JP4522047B2 - 血管形成の調節 - Google Patents
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Description
(緒言)
(発明の分野)
本発明の分野は、Kuzとして知られているタンパク質を標的とすることによって血管形成を変調することである。
【0002】
(発明の背景)
ADAMファミリーの遺伝子はメタロプロテアーゼ及びディスインテグリンドメインの両方を含む膜貫通タンパク質をコードしており(BlackとWhite, 1998 Curr. Opin. Cell Biol. 10,654-659; WolfsbergとWhite, 1996 Dev. Biol. 180, 389-401)、哺乳動物における多様な生物プロセス、例えば受精(Cho等, 1998 Science 281, 1857-1859)、筋芽細胞融合(Yagami-Hiromasa等, 1995 Nature 377, 652-656)及び外部ドメイン分断(Moss等, 1997 Nature 385, 733-736; Black等, 1997 Nature 385, 729-733; Peschon等, 1998 Science 282, 1281-1284)に関与している。ショウジョウバエのクズバニアン(kuzbanian(kuz))遺伝子は無脊椎動物で同定された最初のADAMファミリーのメンバーである(Rooke等, 1996 Science 273, 1227-1231)。過去の遺伝子研究では、kuzはショウジョウバエの神経発生中において側方抑制と軸索成長に必要とされることが示された(Rooke等, 1996;Fambrough等, 1996 PNAS.USA 93, 13233-13238; PanとRubin, 1997 Cell 90, 271-280;Sotillos等, 1997 Development 124, 4769-4779)。特に、側方抑制プロセスの間、kuzはNotchの上流で作用し(PanとRubin, 1997;Sotillos等, 1997)、それがDelta遺伝子によってコードされた側方抑制シグナルのための膜貫通レセプターをコードする。より最近では、Notchの線虫ホモログの活性を同様な形で調節するkuzのホモログが線虫(SUP-17)において同定された(Wen等, 1997 Development 124, 4759-4767)。
【0003】
kuzの脊椎動物ホモログは、アフリカツメガエル、ウシ、マウス、ラット及びヒトにおいて単離されている。KUZのウシホモログ(MADM又はADAM10とも呼ばれる)は最初はウシKUZプロテアーゼに対する生理学的基質ではありそうにない細胞質タンパク質であるミエリン塩基性タンパク質に対するそのインビトロでのタンパク分解活性に基づいて思いがけなく単離された(Howard等, 1996 Biochem. J. 317, 45-50)。最近の研究で、我々は、アフリカツメガエル中でのマウスkuzホモログ(mkuz)のドミナントネガティブ型の発現が余分なニューロン生成を生じ、脊椎動物の神経発生におけるNotchシグナル伝達の調節に対してmkuzの進化的に保存された役割を示唆している(PanとRubin, 1997)。しかして我々は胚性幹(ES)細胞中での遺伝子ターゲティングを利用してmkuz欠損マウスを産生した。我々は、mkuzが胚発生のために必須であり、mkuz変異体マウスはおよそ胎齢(E)9.5日で、神経系、沿軸中胚葉及び卵黄嚢脈管構造に重症の欠陥が生じて死亡することを示す。神経系において、mkuz変異体胎仔は、異所性ニューロン分化を示す。沿軸中胚葉において、mkuz変異体胎仔は体節の遅発性でまとまりのない分節化を示す。これらの表現型はNotch-1又はNotch経路の成分、例えばRBP-Jkを欠くマウスのもの(Conlon等, 1995, Development 121, 1533-1545; Oka等, 1995)と同様であり、マウスの発育中のNotchシグナル伝達の調節におけるmkuzの保存された役割を示している。更に、我々は我々のノックアウト動物ではNotchプロセシングに可視できる欠陥は検出していない。神経発生と体節発生の欠陥に加えて、mkuz変異体マウスはまた卵黄嚢脈管構造に重大な欠陥を示しており、毛管網が拡大して乱れ、大きな卵黄血管がない。そのような表現型はNotch-1又はRBP-Jkを欠くマウス(Swiatek等, 1994 Genes Dev 15, 707-719; Conlon等, 1995; Oka等, 1995 Developement 121, 3291-3301)では観察されていないので、我々は、この表現型はNotchシグナル伝達の調節におけるその役割とは別のmkuzの新規な機能を明らかにするものであると決定した。まとめると、我々の研究は哺乳動物の神経発生、体節発生及び血管形成におけるADAMファミリーのディスインテグリンメタロプロテアーゼの必須の役割を明らかにする。
【0004】
(発明の概要)
我々は、Kuzが体節発生、神経発生及び血管形成に関与しており、関連した病状における介入のための有用な治療上のターゲットを提供することを開示した。従って、本発明は体節発生、神経発生及び特に血管形成におけるKuzの関与に関する方法と組成物を提供する。一実施態様では、本発明は、病原性血管形成であるとされた脊椎動物においてKuzの活性を特異的に調節する工程を含んでなる、血管形成の調節方法を提供する。Kuzに特異的に結合するか、基質又は必要とされるコファクターについてKuzと競合する薬剤に動物を接触させることを含む、Kuz活性を特異的に調節する非常に様々な方法が開示される。
【0005】
他の実施態様では、本発明は、病原性血管形成であると必ずしもされていない脊椎動物においてKuzの活性を特異的に調節し、むしろ動物において結果として生じた血管形成の調節を続いて検出する工程を含んでなる血管形成の調節方法を提供する。
本発明はまた病原性血管形成であるとされた脊椎動物において、例えばKUZ特異的プロテアーゼアッセイ又はKUZ特異的免疫結合アッセイを使用して、Kuzの活性を特異的に検出する方法を提供する。本発明はまた所定のKuz活性を持つ脊椎動物において、例えば病原性血管形成に伴う腫瘍を検出することによって、病原性血管形成を特異的に検出する方法を提供する。
【0006】
本発明はまた血管形成の修飾因子を同定する方法において、(a)予め定まった量のKuzを含む血管形成アッセイ系を候補薬剤に、候補薬剤が存在しない場合に系が基準血管形成を付与する条件下で、接触させ、(b)系の薬剤バイアス血管形成を検出する工程を含み、薬剤バイアス血管形成と基準血管形成の差異により、薬剤による系の血管形成の調節が示される方法を提供する。このような方法は、インビトロの細胞ベースアッセイ又はインビボの動物ベースアッセイで実施されうる。
本発明はまた主題の方法に適合化されたキットと試薬を提供する。
【0007】
(発明の特定の実施態様の説明)
特定の実施態様と実施例の次の説明は例示のために提供されるもので限定のためではない。矛盾せず又はそれ以外の定義が示されない限り、これらの説明及び本明細書全体を通じて、「a」及び「an」という用語は一又は複数を意味し、「又は」という用語は及び/又はを意味する。Kuzは広く記載されている当該分野で認められた天然タンパク質ファミリーを意味し、当該分野でまたよく知られているオーソロガス(orthologs)及び変異体を包含する。例えば、WO98/37092及びWO97/31931;Mayer等(米国特許第5922546号;及びRubin等(米国特許第5935792号)を含む、ヒトKUZの幾つかの型が記載されている。しばしば血管形成について検討され実証されるが、開示された方法と試薬は一般に病原性体節発生及び神経発生にも同様に適用可能であるものと理解されなければならない。
【0008】
幾つかの開示された用途は脊椎動物におけるKuzの活性を特異的に調節することを含む。Kuzに特異的に結合するか、あるいは基質又は必要とされるコファクターに対してKuzと競合する薬剤に動物を接触させることを含む、Kuz活性を特異的に調節する非常に様々な方法が開示される。
【0009】
kuzに特異的に結合する薬剤には、メタロプロテアーゼインヒビター、例えばヒドロキサマートメタロプロテアーゼインヒビター及びTACE(TNF-α転換酵素)インヒビター(レビューには、Amour A等, Ann N Y Acad Sci 1999 June 30;878:728-31を参照)が含まれる。例示的なインヒビターには、IC-3(N-{D,L-[2-(ヒドロキシアミノカルボニル)メチル]-4-メチル-ペンタノイル}-L-アラニン,2-アミノエチルアミド、Black等, Nature, 1997, Vol 385, 729-73; GalkoとTessier-Lavigne, Science, 2000, Vol 289, 1365-1367)、GM6001(NHOHCOCH2CH(I-Bu)CO-Trp-NHMe);GW9471(Moss等, Nature, 1997, Vol 385, 733-736に示されたTACEの精製中に使用されたGW9471のビオチン化誘導体であるGW9277の構造を参照);及び合成ヒドロキサマートペプチド模倣マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターであるBB-94(batimastat)(Hernandez-Pando R等 Int J Exp Pathol 2000 Jun; 81(3):199-209を参照)が含まれる。有用な天然のMMPインヒビターには、MMPsの組織インヒビター(TIMPs)、例えばTIMP-1及びTIMP-3が含まれる(例えばAmour等, FEBS Lett. 2000 May 19;473(3):275-9を参照のこと)。
【0010】
Kuzに特異的に結合するインヒビターの他のクラスは、Kuzに特異的に結合する免疫グロブリン相補性決定領域(CDRs)、特にCDR3領域を含むポリペプチドである。これらは抗体と抗体断片、例えばF(ab)断片を包含する。治療用の抗体及び抗体断片を製造し使用する方法はよく知られている。例えば米国特許第5935792号を参照。
【0011】
細胞内抗体、つまりイントラボディは遺伝子療法における用途を持つ中和分子のクラスを表す(vonMehren M, Weiner LM. (1996) Current Opinion in Oncology. 8: 493-498, Marasco WA. (1997) Gene Therapy. 4: 11-15, Rondon IJ, Marasco WA. (1997) Annual Review of Microbiology. 51:257-283)。抗Kuzイントラボディは重鎖の可変ドメインがペプチドリンカーを介して軽鎖の可変ドメインに結合され、親Kuz抗体の親和性を維持している遺伝子操作された一本鎖抗体である(Rondon等)。抗KuzイントラボディはKuzの酵素活性形態を認識し、結合時にKuzのリン酸転移能を阻害する抗体をコードするポリクローナルか又はモノクローナルの抗Kuz抗体cDNAから設計される。また、抗KuzイントラボディはKuz酵素活性を刺激する抗体をコードするポリクローナルか又はモノクローナル抗体cDNAから産生することができる。抗Kuz一本鎖イントラボディはまた細胞質の安定性を増大させるためにC末端ヒトCκドメインで、及び/又は発生期にあるイントラボディを核コンパートメントに向けるためにC末端SV40核移行シグナルで、それぞれ修飾してもよい(Mhashilkar AM等 (1995) Embo Journal. 14: 1542-1551)。この点について、安定に発現された一本鎖抗Kuzイントラボディとその修飾形態は、真核生物細胞の細胞質又は核コンパートメントの何れかにKuz分子を効率的にターゲッティングするために使用することができる。
【0012】
Kuz特異的イントラボディは標準的なDNAトランスフェクション法(リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、リポフェクタミン等々)を含む幾つかの確立された方法の任意のものによって培養された細胞中に導入することができる。抗Kuzイントラボディは、tet抑制の(Gossen M, Bujard H. (1992) Proc. Natil. Acad. Sci. USA. 89: 5547-5551)又はIPTG誘発性の(Liu HS等, (1998) Biotechniques. 24: 624-632, Hannan GN等(1993) Gene. 130: 233-239)又はグルココルチコイド誘発性(GREを使用)の誘発性発現ベクター、構成発現ベクター(例えばCMV又はRSVプロモータ駆動ベクター)又は組織特異的発現遺伝子のプロモータ(例えばT細胞レセプタープロモータ)を使用する組織特異的発現ベクターの、種々のものの任意のものに構築される。抗Kuzイントラボディ組織(並びに株化細胞)を発現するための重要な変更点は、標準的なプロトコール(Vile RG等(1995) British Medical Bulletin. 51:12-30, Shoji I等 (1997) J. General Virology. 78: 2657-2664, Paulus W等 (1996) J. Virology. 70: 62-67)を使用して適切なウイルス発現ベクターを構築することである。抗Kuzイントラボディ遺伝子はキーとなるウイルス遺伝子に置き換えられ、宿主細胞によってウイルス粒子中に収容される。改変されたウイルスゲノムが標的の組織ゲノム中に組み込まれるが、新しいウイルス粒子の形成を防ぐように崩壊される。そして標的組織の個々の細胞が抗Kuzイントラボディ転写物とタンパク質を生産する。
【0013】
基質又はコファクターに対してKuzと特異的に競合する非常に多種の薬剤を使用することができる。競合的インヒビターには、高親和性の亜鉛結合によってZn-メタロプロテアーゼを阻害することが知られている、置換ヒドロキサマート、カルボキシラート、チオール、ホスホナート、アミノジアチアゾール、及びカテコール、並びにEDTA及び1,10-フェナントロリンのような二価カチオンのキレーターを含む、数多くのクラスが包含される。競合的インヒビターにはまたプロテアーゼドメインが欠失又は点変異誘発によって破壊されているドミナントネガティブ型Kuz変異体が含まれる。そのようなKuz変異体は当該分野で公知であり、新規なドミナントネガティブ型変異体はプロテアーゼドメイン内での残基の標的変異誘発の後に常套的な活性スクリーニングを行うことによって直ぐに作製される。米国特許第5935792号参照。例示的なドミナントネガティブ型ヒトkuz変異体を表1に示す。
【0014】
”番号付けは米国特許第5935792号のヒトKuz(配列番号:4)に記載されたアミノ酸残基を示す。対応する変異は、配列アラインメントによって米国特許第5922546号及びPCT公報WO97/31931に開示されているように、他のヒトKuzタンパク質において同定できる。
【0015】
好適な実施態様では、ドミナントネガティブ型Kuz変異体は可溶性であり、つまり膜貫通ドメインを欠いているが一又は複数の細胞外ドメインを含んでいる。好ましくは、可溶性ドミナントネガティブ型変異体はまたシグナルペプチドとプロドメインを欠き、システインリッチドメイン、ディスインテグリンドメイン及び/又はメタロプロテアーゼドメインを含む。他の好適な実施態様では、可溶性ドミナントネガティブ型変異体は精製、欠失又は可溶化を容易にするか、あるいはある種の他の機能を付与するように選択される非関連ポリペプチドに融合される。融合タンパク質は一般に可溶性Kuz変異体をコードするヌクレオチド配列が、選択された非関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に読み枠を一致させて結合したハイブリッド遺伝子を発現することによって産生される。好適な非関連タンパク質は免疫グロブリンの定常(Fc)領域(例えばヒトIgGのFc領域)であり、これは、得られた融合タンパク質を、生物療法に使用する場合により安定でより長い半減期を持つものとできる。
【0016】
幾つかの開示された用途は、病原性体節発生、神経発生又は特に血管形成であることがきまった脊椎動物、特にマウス、ラット又はヒトを含む。他の実施態様では、本方法は動物の病原性血管形成、体節発生又は神経発生を特異的に検出することに関する。病原性血管形成は例えば望ましくない過剰又は欠乏した血管形成を全身的又は局部的に呈するあらゆる症状を包含し;例示的な元となる状態には、癌、糖尿病性網膜症、リウマチ様関節炎、黄斑変性症、乾癬、及び過剰又は不十分又は調節を誤った血管形成が役割を担っているその他の病理状態が含まれる。例えば、我々のKuz欠損マウスは、Mash-1とニューロゲニン(neurogenin)を含む幾つかの神経の特定遺伝子のアップレギュレーションを呈し、神経前駆体が過剰であることを示している。これらのマウスはまた体節におけるDll1発現の喪失と体節の深刻な表現型破壊によって明らかにされる体節発生不良を呈している。また、マウスは病原性血管形成を呈しており、胚性卵黄嚢中の卵黄の血管が発生していない。病原性体節発生、神経発生又は血管形成は、組織検査、関連しているマーカー遺伝子の発現等々のような常套的な方法によって直ぐに検出される。また、以下において実証するように、内皮細胞ベースの血管形成アッセイのような数多くのインビトロモデル系が知られている。多くの場合、検出は、病原性血管形成に関連する腫瘍のような状態を検出することにより推論して実施される。血管形成は、特に、インビトロ細胞ベースアッセイ、例えばhuvecアッセイ及びインビトロ指標、例えば血流パラメータ、微小血管密度、血管内皮成長因子レベル(例えばLee等 Obstet Gyneco 2000 Oct;96(4):615-21を参照)、成長因子レセプター(例えばShin等 2000 J Cancer Rec Clin Oncol 126, 519-28)等々を含む、任意の常套的な手段によって検出される。これらのアッセイは、異種移植系、例えばRofstad等 2000 Cancer Res 60, 4932-8のようなモデル系で実施できる。
【0017】
Kuzが病原性体節発生、神経発生又は血管形成に関連する症状に対する有用な治療上のターゲットを提供するという本開示は、当業者に明らかな数多くの応用例−病原性体節発生、神経発生又は血管形成に関連する症状の治療ターゲットとしてKuzの使用を前提とした任意の応用例、を提供する。例えば、一実施態様では、本発明は、病原性血管形成であると必ずしもされていない脊椎動物においてKuzの活性を特異的に調節し、むしろ動物中に結果として生じた血管形成の調節を続いて検出する工程を含んでなる血管形成の調節方法を提供する。他の実施態様では、本発明はまた病原性血管形成であるとされた脊椎動物において、例えばKUZ特異的プロテアーゼアッセイ又はKUZ特異的免疫結合アッセイを使用して、Kuzの活性を特異的に検出する方法を提供する。他の実施態様では、本発明は所定のKuz活性を持つ脊椎動物において、例えば病原性血管形成に伴う腫瘍を検出することによって、病原性血管形成を特異的に検出する方法を提供する。
【0018】
本発明はまたKuz活性に関連していることが推測的に知られている血管形成の修飾因子を同定する方法を提供する。例示できるそのような方法は、(a)予め定まった量のKuzを含む血管形成アッセイ系を候補薬剤に、候補薬剤が存在しない場合に系が基準血管形成を付与する条件下で、接触させ、(b)系の薬剤バイアス血管形成を検出する工程を含み、薬剤バイアス血管形成と基準血管形成の差異により、薬剤による系の血管形成の調節が示される。このようなスクリーニング方法は、以下に記載するように、インビトロの細胞ベースアッセイ又はインビボの動物ベースアッセイで実施されうる。
【0019】
更なる説明を行わなくとも、当業者であれば、これまでの説明と次の例証のための実施例を用いて、本発明の化合物を製造し使用し、本発明の方法を実施することができるであろう。従って、次の実施例は本発明の好適な実施態様を特に指摘するもので、残りの開示を如何なる形であっても限定するものとみなしてはならない。上記の発明は理解を容易にするための実施例と例証によりある程度の詳細さで説明したが、特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない限りそれに所定の変形と変更を加えても良いことは本発明の教唆から当業者には明らかであろう。この明細書中に引用した全ての刊行物及び特許出願を、あたかも各個々の刊行物又は特許出願が出典明示によりここに取り込まれる旨が示されているかのように、出典明示によりここに取り込む。
【0020】
(実施例)
1.血管内皮成長因子、インターロイキン8、血小板由来内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞成長因子及びKuzはヒトのメラノーマ異種移植片における血管形成と転移を促進する。
この実験は、メラノーマの血管形成と転移が、Kuzを含む幾つかの既知の血管形成因子のインヒビターによって阻害されることを実証する。実験の詳細はRofstad等 2000 Cancer Res 60, 4932-8のものを適応させた。簡単に述べると、BALB/c nu/nuマウスに移植したヒトメラノーマ株(A-07、D-12、R-18及びU-25)からの細胞が腫瘍モデルとして用いられる。血管形成因子の発現はエライザ、ウェスタンブロット法及び免疫組織化学法により検査される。血管形成は皮内血管形成アッセイを使用して評価される。肺のコロニー形成及び突発性肺転移は、腫瘍細胞の静脈内及び皮内注射後にそれぞれ判定される。腫瘍血管形成、肺コロニー形成、及び突発性転移におけるVEGF、IL-8、PD-ECGF、bFGF及びKuzの特異的な役割は、中和抗体又はドミナントネガティブ型変異体で処置したマウスで評価される。メラノーマ株は複数の血管形成因子を発現し、各々の株が独特の発現パターンを示す。複数の血管形成因子は殆どの血管形成メラノーマ株において血管形成を促進する。腫瘍増殖、肺コロニー形成及び突発性転移は血管形成の速度によって制御され、よって血管形成を促進する血管形成因子によって制御される。肺コロニー形成と突発性転移は中和抗体又はドミナントネガティブ型変異体での処置によって阻害される。結果は、主題の血管形成因子のそれぞれがヒトメラノーマ異種移植片において血管形成と転移を促進することができ、それぞれが治療介入のための有効なターゲットであることを実証する。
【0021】
方法:成体(8−10週齢)の雌のBALB/c nu/nuマウスを用いて腫瘍血管形成、肺コロニー形成及び突発性転移を評価する。
4種のヒトメラノーマ細胞株(A-07、D-12、R-18及びU-25、Rofstad, Br. J. Cancer, 70: 804-812, 1994)を、13%の仔ウシ血清、250mg/lのペニシリン、50mg/lのストレプトマイシンを補填したRPMI1640(25mMのHEPES及びL-グルタミン)中で単層培養物として維持する。培養物を空気中5%のCO2の加湿雰囲気中で37℃にてインキュベーションし、一週間に2回、継代培養する。細胞株にマイコプラズマ汚染がないことが証明された。
【0022】
腫瘍血管形成は内皮血管形成アッセイ(Danielsen, T等, Int. J. Cancer, 76:836-841, 1998)を使用して評価される。100-μlのハミルトンシリンジを用いてマウスの脇腹に10μlの細胞懸濁液の一定分量を接種する。接種点は真皮の深層部分のS.C.筋肉組織上である。接種当たりの細胞数は1.0x106である。接種後7日でマウスを殺し−小さい血管が新生した腫瘍がそのときまでに接種部位に発生する。接種部位の回りの皮膚を取り除き、腫瘍を解剖顕微鏡に配する。腫瘍の方を向いた真皮中の毛細血管をカウントし、目盛付きの接眼レンズを使用して腫瘍の直径を測定する。毛細血管の数を、10μlのHBSSの注射の後に決定したバックグラウンドに対して補正する。血管形成を、腫瘍当たりの毛細血管の数又は腫瘍の外周1mm当たりの毛細血管の数として定量する。
【0023】
インビボでの中和抗体での処置。
腫瘍血管形成、肺コロニー形成、及び突発性転移におけるVEGF、IL-8、PC-ECGF、bFGF及びKuzの特異的な役割は、これらの血管形成因子に対する中和抗体で宿主マウスを処置することによって調べられる。処置に使用される抗体は抗ヒトVEGFマウスモノクローナル抗体、抗ヒトIL-8マウスモノクローナル抗体、抗ヒトPD-ECGFヤギポリクローナル抗体、抗ヒトbFGFヤギポリクローナル抗体及び抗ヒトKuz抗体である。抗体溶液をPBSで希釈し、腹腔内注射によって0.25mlの容量をマウスに投与する。血管形成と肺コロニー形成実験では、処置は、24時間の間隔で与えられる抗体25μg(VEGF及びbFGF)又は100μg(IL-8及びPD-ECGF)の4回の投与からなる。最初の投与量は腫瘍細胞の接種の1時間前に与えられる。
【0024】
インビトロでの中和抗体での処置。
上述の中和抗体の可能な細胞障害性又は抗増殖性効果がインビトロで調べられる。A-07、D-12、R-18又はU-25細胞を、5μg/mlの抗体の存在下又は非存在下で8日間、13%の仔ウシ血清、250mg/lのペニシリン、50mg/lのストレプトマイシンを補填したRPMI1640(25mMのHEPES及びL-グルタミン)中で培養する。培養物中の細胞の数を、培養開始から2、4、6又は8日後に、血球計数器で細胞をカウントすることによって決定する。
【0025】
2.Kuzインヒビターによる血管形成の阻害
この実施例では、IC-3、GM6001、GW9471、BB-94、TIMP-1及び2を含むKuzインヒビターが幾つかのモデル系で血管形成を阻害することが示される。Kuzとその活性の存在はエライザとKuz特異的プロテアーゼ活性によって血管形成の測定前又は後にアッセイされる。我々の結果は、Kuzインヒビターがマトリゲル上に蒔いたラット微小血管内皮細胞によって形成される管形成を減少させ、30−70%でフィブリン上に蒔いたヒト微小血管内皮細胞によるbFGF(10ng/ml)+TNFα(2.5ng/ml)刺激微小血管形成を有意に低減させることを実証している。更に、インヒビター濃度は従属的にラット大動脈-リングアッセイでの突発的な微小血管形成とニワトリ絨毛尿膜アッセイでの血管発生を阻害した。
【0026】
Manolopoulos VG等 Gen Pharmacol 2000 Feb; 34(2):107-16の方法を適応させた。ラット副腎髄質からの微小血管内皮細胞(RAMECs)を単離し、増殖させ、特徴付けた(Manolopoulos等, 1997 Biochim Biophys Acta 1356, 321-332; Manolopoulos等, 1997 Am J. Physiol. 273, C214-C222)。細胞を空気中10%のCO2を補填したDMEM中で培養し、17−19継代で使用する。ヒト包皮微小血管内皮細胞(HMVECs)を、過去に記載されたようにして(Koolwijk等 1996. J. Cell Biol. 132, 1177-1188.)、単離し増殖させる。細胞を、5%のCO2の空気中37℃で、20mMのHEPES(pH7.3)、10%のヒト血清、10%の新生仔ウシ血清(NBCS)、150μg/mlのECGF、5IU/mlのヘパリン、2mMのL-グルタミン及び抗生物質を補填したM199中でゼラチン被覆皿にて培養し、10又は11継代で使用する。両方の細胞型はCa2+/Mg2+を含まない溶液中の0.5g/lトリプシン-EDTAに簡単に暴露することによって継代される。
【0027】
マトリゲルアッセイはKubota Y等, 1988. J. Cell Biol. 107, 1589-1598に従って実施される。15.8mg/mlで基底膜成分を含む腫瘍抽出物であるマトリゲルを1cm2ウェル(120μl/ウェル)に塗布し、37℃で1時間、固化させる。続いて、各ウェルに50000RAMECsを蒔き、実験の薬物を含む完全DMEMと共に37℃で8時間インキュベートする。選んだインキュベーション時間(8時間)は予備実験では我々の実験条件下で最適な管形成のために最低限必要であることが見出されている。各ウェルに形成された管構造の全長を、OPTIMAS画像解析ソフトウェアを備えたコンピュータに接続したビデオカメラが装備された顕微鏡(東京、日本)を用いて、ウェル表面全体をカバーする6倍の顕微鏡視野(2.5x倍率)で測定する。
【0028】
フィブリンゲルアッセイは上掲のKoolwijk等によって記載されたようにして実施される。簡単に述べると、ヒトフィブリンマトリックスを、指示薬なしのM199培地1ミリリットル当たり2.5Uの第XIII因子、2mgのヒトフィブリノーゲン、2mgのクエン酸ナトリウム、0.8mgのNaCl、及び3μgのプラスミノーゲンの混合物に0.1U/mlのトロンビンを加えることによって調製する。全体で300mlのこの混合物を1cm2ウェルに加える。室温での凝固後、フィブリンマトリックスに、10%ヒト血清、10%NBCS及び抗生物質を補填した0.5mlのM199を含ませる。内皮細胞を高密度で蒔いてコンフルエントな単層を取得し、20mMのHEPES(pH7.3)、10%ヒト血清、10%NBCS、2mMのL-グルタミン、抗生物質、10ng/mlのbFGF、及び2.5ng/mlのTNFαを補填した指示薬なしのM199培地で培養する。新鮮培地と試験化合物を2から3日毎に加えて、インキュベーションを10日の間続ける。三次元フィブリンマトリックス中の内皮細胞によって形成された管構造を、位相差顕微鏡によって観察し、各ウェル中のその全長を、OPTIMAS画像解析ソフトウェアを備えたコンピュータに接続したモノクロCCDカメラ(MX5)が装備されたオリンパス顕微鏡を用いて、ウェル表面全体をカバーする6倍の顕微鏡視野で測定する。
【0029】
血管形成のラット大動脈-リングアッセイは、Liekens等, 1997 Oncol. Res. 9, 173-181によって記載されたようにして実施される。簡単に述べると、滅菌した1.5%のアガロース溶液を培養皿に注ぎゲル化させる。アガロースゲルにそれぞれ10及び17mmの直径の2つの同心円を打ち抜くことによってアガロースリングが得られる。そのリングを6ウェルのプレートに移し、各ウェルに3つのリングを配する。胸大動脈を、成体の雄ウィスターラットから取得して、脂肪及び結合組織を除去し、0.5mmのリングに切断する。各大動脈リングを、底部が既に150μlの凝固フィブリノーゲンで被覆されたアガロースウェルの中心に位置させた後、アガロースウェルに凝固フィブリノーゲンを完全に満たす。使用されるフィブリノーゲン溶液は、3mg/mlの濃度になるように無血清培地中に部分的に精製したウシフィブリノーゲンを溶解することにより得られる。フィブリンゲルは室温で30秒で形成される。フィブリンのゲル化後に、各ウェルに、20%FCS、10mMのHEPES、1mMのグルタミン、及び抗生物質を補填したM199培地を満たし、試験化合物を添加する。培養物を毎日調べて倒立顕微鏡で記録する。微小血管網目構造の三次元の複雑さのため、200を越える微小血管の形成がよくあり;よって形成される微小血管は二人の独立した観察者によって0(血管なし)から10(最大の血管数)までのスケールで記録される。
【0030】
絨毛尿膜血管発生アッセイは上掲のLiekens等によって記載されたようにして実施される。簡単に述べると、新鮮な受精卵が、CAMにさらす開口が卵殻に開けられる前に37℃(湿度55−60%)で4日間、インキュベートされる。セロファンテープで開口を塞ぎ、卵をインキュベータに戻す。9日目に、試験化合物が滅菌状態で乾燥させられて上に配されているプラスチック円板(直径10mm)をCAMの選択領域に適用し、各CAMに一つの円板とされる。また、(PBS又はDMSOを含む)コントロール円板を、試験化合物を含む円板から1cm離して各CAMに配する。酢酸コルチゾンの滅菌溶液(100μg/円板)を全ての円板に含めて炎症反応を防止する。その後、開口を覆い、卵を37℃で48時間インキュベートする。卵に多量の10%緩衝ホルマリンをかけることによりインキュベーションを終了させ、プラスチック円板を取り除く。
【0031】
卵を少なくとも4時間室温で維持した後、円板の回りの大きな領域を切断し、ガラススライドに配する。円板の下の血管密度指数(血管数として表される)を測定する(Harris-Hooker等, 1983. J. Cell Physiol. 114, 302-310)。簡単に述べると、膜を10%緩衝ホルマリンに固定し、切り取り、ガラススライド上に平坦にして載せる。血管密度を、円板があったスポットをグリッドで覆うことによって決定する。グリッドは対象領域を覆う3つの同心円(1mm離間)を含む。円に交差する血管をカウントする。この方法により、最近形成された小さい微小血管を考慮に入れながら、微小血管の形成を客観的に評価することが可能になる。円板打ち込みまでの全体のニワトリ胎仔の生存は90%を越える。コントロール円板には化合物を含む円板と同じ容量のDMSOが含められる。
【0032】
3.Kuzはインビトロでの血管構造の形成を促進する。
Kureishi Y等 Nat Med 2000 Sep;6(9):1004-10に記載されたようにして、HUVECによる血管様構造の形成が、基底膜マトリックス調製物である成長因子を低減したマトリゲル(Becton Dickinson, Bedford, MA)で評価される。2ウェルチャンバーのスライドをEBM中4−5x104細胞/ウェルで被覆プレートに蒔き、37℃で60分間、インキュベートする。培地に薬剤(ヒトKuzのメタロプロテアーゼドメイン、Kuzインヒビター、Kuz抗体、VEGF等々)を補填し、37℃で8−12時間、インキュベートする。管形成画像を倒立位相差顕微鏡(Nikon Diaphot)を使用して観察する。像をビデオグラフィックシステム(DEI-750CEデジタルアウトプットカメラ, Optronics, Goleta, CA)にとる。管形成の度合いを、国立保健研究所(NIH)イメージプログラムを使用して各ウェルからランダムな視野で管の長さを測定することにより定量する。VEGF同様、Kuz処置は毛細血管様管の形成を促進し、それはKuzインヒビター及び抗体によって阻害される。
【0033】
4.Kuzは正常コレステロール動物の血管形成:肢血管再生を促進する。
ここでは、我々は、虚血性組織の生理的血管再生をKuzが促進しKuzインヒビターが低減することができることを示す。Kureishi Y等 Nat Med 2000 Sep;6(9):1004-10のものを適応させたプロトコールにおいて、正常コレステロールのウサギからその大腿動脈とその主な枝を一方向から切除し、後肢血流に顕著な減少を生じさせる(Pu等 J. Surg. Res. 54,575-583, 1993)。最初は、我々は虚血性後肢の内皮細胞へのアデノウイルス媒介遺伝子導入を使用して、Kuzがこのモデルで血管再生を促進することを初めて証明する。B-ガラクトシダーゼ(Bgal)を発現するアデノウイルスコンストラクトをこれらの肢に注入すると、導入遺伝子の発現が血管内皮に限定されることが明らかになった。このモデルにおけるアデノ-Kuzコンストラクトの注入は側副血管形成を亢進し、腓腹血圧比の増加によって示されるように組織血流を改善する。これに対して、アデノ-Bgalの注入は未処置の虚血性後肢(コントロール)又は生理食塩水を注入した血管に対して、血管形成又は組織血流を促進しなかった。
【0034】
肢血管再生に対するKuz及びKuzインヒビターの効果を試験するために、Kuzとインヒビターの投薬を、大腿動脈切除後に毎日(例えば腹腔内注射により0.1mg/kgIC-3)行う。Kuz処置を受ける動物は、大腿動脈切除後40日で未処置のコントロール群よりも、より検出可能な、特徴的な螺旋状の形態を持つ側副血管を示す。これに対して、Kuzインヒビター処置を受けた動物は、大腿動脈切除後40日で未処置のコントロール群ほど、検出しにくい特徴的な螺旋状の形態を持つ側副血管を示す。
【0035】
同様に、Kuz処置された動物の肢は虚血性肢の収縮期圧の正常な肢のものに対する比によって決まる減少した血行力学的欠陥を示す。Kuzの投与はまた虚血性肢において毛細血管形成を促進する(Kuz>250毛細血管/mm2;コントロール<170毛細血管/mm2内転筋;P<0.01)。比較のために、幾らかの動物は虚血性肢の大腿中へVEGFをコードするアデノウイルス(アデノ-VEGF)の筋肉内注射を受ける。Kuz同様、VEGFでの処置は側副血管及び毛細血管の形成を亢進し腓腹血圧を増加させた。Kuzインヒビターの同時投与はこれらの効果を逆にすることが示されている。
【0036】
方法:3.0−3.5kgの体重で正常な食餌が与えられた雄のニュージーランドホワイトラビットを用いて、血管成長のKuz及びKuzインヒビター媒介調節の効果を調べる。注入モデルに対しては、左大腿動脈と主要な側枝をその基点から伏在及び膝窩動脈への二股分岐部の2cm以内のところまで切除する。10日後に、術後の回復を可能にするために、末梢の大腿動脈を再暴露し、大腿静脈を一時的にクランプした後、50mlの生理食塩水、Ad-Bgalの3.5x1010ウイルス粒子を有する生理食塩水、又はAd-Kuz(ヒトKuzのメタロプロテアーゼドメインを発現)の3.5x1010ウイルス粒子を有する生理食塩水を末梢の大腿動脈に注入し、15分インキュベートする。クランプの除去後、末梢の大腿動脈を連結する。Ad-Bgalを注入した2匹の動物を、手術の3日後に殺し、腓腹筋中でのB-ガラクトシダーゼの発現を判定する。残りの動物(n=6)について大腿動脈切除後31日目に肢血管再生を分析する。Ad-VEGFの筋肉内注射又はKuzインヒビターの腹腔内注射には、左大腿動脈と側枝をその基部から二股分岐が生じる遠くの点まで完全に切除する。10日後に、術後の回復を可能にするために、2.5mlの生理食塩水中全体で3.5x1010のAd-VEGFのウイルス粒子を、内転筋(2部位)、内側大(2部位)及び半膜性(1部位)筋(注射部位当たり500ul)に3から5mmの深さで27ゲージ針によって注射する。あるいは、インヒビター(IC-3、0.1mg/kg/日)又は生理食塩水を手術の後の日から犠牲にする1日前まで腹腔内投与(1ml)する。これらの群(n=6)の動物について手術から40日後に肢血管再生を分析する。如何なる処置計画の場合にも、死亡、浮腫又は血管腫の形成を含む如何なる有害事象もなかった。腓腹血圧をドップラー流量計(モデル1059, Parks Medical Electronics, Aloha, OR)によって両方の肢について測定する。腓腹血圧は右腓腹収縮期圧に対する左腓腹の比として定義される。側副動脈は内腸骨血管造影によって評価される。3-F注入カテーテル(Tracker-18, Target Therapeutic, San Jose, CA)を総頚動脈内に導入し、蛍光透視鏡の下で0.014インチのワイヤーを使用して虚血性肢の内腸骨動脈まで進める。ノニオン性の対照培地(Isovue-370, Squibb Diagnostics, New Brunswick, NJ)を1ml/秒の速度で注入し、虚血性肢の連続的画像を1フィルム/秒の速度で10秒間記録する。側副血管の定量血管造影分析は、4コマ血管造影図上に配した5mm離れて列に配置された2.5mm直径の円からなるグリッドオーバーレイを用いて結果を知らない研究者によって実施される。血管造影スコアは、可視できる動脈が交差する円の数を内側大腿における円の全数によって割ったものとして算定される。毛細血管密度は安楽死の時点で虚血性肢の内転筋から取り出された切片について光学顕微鏡を用いて結果を知らない研究者によって評価される。筋肉試料はOCT化合物(Miles, Elkhart, IN)に包埋され、液体窒素でスナップ凍結される。横断した形で配向した筋繊維を持つ凍結された切片(5um厚)を、インドキシル-テトラゾリウムを使用してアルカリホスファターゼに対して染色した後、0.5%エオシンで対比染色する。毛細血管密度は10のランダムに選択された視野から平均された毛細血管/mm2として算定される。
【0037】
5.Kuzはニワトリ絨毛尿膜アッセイにおいて血管形成を促進する。
Bellahcene A等 Circ Res 2000 Apr 28;86(8):885-91のものを適応させたプロトコールで、受精したローマン選択白色レグホーン卵を加湿インキュベータにて37℃でインキュベートする。発生の3日目に、矩形の開口を卵殻に開けた。8日目に、3.5mmの内径(高さ500mm、重さ7mg)の2つのシラスティックリングを、ニワトリ胎仔絨毛尿膜(CAM)表面に配する。Kuz(ヒト、メタロプロテアーゼドメイン、15mM)を滅菌PBSに溶解し5mlの一定分量でリング内に適用する。ビヒクル単独(PBS)及び血管形成の刺激剤である塩基性FGF(bFGF、0.5mM)をそれぞれ負のコントロール及び正のコントロールとして使用する。他の実験では、抗avb3抗体LM609(15mg)をリングに加えてKuzの存在下での血管発生に対するその効果を評価する。CAMを10日目まで毎日調べ、ライカDMLM顕微鏡(Van Hopplynus, Brussels, Belgium)でin ovoで写真にとった。各条件に対して最少8個の卵を処置し、実験を少なくとも2回行った。血管指数を、記載されたようにして(Barnhill等 J Invest Dermatol. 1983;81:485-488)リングを横断する全ての識別可能な血管をカウントすることにより決定し、コントロールPBSリングと比較した場合の異なった実験条件での血管数の相対的増加として表す。我々の結果は、Kuzがニワトリ絨毛尿膜アッセイで進行中の血管形成を刺激することを証明する。Kuzの血管形成活性はKuzインヒビター、ドミナントネガティブ型変異体及びKuz特異的抗体によって阻害された。
Claims (4)
- 病原性血管形成であるとされた脊椎動物において、インビトロでKuzの活性を特異的に検出する工程を含んでなる、病原性血管形成を確認するためのKuz活性の検出方法。
- 検出工程が、Kuz特異的プロテアーゼアッセイ又はKuz特異的免疫結合アッセイを使用することを含む、請求項1に記載の方法。
- Kuz活性を有する脊椎動物において、インビトロでKuzの活性を特異的に検出する工程を含んでなる、血管形成の検出方法。
- 検出工程が腫瘍を検出することを含む、請求項3に記載の方法。
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