JP4532963B2 - 動物細胞及び臓器の保存液及び保存方法 - Google Patents
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Description
生物材料の保存には、冷却保存あるいは凍結保存が最も一般的であるが、動物細胞の場合、冷却後、特に凍結・融解後の生存率が低く、これまで臓器移植のための臓器の冷却あるいは凍結による保存には限界があった。
冷却・凍結法の改良のため、生細胞をジメチルスルホキシドを用いて約−80℃で保存する方法(非特許文献1参照)が提案されたが、この方法によっても、融解後の生存率は満足のいくものではない。
そこで、動物細胞や臓器を傷めずに長時間保存する技術、すなわち動物細胞や臓器を構成する細胞の生存率を長時間高く維持する技術の開発が求められている。
Bouroncle BA,Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine,119(4),958−961,1965
(1)高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を含有する、動物細胞または臓器の保存液。
(2)高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤が、1−デオキシマンノジリマイシンである、上記(1)記載の保存液。
(3)動物細胞または臓器に、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させ、その後凍結または冷却する、動物細胞または臓器の保存方法。
(4)高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤が、1−デオキシマンノジリマイシンである、上記(3)記載の保存方法。
ここで、本明細書における高マンノースオリゴサッカライドの語は動物細胞内に存在する高マンノースオリゴサッカライドを示す一般的な意味に用いる。高マンノースオリゴサッカライドは、一般に、マンノースが主に重合した糖鎖であって末端部分に2分子のN−アセチルグルコサミンを有する。高マンノースオリゴサッカライドを構成するマンノースは通常3〜9個程度である。高マンノースオリゴサッカライドは、マンノース、N−アセチルグルコサミン以外の単糖(例えばグルコース等)をさらに重合していてもよく、高マンノースオリゴサッカライドを構成する単糖の総数としては、例えば5〜12個程度が挙げられる。動物細胞内の高マンノースオリゴサッカライドは、一般に末端のN−アセチルグルコサミンを介して、ドリコールリン酸等の糖担体脂質、または蛋白質と結合している。
実施例1
PC12細胞凍結融解後の細胞生存率に対する1−デオキシマンノジリマイシンの効果を次の手順で調べた。
PC12細胞を各種濃度の1−デオキシマンノジリマイシンを含むクレブス液(本発明の保存液)で48時間処理、72時間処理、96時間処理後、−15℃で2時間凍結した。その後、37℃で細胞を融解し、細胞生存率を3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム ブロミド(MTT)アッセイ法にて定量化した。コントロール(非凍結融解・非1−デオキシマンノジリマイシン処理の細胞生存率)に対するパーセント細胞生存率と1−デオキシマンノジリマイシンの濃度との関係をプロットしたグラフを図1に示す。
臓器冷却保存に対する1−デオキシマンノジリマイシンの効果を次の手順により調べた。
(A)コントロール群
氷上で9週齢のC57/BL6マウス(オス)をペントバルビタール麻酔(50mg/kg、腹腔内注射)下で開胸し、左心室にカニューレ挿入・右心耳を切開し、左心室よりクレブス液で5分間灌流(6ml/min)した。マウスを4℃で20時間保存後、4%パラホルムアルデヒド/リン酸バッファー(PHA/PB)液で10分間灌流した。マウス全体をPHA/PB液に1晩浸した後、各臓器(心臓、肝臓、腎臓)を摘出しPHA/PB液中でさらに32時間処理した。続いて30%スクロース/リン酸バッファー液で48時間処理後、ドライアイスにて急速冷凍し、クリオスタットで10−20μmの薄切切片を作成した。心臓、肝臓、腎臓の組織切片はヘマトキシリンエオジン(HE)染色法にて染色された。
(B)1−デオキシマンノジリマイシン処理群
氷上で9週齢のC57/BL6マウス(オス)をペントバルビタール麻酔(50mg/kg、腹腔内注射)下で開胸し、左心室にカニューレ挿入・左心耳を切開し、左心室よりクレブス液で2分間、1mM 1−デオキシマンノジリマイシンを含むクレブス液(本発明の保存液)で3分間灌流(6ml/min)した。以下同様の手順で、心臓、肝臓、腎臓の組織切片が作成され、ヘマトキシリンエオジン(HE)染色法にて染色された。
Claims (2)
- 高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を含有する、動物細胞または臓器の保存液であって、該高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤が、1−デオキシマンノジリマイシンである、保存液。
- 動物細胞または臓器に、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させ、その後凍結または冷却する、動物細胞または臓器の保存方法であって、該高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤が、1−デオキシマンノジリマイシンである、保存方法。
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