・Ｆｃ－融合ドレブリン結合ペプチドによりドレブリンの細胞内イメージングを行った結果を示す。Ｚ０４、Ｚ１０以外のクローンにおいて、ＧＦＰ・Ｆｃ－融合ドレブリン結合ペプチドが細胞内に発現し、親クローンである配列番号１９と同程度に、内在性ドレブリンの集積部位を検出することができた。 The results are shown in FIG. FIG. 7A shows the results of intracellular imaging of drebrin using a GFP/Fc-fused drebrin-binding peptide. In clones other than Z04 and Z10, the GFP/Fc-fused drebrin-binding peptide was expressed intracellularly, and endogenous drebrin accumulation sites could be detected to the same extent as in the parent clone SEQ ID NO: 19.
また、Ｚ０２、Ｚ０６について、ヒトのＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合していない、ＧＦＰ－融合ドレブリン結合ペプチドを用いて同様の試験を行ったところ、Ｆｃ領域を融合した場合と同程度に、内在性ドレブリンの集積部位を検出することができた（図７Ｂ）。 Furthermore, for Z02 and Z06, a similar test was conducted using a GFP-fused drebrin-binding peptide that was not fused to the Fc region of a human IgG antibody, and it was found that endogenous We were able to detect drebrin accumulation sites (Fig. 7B).
８．取得クローンのアミノ酸配列
実施例７で、内在性ドレブリンの集積部位を検出することができた５クローンのアミノ酸配列を決定した。得られた配列を以下に示す。なお、下線は配列番号１９からの変異箇所である。
8. Amino Acid Sequences of Obtained Clones In Example 7, the amino acid sequences of five clones in which endogenous drebrin accumulation sites could be detected were determined. The resulting sequence is shown below. Note that the underlined portion is the mutation site from SEQ ID NO: 19.
Ｚ０２
ELQLVESGGGLAQAGGSLRLSCETSGFRFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２０）
Ｚ０５
EVQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWLRQAPGKGPEWVSATNSGGHRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHADRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２１）
Ｚ０６
EVQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRLAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２２）
Ｚ０８
EVQLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYAVSVKGRFTTSRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２３）
Ｚ０９
EVQLVESGGGLVQAGGSVRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTVSRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHANRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS（配列番号２４）
Z02
ELQLVESGGGLAQAGGSLRLLSCE T SGF R FGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHA N RLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 20)
Z05
E V QLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSW L RQAPGKGPEWVSATNSGG H RTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHADRLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 21)
Z06
E V QLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVR L APGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHA N RLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 22)
Z08
E V QLVESGGGLAQAGGSLRLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYA V SVKGRFT T SRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHA N RLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 23)
Z09
E V QLVESGGGL V QAGGS V RLSCEASGFSFGLFGMSWVRQAPGKGPEWVSATNSGGDRTYYADSVKGRFT V SRDNAKNTMYLQMNSLEPEDTAVYYCHA N RLNRDYTISQYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 24)
本発明のドレブリン結合ペプチドの用途は、ドレブリンの検出や定量のみに限られない。例えばＧＦＰを付加したドレブリン結合ペプチドを作成すれば、ドレブリンの細胞内イメージングが可能となる。これにより、神経科学分野のみならず癌や感染症の分野においても種々の疾患の病態解明に寄与することが可能となるため、産業上非常に有用である。 The use of the drebrin-binding peptide of the present invention is not limited to the detection and quantification of drebrin. For example, if a drebrin-binding peptide with GFP added thereto is created, intracellular imaging of drebrin becomes possible. This makes it possible to contribute to the elucidation of the pathology of various diseases not only in the field of neuroscience but also in the fields of cancer and infectious diseases, and is therefore very useful industrially.
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