JP4511090B2 - Ｄｎａプラスミドワクチン用アジュバンド及びその調製方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンド及びその調製方法に係り、その目的は、ＤＮＡワクチン単体の投与による免疫化に比べて、より強力なＣＴＬ反応を引き起こすことができ、経口投与によっても、パイエル板、粘膜固定層、脾臓に到達することができるパピロマウイルス偽ウイルス及びその調製方法を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
様々な感染性の病原体、例えば病原性ウイルスやバクテリアは、粘膜組織の表面に容易に感染することができる。特に、腸粘膜は病原体が感染しやすい場所である。多くの病原体は、粘膜組織の上皮細胞層における相互作用により感染を引き起こし、その後全身に広がる。このような病原体による感染の進行を防ぐために、病原体に特異的な抗体や細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬｓという。）が粘膜の表面において誘導される。病原体は粘膜組織において自己複製を繰り返し行うから、感染の初期や病気の初期段階において病原体を一掃するために粘膜特異的なＣＴＬｓを誘導することは重要なことである。
【０００３】
腸粘膜のリンパ球細胞は、パイエル板のような器質化したリンパ組織、或いは粘膜固有層のような散在性のリンパ組織に存在する。パイエル板は、病原体が粘膜に感染した後に、免疫反応が誘導される場所と考えられている。通常、ワクチンの皮下接種のような全身性の免疫形成の場合、粘膜における免疫反応の誘導には十分な効果を示さない。それよりも、粘膜の免疫形成は、腸粘膜で免疫反応が生じることが必要とされる。
【０００４】
一方、ＤＮＡ（プラスミド）による免疫形成は、宿主の体液性或いは細胞性の免疫反応を誘導する。プラスミドＤＮＡワクチンにより暗号化された抗原が宿主で生産されるために、変性や修飾された弱毒ワクチンとは異なり、抗原はそれらの本来の形態を保持している。免疫形成された宿主において抗原が発現するので、宿主の免疫系や持続した免疫反応に対して遷延被爆される。
しかしながら、経口投与ではＤＮＡワクチンは腸関連のリンパ球組織に到達することはできない。この理由は、ＤＮＡワクチンは腸や胃で分解されてしまうからである。さらに、ＤＮＡワクチンを筋肉内に投与した場合、殆どの細胞ではＣＴＬｓを生成することができず、ＣＴＬｓを生成した細胞でも、その量は極めて少量である。
【０００５】
一方、パピロマウイルス（以下、単にＰＶという。）は、エンベロープを有さない小型（５０〜６０ｎｍ）の正２０面体二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＰＶの感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル、ヘビ、ウシを含む様々な動物で発生している。ＰＶは上皮細胞に感染し、一般的に感染部位に良性上皮腫瘍又は良性線維上皮腫瘍を誘発する。ＰＶは宿主特異性が高いウイルスであり、ヒトパピロマウイルス（以下、単にＨＰＶという。）はヒト以外の動物に感染することはない。また、組織特異性も極めて高く、一部を除いて、粘膜や皮膚などの上皮組織にのみ感染することができる。
【０００６】
ＨＰＶは、ＤＮＡ配列の相同性に基づき９５を超えるタイプに分類されている（Van Ranst.1996.Human papillomaviruses:A never-ending story? in:Papillomavirus reviews: current research on papillomaviruses.Ed:C.Lacey,Leeds University Press,Leeds,1-19）。それぞれのタイプのＨＰＶは、異なる種類の病気の原因となることが知られている。例えば、ＨＰＶ１，２，３，４，７，１０，２６〜２９型は、正常のヒト及び免疫が低下したヒトの両方に良性イボを発症する。ＨＰＶ５，８，９，１２，１４，１５，１７，１９〜２５，３６，４６〜５０型は、免疫が低下したヒトに偏平性病変を発症する。ＨＰＶ６，１１，３４，３９，４１〜４４，５１〜５５型は、性器粘膜又は呼吸器粘膜の非悪性コンジローマを発症する。ＨＰＶ１６，１８，３１，３３，３５，４５，５８型は、生殖器粘膜の上皮形成異常を引き起こし、その場所での侵入性の子宮癌、膣癌、外陰部癌、肛門癌の大部分に関係している。ＨＰＶ６，１１は、コンジローマ（性器いぼ）と喉頭乳頭腫を引き起こす。
【０００７】
ＰＶは、最大８個の初期遺伝子と２個の後期遺伝子とをコードする。ウイルスゲノムの読み取り枠（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７及びＬ１，Ｌ２（ここで、「Ｅ」は初期を、「Ｌ」は後期を表す）と称されている。
Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、分子量５５−６０ｋＤａを有する。Ｌ２タンパク質は少量のカプシドタンパク質であり、推測分子量５５−６０ｋＤａを有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定すると見掛けの分子量７５−１００ｋＤａを有する。
Ｌ１タンパク質は自己集合組立能を有するために、昆虫、酵母、バクテリア内で発現した場合、ウイルス様粒子（以下、ＶＬＰｓという。）を形成することが知られている。
またパピロマウイルスウイルス様粒子（以下、ＰＶＶＬＰｓという。）は全身性の免疫化のために使用された時、強い体液性と細胞性の免疫反応を引き起こすことが知られている。さらに、ＶＬＰｓはＰＶ偽ウイルスを形成する関連性のないプラスミドをパッケージにするために使用される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ＰＶＶＬＰｓに関する鋭意研究を行ったところ、ＰＶ偽ウイルスは、上記の従来のワクチンの欠点であった、ＤＮＡワクチンを筋肉内に投与した場合、殆どの細胞ではＣＴＬｓを生成することができず、ＣＴＬｓを生成した細胞でも、その量は極めて少量であること、また、経口投与では分解されてリンパ組織に到達することができないといった問題を解決することができることを、すなわち、ＰＶ偽ウイルスは粘膜免疫系に到達することができ、粘膜の免疫反応を誘導することができることを見出した。また、ＶＬＰｓに対するヘルパーＴ細胞反応は偽ウイルス中のプラスミドによって暗号化された抗体に対するＣＴＬ反応を同時に高めることができることを見出した。
さらに、経口投与により、ＰＶ偽ウイルスはパイエル板、粘膜固定層、脾臓に到達でき、全身性の免疫化によって、ＰＶ偽ウイルスはプラスミドＤＮＡワクチンによるものと比べて強力なＣＴＬ反応を誘導できることを見出した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
すなわち、請求項１に係る発明は、少なくとも、パピロマウイルスウイルス様粒子と該パピロマウイルスウイルス様粒子に包膜されたプラスミドとからなるパピロマウイルス偽ウイルスからなるＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンドであって、該パピロマウイルスウイルス様粒子がヒトパピロマウイルスウイルス１６Ｌ１生成物又はウシパピロマウイルス１Ｌ１生成物であることを特徴とするＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンドに関する。
請求項２に係る発明は、パピロマウイルスウイルス様粒子に包膜されたプラスミドがパピロマウイルス由来のものではない請求項１記載のＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンドに関する。
請求項３に係る発明は、パピロマウイルスウイルス様粒子が分解された後に再構築される際に、パピロマウイルスウイルス様粒子内にプラスミドが包膜されてなるパピロマウイルス偽ウイルスからなる請求項１記載のＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンドに関する。
請求項４に係る発明は、前記プラスミドに病原体の遺伝子が導入されており、病気の治療と予防に用いられる請求項１乃至３のいずれかに記載のパピロマウイルス偽ウイルスからなるＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンドに関する。
請求項５に係る発明は、前記プラスミドにＩＬ−２が導入されている請求項１乃至４のいずれかに記載のパピロマウイルス偽ウイルスからなるＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンドに関する。
請求項６に係る発明は、少なくとも、以下の工程（ａ）〜（ｃ）よりなるパピロマウイルス偽ウイルスからなるＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンドの調製方法に関する。
（ａ）パピロマウイルスウイルス様粒子を発現する細胞系において、ヒトパピロマウイルスウイルス１６Ｌ１生成物又はウシパピロマウイルス１Ｌ１生成物を発現する工程。
（ｂ）発現したパピロマウイルスウイルス様粒子がプラスミドを包膜することができる条件を提供して、プラスミドをパピロマウイルスウイルス様粒子中に包膜してパピロマウイルス偽ウイルスを生成する工程。
（ｃ）（ｂ）工程の生成物の中からパピロマウイルス偽ウイルスを分離する工程。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係るＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンド及びその調製方法について説明する。本発明で使用するＰＶ偽ウイルスは、ＰＶＶＬＰｓとこのＰＶＶＬＰｓに包膜されたプラスミドとから構成される。尚、本発明に係るＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンドはＰＶのＤＮＡは含まれていない。
ＰＶＶＬＰｓは、ＰＶウイルスのカプシドを構成するＬ１タンパク質から構成され、Ｌ１タンパク質とＬ２タンパク質の双方から構成されても構わない。
このようなＰＶＶＬＰｓの調製方法は特に限定されず、例えば、ＰＶＶＬＰｓを発現することができる大腸菌、酵母、植物細胞、ほ乳動物細胞を用いたタンパク質細胞発現系を利用して調製する方法を例示することができる。特に、バキュロウイルスをベクターとして夜蛾の幼虫由来株化細胞を使用した発現系を用いることが好ましい。この理由は、生物活性を保持した形で目的とするタンパク質を大量に発現することができるからである。
【００１１】
ＰＶＶＬＰｓとしては特に限定されないが、具体的には、ヒトパピロマウイルス又はウシパピロマウイルスを由来とするＰＶＶＬＰｓを例示することができる。具体的には、ヒトパピロマウイルス１６やウシパピロマウイルス１を由来とするＰＶＶＬＰｓを使用することが好ましい。より好ましくは、ヒトパピロマウイルス１６Ｌ１生成物又はウシパピロマウイルス１Ｌ１生成物から構成されることが好ましい。
ＰＶＶＬＰｓにはプラスミドが包膜されている。プラスミドをＰＶＶＬＰｓにより包膜する方法は特に限定されず、例えば、ＰＶＶＬＰｓを破壊した後に、プラスミドの存在下、ＰＶＶＬＰｓの自己集合作用によりＰＶＶＬＰｓを再構築する方法を例示することができる。
さらに具体的な調製方法について説明すると、まず、ＨＰＶ−ＶＬＰ又はＢＰＶ−ＶＬＰを、溶解緩衝液（２０ｍＭ ＥＧＴＡ、４０ｍＭ ＤＴＴ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に、体積比１：１となるように混合する。次に、１／１０体積比のプラスミド（０．５〜１．０μｇ／μＬ）を加える。停止緩衝液（２５ｍＭ ＣａＣｌ２、２０％（体積）ＤＭＳＯ）を加える。最後に、一晩、４℃でインキュベートする。ＢＰＶ１−ＶＬＰを使用して調製された偽ウイルスは、２００１年３月２３日に中華人民共和国のＣＧＭＣＣに寄託されている（ＣＧＭＣＣ ０５４６）。
【００１２】
以上説明した本発明で使用するＰＶ偽ウイルスの特徴の一つは、粘膜及び全身性のリンパ組織に到達することができることである。経口投与の場合、プラスミドそれ自身では、粘膜及び全身性のリンパ組織に到達することはできない。これは、プラスミドは胃や腸のような環境下では生き抜くことができないからである。ＰＶＶＬＰｓは、胃のような低いｐＨの環境下においても、または小腸のようなタンパク質分解が行われるような環境下においても生育することができる。
【００１３】
どの細胞が偽ウイルスを集めるのかは定かではないが、小腸に付随する上皮組織のＭ細胞が、偽ウイルスを集めるとともに、これをパイエル板に運ぶ重要な役割を有しているのではないかと考えられる。さらに、上皮細胞が偽ウイルスを集めると考えられる。なぜならば、後述する試験例において明らかにされるように、グリーンランタンタンパク質（ＧＬＰ）がエンコードされたＰＶ偽ウイルスを与えたマウスの小腸及び直腸の粘膜固定層におけるＧＬＰ発現を見いだしたからである。ＰＶＶＬＰｓは他の組織や種からの細胞と結合することが知られている。ＰＶ偽ウイルスは、粘膜固有層やパイエル板のマクロファージや樹状細胞と偽感染することができる。このことは、偽ウイルスは上皮層と交差することを示している。どのように、偽ウイルスが上皮細胞を通りぬけて、粘膜固有層やマクロファージに取り付くのかは現在のところ明らかではない。
また、後述する試験例に示されるように、偽ウイルスが主要組織抗体複合体（ＭＬＮ）や脾臓に到達することを見いだした。粘膜固有層の樹状細胞やマクロファージが偽ウイルスに取り付き、ＭＬＮや脾臓に直接移動することが可能である。しかしながら、偽ウイルスが脾臓やＭＬＮに直接到達する可能性を排除することはできなかった。
ＧＬＰがエンコードされたＰＶ偽ウイルスをマウスの鼻腔又は膣粘膜に投与したところ、ウサギの粘膜や女性生殖器の管においてＧＬＰが発現することが確認された。粘膜組織における偽ウイルスによる免疫化は、膣粘膜や気道においてＣＴＬ反応を生じさせることができる。事実、ＰＶＶＬＰｓによる鼻腔内の免疫化は粘膜の抗体反応を引き起こす。このことは、結果として、この場所における粘膜の細胞性の免疫反応が誘導されることを示している。
【００１４】
ＰＶ偽ウイルスの他の重要な特徴は、全身性の投与により、ＤＮＡワクチンよりも強力なＣＴＬ反応を誘導することができることである。これにより、ＰＶＶＬＰｓとプラスミドＤＮＡをともに皮下注射することで、ＤＮＡワクチン単体の投与による免疫化に比べて、より強力なＣＴＬ反応を引き起こすことができる。ＰＶＶＬＰｓはＣＴＬ反応を誘導するためのＤＮＡプラスミドのアジュバンドとして実際に作用することが確かめられた。ＤＮＡプラスミドをパッケージするために使用されたＶＬＰｓは、ＶＬＰ特異的Ｔ−ヘルパー細胞反応を誘導することができる。これは、このＴ−ヘルパー細胞はプラスミドによってエンコードされた抗体のための特異的なＣＴＬｓの発現を高めることができる。事実、ＶＬＰｓは強力なＴｈ１反応を誘導することができる。Ｔｈ１細胞がＣＴＬｓの増殖を増幅することによって、インターロイキン（ＩＬ）−２の産生に見込みがある。偽ウイルスの取り込みの後、偽ウイルスのＶＬＰｓによって抗原提示細胞が活性化される。それによって、ＣＤ８０やＣＤ８６のような、より多くの共刺激の分子を発現する。
実際に、ＰＶＶＬＰｓは、ヒトとマウスの樹状細胞に感染し活性化することが知られている。ＰＶＶＬＰｓにより活性化されたマウスの樹状細胞は、ＣＤ８０のような共刺激の分子のレベルを高める発現をすることができる。そして、ＩＬ−６やＴＮＦαのような炎症誘発性のサイトカインが産生される。これらの抗原提示細胞の活性化は、プラスミド（ＤＮＡワクチン）単体によって形質導入された樹状細胞と比較して、プラスミドによってエンコードされた抗体のための未処置の特異的ＣＴＬｓを活性化するための能力を高めることができる。
【００１５】
ＰＶ偽ウイルスの経口投与は、粘膜性及び全身性のＣＴＬ反応を誘導することができる。腸粘膜ＣＴＬｓは、パイエル板から単離された新鮮なリンパ球の中に見出すことができる。これは、パイエル板において多くの特異的なＣＴＬｓが発生していることを示している。さらに、偽ウイルスの経口投与は、粘膜性の偽ウイルスの感染からマウスを保護する。偽ウイルスの経口投与は、プロテクティブであることを指し示している。この保護は、ＢＰＶの偽ウイルスと交差反応し、それらの取り込みを防ぎ、それらの消去を促進した抗ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰｓ ＩｇＡのありそうもない結果である。なぜならば、これらは、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰｓ単独により免疫化されたマウスは、全く保護されていなかったからである。さらに、この保護は、Ｅ７特異的抗体反応からはできない。なぜならば、Ｅ７は細胞質のタンパク質であり、われわれが使用したこのＥ７ミュータントは、不安定なタンパク質であり、細胞内で分解されてしまう。このように、プロテクションは、明らかにＥ７タンパク質特異的ＣＴＬｓによって媒介されている。パイエル板におけるＧＬＰ発現のロスは、マウスにおける粘膜攻撃から１日後にのみ確認されている。これは、粘膜組織における直接の抗原特異的ＣＴＬイフェクター活性を示している。このデータは、粘膜のＣＴＬ反応が持続して誘発されることを示している。
【００１６】
ＰＶ偽ウイルスは全身性及び粘膜のリンパ組織に偽感染するから、ＰＶ偽ウイルスは遺伝子放出ベクターとして利用することができる。ＧＬＰがエンコードされたＰＶ偽ウイルスをマウスに与えてから、３週間までの期間、ＧＬＰの発現を確認することができる。このデータは、全身及び粘膜のリンパ組織に運ばれた遺伝子の発現が一過性であることを示している。このように、ＰＶ偽ウイルスは、短期間の粘膜系で必要とされる遺伝子を運ぶために使用することができる。例えば、Ｔｈ１型の粘膜の免疫反応を抑制する、クローン病の腸粘膜のためのＩＬ−１０遺伝子、または喘息のための上気道においてＴｈ２免疫反応を抑制するためのＩＬ−１２遺伝子、などの免疫調節性のサイトトキシン遺伝子を運ぶために使用することができる。
【００１７】
ＰＶ偽ウイルスは複製しないベクターである。他の生きたベクターと比較した有利な点は、これらはＰＶＶＬＰｓやプラスミドから構成され、病原性が復帰する危険性がない点である。たとえ、これらは、ホストゲノムへのＤＮＡの組み込みについて関係するといえども、今までにＤＮＡプラスミドに関係する新たな新生物については見いだされていない。Ｌ１タンパク質からなるＰＶＶＬＰｓはホストにおいて有害な効果は発見されていない。偽ウイルスに感染した細胞は、偽ウイルスに対するＣＴＬ反応を誘導することで、通常、特異的なＣＴＬによって除去される。たとえ、偽ウイルスはホストにおいて複製されないとしても、Ｔ細胞に対する抗原の暴露により誘発されたホストの抗原提示細胞において免疫原が発現する。
【００１８】
結果として、ＰＶ偽ウイルスは、ＤＮＡワクチンに比べてより強力なＣＴＬ反応を誘発することができる。プロテクティブな粘膜や全身性のＣＴＬ反応を誘発する。そして、ＰＶ偽ウイルスは、粘膜上皮細胞における病原体による感染を治療または防ぐための通常のワクチンとして使用することができる。
【００１９】
上記したプラスミドには様々な遺伝子を導入することができる。プラスミド中に導入される遺伝子の例としては、発現生成物、例えば遺伝子療法又は遺伝子免疫感作に有用なタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド（グリコシル化、リン酸化又はアミド化等により修飾される）をコードする遺伝子が挙げられる。それらの発現を制御する配列は、プロモーター（例えば、ＲＳＶ又はＣＭＶ）、エンハンサー、リーダーペプチド、終止およびポリアデニル化シグナル、スプライシングシグナル、ウイルスレプリコンおよび選択可能マーカーをコードする遺伝子を含む。
【００２０】
本発明で使用するＰＶ偽ウイルスは、各種の病気の治療に使用することができる。具体的には、遺伝性疾患の治療に、心臓血管性疾患から癌からエイズに及ぶ後天性疾患の治療に適用可能である。癌の例としては、黒色腫、腎細胞癌、卵巣癌、頸部癌、神経芽細胞腫、脳、頭部および頸部の癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、中皮腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫および皮膚癌が挙げられる。遺伝子療法を受けることが可能なその他の疾患の例としては、異常ヘモグロビン症、重度複合型免疫欠損、血友病、家族性高コレステロール血症、遺伝性気腫、嚢胞性線維腫、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ゴシェ病、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、α−１抗トリプシン欠損症、ファンコーニ貧血、ハンター症候群、慢性肉芽腫、慢性関節リウマチ、末梢血管性疾患、パーキンソン病、糖尿病、骨粗鬆症、慢性創傷、乾癬およびアトピー性皮膚炎が挙げられる。
【００２１】
本発明で使用する偽ウイルス粒子により保有される遺伝子の例は、ヘモグロビンの構成成分、アデノシンデアミナーゼ、血液凝固因子、受容体（例えば、ＬＤＬ受容体、ＡＣｈ受容体、ホルモン受容体）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、α−１抗トリプシン、イオンチャンネル（例えば、ＣＦＴＲ）、ジストロフィン、リソソーム酵素、インスリン、カルシトニン、ホルモン、成長因子、サイトカイン；成長ホルモン、エリスロポイエチン、上皮小体ホルモン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＩＧＦ、ＭＤＲ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロン、ｐ５３；抗体およびその断片、ＭＨＣ複合体の成分（例えば、ＨＬＡ−Ｂ７）およびマイナー組織適合性抗原；アンチセンスおよび三重らせん物質；腫瘍抑制遺伝子；ウイルス性抗原、細菌性抗原、寄生虫性抗原；結合組織タンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチンおよびフィブロネクチン）および外来タンパク質（例えば、リゾチームおよびＢＳＡ）をコードするものなどを例示することができるが、特に限定はされない。
【００２２】
さらに本発明で使用するＰＶ偽ウイルスは、非経口、経腸、経口又は局所的適用に適した医薬上許容可能な有機又は無機担体物質と混合して用いることができる。適切な医薬上許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、植物性油、合成脂肪ビヒクル等が挙げられる。非経口適用に関しては、特に適した処方物は、注射可能な滅菌溶液、好ましくは油性又は水性溶液、並びに懸濁液、乳濁液、あるいはインプラントである。
【００２３】
経腸的適用に関しては、特に適しているのは、錠剤、糖衣丸剤、液体、ドロップ、座薬又はカプセルである。甘味ビヒクルを用いる場合には、シロップ、エリキシル等が用いられる。局所適用に関しては、これらは、局所適用に適合性の担体を含み、好ましくは水より大きい動的粘度を有する非噴霧可能形態、粘性〜半固体又は固体形態として用いられる。適切な処方物としては、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤、膏薬、エーロゾル剤等が挙げられる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２５】
（１）細胞
ＲＭＡ細胞（マウスのＴ−リンパ腫細胞），ＲＭＡ−ｎｅｏ細胞，ＲＭＡ−Ｅ７細胞は、熱で不活性化した１０％−ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが追加されたＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）で維持された。
【００２６】
（２）プラスミド
プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。グリーンランタンタンパク質（ＧＬＰ）のための発現カセットは、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏのＮｏｔＩサイトにＧＬＰのｃＤＮＡの全長を導入することで調製した。融合タンパク質である、ＧＬＰが融合したリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）ｇｐ ３３主要組織抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＨ−２Ｄｂ制限的エピトープ（アミノ酸３３〜４１、ＫＡＶＹＮＦＡＴＣ）のための発現カセットは、テンプレートとしてｐＣＩ−GLPを、オリゴヌクレオチド５’プライマーとして「ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＴ」（配列番号１）を、オリゴヌクレオチド３’プライマーとして、（ＧＬＰとＬＣＭＶ ｇｐ ３３エピトープとの間に、下線部のリンカー配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３）を有する）「ＴＣＡＡＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＡＡＴＴＧＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴ」（配列番号２）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して調製された。増量混合物（５０μＬ）には、ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ（それぞれ２００μＭ）オリゴヌクレオチドプライマー（１μＭ）、テンプレートＤＮＡ（２５ｎｇ）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５μＭ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）が含まれている。反応混合液は９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間を３０サイクル、最後の１０分間は７２℃で維持された。増幅されたＤＮＡはゲル濾過されてＴ−イージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に結合された。それから、ＤＮＡはＥｃｏＲＩで分解されて、対応する酵素で分解されたｐＣＩ−ｎｅｏに結合された。ＨＰＶ１６Ｅ７オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、同じリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３）を用いたＰＣＲによりＧＬＰに融合された。そのフラグメントは、ｐＣＩ−ＧＬＰ−Ｅ７を形成するためにｐＣＩ−ｎｅｏに挿入された。Ｅ７ＯＲＦはｐＣＭＶに挿入された。
【００２７】
（３）バキュロウイルス組換え体の産生
Spodoptera fugiperda（Ｓｆ９）細胞は、１０％ＦＣＳと２ｍＭのグルタミンを補足したＴＮＭＦＨ培地（シグマ社）において２７℃で単層培養された。Ｓｆ９細胞に形質移入するための１０μｇのトランスファープラスミド（PVL1933 BPV-1 L1Δ or PVL1932 HPV-16 L1Δ）が、０．２μｇの直線化されたＢａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）とともに使用された。組換えウイルス体は、（Muller,M.,J.Zhou,T.D.Reed,C.Rittmuller,A.Burger,J.Gabelsberger,J.Braspenning,and L.Gissmann.1997. Chimeric papillomavirus-like particles. Virology 234:93-111）や（Paintsil,J.,M.Muller,M.Picken,L.Gissmann,and J.Zhou.1996.Carboxyl terminus of bovine papillomavirus type-1 L1 protein is not required for capsid formation. Virology 223:238-244）に述べられているような方法により生成された。
【００２８】
（４）ＰＶＶＬＰｓの生成
Ｓｆ９細胞は、１〜２×１０６個の細胞／ｍＬの濃度でスピナフラスコ中で１０％ＦＣＳと２ｍＭのグルタミンを補足したＴＮＭＦＨ培地で培養された。約２×１０８個の細胞は、１０ｍＬの培地に再懸濁されて、５分間１５００ｇでペレット化された。それから、室温で１時間１０ｍＬ、２〜５の感染効率でバキュロウイルス組換え体を加えた。１２５ｍＬの培地を加えた後に、細胞は５個の円形シャーレ（直径１５０ｍｍ）に蒔かれ、２７℃で３〜４日間培養された。細胞は回収されて、１０ｍＬの抽出緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＣａＣｌ２，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で懸濁されてペレット状にされた。この細胞はスピード３で１分間超音波処理され、抽出物は４℃で３０分間１０，０００ｒｐｍでペレット状にされた。このペレットは８ｍＬの抽出緩衝液で懸濁されて、スピード４．５で３０秒間再び超音波処理されて再び遠心分離された。上澄の合計は、８ｍＬのＣｓＣｌ溶液（４．６ｇのＣｓＣｌ／８ｍＬの抽出緩衝液）の上に１４ｍＬの４０％ショ糖溶液が接した二段階の勾配の上に層を形成され、Sorvall AH629スイングバケットロータを使用して１０℃で二時間、２７０００ｒｐｍで遠心分離された。ＣｓＣｌとショ糖と完全なＣｓＣｌ層の中間層を回収して、抽出緩衝液が満たされた１３．４ｍLのQuickseal tubeに注いだ。試料は２０℃、５００００ｒｐｍで一晩遠心分離された。２１ゲージの針でチューブの上部と下部に孔を開けることによって、勾配が画分された。そして、それぞれの画分５μＬを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタン法によって分析した。
【００２９】
（５）ウェスタン法
感染させたインサート細胞からの抽出物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されて、セミドライブロティングシステム（Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｕｎｉｔ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してニトロセルロースに転写された。その膜は、５％乾燥無脂肪乳で一晩遮断された。そして、マウス抗ＨＰＶ １６ Ｌ１モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）又はウサギ抗ＢＰＶ １ Ｌ１抗体と培養された。それから、その膜は抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰまたは抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰと培養された。最後に、その膜は、ＥＣＬ装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理された。陽性反応の画分は、電子顕微鏡によるＶＬＰｓの存在を確認する試験が行なわれた。
【００３０】
（６）ＰＶ偽ウイルスの調製
ヒトＰＶ（ＨＰＶ）１６ ＶＬＰｓ又はウシＰＶ（ＢＰＶ） １ ＶＬＰｓ組換え体の分解または再構築は、TouzeやCoursaget（Touze,A.,P.Coursaget.1998. In vitro gene transfer using human papillomavirus-like particles.Nucleic Acids Res.26:1317-1323）の改良方法で行った。精製した５μｇのＨＰＶ１６ ＶＬＰｓ又はＢＰＶ １ ＶＬＰｓ（理論上、１．５×１０１１粒子）は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴを含み、最終の体積が１００μＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐH７．５）で、室温で３０分間培養した。このステップで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液と１５０ｍＭ ＮａＣｌに加えられた１μｇの発現プラスミドを、分裂したＶＬＰｓに加えた。この試料は、室温で一時間、等量のＣａＣｌ２（２５ｍｍ）と２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）により希釈された。この試料は、室温で１時間１０Ｕ ベンゾナーセ＋プロテナーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）で処理された。そして、プラスミドＤＮＡの存在は、ＤＮＡプラスミドがＶＬＰｓの中にパッケージされているかどうか証明するために、アガロースゲル電気泳動法で決定された。その結果、０．５μｇのＤＮＡプラスミド（約７×１０１０のプラスミドのコピー）が２００μＬの偽ウイルスに組み込まれていた。尚、２００１年３月２３日に中華人民共和国のＣＧＭＣＣに寄託されている（ＣＧＭＣＣ ０５４６）。
【００３１】
（７）電子顕微鏡
ＣｓＣｌ勾配から得られたそれぞれの画分２０μＬは、フローティングフィルターパット（孔の径０．０２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上で４５分間１０ｍＭのＨＥＰＥＳによって透析された。炭素コートされた銅グリッド（２００メッシュの大きさ，ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は２分間、２０μＬのポリＬ−リジン（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で処理された。この試料は、２分間そのグリッドの上に置かれた。斑点のあるグリッドは、２分間、３０μＬのウラニルアセテートで染色された。過剰の染色剤は除去されて、そしてグリッドは、空気乾燥された。検体はZeiss EM 900電子顕微鏡で観察された。
【００３２】
（８）マウス
６週齢〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６系マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。）を使用した。全てのマウスは病原体フリーの状態に維持された。
【００３３】
（９）免疫化
全身の免疫化のために、マウスは１００μＬのＨＰＶ偽ウイルス（約３．５×１０１０偽ウイルス又は０．２５μｇのプラスミド）、１００μＬのＨＰＶＶＬＰｓ、１００μＬのＰＢＳに混合した２０μｇのプラスミド、１００μＬのＩＦＡに混合した１００μｇのペプチド（ＬＣＭＶｇｐ ａａ ３３−４１）で免疫された。免疫化の１４日後、五匹のマウスのグループは、１００μＬのＢＰＶ偽ウイルス（約３．５×１０１０偽ウイルス又は０．２５μｇのプラスミド）、１００μＬのＢＰＶＶＬＰｓ、２０μｇのプラスミド、１００μＬのペプチド（ＬＣＭＶｇｐ ａａ ３３−４１）で追加免疫された。粘膜の免疫化のために、マウスは１００μＬのＰＶ偽ウイルス、１００μＬのＶＬＰｓ、陰性対照として１００μＬのＰＢＳに混合した２０μｇのプラスミドを強制栄養による経口投与によって免疫化された。そして、同じ方法で１４日目にも追加免疫された。
【００３４】
（１０）全身性のＣＴＬｓの検出
追加免疫してから二週間の後、マウス（５グループ）は屠殺された。そして、それぞれのマウスから脾臓細胞が単離された。５％ＣＯ２、３７℃で１時間、ナイロンウールカラムでインキュベーションした後に、濃縮されたＴ−細胞は、カラムに完全な細胞培養培地（ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％の熱不活性化されたＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが含まれている。）を通すことで洗浄された。細胞は、１０％の熱不活性化されたＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、５μｇ／ｍＬのＥ７ペプチド（ａａ ４９−５７，ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ，Ｈ−２Ｄｂ−制限エピトープ）又はＬＣＭＶ ｇｐ ペプチドが混合されたＲＰＭＩ １６４０培地で３７℃、５％ＣＯ２で７日間培養された。特異的な細胞溶解活性は、以下の５１Ｃｒ−遊離試験法によって決定された。
【００３５】
（１１）パイエル板と、腸間膜のリンパ節細胞の単離
マウスを屠殺した後に、腸間膜のリンパ節細胞（ＭＬＮ）は腸間膜のリンパ節から分離された。そして、パイエル板を確認して小腸から取り外した。単細胞浮遊液を完全な細胞培養培地で作成した。新たに単離された腸のＴ−細胞は試験管内でアポトーシスを受けるための、それらの特異的な細胞溶解活性は、直ちに５１Ｃｒ−遊離試験法によって決定された。
【００３６】
（１２）試験管内の細胞溶解測定
ターゲット細胞（ＲＭＡ細胞，ＲＭＡ−ｎｅｏ細胞，ＲＭＡ−Ｅ７細胞）は３７℃で１時間、５１Ｃｒ（１００μＣｉ）で標識され、三回洗浄された。ＲＭＡ細胞は、細胞に５μｇ／ｍＬのペプチドを直接に導入することによって、ペプチドによって標識された。それからターゲット細胞（２０００個の細胞／ウェル）は、異なる比（イフェクター：ターゲット）でイフェクター細胞とともに、３７℃、６時間、Ｖ底の９６ウェルの微量定量プレートでインキュベートされた。上澄が回収されて、γカウンター（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．）によって５１Ｃｒ放出量を定量された。特異的な溶解が以下の計算式（数１）に従って計算された。自然発生した放出は、効果細胞が加えられていない培養培地の５１Ｃｒで標識されたターゲット細胞を含む微量培養から決定された。また最大の放出は、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０を有する５１Ｃｒで標識されたターゲット細胞の溶解によって決定された。
【００３７】
【数１】

【００３８】
（１３）ＩＦＮ−γ−分泌細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
田口ら（Taguchi,T.,1990.J.Immunol.Methods 128:65-73）によって述べられているＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＣＤ８Ｔリンパ球を検出するために改良された。まず、９６−ウェルフィルトレーションプレート（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ）を抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコートした。１０％ＦＣＳ、L−グルタミン、２−メルカプトエタノール、抗生物質を加えたＲＰＭＩ１６４０培地で三倍希釈した脾臓細胞は、１×１０６γ−線照射（５０Ｇｙ）された脾臓細胞供給装置で、１０Ｕｎｉｔｅｓ／ウェルの組換えヒトＩＬ−２（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）とともににウェルに加えられた。細胞はペプチド刺激とともに４８時間培養された。培養の後、プレートは、ビオチン化された抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のインキュベーションで洗浄された。スポットは、新たに調製された基質緩衝液（０．３３ｍｇ／ｍＬの３−アミノ−９−エチル−カルバゾールと０．１M酢酸ナトリウムに添加された０．０１５％過酸化水素に、ｐH５）によって発現された。
【００３９】
（１４）コンフォーカル顕微鏡
組織のスライド（５〜７μｍ）は、１０分間、２％ホルムアルデヒドが添加されて冷却されたリン酸緩衝食塩水で固定された。そして、Zeiss EM 900コンフォーカル顕微鏡で観察された。画像はZeissにより開発されたソフトウェアを使用して撮影して記録された。
【００４０】
（１５）統計処理
異なる二つのグループの比較は、分散分析により行った。グループ間の比較は、Ｄｕｎｃａｎ試験により行った。α値が０．０５を有意義なデータとした。
【００４１】
試験例１：ＰＶ偽ウイルスの調製
ヒトパピロマウイルス(ＨＰＶ)１６Ｌ１ＶＬＰｓ又はウシパピロマウイルス（ＢＰＶ）１Ｌ１ＶＬＰｓは、バキュロウイルス組換え体を使用したSpodoptera frugiperda（Ｓｆ９）昆虫細胞内で調製された。その細胞は、Ｃ端欠失のＨＰＶ１６Ｌ１又はＢＰＶ１Ｌ１の一方をエンコードされた組換えバキュロウイルスによって感染された。Ｃ端欠失はＰＶＶＬＰｓの製造の増強作用を有する。感染から三日後、細胞は溶解され、そしてＶＬＰｓはＣｓＣｌとショ糖の勾配により精製された。勾配は（一フラクション当り１ｍＬ）分割されて、それぞれのフラクション５μＬは、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とウェスタン法により分析された。Ｌ１タンパク質の陽性画分は、電子顕微鏡によりＶＬＰｓの存在を確認する試験が行なわれた。ＶＬＰｓを含む画分は、一時間、１０ｍＭ ＨＥＰＥｓ（ｐＨ７．５）で透析された。ＢＰＶ１又はＨＰＶ１６ＶＬＰｓ（図１ａ、ｂ参照）は、ＥＧＴＡとジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む等体積の緩衝液に加えられ、室温で３０分間インキュベーションされた。図１に示されるように、このようなコンディションではＶＬＰｓは完全に分裂された（図１のｂ、ｅ参照）。プラスミドＤＮＡ（ｐＣＩ−ＧＬＰ）が加えられた。そして、その調製液はＶＬＰｓ（図１ｃ、ｆ参照）を再生する目的でＣａＣｌ２とＤＭＳＯを加えてインキュベートした。多くのＬ１タンパク質はこのコンディションで再構築されるものと思われる。ＤＮＡプラスミドがＶＬＰｓの内部にパッケージされているか、またはその表面に存在するのかを決定するために、ＶＬＰｓの表面のＤＮＡを分解するために、再生の後にベンゾナーゼ（Ｂｚ）を使用した。それから、この偽ウイルスは、ＶＬＰｓを破壊するために、プロテナーゼＫ（ｐＫ）で処理された。そして、ＶＬＰｓ内部のプラスミドＤＮＡの存在は、アガロースゲル電気泳動により決定された。ＢｚとｐＫで処理された偽ウイルス内にＤＮＡプラスミドが存在していた。これにより、ＤＮＡプラスミドは、ＶＬＰｓの内部に取り込まれていることが確かめられた（図２）。
【００４２】
試験例２：ＰＶ偽ウイルスによるＣＴＬ反応の誘導
プラスミドＤＮＡワクチンに比べて、ＰＶ偽ウイルスがより強いＣＴＬ反応を誘導するかどうか試験した。グリーンランタンタンパク質（ＧＬＰ）が融合したリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）ｇｐ（アミノ酸３３〜４１）のＨ−２Ｄｂ制限的エピトープがエンコードされたプラスミドを含むＨＰＶ−１６偽ウイルス（ＨＰＶ−ｐＣＩ−ＧＬＰ−ＬＣＭＶ）又はプラスミド単体（ｐＣＩ−ＧＬＰ−ＬＣＭＶ）をマウスに皮下注射することで免疫化した。ｐＣＩ−ＧＬＰ、ＨＰＶ−１６ＶＬＰｓ、ＧＬＰ（ＨＰＶ−ｐＣＩ−ＧＬＰ）がエンコードされた偽ウイルスは陰性対照として使用された。不完全フロインドアジュバント中のＬＣＭＶ ｇｐ ペプチド（ａａ ３３−４１）は陽性対照として使用された。
免疫接種から１４日後、マウスは、ＧＬＰ−ＬＣＭＶ又はＧＬＰがエンコードされたＢＰＶ−１偽ウイルス、ｐＣＩ−ＧＬＰ−ＬＣＭＶプラスミド又はｐＣＩ−ＧＬＰプラスミド、ＶＬＰｓＢＰＶ−１、或いはｇｐ ３３ペプチド、を皮下に追加免疫された。追加免疫から１４日後、脾臓細胞が単離されて、ＬＣＭＶ ｇｐ ３３ペプチド（ａａ ３３−４１）とともに、Ｔ−Ｓｔｉｍ培地（ＣｏｎＡを除く）で、１週間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。標準的な５１Ｃｒ遊離試験は、ＬＣＭＶペプチド又はターゲット細胞である対照ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ ａａ ４９−５７）でラベルしたマウスのＲＭＡ細胞を使用したＬＣＭＶ特異的ＣＴＬｓを検出するために採用された。ＬＣＭＶエピトープがエンコードされたＰＶ偽ウイルスは、ＬＣＭＶエピトープがエンコードされたプラスミドに比べて、より強いＣＴＬ反応を示すことが分かる（図３参照）。さらに、ＥＬＩＳＰＯＴ試験法により、ＰＶ偽ウイルスは、プラスミド単体に比べて、ＬＣＭＶペプチドに特異的なインターフェロン（ＩＦＮ）−γ−産生ＣＤ８＋細胞を、３倍以上発現させることが確かめられた（表１参照）。
【００４３】
【表１】

マウスが、ＬＣＭＶｇｐ３３エピトープ（ａａ３３−４１）が融合したＧＬＰがエンコードされたプラスミドを含むＨＰＶ偽ウイルス又はＧＬＰ、ＶＬＰｓ単体又はプラスミドｐＣＩ−ＧＬＰ−ＬＣＭＶ、ｐＣＩ−ＧＬＰ単体又はＬＣＭＶペプチド＋ＩＦＡ（ａａ３３−４１）によって免疫化された。それから、ＢＰＶ偽ウイルス（ＰＶ）、ＶＬＰｓ単体又はプラスミド単体で追加免疫された。追加免疫から二週間後、脾臓のリンパ球（五匹）が抗−γ−ＩＦＮ抗体でコートされたプレートでインキュベートされた。二日後、ビオチン抗−γ−ＩＦＮ抗体が添加されて一晩インキュベートされた。それから、ストレプタビジン−ＨＲＰが添加された。ＡＥＣ基質による発色の後、スポットがカウントされた。表の数値は、スポットの三倍±標準偏差を意味している。
【００４４】
試験例３：ＣＴＬ反応を誘発するためのＰＶＶＬＰｓのＤＮＡワクチンのアジュバンドとしての作用
ＶＬＰｓがＤＮＡワクチンによるＣＴＬ誘導のアジュバンドとしての効果を有するかどうか試験するために、プラスミド単体（２０μｇ）、ＢＰＶＶＬＰｓ（２．５μｇ）とプラスミド（２．５μｇ）、コントロールとしてＶＬＰｓ（２．５μｇ）単体、をマウス（一群五匹）に免疫接種した。そして、γ−ＩＦＮ ＥＬＩＳＰＯＴによってＬＣＭＶ ｇｐ ３３特異的ＣＴＬｓの発現を決定した。プラスミド単体で免疫接種したグループは、ＬＣＭＶ ｇｐ ３３エピトープが１０．７±７．２５（ＳＤ）／２×１０４脾臓細胞数観察された。一方、プラスミドに加えてＶＬＰｓを免疫接種した場合、２３．３５±１．２６（ＳＤ）／２×１０４脾臓細胞数観察された。ＶＬＰｓ単体では特異的なT細胞は誘発されなかった。このように、プラスミドとＶＬＰｓの共同した免疫化はプラスミド単独（ｐ＜０．０５）による免疫化に比べてより多くのＣＴＬｓを誘導するから、ＶＬＰｓはＤＮＡワクチンによるＣＴＬｓの発生のためのアジュバンドとなりえることが示された。
【００４５】
試験例４：ＰＶ偽ウイルスの粘膜と全身のリンパ球組織に対する偽感染
粘膜及び全身のリンパ組織にＰＶ偽ウイルスが偽感染するかどうか確認するために、ＧＬＰ（ＰＶ−ｐＣＩ−ＧＬＰ）がエンコードされたプラスミドを含む偽ウイルスの経口投与により粘膜または全身のリンパ組織にＧＬＰを発現するかどうかを決定した。もし、偽ウイルスが粘膜又は全身のリンパ組織に偽感染すれば、コンフォーカル顕微鏡でＧＬＰの発現を確認することができる。Ｃ５７／ＢＬ６系マウス（一群五匹）にＨＰＶ又はＢＰＶ偽ウイルス（ＨＰＶ−ｐＣＩ−ＧＬＰ又はＢＰＶ−ｐＣＩ−ＧＬＰ）、ＶＬＰｓ単体（ＨＰＶＶＬＰｓ又はＢＰＶＶＬＰｓ）、又はプラスミド単体（ｐＣＩ−ＧＬＰ）を与えた。与えてから１日後又は７日後に、マウスを屠殺した。小腸、直腸、脾臓、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、筋肉を直ぐに取り出して凍結した。切り取った組織を作成して、そしてＧＬＰ反応をコンフォーカル顕微鏡で決定した。一日後（図４Ａ参照）及び七日後にパイエル板、粘膜固有層、直腸、脾臓、ＭＬＮにＧＬＰが発現していることが確認された。ＰＶ偽ウイルスが皮下注射により与えられた場合、ＧＬＰの発現は、リンパ節の排泄管、脾臓で確認されたが、筋肉では確認できなかった（図４Ｂ参照）。偽ウイルスによる誘発された細胞であるかどうかを決定するために、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３、ＣＤ１９に対するＰＥで標識された抗体により組織を染色した。そして、ＧＬＰと共存しているかどうかで決定した。ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋細胞はＧＬＰと共存していた（図５参照）。これにより、マクロファージ及び樹状突起細胞が、ＰＶ偽ウイルスによって偽感染することが確かめられた。一方、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋細胞はＧＬＰと共存していなかった。
【００４６】
試験例５：ＰＶ偽ウイルスの経口投与による粘膜又は全身性のリンパ組織の特異的なＣＴＬｓの誘発
ＰＶ偽ウイルスの経口投与が粘膜又は全身性のＣＴＬ反応を誘発するかどうかを確認するために、全身にＣＴＬ反応を効果的に誘発することで知られているＨＰＶ１６Ｅ７変異体がエンコードされたプラスミドを使用した。マウス（Ｃ５７／ＢＬ６系、一群五匹）はＥ７変異体（ＨＰＶ−ｐＣＭＶ−Ｅ７）がエンコードされたＨＰＶ−１６偽ウイルス、Ｅ７変異体（ｐＣＭＶ−Ｅ７）がエンコードされたプラスミド、ＨＰＶ−１６ＶＬＰｓ単体が入った餌が与えられた。餌が与えられてから１４日後、Ｅ７変異体（ＢＰＶ−ｐＣＭＶ−Ｅ７）がエンコードされたＢＰＶ−１偽ウイルス、プラスミドｐＣＭＶ−Ｅ７、ＢＰＶ−１ＶＬＰｓ単体によりマウスは追加免疫された。追加免疫されてから１４日後、ＭＬＮ、パイエル板、脾臓が単離された。ＭＬＮとパイエル板からのリンパ球は直ちにＥ７−特異的ＣＴＬｓが検出された。脾臓由来のリンパ球は、１週間、Ｅ７ペプチド（ａａ４９−５７,ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）で刺激された。標準的な５１Ｃｒ遊離試験法を行った。ＰＶ−ｐＣＭＶ−Ｅ７が経口投与されたマウスのＴ細胞は、Ｅ７発現ターゲット細胞に対する粘膜および全身性のＣＴＬ反応を有することが分かった（図６参照）。プラスミド単体またはＰＶＶＬＰｓによる経口投与による免疫化は、Ｅ７−特異的ＣＴＬ反応を誘発しなかった。偽ウイルスは、皮下注射による免疫化では、粘膜の免疫反応を誘発しなかった。
【００４７】
試験例６：ＰＶ偽ウイルスの経口投与による免疫化
可溶性タンパク質の経口投与では、全身の耐性を誘発することが知られている。経口投与によって、ＰＶ偽ウイルスが全身の耐性を誘発するかどうか試験を行った。マウス（Ｃ５７／ＢＬ６系、一群五匹）に、ＨＰＶ−ｐＣＭＶ−Ｅ７、ｐＣＭＶ−Ｅ７、ＨＰＶＶＬＰｓ単体を与えた。経口投与から１４日後、ＢＰＶ−ｐＣＭＶ−Ｅ７を皮下注射した。脾臓のＴ細胞が単離され、そして、Ｔ−ｓｔｉｍ培地（ＣｏｎＡなし）で、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一週間、Ｅ７タンパク質とともにインキュベートされた。標準的な５１Ｃｒ遊離試験を行ったところ、ＲＭＡ−Ｅ７、ＲＭＡ−ｎｅｏをターゲット細胞として使用した場合、特異的なＣＴＬｓが検出された。三グループの全てのマウスは、ＲＭＡ−Ｅ７に対するＣＴＬｓを有していた。しかし、ＲＭＡ−ｎｅｏに対しては有していなかった。（図７参照）
【００４８】
試験例７：ＰＶ偽ウイルスの経口投与による粘膜感染に対する免疫性
ＰＶ偽ウイルスの経口投与によって、粘膜防御を誘発するかどうかを試験した。Ｅ７がエンコードされたＨＰＶ−１６偽ウイルスを用いてマウスを免疫化した。そして、ＧＬＰ−Ｅ７でエンコードされたＢＰＶ−１偽ウイルスを感染させた。もしＨＰＶ−１６偽ウイルスが防御免疫反応を誘発するのであれば、粘膜の免疫系はＢＰＶ−１偽ウイルス感染細胞を駆除することができるのではないかと考えた。そのような反応はコントロールの免疫化された場合よりもＨＰＶ−１６偽ウイルスで免疫化された場合のウサギの組織におけるＧＬＰの発現が少ないこと又はないことによって検出することができる。ＨＰＶ−ｐＣＭＶ−Ｅ７、ｐＣＭＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−１６ＶＬＰｓをマウス（一群五匹）に与えた。経口投与の後、十四日後、ＨＰＶ−ｐＣＭＶ−Ｅ７、ｐＣＭＶ−Ｅ７単体、ＨＰＶ−１６ＶＬＰｓで追加免疫された。追加免疫の後１４日後、全ての三グループが、ＧＬＰ−Ｅ７溶解タンパク質をエンコードするＢＰＶ−１偽ウイルスにより感染させた。一日後、マウスが屠殺された。そしてパイエル板におけるＧＬＰ発現が決定された。ＧＬＰ発現は、ＰＶ偽ウイルス（それぞれの顕微鏡の範囲に平均４緑スポット±１）で免疫化されたマウスのパイエル板では、ＶＬＰ（それぞれの顕微鏡の範囲に平均２０緑スポット±３）又はプラスミド（それぞれの顕微鏡の範囲に平均２１緑スポット±４）で免疫化された場合に比べて著しく少なかった（ｐ＜０．０５）（図８参照）。
【００４９】
試験例８
ＬＣＭＶ ｇｐ ａａ３３−４１がエンコードされたプラスミドがパッケージされたウシパピロマウイルスウイルス様粒子（ＢＰＶＶＬＰｓ）からなる偽ウイルス４０μｇをＢ６マウス（１２ヶ月齢、３ヶ月齢）に経口投与して免疫化した。いくつかのグループのマウスは、ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶ（ＰＶ偽ウイルスはＩＬ−２がエンコードされている）で免疫化された。マウスは二週間後に追加免疫された。ターゲット細胞としてＲＭＡ細胞を使用した５１Ｃｒ遊離試験により、ＬＣＭＶ ｇｐ ａａ３３−４１に対する全身性及び粘膜における細胞傷害性T−細胞反応を試験するために、追加免疫から二週間後に、脾臓と粘膜リンパを単離した。さらに、ＥＬＩＳＡによって、血清イムノグロブリンｇ（ＩｇＧ）及びＶＬＰｓに特異的な腸の分泌型ＩｇＡを測定した。さらに、ＥＬＩＳＰＯＴによるマウスの免疫化に従って、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−βのような全身および粘膜性のＴ細胞インターロイキン産生を測定した。また、３Ｈ−細胞の取り込みによって、ヘルパーＴ細胞の増殖を測定した。以下、この試験例について詳細に説明する。尚、図９〜１４中のｐｓｖはＰＶ偽ウイルスのことである。
【００５０】
試験例８−１
高齢（１２ヶ月齢）Ｂ６マウスと若い（３ヶ月齢）Ｂ６マウスは、（ＩＬ−２エンコードされたＰＶ偽ウイルス又はＰＢＳが加えられた又は加えられていない）１００μＬのＰＢＳに溶解された４０μｇのＢＰＶ偽ウイルスにより免疫化された（一群５匹）。二週間後、マウスは屠殺されて、小腸は洗浄されて、トリプシン阻害剤で処理された。２００ｎｇ／１００μＬ／ウェルのＢＰＶＶＬＰｓ、コントロールとしてのＰＢＳが、室温で９６ウェルプレートで培養された。ブロッキング緩衝液が室温で一時間インキュベーションされた。そして、糞抽出物が１００μＬ／ウェルのプレートごとに異なる濃度でインキュベーションされた。糞抽出物は洗浄され、そして、抗−ＩｇＡ抗体がウェルに添加されて室温で１〜２時間インキュベーションされ、洗浄された。第二の抗体であるＨＲＰは５０００倍に希釈されて１００μＬ／ウェルで３０分間インキュベートされた。洗浄され、発色緩衝液が添加され、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加により反応が停止された。糞抽出物の異なる濃度におけるＥＬＩＳＡによるＯＤの平均値の結果に示した。
【００５１】
結果を図９に示す。図９に示される結果の通り、高年齢のマウスにおいて、ＰＶ偽ウイルスの経口投与では最小限の分泌型ＩｇＡ反応を誘発した。一方、高年齢のマウスにおいて、ＩＬ２がエンコードされたＰＶ偽ウイルスの存在下で、強力な分泌型ＩｇＡを発現した。
【００５２】
試験例８−２
高齢（１２ヶ月齢）Ｂ６マウスと若い（３ヶ月齢）Ｂ６マウスは、（ＩＬ−２エンコードされたＰＶ偽ウイルスが加えられた又は加えられていない）１００μＬのＰＢＳに溶解された４０μｇのＢＰＶ偽ウイルスが与えられた（一群５匹）。二週間後、マウスは屠殺されて、血液が回収された。１００μＬ／ウェル当たり２００ｎｇのＢＰＶＶＬＰｓ又はコントロールとしてのＰＢＳが、室温で一晩、９６ウェルプレートで培養された。ブロッキング緩衝液が室温で一時間インキュベーションされた。血清のサンプルが、１００μＬ／ウェルに異なる濃度で加えられてインキュベーションされた。血清は洗浄され、ウェルに抗マウスＩｇＧが加えられて、室温で１〜２時間インキュベーションされた。そして洗浄された。第二の抗体であるＨＲＰが、５０００倍希釈されて１００μＬ／ウェルで３０分間インキュベーションされた。そして、洗浄され、発色緩衝液が添加され、反応が２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えることで停止された。異なる濃度で添加された血清のＯＤ（ＥＬＩＳＡ）の平均を測定した。
【００５３】
結果を図１０に示す。図１０に示される結果の通り、ＰＶ偽ウイルスの経口投与は最小のＩｇＧ反応を誘導した。しかし、高齢のマウスにおいてＩＬ２がエンコードされたＰＶ偽ウイルスの存在下で強力な全身性のＩｇＧを誘導した。
【００５４】
試験例８−３
高齢（１２ヶ月齢）Ｂ６マウスと若い（３ヶ月齢）Ｂ６マウス（一群５匹）は、ＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２とともに或いはＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２なしで、４０μｇのＬＣＭＶ ｇｐ ａａ３３−４１がエンコードされたＰＶ偽ウイルスが経口投与された。二週間後、追加免疫された。追加免疫から二週間後、マウスは屠殺されて、粘膜固有層とパイエル板のリンパ球が回収された。ターゲット細胞である、ＲＭＡ細胞が３７℃で１時間、５１Ｃｒでラベリングされ、三回洗浄された。一部のＲＭＡ細胞には、さらに、ＬＣＭＶ ｇｐ ａａ３３−４１ペプチドを５μｇ／ｍＬ直接与えることでラベリングした。ターゲット細胞（２０００細胞／ウェル）はイフェクター細胞（イフェクター：ターゲット細胞の比が異なるように添加して）とともに、９６ウェルのＶ字底マイクロタイタープレートで３７℃、６時間、インキュベーションされた。上清が回収されて５１Ｃｒ放出をγ−カウンターで測定した。結果を図１１に示す。尚、図１１中の横軸はイフェクターとターゲット細胞の比である。
【００５５】
図１１に示されるとおり、ＰＶ偽ウイルスの経口投与は高齢のマウスで最小の粘膜性のＣＴＬ反応を誘導する。しかし、ＩＬ−２エンコードされたＰＶ偽ウイルスの存在で強力なＣＴＬ反応を誘発することができる。
【００５６】
試験例８−４
高齢（１２ヶ月齢）Ｂ６マウスと若い（３ヶ月齢）Ｂ６マウス（一群５匹）は、ＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２とともに或いはＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２なしで、４０μｇのＬＣＭＶ ｇｐ ａａ３３−４１がエンコードされたＰＶ偽ウイルスが経口投与された。二週間後、追加免疫された。追加免疫から二週間後、マウスは屠殺されて、脾臓のリンパ球が回収された。ターゲット細胞である、ＲＭＡ細胞が３７℃で１時間、５１Ｃｒでラベリングされ、三回洗浄された。一部のＲＭＡ細胞には、さらに、ＬＣＭＶ ｇｐ ａａ３３−４１ペプチドを５μｇ／ｍＬ直接与えることでラベリングした。ターゲット細胞（２０００細胞／ウェル）はイフェクター細胞（エフェクター：ターゲット細胞の比が異なるように添加して）とともに、９６ウェルのＶ字底マイクロタイタープレートで３７℃、６時間、インキュベーションされた。上清が回収されて５１Ｃｒ放出をγ−カウンターで測定した。結果を図１２に示す。尚、図１２中の横軸はイフェクターとターゲット細胞の比である。
【００５７】
図１２に示されるとおり、ＰＶ偽ウイルスの経口投与は高齢のマウスで最小の粘膜性のＣＴＬ反応を誘導する。しかし、ＩＬ−２エンコードされたＰＶ偽ウイルスの存在で強力なＣＴＬ反応を誘発することができる。
【００５８】
試験例８−５
高齢（１２ヶ月齢）Ｂ６マウスと若い（３ヶ月齢）Ｂ６マウスは、ＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２とともに或いはＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２なしで、ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶが経口投与された。二週間後、追加免疫された。追加免疫から二週間後、マウスは屠殺されて、粘膜固有層とパイエル体のリンパ球が回収された。通常のＢ６マウスからの脾臓のフィーダー細胞が単離されて照射された。粘膜細胞は異なるＶＬＰｓの投薬量で培養された。そして脾臓フィーダー細胞により照射された。インキュベーションから三日後、細胞は１６時間Ｈ３−チミジンで適用された。そしてＨ３−チミジンの取り込みを測定した。ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶで免疫化された高齢マウスからのＴヘルパー細胞の増殖は、若いマウスのそれと比較すると、減少した。対照的に、ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶ＋ＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２で免疫化された高齢マウスのＴヘルパー細胞の増殖は、ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶ単体で免疫化された高齢マウスのそれと比較すると有意な回復を見せた。結果を表２に記載する。表２の結果は、それぞれ一群当り、五匹の平均値（ＣＰＭ）である。
【００５９】
【表２】

【００６０】
表２の結果の通り、高齢のマウスにおける粘膜のＴヘルパー細胞の増殖は減少するが、ＩＬ−２エンコードされたＰＶ偽ウイルスの経口投与により、増殖反応が回復することが分かる。
【００６１】
試験例８−６
高齢（１２ヶ月齢）Ｂ６マウスと若い（３ヶ月齢）Ｂ６マウスは、ＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２とともに或いはＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２なしで、ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶが経口投与された。二週間後、追加免疫された。追加免疫から二週間後、マウスは屠殺されて、脾臓のリンパ球が回収された。通常のＢ６マウスからの脾臓のフィーダー細胞が単離されて照射された。Ｔ細胞は異なるＶＬＰｓの投薬量で培養された。そして脾臓フィーダー細胞で照射された。インキュベーションから三日後、細胞は１６時間Ｈ３−チミジンで適用された。そしてＨ３−チミジンの取り込みを測定した。ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶで免疫化された高齢マウスからのＴヘルパー細胞の増殖は、若いマウスのそれと比較すると、減少した。対照的に、ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶ＋ＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２で免疫化された高齢マウスのＴヘルパー細胞の増殖は、ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶ単体で免疫化された高齢マウスのそれと比較すると有意な回復を見せた。結果を表３に記載する。表３の結果は、それぞれの群当り、３匹の平均値（ＣＰＭ）である。
【００６２】
【表３】

【００６３】
表３の結果の通り、高齢のマウスにおける全身性のＴヘルパー細胞の増殖は減少するが、ＩＬ−２エンコードされたＰＶ偽ウイルスの経口投与により、増殖反応が回復することが分かる。
【００６４】
試験例８−７
高齢（１２ヶ月齢）Ｂ６マウスと若い（３ヶ月齢）Ｂ６マウスは、ＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２とともに、或いはなしで、ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶが経口投与された。二週間後、追加免疫された。追加免疫から二週間後、マウスは屠殺されて、粘膜固有層とパイエル体のリンパ球が回収された。そして、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−βに対する抗体がコートされた９６ウェルプレートで、１２０μｇ／ｍＬのＶＬＰで刺激された。脾臓細胞が単離され、照射されて、３７℃で４８時間、粘膜細胞とともにインキュベートされた。このプレートは洗浄され、抗−マウスＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＦＮ−γ，ＴＧＦ−βでラベルされたビオチンが加えられて、４℃で一晩培養された。このプレートは洗浄されて、ストレプタビジンとペルオキシダーゼ結合体が加えられ、ＡＥＣペロオキシダーゼの基質が加えられ、そしてプレートは二回洗浄された。結果を図１３に記載する。図１３の結果は、一サンプル三回、一群三匹からの１００×１０３粘膜細胞当りのＴ−細胞のサイトトキシン産生の平均値を示している。
【００６５】
図１３に示されるとおり、高齢および若いマウスにおける粘膜のサイトトキシンの生産は、偽ウイルスのワクチン投与に従うことが分かる。
【００６６】
試験例８−８
高齢（１２ヶ月齢）Ｂ６マウスと若い（３ヶ月齢）Ｂ６マウスは、ＰＶ偽ウイルス−ＩＬ−２とともに、或いはなしで、ＰＶ偽ウイルス−ＬＣＭＶが経口投与された。二週間後、追加免疫された。追加免疫から二週間後、マウスは屠殺されて、脾臓のリンパ球が回収された。そして、ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＦＮ−γ，ＴＧＦ−βに対する抗体がコートされた９６ウェルプレートで、１２０μｇ／ｍＬのＶＬＰで刺激された。脾臓細胞が単離され、照射されて、３７℃で４８時間、脾臓のリンパ球とともにインキュベートされた。このプレートは洗浄され、抗−マウスＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＦＮ−γ，ＴＧＦ−βでラベルされたビオチンが加えられて、４℃で一晩培養された。このプレートは洗浄されて、ストレプタビジンとペルオキシダーゼ結合体が加えられ、ＡＥＣペロオキシダーゼの基質が加えられ、そしてプレートは二回洗浄された。結果を図１４に記載する。図１４の結果は、一サンプル三回、一群三匹からの１００×１０３粘膜細胞当りのＴ−細胞のサイトトキシン生産の平均値を示している。
【００６７】
図１４に示されるとおり、高齢および若いマウスにおける全身性のサイトトキシンの生産は、偽ウイルスのワクチン投与に従うことが分かる。
【００６８】
【発明の効果】
以上詳述した如く、本発明のＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバンドは、ＤＮＡワクチン単体の投与による免疫化に比べて、より強力なＣＴＬ反応を引き起こすことができる。また、パピロマウイルス偽ウイルスは、経口的な投与で免疫反応を誘発することができる。従って、この偽ウイルスは、ウイルスの感染や粘膜の腫瘍などの様々な疾病の治療及び予防に効果を発揮する。またパピロマウイルス偽ウイルスは、経口投与によって、パイエル板、粘膜固定層、脾臓に到達することができ、全身性の免疫化によって、プラスミドＤＮＡワクチンよりも強力なＣＴＬ反応を誘導することができる。
【００６９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Liang Qiao; Wei Shi
<120> PAPILLOMA PSEUDO-VIRUS AND PREPARATION
<160> 2
<150> CN 01118003.X
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gccaccatga gcaagggcga ggaactgt 28
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> ２
tcaacaggtg gcaaaattgt agacagcctt agatccgccg ccaccgccac ccttgtacag 60
ctcgtccat 69
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＢＰＶ−１Ｌ１又はＨＰＶ−１６Ｌ１由来のＶＬＰｓ、ＥＧＴＡ−及びＧＴＴ−粉砕されたＶＬＰｓ、偽ウイルスの電子顕微鏡写真である。ＶＬＰｓはＥＧＴＡとＤＴＴにより粉砕されて、ｐＣＩ−ＧＬＰプラスミドが加えられた。ＶＬＰｓはＰＶ偽ウイルスを形成するためにＣａＣｌ２の濃度を高めると再構築された。
（ａ）は、ＢＰＶＶＬＰｓ、（ｂ）は、粉砕されたＢＰＶＶＬＰｓ、（ｃ）はＢＰＶ偽ウイルス、（ｄ）はＨＰＶＶＬＰｓ、（ｅ）は粉砕されたＨＰＶＶＬＰｓ、（ｆ）はＨＰＶ偽ウイルスである。倍率は８４，０００倍である。
【図２】 ＰＶＶＬＰｓによりカプシドに包まれたプラスミドｐＣＩ−ＧＬＰＤＮＡである。ベンゾナーゼ（Ｂｚ）とプロテナーゼＫ（ｐＫ）により消化された後にＰＶ偽ウイルス中のパッケージされたプラスミドＤＮＡの電気泳動である。この偽ウイルスは、ＤＮＡプラスミドがＶＬＰｓ中に取り込まれているかを証明するために、ＶＬＰｓの表面のＤＮＡを消化するためにＢｚとｐＫにより処理された。１μｇのプラスミドＤＮＡが偽ウイルスを作成するために使用された。そして、ベンゾナーゼとプロテナーゼＫによる２００μｇの偽ウイルスの消化の後、０．５μｇのプラスミドが残った。
【図３】 ＰＶ偽ウイルスは、ＤＮＡワクチンに比べて、強力なｌｃｍｖ−特異的ＣＴＬ反応を誘発する。マウスは、融合タンパク質ＧＬＰ−ＬＣＭＶ ｇｐ３３エピトープ（ａａ３３−４１）又はＧＬＰがエンコードされたプラスミドが入った偽ウイルス、ＶＬＰｓ単体又はプラスミド単体（ｐＣＩ−ＧＬＰ−ＬＣＭＶ又はｐＣＩ−ＧＬＰ）、パネルごとに示されたＩＦＡ中でＬＣＭＶ ｇｐペプチド（ａａ３３−４１）、が皮下注射された。５１Ｃｒ−遊離試験法は、脾臓のリンパ組織におけるＬＣＭＶ ｇｐ３３エピトープ特異的ＣＴＬｓを決定するために採用された。ターゲット細胞（ＲＭＡ）は、ＬＣＭＶペプチド（ａａ３３−４１）又はコントロールペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ａａ４９−５７）がパルスされた。このデータは、平均±標準偏差（特異的な溶解の％）を示している（一群５匹のマウス）。
【図４】 経口投与により、ＰＶ偽ウイルスは、腸粘膜または全身性のリンパ組織に偽感染する。
Ａ：ＧＬＰがエンコードされたＨＰＶ偽ウイルス又はＢＰＶ偽ウイルスは、マウスに経口投与された。ＧＬＰ発現はコンフォーカル顕微鏡によって示された組織によって決定された。ＧＬＰは小腸及び大腸の粘膜固有層、パイエル板、腸間膜リンパ節、直腸、脾臓において発見された。しかしながら筋肉では発見されなかった。これはＨＰＶ偽ウイルスの投与されたマウスのデータを示している。
Ｂ：ＧＬＰがエンコードされたＢＰＶ偽ウイルス又はＨＰＶ偽ウイルスがマウスに皮下注射された。ＧＬＰ発現は、排出リンパ節、脾臓で発見されたが、粘膜では発見されなかった。ＢＰＶ偽ウイルスの投与されたマウスからのデータを示している。直線は５〜１０μｍを示している。
【図５】 ＧＬＰがエンコードされたＰＶ偽ウイルスの経口投与されたマウスの粘膜組織のＧＬＰ発現により、腸のＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ−陽性細胞が突き止められた。ＧＬＰがエンコードされた偽ウイルスの経口投薬から一日後、マウスの粘膜組織は取り除かれ、抗マウスＣＤ１１ｂ−又はＣＤ１１ｃ−抗体で染色された。ＰＥラベルされた第二抗体は洗浄の後に使用された。粘膜組織におけるＧＬＰ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃの発現は、共焦点顕微鏡によって決定された。粘膜固有層（矢印で示す。）におけるＧＬＰ(緑色)、ＣＤ１１ｃ（パネルＡ中の赤色）、ＣＤ１１ｂ（パネルＢ中の赤）の発現が示されている。
【図６】 Ｅ７がエンコードされたＰＶ偽ウイルスの経口投与は、粘膜と全身性のＥ７特異的ＣＴＬｓを誘導した。Ｅ７ミュータント、ＶＬＰｓ単体、プラスミド単体、がエンコードされたプラスミドを有するＨＰＶ１６偽ウイルスの経口投与によりマウスが免疫化された。そして、これらは、ＢＰＶ偽ウイルス、ＶＬＰｓ単体、プラスミド単体、で追加免疫された。
（ａ）パイエル板と腸間膜リンパ節は単離されて、直ぐに試験管内における再刺激なしのＥ７−特異的ＣＴＬｓを試験するために使用された。５１Ｃｒ遊離反応が、Ｅ７特異的ＣＴＬｓを決定するために使用された。ターゲット細胞はＥ７抗体を発現したＲＭＡ−Ｅ７又はＲＭＡ−ｎｅｏ（陰性対照細胞）であった。ＲＭＡＥ７とＲＭＡｎｅｏは、比較できるＭＨＣクラスＩレベルを発現した。プラスミド又はＶＬＰｓが与えられたマウスからのリンパ細胞は、ＲＭＡ−Ｅ７細胞を溶解しなかった。
（ｂ）脾臓のリンパ球は単離されて、試験管内でＥ７ペプチド（ａａ４９−５７）とともに再刺激された。５１Ｃｒ遊離試験は、Ｅ７特異的ＣＴＬｓを決定するために使用された。ターゲット細胞（ＲＭＡ）は、Ｅ７ペプチド（ａａ４９−５７）又はコントロールペプチドでパルスされた。このデータは平均±標準偏差（一群五匹の特異的溶解の％）を示す。
【図７】 ＰＶ偽ウイルスの経口投与は全身性の耐性を誘発しない。マウスはＨＰＶ１６Ｅ７がエンコードされたプラスミドを有するＨＰＶ１６偽ウイルス、ＶＬＰｓ単体、プラスミド単体を経口投与された。それから、マウスはＥ７タンパク質がエンコードされたＢＰＶ偽ウイルス（ＰＶ）で全身性の免疫化をされた。脾臓のリンパ球は単離されて、試験管内でＥ７ペプチド（ａａ４９−５７）で再刺激された。５１Ｃｒ遊離試験法は、Ｅ７特異的ＣＴＬｓの存在を決定するために採用された。ターゲット細胞（ＲＭＡ）は、Ｅ７ペプチド（ａａ４９−５７）、コントロールペプチドでパルスされた。このデータは平均±標準偏差（一群５匹のマウス特異的溶解％）を示している。
【図８】 偽ウイルスの経口投与は粘膜の攻撃に対してマウスを保護することができた。マウスはＥ７がエンコードされたプラスミドを持つＨＰＶ１６偽ウイルス、ＶＬＰ単体、プラスミド単体を経口投与された。そして、同様の方法で１４日後に追加免疫された。２８日目にマウスの全ての３群が、ＧＬＰ−Ｅ７融合タンパク質がエンコードされたＢＰＶ偽ウイルスで経口的な攻撃をされた。一日後、マウスはパイエル板におけるＧＬＰ発現を決定するために屠殺された。ＧＬＰ発現は、ＶＬＰ又はプラスミドで免疫化されたマウスに比べて、偽ウイルスで免疫化されたマウスからのパイエル板では、著しく少なかった。
【図９】 試験例８−１の結果を示すグラフである。
【図１０】 試験例８−２の結果を示すグラフである。
【図１１】 試験例８−３の結果を示すグラフである。
【図１２】 試験例８−４の結果を示すグラフである。
【図１３】 試験例８−５の結果を示すグラフである。
【図１４】 試験例８−６の結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 少なくとも、以下の工程からなるパピロマウイルス偽ウイルスからなる、粘膜免疫反応の誘導を増強するための、経口投与用ＤＮＡプラスミドワクチン用アジュバントの調製方法。
   （ａ）パピロマウイルスウイルス様粒子を発現する細胞系において、ヒトパピロマウイルス１６Ｌ１生成物又はウシパピロマウイルス１Ｌ１生成物を発現する工程。
   （ｂ）発現したパピロマウイルスウイルス様粒子がプラスミドを包膜することができる条件を提供して、プラスミドをパピロマウイルスウイルス様粒子中に包膜してパピロマウイルス偽ウイルスを生成する工程であって、当該プラスミドがインターロイキン−２遺伝子を担持しており、以下の工程を含む工程。
   （i）ヒトパピロマウイルス１６Ｌ１生成物又はウシパピロマウイルス１Ｌ１生成物を溶解緩衝液に混合する工程であって、前記溶解緩衝液がＥＧＴＡ、ＤＴＴ、ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含む工程。
   （ii）プラスミドを加える工程。
   （iii）停止緩衝液を加える工程であって、前記停止緩衝液がＣａＣｌ_２及びＤＭＳＯを含む工程。
   （ｃ）（ｂ）工程の生成物の中からパピロマウイルス偽ウイルスを分離する工程。

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