JP4519156B2

JP4519156B2 - 電極触媒及びこれを用いた酵素電極、並びにヒドロゲナーゼの改変方法

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Publication number: JP4519156B2
Application number: JP2007157687A
Authority: JP
Inventors: 英孝錦織; 宏史西原; 基石尹
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Filing date: 2007-06-14
Publication date: 2010-08-04
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Description

本発明は、耐酸素性に優れた改変型ヒドロゲナーゼ及びこれを用いた酵素電極、並びに、ヒドロゲナーゼの改変方法に関する。

燃料電池は、電気的に接続された２つの電極に燃料と酸化剤を供給し、電気化学的に燃料の酸化を起こさせることで、化学エネルギーを直接電気エネルギーに変換する。火力発電とは異なり、燃料電池はカルノーサイクルの制約を受けないので、高いエネルギー変換効率を示す。中でも、電解質膜として固体高分子電解質膜を用いた固体高分子電解質型燃料電池は、小型化が容易であること、低い温度で作動すること、などの利点があることから、特に携帯用、移動体用電源として注目されている。

固体高分子電解質型燃料電池において、アノード（燃料極）では（１）式の反応が進行する。
Ｈ₂ → ２Ｈ⁺ ＋２ｅ^- ・・・（１）
（１）式で生じる電子は、外部回路を経由し、外部の負荷で仕事をした後、カソード（酸化剤極）に到達する。そして、（１）式で生じたプロトンは、水と水和した状態で、電気浸透により固体高分子電解質膜内をアノード側からカソード側に移動する。

一方、カソードでは（２）式の反応が進行する。
４Ｈ⁺ ＋Ｏ₂ ＋４ｅ^- → ２Ｈ₂Ｏ・・・（２）

上記（１）式、（２）式の反応を促進させる電極触媒としては、触媒能の高さから、通常、白金や白金合金が賞用されてきた。しかしながら、白金には、枯渇資源であること、それに伴い非常に高価であること等の問題がある。そこで、白金や白金合金に代わる新規電極触媒の研究が進められている。

このような新規電極触媒として、ヒドロゲナーゼ（水素酸化還元酵素）が注目されている。ヒドロゲナーゼは、生物由来の触媒であるため、培養により大量生産が可能である。また、その水素酸化活性能も白金と同等、さらにはそれ以上と言われており、しかも、常温でも高い反応性を示す。例えば、非特許文献１にも、ヒドロゲナーゼが白金触媒と同等の触媒活性を示すように制御可能である旨の記載がある。

ヒドロゲナーゼについての研究は従来からなされており、その触媒作用を利用する技術の提案もされている（非特許文献１、特許文献１〜４など）。ヒドロゲナーゼは、水素酸化還元触媒としての機能を持つ酵素で、多くの場合、（１）ヒドロゲナーゼの三次元構造の内部に位置し、水素酸化還元触媒としての機能を有する（水素酸化活性、水素発生活性を有する）活性サイトを含有する活性サブユニット（大サブユニット）と、（２）水素分子の酸化により生成する電子又は水素発生に必要な電子の活性サイト−ヒドロゲナーゼ外部間の伝達を担う電子伝達サイトを含有する電子伝達サブユニット（小サブユニット）と、からなるタンパク質である。

しかしながら、ヒドロゲナーゼは、不安定な酵素であり、酸素によってその触媒作用を阻害され、活性を失いやすいという問題がある。ゆえに、ヒドロゲナーゼの応用研究や活用を実現するためには、外的要因に対する安定性が高く、使用環境の制限が少ないヒドロゲナーゼを得ることが重要である。

安定性の高いヒドロゲナーゼを得るべく多くの研究開発が行われており、例えば、特許文献２には、アミノ酸配列を改変し、耐熱化及び耐酸素化した耐熱耐酸素性ヒドロゲナーゼタンパク質が記載されている。また、特許文献３には、好酸高温水素細菌や好酸中温水素細菌から得られる酸化的条件下で活性を支持するヒドロゲナーゼを保持する水素細菌及びこれから得られるヒドロゲナーゼが記載されている。

Solid state communications,vol.133,No.9,pp.589-591(2005) 特表２００５−５０１３８７号公報特開２０００−３５０５８５号公報特開平４−３６５４７４号公報特開２００２−２１４１９０号公報

本発明は、上記実情を鑑みて成し遂げられたものであり、酸素に対する耐性が高く、安定性に優れた改変型ヒドロゲナーゼを提供することを第一の目的とする。また、耐酸素性が高い改変型ヒドロゲナーゼを用い、長期間にわたって安定した電極特性を示す酵素電極を提供することを第二の目的とする。さらには、高い耐酸素性を有する改変型ヒドロゲナーゼを得るためのヒドロゲナーゼの改変方法を提供することを第三の目的とする。

本発明の電極触媒は、（１）水素酸化還元活性を有する活性サイトを含む活性サブユニットと、（２）上記活性サイトとヒドロゲナーゼの外部との電子の受け渡しをする電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットと、より構成される、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ）由来のヒドロゲナーゼから、前記電子伝達サブユニットの前記電子伝達サイトを除去してなる改変型ヒドロゲナーゼからなることを特徴とするものである。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、水素酸化又は水素発生に大きく関与する活性サイト並びに電子伝達サイトのうち、電子伝達サイトが酸化による機能的損傷を受けやすいという知見を得た。そして、酸化による機能的損傷を受けやすい電子伝達サイトを除去し、ヒドロゲナーゼを改変することで、耐酸素性に優れた改変型ヒドロゲナーゼが得られることを見出した。

電子伝達サイトを除去してなる改変型ヒドロゲナーゼの典型例としては、前記電子伝達サブユニット（２）を除去し、前記活性サブユニット（１）のみからなるものが挙げられる。

また、本発明の電極触媒は、（１）水素酸化還元活性を有する活性サイトを含む活性サブユニット、及び（２）上記活性サイトとヒドロゲナーゼの外部との電子の受け渡しをする電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットより構成される、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ）由来のヒドロゲナーゼを生成する菌から、該ヒドロゲナーゼを分離する際に、該ヒドロゲナーゼを酸素雰囲気に曝露する処理を行うことにより、前記電子伝達サブユニット（２）の前記電子伝達サイトを除去して得られる、改変型ヒドロゲナーゼからなることを特徴とする。

本発明では、電子伝達サイトの耐酸素性が低いことに着目し、ヒドロゲナーゼを酸素雰囲気下に曝露することによって、電子伝達サイトを脱離させた改変型ヒドロゲナーゼを得ることができる。具体的には、前記ヒドロゲナーゼ生成菌から、膜画分を分離し、（Ａ）該膜画分を酸素雰囲気に曝露した後、該膜画分から前記ヒドロゲナーゼを可溶化、或いは、（Ｂ）酸素雰囲気下において該膜画分から前記ヒドロゲナーゼを可溶化する処理を行うことにより得られるものが挙げられる。

本発明の電極触媒は、耐酸素性が高く、酸素が存在する環境においても、その水素酸化還元活性（水素酸化又は水素発生に対する触媒活性）が長期間にわたって安定しているため、本発明の電極触媒を備える酵素電極は、長期間にわたって安定した電極特性を発現することができる。

本発明のヒドロゲナーゼ改変方法は、（１）水素酸化還元活性を有する活性サイトを含む活性サブユニット及び（２）上記活性サイトとヒドロゲナーゼの外部との電子の受け渡しをする電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットより構成される、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ）由来のヒドロゲナーゼを生成する菌から、ヒドロゲナーゼを分離する工程、及び、該ヒドロゲナーゼを酸素雰囲気に曝露する工程を備え、前記ヒドロゲナーゼから電子伝達サブユニットの電子伝達サイトを除去することを特徴とするものである。

本発明のヒドロゲナーゼの改変方法は、電子伝達サイトの耐酸素性が低いことに着目し、酸素雰囲気にヒドロゲナーゼを曝露することによって、ヒドロゲナーゼから電子伝達サイトを脱離させ、アミノ酸変異等を施すことなく、容易にヒドロゲナーゼの酸素耐性を向上させることができる。

具体的には、前記ヒドロゲナーゼ生成菌から、膜画分を分離する工程と、（Ａ）該膜画分を酸素雰囲気に曝露する工程、及び該酸素曝露工程後、該膜画分から前記ヒドロゲナーゼを可溶化する工程とを備えるか、或いは、（Ｂ）酸素雰囲気下において該膜画分から前記ヒドロゲナーゼを可溶化する工程とを備え、前記ヒドロゲナーゼから電子伝達サブユニットの電子伝達サイトを除去する方法が挙げられる。

本発明の改変型ヒドロゲナーゼは、耐酸素性が高く、長期間にわたって安定した触媒活性を発現しうることから、耐久性に優れ、且つ、使用環境の制限が少ない酵素電極を提供することができる。また、本発明の改変型ヒドロゲナーゼは、非常に簡易的な方法により得ることが可能であり、生産性に優れている。

本発明の改変型ヒドロゲナーゼは、（１）水素酸化還元活性を有する活性サイトを含む活性サブユニットと、（２）上記活性サイトとヒドロゲナーゼの外部との電子の受け渡しをする電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットと、より構成されるヒドロゲナーゼから、前記電子伝達サブユニットの前記電子伝達サイトを除去してなることを特徴とするものである。

ヒドロゲナーゼの多くは、水素の酸化反応と水素の発生反応に対して触媒活性を有しており、水素酸化と水素発生に対して直接関連する活性サイトを含有する活性サブユニット（１）と、該活性サイトから水素の酸化反応に際して発生した電子をヒドロゲナーゼの外部へ伝達、若しくは、ヒドロゲナーゼの外部から該活性サイトへ水素の発生反応に必要な電子を伝達する電子伝達サイトを含有する電子伝達サブユニット（２）とから構成される。

既述したように、ヒドロゲナーゼは、水素酸化触媒又は水素発生触媒として優れた活性を有しているものの、その耐酸素性の低さから、酸素存在下での機能的安定性が低く、長期間にわたって安定した触媒活性を発現しにくいという問題があった。
そこで、本発明者らが鋭意検討したところ、ヒドロゲナーゼの水素酸化還元活性（水素酸化活性又は水素発生活性）に大きく関与する活性サイトを含む活性サブユニット、及び、電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットのうち、電子伝達サイトは特に酸素に対する耐性が低く、酸素による機能的損傷を受けやすいという知見を得た。

ヒドロゲナーゼ外部−ヒドロゲナーゼ活性サイト間の電子伝達を担う電子伝達サイトに、酸化等の外的要因により機能低下若しくは分解、脱離等が生じ、その電子伝達機能が失われると、活性サイトで生じた電子がヒドロゲナーゼ外部に伝達されなくなる、また、水素発生に必要な電子がヒドロゲナーゼの外部からヒドロゲナーゼの活性サイトに伝達されなくなる。

本発明では、インタクト型（活性サブユニットと電子伝達サブユニットからなる二量体型ヒドロゲナーゼ）のヒドロゲナーゼから電子伝達サイト、典型的には、電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットを人工的に除去することによって、ヒドロゲナーゼの耐酸素性を大幅に向上させることを実現した。

予め電子伝達サイトを除去することによって、酸素雰囲気下においても、酸化による電子伝達サイトの機能低下や分解、脱離等が生じないため、長期間にわたって酸素雰囲気に曝露した場合でも、安定した水素酸化活性や水素発生活性を発現することができる。本発明の改変型ヒドロゲナーゼのように電子伝達サイトが予め除去されている場合と異なり、その使用過程において酸素雰囲気にさらされ、電子伝達サイトの分解、脱離が生じる場合、機能低下、分解、脱離した電子伝達サイトが、活性サイトとヒドロゲナーゼの外部との電子伝達を阻害し、その結果、ヒドロゲナーゼの水素酸化能や水素発生能は、予め電子伝達サイトを除去しておいた改変型ヒドロゲナーゼよりも低いレベルまで低下すると推測される。但し、本発明の改変型ヒドロゲナーゼは、インタクト型のヒドロゲナーゼと比較して初期状態の触媒活性能が劣る場合もある。

本発明の改変型ヒドロゲナーゼは、典型的には電子伝達サブユニットを除去し、活性サブユニットのみからなるものであり、このように、活性サブユニットのみからなる改変型ヒドロゲナーゼは、活性サイトがヒドロゲナーゼの外部と直接電子伝達を行うことができると推測される。通常、インタクト型のヒドロゲナーゼにおいて、活性サイトは、ヒドロゲナーゼタンパク質の三次元構造の中心部近傍に位置しており、このような三次元構造の内部に位置する活性サイトとヒドロゲナーゼ外部間の電子伝達を電子伝達サイトが担っているが、電子伝達サブユニットを除去することによって、活性サイトが三次元構造表面から近くなるため、活性サイトとヒドロゲナーゼの外部とが直接、電子伝達を行えるようになる（図１参照）。

尚、本発明において、改変型ヒドロゲナーゼは、電子伝達サイトが除去されていれば、電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニット全体が除去されていなくてもよく、電子伝達サイト以外の電子伝達サブユニットの一部が除去されずに残っていてもよい。典型的にはヒドロゲナーゼが含有する全電子伝達サイト、特に電子伝達サブユニットごと、全電子伝達サイトが除去される。

本発明において、ヒドロゲナーゼ（インタクト型）としては、特に限定されず、その採取源等に特に制限はない。例えば、ヒドロゲナーゼの採取源として、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ）等のヒドロゲノビブリオ属に属する細菌；デスルフォビブリオ・バルガリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｖｕｌｇａｒｉｓ）やデスルフォビブリオ・ギガス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｇｉｇａｓ）等のデスルフォビブリオ属に属する細菌；クロストリジウム・パストリアナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）等のクロストリジウム属に属する細菌；等が挙げられる。

その他にも、例えば、ヒドロゲノファガ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ）属に属する細菌（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａｓｐ．）、ピロジクチウム・ブロッキー（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍｂｒｏｃｋｉｉ）由来のヒドロゲナーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ）由来のヒドロゲナーゼ、バチルス・シレーゲリー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）由来のヒドロゲナーゼ、クロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）由来のヒドロゲナーゼ等が挙げられる。

さらには、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）等のラルストニア属に属する細菌；チオカプサ・ロゼオペルシシーナ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）等のチオカプサ属に属する細菌；オリゴトロファ・カルボキシドボランス（Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ）；アキフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）；ヒドロゲノバクター・サーモフィラス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）等も挙げられる。

触媒活性の高さ及び安定性（熱安定性、酸素耐性）の観点から、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ（ヒドロゲノビブリオ・マリナス）由来のヒドロゲナーゼを好適に用いることができる。ヒドロゲノビブリオ・マリナスとしては、理化学研究所に寄託（申請書受理番号第７６８８号）されているヒドロゲノビブリオ・マリナスＭＨ−１１０が容易に入手できる。
ヒドロゲノビブリオ・マリナス由来のヒドロゲナーゼとしては、特開２０００−３５０５８５号公報の配列番号２のアミノ酸配列を有する小サブユニットと、配列番号４のアミノ酸配列を有する大サブユニットとからなるものを例示できる。
尚、ヒドロゲナーゼは、ヒドロゲナーゼ活性を有する限り、アミノ酸配列において数個（例えば１〜３個程度）のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていたり、或いは、工学的に任意に変異を加えられたものでもよい。

上記したような微生物由来のヒドロゲナーゼは、微生物を培養することで増殖させることができる。微生物の培養方法は、培養する微生物の種類に応じて決めればよい。例えば、ヒドロゲノビブリオ・マリナスは、水素、酸素及び二酸化炭素からなる気相下で、無機化合物によりなる組成の培地で、液体又は固体培養することができる。

ヒドロゲナーゼは活性サイトのタイプにより分類され、具体的には、例えば、活性サイトがＮｉ−Ｆｅを含有し、電子伝達サイトがＦｅ−Ｓクラスターを含有する、［Ｎｉ−Ｆｅ］型ヒドロゲナーゼが挙げられる。［Ｎｉ−Ｆｅ］型ヒドロゲナーゼは、Ｎｉ−Ｆｅを含有する大サブユニット（活性サブユニット）と、Ｆｅ−Ｓクラスターを３つ含んでなる小サブユニット（電子伝達サブユニット）からなるヘテロダイマーである。

本発明の改変型ヒドロゲナーゼは、電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットが特に耐酸素性が低いことを利用して得られる。つまり、インタクト型ヒドロゲナーゼをヒドロゲナーゼ生成菌から抽出し、単離精製する過程において、酸素雰囲気に曝露することによって、電子伝達サイトの酸化分解を引き起こし、電子伝達サイトの脱離を生じさせる。

ヒドロゲナーゼは、細胞質膜に結合している膜結合型のほか、ペリプラズム、細胞質に存在するものも知られている。膜結合型のヒドロゲナーゼの場合には、ヒドロゲナーゼ生成菌を破砕、遠心分離等することで得られる膜画分を可溶化する際に該膜画分を酸素雰囲気に曝露、若しくは、膜画分を酸素雰囲気に曝露した後、可溶化処理を行うことで、該膜画分に含有されるヒドロゲナーゼを酸素雰囲気に曝露し、酸化させることができる。その結果、ヒドロゲナーゼを構成する電子伝達サブユニット中の電子伝達サイトが、典型的には、電子伝達サブユニットごと、該ヒドロゲナーゼより除去される。酸素雰囲気の曝露条件は、用いるヒドロゲナーゼの種類等により異なるので、活性サイトの触媒活性を維持できる範囲内で、適宜設定することができる。

ヒドロゲナーゼを生成菌から抽出、単離精製する方法は、特に限定されず、一般的な方法を採用することができる。例えば、ヒドロゲナーゼが菌体の内部に生産される場合には、まず菌体を適当な緩衝液に懸濁し、機械的破壊法、例えば、超音波破壊、フレンチプレス、ガラスビーズを用いるホモジナイザー、凍結融解法、凍結破砕法などにより、菌体を破砕した破砕液を得る。そして、得られた破砕液から遠心分離等により菌体を除去し、膜画分を調製する。膜画分には、界面活性剤を加えて膜タンパクの可溶化処理を行う。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトクラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。

一方、ヒドロゲナーゼが菌体の外部に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。そして、上記したようなイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、ヒドロゲナーゼを単離精製することができる。

カラムクロマトグラフィーによる単離精製工程の前には、必要に応じて、硫酸アンモニウム等による塩析沈殿、有機溶媒による分別沈殿、ｐＨ処理による変性沈殿や等電点沈殿、等の方法により、ヒドロゲナーゼの分離、精製工程を設け、純度を上げておいてもよい。
尚、ヒドロゲナーゼは、ヒドロゲナーゼを持つ微生物の染色体ＤＮＡからヒドロゲナーゼ遺伝子を単離し、当該遺伝子を含有する組み換えベクターを含む形質転換体を培養し、得られる培養物から採取してもよい。

既述したように、本発明の改変型ヒドロゲナーゼは、耐酸素性が高く、酸素雰囲気下において、安定した触媒活性を示す。このような安定した触媒活性を示す改変型ヒドロゲナーゼは、様々な分野において利用可能であり、例えば、改変型ヒドロゲナーゼを電極触媒として用いる酵素電極が挙げられる。酵素電極の用途として、具体的には、例えば、上記したように、アノード（燃料極）で水素酸化（Ｈ₂ → ２Ｈ⁺ ＋２ｅ^-）、カソード（酸化剤極）で酸素還元（４Ｈ⁺ ＋Ｏ₂ ＋４ｅ^- → ２Ｈ₂Ｏ）を起こさせることで発電する燃料電池の燃料極としても利用が可能である。その他にも、バイオセンサー等への利用も可能である。

改変型ヒドロゲナーゼを備える酵素電極の形態としては特に限定されず、電極触媒である改変型ヒドロゲナーゼを導電性基材上に固定して用いたり、又は、改変型ヒドロゲナーゼを電解液中に分散させて用いることができる。改変型ヒドロゲナーゼの固定方法は、特に限定されず、一般的な方法を採用することができる。
また、一般的にヒドロゲナーゼ等の酵素は、電極基板である導電性基材との電子伝達を効率よく行うことができないことが多いため、導電性基材と改変型ヒドロゲナーゼとの電子伝達を媒体する電子伝達メディエータを用いてもよい。電子伝達メディエータとしては、電子を運搬する働きを有する化合物、例えば、メチルビオローゲン、ベンジルビオローゲン等が挙げられる。

（実施例１）
＜改変型ヒドロゲナーゼの調製＞
ＨｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓＭＨ−１１０株に、菌体１ｇ（湿重量）あたり５ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加え、よく懸濁し、超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製、ＳＯＮＩＦＩＥＲ−４５０）を用いて、２０ｋＨｚの出力で２分間の破砕処理を３回行った。破砕液を４℃、８，０００×ｇで２０分間遠心分離した。次いで、遠心後の上清をさらに４℃、１２８，０００×ｇで１時間超遠心分離し、細胞膜（膜画分）を回収した。

得られた膜画分を再び５倍量の０．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で懸濁した後、超遠心分離することにより洗浄を行った。その後、洗浄された膜画分に菌体の１０倍量（湿重量）の０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加え、空気中において、４℃、約２０時間攪拌し、可溶化処理を行った。可溶化後の酵素液は加熱温度が５５℃に達してから１５分間加熱処理した後、氷上にて１時間以上冷却した。引き続き、２０，０００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎの高速遠心分離によって沈殿を除去し、上清を改変型ヒドロゲナーゼ（電子伝達サブユニット除去型）の可溶化液とした。

得られた改変型ヒドロゲナーゼの可溶化液に、０．７Ｍ硫酸アンモニウムを加え穏やかに攪拌し、上記と同様の方法で再び遠心した調製液をＰｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムに供した。精製用バッファーは２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．７Ｍ硫酸アンモニウム、１０％グリセロール、非イオン性界面活性剤である１μＭｎ−ヘキサデシル−１−β−Ｄ−マルトピラノサイドを使用し、硫酸アンモニウム濃度を低下させる濃度勾配により改変型ヒドロゲナーゼを分画した。

さらに、ベンジルビオローゲン（ＢＶ）還元活性を示す画分をＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅに供し、１−４００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）の濃度勾配により更に精製を行った。バッファーには１０％グリセロール、１μＭｎ−ヘキサデシル−１−β−Ｄ−マルトピラノサイドを添加したものを使用した。

溶出されたベンジルビオローゲン活性画分はＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５を用いて濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００のゲル濾過に供した。バッファーは１００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、１μＭｎ−ヘキサデシル−１−β−Ｄ−マルトピラノサイドを使用した。以上のようにして精製した改変型ヒドロゲナーゼは、バイアルびんに分注し、気相をアルゴンとして室温にて保存した。

＜改変型ヒドロゲナーゼの活性測定＞
６０℃の水素飽和させた５０ｍＭカリウムリン酸バッファー（ｐＨ７）において、１分間あたりに１μｍｏｌのベンジルビオローゲンを還元する酵素活性量を１ユニットとし、上記にて得られた改変型ヒドロゲナーゼの活性を測定した。
結果を図２（Ａ）に示す。

＜改変型ヒドロゲナーゼの電気泳動＞
上記の活性測定において、大気中で４１０時間、大気曝露させた改変型ヒドロゲナーゼについて、電気泳動を行った。まず、改変型ヒドロゲナーゼに等量の変性緩衝液（６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を加え混合し、沸騰水中で５分間熱変性させた。その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法［Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５（１９７０）］に従って行った。分離ゲル濃度は１０％で、泳動緩衝液は、２５ｍＭトリス、０．１９２Ｍグリシン、０．１％ＳＤＳを用いた。

結果を図２（Ｂ）に示す。尚、図２（Ｂ）において、Ｓｔは分子量マーカー（標準試料）、１は比較例１（インタクト型）、２は実施例１の電気泳動の結果である。

（比較例１）
＜インタクト型ヒドロゲナーゼの精製＞
ＨｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓＭＨ−１１０株に、菌体１ｇ（湿重量）あたり５ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加え、よく懸濁し、超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製、ＳＯＮＩＦＩＥＲ−４５０）を用いて、２０ｋＨｚの出力で２分間の破砕処理を３回行った。破砕液を４℃、８，０００×ｇで２０分間遠心分離した。次いで、遠心後の上清をさらに４℃、１２８，０００×ｇで１時間超遠心分離し、細胞膜（膜画分）を回収した。

得られた膜画分を再び２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁した。その膜画分に１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を１：１の割合で混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の終濃度を０．５％とした。アルゴン気相下にて４℃、１ｈ穏やかに攪拌することによってヒドロゲナーゼの可溶化を行った。その後、加熱処理によって熱に不安定なタンパク質を変性除去した。加熱処理はサンプルの温度が６０℃に達してから１５分間行い、その後、氷上にて１時間以上冷却した。

その後、２０，０００×ｇ、４℃、２０ｍｉｎの高速遠心分離によって沈殿を除去した上清をＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムに供した。精製用バッファーは２０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用し、ＮａＣｌの濃度勾配によりヒドロゲナーゼの溶出を行った。バッファーには１０％グリセロール、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した。
１７０ｍＭ程度のＮａＣｌ濃度で溶出された活性画分をＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅによるカラムクロマトグラフィーに供し、１−４００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）の濃度勾配により溶出を行った。バッファーには１０％グリセロール、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した。

４５−５５ｍＭのリン酸濃度で溶出されたヒドロゲナーゼ活性画分をＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５を用いて濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００のゲル濾過に供することで電気泳動上単一バンドにまで精製した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００のゲル濾過に用いたバッファーは、１００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用した。

以上のようにして得られた精製ヒドロゲナーゼはバイアルびんに分注し、気相をアルゴンとして室温にて保存した。
尚、本ヒドロゲナーゼはグリセロールを添加することによって酵素活性が安定化されたため、各精製段階で使用したバッファーには１０％グリセロールを添加した。また、バッファーはアルゴン置換により嫌気的にして使用した。

＜インタクト型ヒドロゲナーゼの活性測定＞
実施例１の改変型ヒドロゲナーゼと同様にして、インタクト型ヒドロゲナーゼの活性測定を行った。結果を図２（Ａ）に示す。

＜インタクト型ヒドロゲナーゼの電気泳動＞
実施例１の改変型ヒドロゲナーゼと同様にして、インタクト型ヒドロゲナーゼの電気泳動を行った。結果を図２（Ｂ）に示す。

（活性測定及び電気泳動の結果）
図２（Ｂ）により、比較例１のインタクト型ヒドロゲナーゼでは、分子量３２０００程度の小サブユニット（電子伝達サブユニット）に由来する濃いバンドが観察された。これに対して、実施例１の改変型ヒドロゲナーゼでは、小サブユニットに由来するバンドがほとんど観察されず、ほぼ完全に小サブユニットが除去されていることが確認された。
また、図２（Ａ）より比較例１のインタクト型ヒドロゲナーゼでは大気曝露によって急激な活性低下が観察された。耐酸素性の低い小サブユニットの電子伝達機能が失われて、外部にある電子受容体（ベンジルビオローゲン）との反応性が失われていったことがわかる。これに対して、本発明にかかる実施例１の改変型ヒドロゲナーゼは、予め、耐酸素性の低い小サブユニットが除去されているため、４１０時間の大気曝露後も活性中心からベンジルビオローゲンへの直接的な電子伝達反応が損なわれず、安定した活性を示した。

本発明にかかる改変型ヒドロゲナーゼ（Ａ）と従来のインタクト型ヒドロゲナーゼの概念図である。実施例における活性測定（Ａ）及び電気泳動（Ｂ）の結果を示す図である。

Claims

（１）水素酸化還元活性を有する活性サイトを含む活性サブユニットと、（２）上記活性サイトとヒドロゲナーゼの外部との電子の受け渡しをする電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットと、より構成される、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ）由来のヒドロゲナーゼから、
前記電子伝達サブユニット（２）の前記電子伝達サイトを除去してなる、改変型ヒドロゲナーゼからなることを特徴とする電極触媒。
前記電子伝達サブユニット（２）を除去してなる改変型ヒドロゲナーゼからなる、請求項１に記載の電極触媒。
（１）水素酸化還元活性を有する活性サイトを含む活性サブユニット、及び、（２）上記活性サイトとヒドロゲナーゼの外部との電子の受け渡しをする電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットより構成される、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ）由来のヒドロゲナーゼを生成する菌から、該ヒドロゲナーゼを分離する際に、該ヒドロゲナーゼを酸素雰囲気に曝露する処理を行うことにより、前記電子伝達サブユニット（２）の前記電子伝達サイトを除去して得られる、改変型ヒドロゲナーゼからなることを特徴とする電極触媒。
前記ヒドロゲナーゼ生成菌から、膜画分を分離し、（Ａ）該膜画分を酸素雰囲気に曝露した後、該膜画分から前記ヒドロゲナーゼを可溶化、或いは、（Ｂ）酸素雰囲気下において該膜画分から前記ヒドロゲナーゼを可溶化する処理を行うことにより得られる改変型ヒドロゲナーゼからなる、請求項３に記載の電極触媒。
請求項１乃至４のいずれかに記載の電極触媒を用いた酵素電極。
（１）水素酸化還元活性を有する活性サイトを含む活性サブユニット、及び、（２）上記活性サイトとヒドロゲナーゼの外部との電子の受け渡しをする電子伝達サイトを含む電子伝達サブユニットより構成される、ヒドロゲノビブリオ・マリナス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏｍａｒｉｎｕｓ）由来のヒドロゲナーゼを生成する菌から、ヒドロゲナーゼを分離する工程、並びに、該ヒドロゲナーゼを酸素雰囲気に曝露する工程を備え、
前記ヒドロゲナーゼから電子伝達サブユニット（２）の電子伝達サイトを除去する、ヒドロゲナーゼの改変方法。
前記ヒドロゲナーゼ生成菌から、膜画分を分離する工程と、（Ａ）該膜画分を酸素雰囲気に曝露する工程、及び、該酸素曝露工程後、該膜画分から前記ヒドロゲナーゼを可溶化する工程とを備えるか、或いは、（Ｂ）酸素雰囲気下において該膜画分から前記ヒドロゲナーゼを可溶化する工程とを備え、前記ヒドロゲナーゼから電子伝達サブユニットの電子伝達サイトを除去する、請求項６に記載のヒドロゲナーゼの改変方法。