JP4528967B2 - Gefitinib、及び類薬に感受性を示す細胞・組織におけるDNAの簡便検査方法 - Google Patents
Gefitinib、及び類薬に感受性を示す細胞・組織におけるDNAの簡便検査方法 Download PDFInfo
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Description
(2)電気泳動、或いはスピンカラム等によるPCR産物の精製とシーケンス反応の鋳型となる精製PCR産物の定量操作(1〜1.5時間)
(3)高価な専用試薬とシーケンス用プライマーによるシーケンス反応(3時間)
(4)シーケンス反応生成物の濃縮、bufferへの再溶解と熱変性(0.5時間)
(5)自動シーケンサーへのセット、自動解析(1時間/1サンプル)
exon19の塩基欠失型変異には、いくつかの欠失パターンが認められるが、既知のその全てに共通しているものは、コドン747から750までのコアとなる4アミノ酸残基LREA(ロイシン、アルギニン、グルタミン酸、アラニン)の欠失である。従って、この4アミノ酸残基の欠失を特異的に検出するように以下のプライマーを設計した(配列番号1〜3参照)。
Ex19midR :5’−GGAGATGTTGCTTCTCTTAATTC―3’
Ex19R :5’−TGAGGTTCAGAGCCATG−3’
既に報告されているexon21の変異では、コドン858のロイシンがアルギニンに置換する一塩基置換型変異(T>G)が最も多く、この変異は欧米人に比べ日本人で著しく多いとされている。この塩基置換は制限酵素EaeI、あるいはそのイソシゾマーの認識配列(Y/GGCCR)の消失を招くため、変異部位を挟んでPCRを行い、制限酵素での切断で変異を検出できるよう、以下のプライマーを設計した(配列番号4、5参照)。
Ex21R:5’−CAATACAGCTAGTGGGAAGG−3’
本酵素により249bpと127bpに切断されることが確認できるが、変異型ホモ接合体では切断されず376bpのままであり、ヘテロ接合体では、これら3種類のバンド全てが検出されていることが分かる。
Exon21においてアミノ酸置換をもたらす既知の変異のうち、もう一種類は、コドン861のロイシンがグルタミンに置換する一塩基置換型変異(T>A)である。この塩基置換は、制限酵素PvuIIの認識配列(CAG/CTG)の出現を招くため、変異部位を挟んでPCRを行い、制限酵素での切断で変異を検出することができる。変異の部位が上記コドン858に近接しているため、L858R変異を判定するために増幅したPCR産物を利用して、制限酵素をPvuIIに変更するだけで判定が可能となる。今回は制限酵素として、PvuII(Takara)を用いたが、そのイソシゾマー、例えばBavIやDmaIなどを使用することも可能である。
Claims (6)
- 配列番号1記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号2記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号3記載の塩基配列からなるプライマー、を含んでなるgefitinib及びEGFRを標的分子としたgefitinibの類薬応答性遺伝子変異検出用プライマーセット。
- 配列番号1記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号2記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号3記載の塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットを含む反応溶液を用いてPCRを行う工程、
前記PCRを行う工程により得たPCR産物に対して電気泳動を行う工程、を有する
gefitinib及びEGFRを標的分子としたgefitinibの類薬応答性遺伝子変異の判定方法。 - 配列番号4記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号5記載の塩基配列からなるプライマーを含んでなるgefitinib及びEGFRを標的分子としたgefitinibの類薬応答性遺伝子変異検出用プライマーセット。
- 配列番号4記載の塩基配列からなるプライマー、及び、配列番号5記載の塩基配列からなるプライマーを含むプライマーセットを含む反応溶液を用いてPCRを行う工程、
前記PCRを行う工程により得たPCR産物に対して制限酵素を用いてPCR産物を切断する工程、を有するgefitinib及びEGFRを標的分子としたgefitinibの類薬応答性遺伝子変異の判定方法。 - 前記制限酵素は、EaeI、またはそのイソシゾマーであることを特徴とする請求項4記載のgefitinib及びEGFRを標的分子としたgefitinibの類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
- 前記制限酵素は、PvuII、またはそのイソシゾマーであることを特徴とする請求項4記載のgefitinib及びEGFRを標的分子としたgefitinibの類薬応答性遺伝子変異の判定方法。
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