JP4500138B2 - 細胞画像解析方法 - Google Patents
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Description
図11を使って代表的な輪郭解析方法であるWatershedについて簡単に説明する。細胞の輪郭となる画像中の境界は、2値化などの適当な方法により検出されている。この画像中で、いくつかの細胞は重なって、密接して存在している。この場合、2つの細胞の境界も重なっているので複数の細胞を正しく分離しなくてはならない。Watershed法によれば、図11に示すように複数の細胞が重なっている輪郭上で、くびれている部分を個々の細胞の境界として認識し、単一の細胞ごとの検出が可能になる。しかしこの方法では、多くの細胞が密接したものに対しては正しく細胞を分離できないという難点がある。
また、対物レンズ35をZ方向に移動させることにより、レーザ光のフォーカス位置をZ軸方向に沿って上下に移動させることができる。
まず、図2を参照して、細胞解析処理の流れについて、その概要を説明する。
(1)対象とする細胞を培養する(ステップA1)。
(2)次に染色などの適当な前処理を行い可視化の準備を行う(ステップA2)。ステップA2において、前処理とは、適当な方法で培養された細胞に、撮像のための処理を施すことであって、蛍光物質を投与することなどの処理を行うにより細胞の可視化が行われる。
(3)これら細胞試料42を顕微鏡などの光学系に載置して、光検出器55で撮像する(ステップA3)。
(4)光検出器55で撮像した細胞画像をデジタル化してコンピュータ10などの図示しない記憶装置に保存する(ステップA4)。保存された細胞画像は、カラーまたは単色の像である。また、画像は、1000×1000などの上下左右に幅をもったデータとして保存される。画像の上の各点には、位置を表す座標が振り分けられ、各点は、各色の輝度を持つ。なお、座標(x、y)の輝度は230などのように表現されデジタルデータとして保存される。
(5)これら画像をコンピュータ上で処理解析する(ステップA5)。
画像解析は、これらのデジタルデータをパソコン上のソフト・プログラムなどで適当な処理を行い解析する方法である。特に、細胞を使った画像解析においては、細胞を認識することが目的となる。
細胞の認識は、通常、実験者によって直接行われる。実験の種類によって異なるが、一般的には、顕微鏡画像(あるいは顕微鏡の視野)を観察しその画像中に「細胞が存在するかどうか。」「細胞が存在する場合、細胞の位置はどこにあるか」「画像中に含まれる細胞の数はいくつか」「画像中の細胞の種類はいくつあるか」「特定の種類の細胞はいくつあるか」「各細胞の大きさはどの程度あるか」などを認識し、記録し、実験のためのデータを提供することを目的に細胞認識は行われる。
すなわち、細胞の認識は、(1)画像中、個々の細胞の位置を特定し、(2)細胞の特徴を取得し、(3)取得した特徴により細胞を分類することを目的として行われる。ここにおいて、本発明の一実施態様に係る細胞画像解析は上記の細胞認識をコンピュータ上で自動的に行うことを目的とする。なお、上記方法で取得した個々の細胞の特徴量は、平均化などの統計的な処理を施される。
細胞ベースの化合物スクリーニングは、効果のある薬剤を見つけることを目的とするものであって、適当な化合物などをターゲットにする細胞に投与し、これら化合物が細胞に及ぼす影響を定量化することにより、行われる。
さらに、これらの定量化されたデータは、複数の化合物の場合と比較され、これらいくつかの化合物の中から、細胞に及ぼす影響の大きいもの、効果のあるものを発見することを目的として行われる。
サンプルとなる細胞を培養し(ステップB1)、条件に応じて、いくつかのグループに分類する(ステップB2)。例えば化合物の細胞に及ぼす効果を測定する実験系においては、化合物を加えたものと、そうではない細胞群に分けられる(ステップB2からステップB5)。
上記の例において、単一の細胞の観察を目的とする場合には、適当な処理により細胞は一個一個分離されている。また病理組織の判定の場合は、細胞組織は比較的きれいなパターンを持っている。これらの例では、細胞の境界は抽出しやすく、細胞の輪郭検出自体が問題になることは比較的少ない。また、細胞の数だけが問題になる場合、通常は細胞核を染色してしまうという方法を採る。
さらに、細胞同士が重なっているもしくは、複数の細胞が密に接しているため細胞間を隔てる境界を正しく認識することができないということが第2の問題である。
まず、画像中における特徴的な点を抽出する。特徴的な点は、輝度の極小極大値、境界から一定以上の距離をもつもの、色(色相や彩度)が特徴的なものなどである。
細胞の中心などの形態的に注目すべき点は、上記のような特徴を持っている場合が多い。
また抽出点の選択で分かるように、この処理には、輝度勾配の解析や境界抽出などの典型的な画像処理技術を含んでいる。
コンピュータソフトは、サンプルによりまた実験条件の変更により、設定を変更することや、間違いを補正することが求められるが、ソフトを使用するユーザーにとってこれら操作が容易になることが予想できる。
細胞のサンプルは、規格化、つまり画一化されていないものであることを想定としているので、画像中まったく点がない、あるいは、細胞が部分領域に偏っている場合もある。
本発明により、特徴的な点を機械的に抽出することによって、これら必要のない領域は全く検査しないことになるので、処理の高速化、また処理の際のデータ量を減らすことができる。
従って、なるべく設定パラメタは増やさず、また、パラメタの設定は、全ての画像に対して一定ではなく、画像中の他の点と比較するなどの、相対的な設定方法を取ることが望ましい。
本発明の実施態様では、局所的に比較して点を抽出しているので、この条件を満たしている。
具体的な代表点の抽出方法として、例えばクラスタ分析の手法を使う場合もある。クラスタ分析は、例えば二次元上に点が分布している場合、2点間の距離がもっとも短いものをグループ化し、この2点間の中点を新たな点とし2点を候補の点から除くという処理を繰り返し、代表的な点を抽出するという手法である。
これらの距離のうちもっとも距離の短い点の組を選択する。図8(a)において、bとdがもっとも距離が近いので、bとdの中点を新たにb’として画像上に点を新たに付け加え、bとdの点を画像上から消去する(図8(b))。
そして、a、b’、c、eの4つの画像上の点に対して同様の操作を繰り返す(図8(c))。
上記の処理において、例えば、最近点が一定以上を超えた場合処理を中止するという設定にすれば、簡単かつ高速に代表点抽出を行うことができる。
(1)画像中で特徴的な点を抽出する。(2)これらの点を「細胞輪郭」、「細胞内」の2つに分類し、「細胞内」だけを選択する。(3)これらの各点に対して、距離の近い点をまとめて、一つの細胞に対して、一つの点を選ぶように選択する。
この場合において、図9(c)の場合p1、p2を直径とする円のなかには、いくつかの境界に対応した点が存在するため、これらの2点は別な細胞に含まれる点として認識される。以上の方法により細胞の中心に対応する点の候補を画像から抽出することができる。なお、この場合において、前述したように、細胞中心と、境界とは、特徴が異なる場合があるので、容易に判別ができる。
(1)図5、図6などの適当な方法で、画像上の特徴的な点の抽出を行い(ステップC1)、
(2)図7のような方法により、各点を解析し、これにより、細胞体内部点に対応した点を選択するなどの処理を行う。
(3)さらに、図8で説明したようなクラスタ化を行うが、このクラスタ化に際して、
(4)図9で説明したような条件付けを行う。
(5)以上の処理で決定された細胞を代表する点を使って、図10で説明したような方法を使って、各細胞の境界を求める。
上記の実施態様では、特に触れなかったが、特徴的な点を抽出するために、画像をいくつかの局所領域に分割することが好ましい。なお、この場合に、分割の大きさは、細胞の大きさよりも多少大きくすることが好ましい。これにより、領域中の点に比べ何らかの特徴を持つ点を抽出することができ、点単独の(周りの点を考慮にいれない)特徴のみならず近傍の点の情報を加味した解析を行うことができ、細胞認識の精度を上げることができる。
さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。
20…光源
22…コリメートレンズ
25…ダイクロイックミラー
30…XYスキャナ
35…対物レンズ
40…試料ステージ
41…マイクロプレート
42…試料
45…試料ステージコントローラ
50…ミラー
51…レンズ
52…ピンホール
55…光検出器
80…画像処理部
81…特徴点抽出部
82…グループ化部
83…細胞中心決定部
84…画像分割部
85…細胞領域解析部
Claims (5)
- 細胞などの画像を解析する細胞画像解析方法において、
前記画像から、輝度が極小値または極大値の点、周囲の点と異なる色を有する点、および、輝度勾配が極大となる点の少なくともひとつを、抽出点として抽出する抽出ステップと、
前記抽出点を、細胞内に分布している細胞内グループと、細胞境界上に分布している細胞境界グループとに分類する分類ステップと、
前記細胞内グループの抽出点から細胞中心に対応する点を決定する決定ステップとを具備することを特徴とする細胞画像解析方法。 - 請求項1に記載の細胞画像解析方法において、前記決定ステップが、
観察対象の単一細胞のおおよその大きさを設定値として設定する設定ステップと、
前記細胞内グループ内の最も近い2点を検出する検出ステップと、
前記2点間の距離と前記設定値を比較し、前記2点間の距離が前記設定値よりも小さい場合に前記2点を1点にまとめるまとめステップと、
前記細胞内グループ内の任意の2点間の距離がすべて前記設定値よりも大きくなるまで、前記検出ステップと前記まとめステップとを繰り返す繰り返しステップとを具備することを特徴とする細胞画像解析方法。 - 請求項1に記載の細胞画像解析方法において、前記決定ステップが、
観察対象の単一細胞のおおよその大きさを設定値として設定する設定ステップと、
前記細胞内グループ内の最も近い2点を検出する検出ステップと、
前記2点間の距離と前記設定値を比較し、前記2点間の距離が前記設定値よりも小さく、かつ、前記2点を直径とする円内に前記細胞境界グループの点が含まれない場合に前記2点を1点にまとめるまとめステップと、
前記細胞内グループ内の任意の2点間の距離がすべて前記設定値よりも大きくなる、または、2点間の距離が小さくかつ前記2点を直径とする円内に、前記細胞境界グループの点が含まれるまで、前記検出ステップと前記まとめステップとを繰り返す繰り返しステップとを具備することを特徴とする細胞画像解析方法。 - 請求項1に記載の細胞画像解析方法において、前記決定ステップが、前記細胞内グループの複数の点の重心を求めるステップであることを特徴とする細胞画像解析方法。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載の細胞画像解析方法において、前記細胞内グループは、密集して抽出された点のグループであり、前記細胞境界グループは、線状に抽出された点のグループであることを特徴とする細胞画像解析方法。
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