JP4499554B2 - 少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の局所的使用 - Google Patents

Description

本発明は、局所適用のための少なくとも1つの二本鎖RNAオリゴヌクレオチド(dsRNA)の新規な使用、および生理学的に許容される媒体内に少なくとも1つの被包された二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含む局所的使用のための組成物に関する。

皮膚または皮膚付属器のある種の美的欠陥またはある種の障害を補正または予防するために、多数の物質が局所的に使用される。これらの物質のうち、真の生物学的特異性を示すものが特に求められている。

このように、上記物質が特異的活性(特異的な生物活性など)を示す程度が大きくなれば、それだけ上記物質が望ましくない副作用を誘発しにくくなる。例えば、顔色を白くする、または望ましくない色素沈着を予防することを目的とする組成物において、チロシナーゼなどの酵素を標的とした活性を有する物質を使用することが好ましい。例えば、老化を予防するための組成物を調製するために、ある種のメタロプロテイナーゼまたはエラスターゼに対して特異的に作用する物質を使用することを挙げてもよい。

現在までに、この特異性の問題は、天然のDNAもしくはRNAオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスDNAを使用することによって解決されている。しかし、そうした使用には制限がある。

したがって、局所用薬剤において、DNA、非特異的RNAまたはアンチセンスDNAオリゴヌクレオチド(例えば、特許出願WO 01/58918に記載されたもなど)を使用しても、所望の有効性を得ることは可能になっていない。特に、皮膚表面上のリボヌクレアーゼが天然RNAを分解し、求める効果を得るのに十分な量が、標的mRNAまで到達することは不可能である。上述のものなど一本鎖オリゴヌクレオチド使用におけるもう1つの制限は、上記オリゴヌクレオチドが二次的な再折りたたみ(または、二次的な再対形成)を受けるかもしれないというリスクである。この理由のため、in vivo一本鎖オリゴヌクレオチド(アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドなど)の投与は、効果がないことが多い。さらに、上記オリゴヌクレオチドは細胞内で急速に分解され、in vivo細胞外半減期が短いため、in vivo一本鎖オリゴヌクレオチドが発揮する効果の安定性は短い(Khan A & al J Drug Target 2000 8 319334)。

したがって、標的とする方法で活性化合物を投与する困難および特異性の問題の両方を解決し、かつ局所適用に適した組成物が必要である。

二本鎖RNAオリゴヌクレオチド(dsRNAとも呼ぶ)は、植物および真核生物内に存在することが長い間知られている(Haines D.S.ら、J.Cell Biochem.1991;46:9-20)。その役割は、特定遺伝子の発現を阻害することである(Fire A.、Trends in Genetic 1999;15:358-363)。

治療を目的としたdsRNAの使用は、特許出願WO 01/36646に記載されており、そこでは、疾患(特に癌)に関与する遺伝子を阻害する方法が提案されている。この方法を実施する例において、阻害される遺伝子を標的とするdsRNAを細胞内に注射することによって、未分化細胞(胚細胞または卵母細胞など)内で遺伝子発現を阻害することが提案されている。この目的は全身的効果を得ることである。考えられる投与形態は、一般的な投与に関係する。

この明細書中で提唱される薬学的組成物とは反対に、局所用薬剤は、特定の分化細胞に到着し、同時に表面的なレベルでのみ作用するべきである。すなわち、皮膚または皮膚付属器(真皮、表皮、および角質化した皮膚付属器)のレベルで、または皮膚を覆う真核微生物を標的とすることによって皮膚の表面だけで作用するということである。また、特定の皮膚細胞型(線維芽細胞、メラニン形成細胞、ケラチン生成細胞、ランゲルハンス細胞、または美的欠陥もしくは特定の皮膚病学的疾患に関与している内皮細胞など)に対する効果を探索することを望むことも可能である。本発明の文脈で、分化細胞(特に皮膚細胞)内にある特定タンパク質の発現を特異的に阻害するために、したがって局所的外用使用のための組成物を調製するために、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用することが可能であることが、ここでわかった。
特許出願WO 01/58918 Khan A & al J Drug Target 2000 8 319334 Haines D.S.ら、J.Cell Biochem.1991;46:9-20 Fire A.、Trends in Genetic 1999;15:358-363 特許出願WO 01/36646 Tuschl.T.Chem.Biochem.2001;2:239-245 Nykanen A & al Cell 2001 107 309-321 AtschulらJ Molec.Biol.1990、215:403 GarrettらBioorg.Med.Chem.2000 July 8(7):19779-97 SambrookらMolecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版(1989) DNA cloning、volume I and II、D.N.Glover(1985年版) Oligonucleotide Synthesis、M.J.Gaits(1984年版) Nucleic Acid Hybridation、B.D.Hames and S.J.Higgins(1984年版) Transcription and Translation B.D.Hames and S.J.Higgins(1984年版) Animal Cell Culture、R.I.Freshney(1986年版) Immobilised Cells and Enzymes、IRL Press(1986) B.Pertal、A Practical Guide to Molecular Cloning(1984) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells、J.H.Miller and M.P.Calos、Cold Spring Harbor Laboratory(ed.1987) Methods of Enzymology、vol.154、Wu and Grossman、and 155、Wu、Mayer and Walker(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology、Academic Press、London、Scopes(1987) Protein Purification:Principle and Practice、第2版.、SpringerVerlag、N.-Y. Handbook of Experimental Immunology vol.I-IV、C.D.Weir and C.C.Blackwell(1986) 特許出願WO 01/75164 「Textbook of dermatology」、RH Champion、JL Burton、DA Burns、SM Breathnach編、第6版、1998、Blackwell Science LtD ISBN 0-632-037962 Jamora C、DasGupta R、Kocieniewski P、Fuchs E.Nature 2003 Mar 20;422(6929):317-22 Y.HEROUYら、European Journal of Dermatology、no.3、vol.10、April-May 2000、pp.173-180 Woessner J.F.、Faseb Journal、vol.5、1991、2145 「Modulation of interaction of polycations with negative unilamellar lipid vesicles」、Yaroslavovら、Colloids and surfaces B:Biointerfaces 16(1999)29-43 「Turbidometric analysis of polyelectrolyte complexes formed between poly(Llysine)and DNA」、Wardら、Colloids and surfaces B:Biointerfaces 16(1999)253-260 特許出願EP 0582503 米国特許第5439672号 特許出願EP 1 010 413 特許出願EP 1 010 414 特許出願EP 1 010 415 特許出願EP 1 010 416 特許出願EP 1 013 338 特許出願EP 1 016 453 特許出願EP 1 018 363 特許出願EP 1 020 219 特許出願EP 1 025 898 特許出願EP 1 120 101 特許出願EP 1 120 102 特許出願EP 1 129 684 特許出願EP 1 160 005 特許出願EP 1 172 077 EP 0 447 318 EP 0 557 489 EP特許0 582 503 米国特許5021200 米国特許5489426 EP特許0 879 589 特許出願EP-A-0518772 特許出願EP-A-0518773 JP-A-2-295912 TuschlらJournal of Cell Science 2001、114、4557-4565)

この理由のため、本発明は、真皮細胞および表皮細胞(メラニン形成細胞、線維芽細胞、ケラチン生成細胞、その他)などの分化細胞に作用する少なくとも1つの二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを局所適用のための使用することに関する。

本発明による使用は、上述の特徴を備えており、これまで遭遇してきた困難を克服することを可能にする。
- 皮膚表面の真核微生物内のタンパク質または真皮および表皮細胞内のタンパク質の発現を特異的に目的とする。特に、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドが標的細胞内で広がることを可能にする被覆物を選択することによって、細胞のターゲッティングを行うことが可能になる。
- 二本鎖RNAオリゴヌクレオチドによって、1つの遺伝子(または、異なる配列を有し、異なるタンパク質をコードするmRNAを標的とする複数の二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを組み合わせた組成物の場合は、複数の遺伝子)を特異的に阻害することが可能になる。
- その二重鎖構造のため、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアーゼ(RNAを分解する酵素)に対して耐性を有する。上記オリゴヌクレオチドは皮膚表面では破壊されない。
- その二重鎖構造のため、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、折りたたみと自己対形成が不可能である。
このようにして、活性産物のバイオアベイラビリティ(すなわち、求める効果を発揮する、細胞内で生ずる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの量)が顕著に改善され、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの使用量を減らすことが可能になる。

本発明による二本鎖RNAを含む組成物は、侵襲的な投与形態をとることなく標的細胞に到達することを可能にし、細胞核内に侵入する必要なくして活性を発揮するため、特に美容的または皮膚病学的な使用に適している。

対応するmRNAの発現の阻害を誘導する細胞の機構は、細胞質内で、複雑なメカニズムによって作用する。細胞内に二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを投与すると、上記オリゴヌクレオチドが標的とするmRNAの転写後消衰が関与する現象が誘発される。

作用する分子メカニズムには、21〜23ヌクレオチドの配列(二本鎖RNAオリゴヌクレオチド内に含まれ、mRNA配列の特異性の原因となる)が関与する。これら二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、dsRNAまたはsiRNA(短い干渉RNA、Tuschl.T.Chem.Biochem.2001;2:239-245参照)とも呼ばれる。そのメカニズムにはdsRNA-タンパク質複合体が関与する。その複合体は、ATP依存的方法で形成され、標的mRNAを特異的に破壊する反応を開始させる(Nykanen A & al Cell 2001 107 309-321)。

本発明の目的は、まず第1に、少なくとも10個のヌクレオチド、詳しくは12〜40個のヌクレオチド、好ましくは20〜25個のヌクレオチドを含む少なくとも1つの二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの局所適用のための使用に関する。特に好ましいのは、21〜23個のヌクレオチドを含む二本鎖RNAオリゴヌクレオチドである。

「二本鎖RNAオリゴヌクレオチド」は、その配列が少なくとも標的メッセンジャーRNAの一部と実質的に同一である二重らせん構造を有するリボ核酸配列であると理解される。

本発明による二本鎖RNAオリゴヌクレオチドのこれらの配列は、概して、内在性の配列に由来する。すなわち、その配列は哺乳動物または真核微生物ヌクレオチド配列の全部または一部を表す。その配列は、例えば、逆転写酵素を使用して哺乳動物由来メッセンジャーRNA(mRNA)から作製する遺伝子配列またはコーディングDNA(cDNA)配列でもよい。その配列はまた、イースト菌遺伝子配列でもよい。

特に、二本鎖RNAオリゴヌクレオチド配列が、ある遺伝子配列の全部または一部と対応するときは、関係する遺伝子の1つまたは複数のエクソン配列を使用するのが好ましい。

本発明による二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、置換、欠失または挿入によって修飾された1つまたは複数のヌクレオチドを含む二本鎖RNAオリゴヌクレオチドであってもよい。これらの修飾は、そのオリゴヌクレオチドが、分解メカニズムの標的となるmRNA断片を特異的に認識することを可能にするような二本鎖RNAオリゴヌクレオチド配列への修飾である。

二本鎖RNAオリゴヌクレオチドはまた、例えば、その安定性を改善する修飾骨格を有していてもよい。

例えば、天然RNA鎖のホスホジエステル結合は、少なくとも1つの窒素原子または硫黄原子を含むように修飾してもよい。さらに、本発明による二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは4つの通常塩基以外の塩基を含んでもよい。

二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの二本鎖構造は、2本の相補的一本鎖RNAを対形成させることによって得ることができる。また、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、ユニークな「自己相補的」一本鎖RNA(すなわち、折りたたまれて二重らせんを形成している一本鎖と対を形成することができる相補的配列の2断片を有する1つの鎖)の折りたたみおよび対形成によって得ることができる。

「ある遺伝子断片と実質的に同一である二本鎖RNAオリゴヌクレオチド」とは、配列が上記遺伝子断片とある程度の相同性(2つの配列間で同一である核酸塩基のパーセンテージ、AtschulらJ Molec.Biol.1990、215:403提唱の算出法を参照)を有する二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを意味すると理解され、その相同性は80%〜100%、好ましくは少なくとも90%である。

本発明の1つの好ましい実施形態において、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、長さ2〜6ヌクレオチドの対になっていない末端を示す。

本発明による二本鎖RNAオリゴヌクレオチドはまた、宿主細胞内へのトランスフェクションの効率を向上させるため、Garrettら(Bioorg.Med.Chem.2000 July 8(7):19779-97)による定義のように、ポリエチレングリコールの付加によって修飾してもよい。

本発明による二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、手動によってまたは自動的に、数多くのin vivo合成法またはin vitro合成法を使用して合成することができる。

in vitro 合成法は、化学的方法でも酵素的方法でもよい。例えば、選択したDNA(またはcDNA)配列モデルを転写するRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、SP6)を使用する。

in vivoで二本鎖RNAを合成する方法は、数多く文献に記載されている。それらは、様々な細菌またはより高度な生物の細胞型において、実施することができる[SambrookらMolecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版(1989)、DNA cloning、volume I and II、D.N.Glover(1985年版)、Oligonucleotide Synthesis、M.J.Gaits(1984年版)、Nucleic Acid Hybridation、B.D.Hames and S.J.Higgins(1984年版)、Transcription and Translation B.D.Hames and S.J.Higgins(1984年版)、Animal Cell Culture、R.I.Freshney(1986年版)、Immobilised Cells and Enzymes、IRL Press(1986)、B.Pertal、A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells、J.H.Miller and M.P.Calos、Cold Spring Harbor Laboratory(1987年版)、Methods of Enzymology、vol.154、Wu and Grossman、and 155、Wu、Mayer and Walker(1987)、Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology、Academic Press、London、Scopes(1987)、Protein Purification:Principle and Practice、第2版、SpringerVerlag、N.-Y.and Handbook of Experimental Immunology vol.I-IV、C.D.Weir and C.C.Blackwell(1986)]。また、特許出願WO 01/36646およびWO 01/75164に記載の合成方法を参照することも可能である。

使用する二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの配列は、各々の場合において、分子生物学的方法を使用して、特定の局所的使用のために選択する。美容的または皮膚病学的分野において関心対象となる生物学的標的のmRNAは、例えば後述するタンパク質であってもよいし、他の皮膚タンパク質をコードするmRNAであってもよい。

また、例えば相補的または相乗的効果を得る目的のために、異なる配列を有し、それぞれが異なる活性を有するいくつかの二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの組合せを使用することも可能である。

詳しくは、本発明は、皮膚または皮膚付属器の細胞によって発現されるタンパク質をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる少なくとも1つの二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの局所的使用に関する。

本発明はまた、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドが皮膚または頭皮の表面に存在する真核微生物によって発現されるタンパク質をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる化粧用組成物に関する。

詳しくは、上記皮膚タンパク質は、メラニン形成細胞、および/またはケラチン生成細胞、および/または線維芽細胞、および/または内皮細胞、または常在性免疫細胞(例えばランゲルハンス細胞)によって発現されるタンパク質である。そのタンパク質は、ケラチン生成細胞によって発現されるのが好ましい。

合成が低減または阻害される可能性のあるタンパク質および/またはオリゴペプチドは、細胞分化または増殖現象に関与しているものであり、以下のようなものがある。
- 成長因子EGF、TNF-α、TGF、エンドセリン、NGF、HGF、IGF、およびVEGF;
- サイトカイン、例えば、IL1、IL6、IL8などの型の;
- 受容体、EGFr、TGFr、PAR、PPAR、FXR、RXR、CB1R、CB2R、VR1、CRAB2などの型の;
- カルモジュリン、CLPおよびCLSP型のカルシウム結合タンパク質、ならびにS100A8、Sl00A9、S100A7などS100タンパク質ファミリーのカルシウム結合タンパク質;
- カルシニュリン;
- トランスグルタミナーゼ、例えば、トランスグルタミナーゼ1、3または5;
- 細胞間合着/結合を確実にするタンパク質(オクルディン、ラミニン、カベオリン、デスモグレイン、デスモコリン、コルネオデスモシン、プラコグロビン、デスモプラキン、など);
- ホスファターゼまたはプロテインホスファターゼなどタンパク質の翻訳後修飾に関与する酵素、例えば、カルシニュリン、ホスホリラーゼ、プロテインキナーゼ(例えば、PKC)、グルコシルトランスフェラーゼ、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ、など;
- プロテアーゼ(MMP、例えば1、2、3および9、エラスターゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ(カテプシンEおよびカテプシンDなど)、カテプシンL、BまたはH型のシステインプロテアーゼ、カテプシンL2、SCCL、キモトリプシン等価物、例えば、SCCE(カリクレイン7)型の、トリプシン様、例えば、SCTE(カリクレイン5)型の、ウロキナーゼ、SASPアーゼ、カスパーゼ、とりわけカスパーゼ14、カルパイン、フィラグリンの加水分解に関与するサブチリシン様プロタンパク質コンバターゼ型のプロテアーゼ(フューリン、PACE4、PC5/6およびPC7/8など)、膜内外型セリンプロテアーゼファミリーのプロテアーゼ[例えば、マトリプターゼおよび/またはそれらの内因性インヒビター(TIMP、PAI1、PAI2、アンチロイコプロテアーゼ、エラフィン、LEKTI、シスタチンA、シスタチンM/E、その他など)];
- エキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼ、(例えば、へパラナーゼ型、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチン分解酵素、アスパルチルグルコサミニダーゼ、Bグリコシダーゼ、グリコシダーゼ、その他、およびそれらの内因性インヒビター);
- 脂質代謝酵素(HMGCoA還元酵素、コレステロールスルファターゼまたはスルホトランスフェラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼ、その他など);
- チロシナーゼ、TRP-1またはTRP-2;
- エイコサノイド代謝酵素(シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ホスホリパーゼ、15-PGDH、その他など);
- I型またはII型5α還元酵素などホルモン代謝酵素;
- エラスチン、コラーゲンなどの型のマトリックスタンパク質;
- サイトケラチン型のケラチノサイト分化タンパク質 ;
- フィラグリン、水チャネルなど皮膚の水分補給に関与するタンパク質;
- 皮膚の抗菌防御に関与するタンパク質、hBD2、hBD3、ダームシディン、リボヌクレアーゼ7、など;
発現および/または活性が阻害されることが意図されるタンパク質またはペプチドの、他の限定されない例は、「Textbook of dermatology」、RH Champion、JL Burton、DA Burns、SM Breathnach編、第6版、1998、Blackwell Science LtD ISBN 0-632-037962で挙げられている。

発現が低減または阻害される真皮内メッセンジャーRNAは、線維芽細胞のメッセンジャーRNA、または真皮内に存在する他の細胞、すなわち血管の細胞、表皮付属器の細胞(例:皮脂細胞(sebocytes)、汗腺など)、および真皮内に移動することができる細胞(免疫または炎症に関与する細胞など)のメッセンジャーRNAである。

合成が低減または阻害されるタンパク質および/またはオリゴペプチドは、ケラチン生成細胞の場合に述べられるものなど、細胞分化または増殖現象に関与するものである。さらに、以下のものがある。
- 成長因子EGF、TGF、エンドセリン、NGF、HGFおよびFGF、など;
- ホスファターゼ;
- トランスグルタミナーゼ;
- ホスホリラーゼ;
- 細胞外マトリックスの更新に関与するタンパク質(プロテアーゼ:MMPメタロプロテアーゼ、ウロキナーゼなどのセリンプロテアーゼ、tPA、ヒアルロニダーゼ);
- コラーゲンなど真皮の構造タンパク質、またはプロテオグリカンタンパク質などアモルファス基質の構造タンパク質;
- リジルオキシダーゼおよびリジルヒドロキシラーゼなど、真皮の成熟に関与するタンパク質。

毛嚢など複合体構造のレベルでは、一群のsiRNAの使用が予想される。それはそれぞれ、所望の効果を得るために、毛幹の調節タンパク質および/または構造タンパク質をコードすることが知られているメッセンジャーに向けられる:
- 抗成長:例えば、細胞周期に関与するタンパク質、ならびに/またはIGF受容体および/もしくはT4甲状腺受容体;
- 抗損傷:例えば、サイトカインIL1、IL6、TNFアルファ、ならびにMCP1および/またはMMPプロテアーゼに対して向かうsiRNA、ウロキナーゼおよび/またはリポキシゲナーゼ;
- 再成長:例えば、PGF2アルファおよび/または5アルファ還元酵素の分解に関与するタンパク質;アルファ3ベータ1インテグリン、ベータカテニン、ラミニン10およびLEF-1など形態形成に関与するタンパク質;
- 毛幹の形成(カーリングまたはアンカーリングなど):例えば、毛幹の分化に関与するタンパク質(酸性または塩基性毛角質など)、および毛幹タンパク質のクロスリンクに関連する酵素(例:チオール酸化還元酵素、ならびにトランスグルタミナーゼ3および5)。この型のタンパク質の非限定的リストとして、「Jamora C、DasGupta R、Kocieniewski P、Fuchs E.Nature 2003 Mar 20;422(6929):317-22」を参照してもよい。

脂腺など複合体構造のレベルでは、一群のsiRNAの使用が予想される。それらはそれぞれ、皮脂の合成に関与するタンパク質(HMGCoa還元酵素、およびスクアレンシンターゼなど)に対して向けられる。

本発明によると、これら全ての細胞型の場合、異常タンパク質および/またはオリゴペプチド[特にウイルス活性(例えば、ゆうぜい性HPV)または癌細胞に関係するもの、またはある種の疾患において過剰発現されるもの]の発現に対して向けられるsiRNAを使用することが考えられる。名前を挙げてよいものは、例えば、ある種のサイトカイン(例えば、ILl、TNFアルファ-308およびTNFベータ+252)、受容体タンパク質(例えば、Toll様受容体、TLR)、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ、細胞接着分子(例えばCDw60)などの増殖に関係するある種のタンパク質、プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼ(角質層キモトリプシン酵素、SCCE)もしくはメタロプロテアーゼ(特に、乾癬に関与するMMP-9およびMMP-19)、または他にカルシウム結合タンパク質(カルモジュリン様セリンプロテアーゼ、CLSP)である。

本発明によると、これら全ての細胞型の場合、皮膚の治療を意図する薬剤の非活性化に関与するタンパク質および/またはオリゴペプチドの発現に対して向かうsiRNAを使用することも考えられる。例えば、乾癬の場合におけるシトクロムP450またはシトクロムCYP2Slなどの解毒タンパク質である。

本発明によると、これら全ての細胞型の場合、外的な有害変化によって誘発されるタンパク質および/またはオリゴペプチドの発現に対して向かうsiRNAを使用することが考えられる。例えば、角膜バリアの機械的/化学的損傷に続いて発生するP2Xプリン受容体に対して向かうsiRNAである。

その(皮膚)表面に存在し、内部でタンパク質および/またはオリゴペプチドの合成を低減させるか、阻害することが可能である微生物は、イースト菌および真菌などの真核生物である。非限定的に以下のものを挙げてもよい。
- 真菌症を引き起こす病原因子である皮膚糸状菌(紅色白癬菌および毛瘡白癬菌を含むトリコフィートン種)。皮膚糸状菌は好ケラチン性の糸状菌であり、すなわち毛および爪ならびに角膜層に対して優先的親和性を有する。

3つの型の皮膚糸状菌が、皮膚糸状菌症の原因となる。
1.ヒト寄生性皮膚糸状菌(これらは厳密にヒト起源である)。病原菌の例は以下の通りである。紅色白癬菌(Trichophyton rubrum)、趾間白癬菌(Trichophyton interdigitale)、菫色白癬菌(Trichophyton Violaceum)、T.Rosaceeum、断髪性白癬菌(T.Tonsurans)、スーダン白癬菌(T.Soudanensae)、シェンライン白癬菌(Trichophyton Schoenleinii)、有毛表皮糸状菌(Epidermophyton Floccosum)Microsporum Audouinii。
2.動物によって人に伝播される動物好性皮膚糸状菌。原因菌の例は、イヌ小胞子菌(Microsporum canis)、毛瘡白癬菌(Trichophyton Mentagrophytes)、およびTrichophyton Ochraceumである。
3.土によって人に伝播される好地性皮膚糸状菌。主な病原菌は、石膏状小胞子菌(microsporum gypseum)である。
- 非皮膚糸状菌[カンジダアルビカンス(C.albicans)などのカンジダ属種、S.brevicaulisなどのスコプラリオプシス属種、およびマラセジア属種]。これらは、カンジダ属によって、および癜風菌(Malassezia furfur)[以前は、pityrosporonと呼ばれた]によって代表されるイースト菌である。カンジダ属は、皮膚、爪および毛ならびに粘膜に影響を及ぼす。癜風菌(頻出する、皮膚、特に脂漏皮膚の腐生菌)は、癜風の病原因子である。死んだ皮膚の小片が、皮膚の残部から分離するように頭皮から分離するのは、全く正常であるが、一生続くこの表皮更新プロセスは、時々厄介な程度を呈することがある。見苦しいことの他、フケはまた、時に、過敏、発赤およびそう痒などのより深刻な頭皮の問題を伴うこともある。その場合、これは脂漏性皮膚炎と呼ばれる。Pityrosporum ovale菌によって促進される皮膚愁訴である。
- カビ類(角膜層の状態への関与は比較的少ない)。これらはある種の爪甲真菌症および侵襲性真菌症の原因となる。

本発明によると、カンジダアルビカンスシトクロムP450-依存性14-アルファステロールデメチラーゼおよびスクアレンエポキシダーゼ、抗真菌薬の毒性を除くためのタンパク質(トリコフィートンルブラムエステラーゼなど)、アスパラギン酸プロテアーゼ、カンジダ属ホスホリパーゼBおよびホスホリパーゼD、ならびに2,3-オキシドスクアレンシクラーゼ[22,23-エポキシ-2アザ-2,3-ジハイドロスクアレン(EAS)およびアザスクアレンアルコール(ASA)など]など、これらの生物の特定タンパク質を阻害することが考えられる。非限定的な例として、より完全な真核生物のリストは、「Textbook of dermatology」、RH Champion、JL Burton、DA Burns、SM Breathnach編、第6版、1998年、Blackwell Science LtD ISBN 0-632-037962で見られる。

より一般的には、本発明によって、siRNAは、期待される局所的効果に従って選択されかつ/または組み合わされる。先行技術を使用する場合、容易に予想できるのは、薬剤によって、または望ましくない影響の結果として誘発かつ/または抑制されるメッセンジャーRNAをストリーミングするためのDNAアレイ法を使用して、獲得かつ/または予防すべき効果と対応するsiRNAの選択および組合せを決定することである。

使用するdsRNAsは、それぞれの場合において、特定の局所的使用のために、適切な分子生物学的方法を使用して選択される。そして、これは、それぞれのメッセンジャーRNAのために、特にその一次構造に従って行われる。化粧品において関心対象となる生物学的標的のmRNAは、例えば、以下のものでありうる(これは、ある非限定的リスト内にあるものである)。チロシナーゼ、TRP-1、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、メタロプロテアーゼ、HmoCoA還元酵素、5α還元酵素、SCCE、NO合成酵素、ウロキナーゼ、表皮タンパク質のためのmRNA、など。

本発明の1つの実施形態では、チロシナーゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用する。詳しくは、その二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、5'センス鎖の配列が配列番号1:5'-UGCACCACUUGGGCCUCAAdTdTであり、5'アンチセンス鎖の配列が配列番号2:5'-UUGAGGCCCAAGUGGUGCAdTdTである。

本発明による使用はまた、TRP-1(チロシナーゼ関連タンパク質1)をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含むことができる。

そのような局所的使用は、皮膚ならびに/または毛および爪の色素脱失および/または漂白に適している。

本発明のもう1つの実施形態では、酵素好中球エラスターゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用する。

詳しくは、その二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、5'センス鎖の配列が配列番号3:5'-CGGCUACGACCCCGUAAACdTdTであり、5'アンチセンス鎖の配列が配列番号4:5'-GUUUACGGGGUCGUAGCCGdTdTである。

そうした局所的な使用は、皮膚老化の徴候(皮膚の堅固さおよび/または柔軟性の喪失、および/または皮膚の萎縮、および/または皺や小皺の形成など)を予防かつ/または抑制することを目的とする。

本発明のもう1つの実施形態では、ヒアルロニダーゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用する。

そうした局所的な使用は、皮膚老化の徴候(皮膚の堅固さおよび/または柔軟性の喪失、および/または皮膚の萎縮、および/または皺や小皺の形成など)を予防かつ/または抑制することを意図する。

本発明のもう1つの実施形態では、メタロプロテイナーゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用する。

詳しくは、メタロプロテイナーゼ(MMPs)については、Y.HEROUYらの論文に記載されている(European Journal of Dermatology、no.3、vol.10、April-May 2000、pp.173-180)。

メタロプロテイナーゼファミリーは、このように、構造および基質特異性に関する類似性に基づいて明確に定義されたいくつかの群から成っている(Woessner J.F.、Faseb Journal、vol.5、1991、2145参照)。これらの群には、以下のものがある。線維性コラーゲンを分解することを意図するコラゲナーゼ(MMP-1または間質性コラゲナーゼ、MMP-8または好中球コラゲナーゼ、MMP-13またはコラゲナーゼ3、およびMMP-18またはコラゲナーゼ4)、IV型コラーゲンまたはいずれの形態の変性コラーゲンも分解するゼラチナーゼ(MMP-2またはゼラチナーゼA(72kDa)およびMMP-9またはゼラチナーゼB(92kDa))、ストロメライシン(MMP-3またはストロメライシン1、MMP10またはストロメライシン2、およびMMP-11またはストロメライシン3)[その広域抗菌スペクトルは、糖蛋白質(フィブロネクチンおよびラミニン)、プロテオグリカンなどの細胞外マトリックスタンパク質を標的とする]、マトリライシン(MMP-7)、メタロエラスターゼ(MMP-12)、または膜メタロプロテイナーゼ(MMP-14、MMP-15、MMP-16、およびMMP-17)。

メタロプロテイナーゼ(MMP)は、タンパク質分解酵素(エンドプロテアーゼ)ファミリーのメンバーである。そのタンパク質分解酵素は、活性部位において、3つのシステイン残基と結合した1つの亜鉛原子、および1つのメチオニンを有し、中性pHで細胞外マトリックスおよび基底膜の高分子構成要素を分解する(コラーゲン、エラスチンなど)。これらの酵素は、生物界に非常に広く分布しているため、器官の成長および組織の更新など正常な生理的状況で存在するが、発現のしかたは弱い。しかし、ヒトにおいては、その過剰発現およびその活性化は、マトリックスの破壊および再構築を含む数多くのプロセスと関連がある。これによって、例えば細胞外マトリックスの制御できない再吸収(resorption)が起こる。

この性質の局所的使用は、皮膚老化の徴候(皮膚の堅固さおよび/または柔軟性の喪失、および/または皮膚の萎縮、および/または皺や小皺の形成など)を予防および/または抑制することを意図する。それらはまた、頭髪および/または体毛の成長を誘発かつ/または刺激すること、および/またはその喪失を遅延させることを目的とする使用にも適している。

本発明のもう1つの実施形態では、HMG-CoA還元酵素をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用する。

詳しくは、その二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、5'センス鎖の配列が配列番号5:5'-AGCCGCGAGGGUCGUCCAAdTdTであり、5'アンチセンス鎖の配列が配列番号6:5'-UUGGACGACCCUCGCGGCUdTdTである。

そのような局所的使用は、腋窩または足の領域で脂または汗の過剰な生産を予防かつ/または抑制することを目的とする。

本発明のもう1つの実施形態では、I型および/またはII型5α還元酵素(好ましくはI型5α還元酵素)をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用する。

詳しくは、その二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、5'センス鎖の配列が配列番号7:5'CUGCAUCCUCCUGGCCAUGdTdTであり、5'アンチセンス鎖の配列が配列番号8:5'CAUGGCCAGGAGGAUGCAGdTdTである。

そのような局所的使用は、男性ホルモン依存性疾患を治療(特に脂漏過多および/またはざ瘡を治療)すること、ならびに/または頭髪および/もしくは体毛の成長を誘導かつ/もしくは刺激すること、ならびに/または頭髪の喪失を遅延させることを意図する。

本発明のもう1つの実施形態では、カルモジュリン様皮膚タンパク質(CLSP)をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用する。

詳しくは、その二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、5'センス鎖の配列が配列番号9:5'-GGCUUUCUCCGCGGUUGACdTdTであり、5'アンチセンス鎖の配列が配列番号10:5'-GUCAACCGCGGAGAAAGCCdTdTである。

そうした局所的使用は、皮膚老化の徴候を抑制、かつ/または紫外線の有害効果を抑制、かつ/または乾燥皮膚を治療することを意図する。

本発明のもう1つの実施形態では、NO合成酵素をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用する。

そのような局所的使用は、細胞増殖および/または分化を阻害、ならびに/または皮膚細胞の分解および/もしくは破壊を阻害し、このように、内因性および/もしくは外因性老化を抑制、ならびに/または毛の喪失を遅延させることを意図する。これらの組成物はまた、特定の光誘発紅斑において、敏感皮膚および紅斑の治療に適している。

本発明のもう1つの実施形態では、ウロキナーゼなどセリンプロテアーゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用する。このタイプの組成物は、特に美容的な治療、ならびに乾燥かつ/または炎症をおこした皮膚の外見改善に適している。

本発明の他の実施形態では、下記のものをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを使用することが可能である。
- IL1(敏感な皮膚の領域における適用のため)、
- 5α還元酵素(脂肪質の皮膚の領域における適用のため)、
- 細菌性リパーゼ(フケ形成の抑制を目的とする適用のため)、あるいは、
- lox12 および/またはcox2および/またはIL1および/またはTGFβ1(毛の喪失を抑制することを目的とする適用のため)。

本発明による使用のために、上記二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、上記組成物の合計重量に基づいて、二本鎖RNA オリゴヌクレオチド5×10^-7〜5%重量、好ましくは0.0001〜1%重量の濃度で、組成物内に存在することができる。

そのような組成物は、このタイプの適用で通常使用する全ての製剤形態(galenic forms)の中で存在することができる。詳しくは、水性溶液もしくは油性溶液、水中油滴(oil-in-water)または油中水滴(water-in-oil)、またはマルチプルエマルジョン、シリコネート系(siliconated)エマルジョン、マイクロエマルジョンまたはナノエマルジョン、水性もしくは油性ゲル、または無水液体、糊状もしくは固体製品の形態である。

本発明は、もう1つの目的において、局所適用されることを意図し、生理学的に許容される媒体内に、被包された二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。

1つの好ましい実施形態において、上記組成物は、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドが、マイクロスフィア、ナノスフィア、オレオソーム、ニオソームまたはナノカプセルなど被覆のコアまたは壁の中に被包されたものである。

上記二本鎖RNAオリゴヌクレオチドは、水溶液内において、有効なモル濃度で、200〜100000g/mの分子量を有するポリエチレンイミン(PEI)と複合化することができる。PEIの性質およびその割合(10^-4〜1%)は、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含有する初期型の水溶液に依存し、予想される化粧用製剤に依存する。その初期溶液が乳白光を発することによって、上記複合体の形成を示すことができる。

上記複合体が形成されると、それは水性コアを有する粒子(ニオソームなど)内に被包されるか、または重合体もしくは陽イオン脂肪親和性界面活性剤(疎水性PEIなど)を含有する層状表面を有する小胞の表面上に複合化される。

したがって、上記二本鎖RNAオリゴヌクレオチドには、以下のようなことを行うこともできる。
- ポリカチオン(例えば、親水性PEIまたはキトサン)によって複合化する;
例えば、以下のものを選択することが可能である。ポリ(4-ビニルピリジン)由来ポリカチオン(「Modulation of interaction of polycations with negative unilamellar lipid vesicles」、Yaroslavovら、Colloids and surfaces B:Biointerfaces 16(1999)29-43);リジンの重合体および共重合体(Wardら「Turbidometric analysis of polyelectrolyte complexes formed between poly(Llysine)and DNA」に引用、Colloids and surfaces B:Biointerfaces 16(1999)253-260);BASFのLuviquatsなど、四級化ビニルイミダゾールおよびビニルピロリジンの共重合体(1000〜1000000 mw);BASFのMerquatsなどジアリルジメチルアンモニウムの塩化物ベースの共重合体(10000〜10000000 mw);キトサンおよびその誘導体などポリグルコースアミン;疎水性または非疎水性のポリエチレンイミンなどポリアミン;RhodiaのJaguarsなどグアー誘導体;National StarchのCelquats、またはAmercholのQuarisoftsなど陽イオンセルロース誘導体;ISPのGafquatsなどビニルピロリドンおよびジメチルアミノプロピルメタクリルアミドの共重合体;KingstonのHYPAN QT 100などアクリル酸の陽イオン誘導体;Allied ColloideのSalcare SC92、SC95および96、ならびにRohm GmbhのP1ex4739L;ジウレタンおよびポリウレタンの誘導体(AlzoのPolyderme PPI-SA、Foamox PPI-SA、Foamtaine PPI-SA15およびFoamquat PPI-SAなど)、ならびにコポリアミン(Henkelのpolyquart H-81など);
- この複合体は、その後、リポソーム、特にニオソームなど水性コアを有する粒子内に被包することができる(特許出願EP 0582503または米国特許第5439672号を参照);
- 重合体または陽イオン脂肪親和性界面活性剤を含有する層状表面を有する小胞の表面上で複合化する。

この後者の場合、陽イオン脂肪親和性界面活性剤は、特に四級アンモニウム塩ならびに脂肪アミンおよびそれらの塩によって形成される群から選択することができる。

四級アンモニウム塩の例は以下のものである。

式中、基R₁〜R₄(同一であっても異なっていてもよい)は、1〜30個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の脂肪族基または芳香族基(アリールまたはアルキルアリールなど)を表す。脂肪族基は、ヘテロ原子(特に、酸素、窒素、硫黄、およびハロゲンなど)を含むことができる。脂肪族基は、例えば、アルキル基、アルコキシル基、ポリオキシ(C₂-C₆)アルキレン基、アルキルアミド基、(C₁₂-C₂₂)アルキルアミド(C₂-C₆)アルキル基、(C₁₂-C₂₂)アルキル酢酸塩基、および約1〜30個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基から選択される。Xは、ハロゲン化物、リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、(C₂-C₆)アルキル硫酸塩、およびアルキル-またはアルキルアリールスルホン酸塩の群から選択される陰イオンである。化学式(II)の好ましい四級アンモニウム塩は、一方で、ジアルキルジメチルアンモニウムまたはアルキルトリメチルアンモニウム塩化物などのテトラアルキルアンモニウム塩化物(アルキル基が約12〜22個の炭素原子を含む)であり、特に、ベヘニルトリメチルアンモニウム、ジステアリルジメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ベンジルジメチルステアリルアンモニウムなどの塩化物である。あるいは、他方で、ステアラミドプロピルジメチル(ミリスチルアセテート)アンモニウムの塩化物(「CERAPHYL 70」の名称でVAN DYKによって市販)である。

(2)次の化学式のような、イミダゾリウムの四級アンモニウム塩。

式中、R₅は、8〜30個の炭素原子を有するアルケニル基またはアルキル基(例えば、獣脂脂肪酸由来)を表す。R₆は、水素原子、1〜4個の炭素原子を有するアルキル基、または8〜30個の炭素原子を有するアルケニル基もしくはアルキル基を表す。R₇は、1〜4個の炭素原子を有するアルキル基を表す。R₈は、水素原子、または1〜4個の炭素原子を有するアルキル基を表す。Xは、ハロゲン化物、リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、アルキル硫酸塩、およびアルキル-またはアルキルアリールスルホン酸塩を含む群から選択される陰イオンである。好ましくは、R₅およびR₆は12〜21個の炭素原子(例えば、獣脂脂肪酸由来)を有するアルケニル基またはアルキル基の混合物を意味し、R₇はメチル基を意味し、R₈は水素を意味する。このような生成物は、例えば、REWOによって「REWOQUAT W 75」の名称で市販されている。

(3)次式の四級ジアンモニウム塩。

R₉は、約16〜30個の炭素原子を有する脂肪族基を意味する。R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃、およびR₁₄は、水素、または1〜4個の炭素原子を有するアルキル基から選択される。Xは、ハロゲン化物、酢酸塩、リン酸塩、硝酸塩、および硫酸メチルを含む群から選択される陰イオンである。これらの四級ジアンモニウム塩は、特に、プロパン獣脂(propanetallow)ジアンモニウム二塩化物を有する。

上記二本鎖RNAオリゴヌクレオチドはまた、どのサイズの陽イオン油性滴であっても、その表面上で複合化することができる。(特許出願EP 1 010 413、EP 1 010 414、EP 1 010 415、EP 1 010 416、EP 1 013 338、EP 1 016 453、EP 1 018 363、EP 1 020 219、EP 1 025 898、EP 1 120 101、EP 1 120 102、EP 1 129 684、EP 1 160 005およびEP 1 172 077を参照)

上記二本鎖RNAオリゴヌクレオチドはまた、層状コーティングを備え(EP 0 447 318およびEP 0 557 489を参照)、表面に陽イオン界面活性剤を含有する(陽イオン界面活性剤については、前掲の参考文献を参照)ナノカプセルまたはナノ粒子の表面で複合化することができる。

詳しくは、本発明による、好ましい小胞は以下のものである。
- EP特許0 582 503に記載されたニオソーム。
- 合成の方法が米国特許5021200に記載された脂質小球。
- 米国特許5489426に記載された水中油滴ニオソーム。
- EP特許0 879 589で提案されたナノエマルジョン。

次のような脂質を使用するのが好ましい。すなわち、C10〜C22アルキル鎖上にグラフトして疎水化したPEI(5〜50%)。そのアルキル鎖は、不飽和もしくは飽和の、または分岐状もしくは非分岐状の、ステアリルアミンまたはベヘニルトリアンモニウム塩化物である。

より詳しくは、直径が2μm以下、好ましくは50nm〜1μmである小胞が好ましい。

また、ガス推進システムまたは極微針パッチなどの物理的な皮内投与方法を使用することが可能である。

図1(極微針パッチを表す)において、ミニダート(円錐体)は、小胞内に被包されたdsRNAが到達すべき深さ(表面の表皮、深部の表皮、表面の真皮、その他)に対応する高さを有する。パッチのサイズは、例えば、色素班または皺の領域に合わせることができる。

より詳細には、局所適用を意図する上記組成物は、多かれ少なかれ液状であり、白色または着色クリーム状、軟膏状、ミルク状、ローション状、漿液状、ペースト状、ムース状、またはゲル状の外見を有することができる。それは、必要に応じて、エアゾールの形で皮膚に適用することができる。それはまた、固形状および、例えばスティック状にすることもできる。それは、治療用製品としておよび/または皮膚化粧用製品として使用することができる。

このように、本発明による組成物は、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドに加えて、以下のものから選択した少なくとも1つの活性化合物を含むことができるが、このリストに限定されるものではない。α-ヒドロキシ酸;サリチル酸およびその誘導体(n-オクタノイル-5-サリチル酸など);HEPES;プロシステイン;0-オクタノイル-6-D-マルトース;メチルグリシン二酢酸の二ナトリウム塩;セラミド;ジオスゲニンなどのステロイドおよびDHEAの誘導体;コウジ酸;N-エチルオキシカルボニル-4-パラアミノフェノール;アスコルビン酸およびその誘導体;コケモモ抽出物;レチノイドならびに、特にレチノールおよびそのエステル;ポリペプチドおよびそのアシル化誘導体;植物ホルモン;イースト菌酵母(Saccharomyces cerevisiae)抽出物;藻類抽出物;Vitreoscilla filiformis抽出物;大豆、ハウチワマメ、トウモロコシおよび/またはエンドウの抽出物;アルベリンおよびその塩、特にアルベリンクエン酸塩;レスベラトロル;カロチノイドおよび、特にリコピン;トコフェロールおよびそのエステル;補酵素Q10またはユビキノン;キサンチンならびに、特に、カフェインおよびそれを含む天然抽出物;ナギイカダおよびセイヨウトチノキの抽出物;およびこれらの混合物。

さらに、本発明による組成物は、少なくとも1つのUVAおよび/またはUVBフィルターを含むことができる。上記サンスクリーンフィルターは、有機フィルターおよび無機フィルターならびにそれらの混合物から選択することができる。

UV-Aおよび/またはUV-Bにおいて作用し、特に挙げることのできる有機フィルターの例は、CTFA名によって下記のように呼ばれるものである。
- パラアミノ安息香酸の誘導体:PABA、エチルPABA、エチルジヒドロキシプロピルPABA、エチルヘキシルジメチルPABA(特に、「ESCALOL 507」の名称でISPによって市販されている)、グリセリルPABA、PEG-25 PABA(「UVINUL P25」の名称でBASFによって市販されている)
- サリチル酸誘導体:ホモサラート(「EUSOLEX HMS」の名称でRONA/EM INDUSTRIESによって市販)、エチルヘキシルサリチル酸塩(「NEO HELIOPAN OS」の名称でHAARMANN and REIMERによって市販)、ジプロピレングリコールサリチル酸塩(「DIPSALに」の名称でSCHERによって市販)、TEAサリチル酸塩(「NEO HELIOPAN TS」の名称でHAARMANN and REIMERによって市販)、
- ジベンゾイルメタンの誘導体:ブチルメトキシジベンゾイルメタン(特に、商品名「PARSOL 1789」でHOFFMANN LA ROCHEによって市販)、イソプロピルジベンゾイルメタン、
- ケイ皮の誘導体:メトキシケイ皮酸エチルヘキシル(特に、商品名「PARSOL MCX」でHOFFMANN LA ROCHEによって市販)、メトキシケイ皮酸イソプロピル、メトキシケイ皮酸イソアミル(商品名「NEO HELIOPAN E 1000」でHAARMANN and REIMERによって市販)、シノキセート、メトキシケイ皮酸DEA、メチルケイ皮酸ジイソプロピル、ジメトキシケイ皮酸エチルヘキサン酸グリセリル、
- β,β'-ジフェニルアクリル酸塩の誘導体:オクトクリレン(特に、商品名「UVINUL N539」でBASFによって市販)、エトクリレン(商品名「UVINUL N35」でBASFによって市販)、
- ベンゾフェノンの誘導体:ベンゾフェノン-1(商品名「UVINUL 400」でBASFによって市販)、ベンゾフェノン-2(商品名「UVINUL D50」でBASFによって市販)、ベンゾフェノン-3またはオキシベンゾン(商品名「UVINUL M40」でBASFによって市販)、ベンゾフェノン-4(商品名「UVINUL MS40」でBASFによって市販)、ベンゾフェノン-5、ベンゾフェノン-6(商品名「HELISORB 11」でNORQUAYによって市販)、ベンゾフェノン-8(商品名「SPECTRA-SORB UV-24」でAMERICAN CYANAMIDによって市販)、ベンゾフェノン-9(商品名「UVINUL DS-49」でBASFによって市販)、およびベンゾフェノン12、
- ベンジリデンカンフルの誘導体:3-ベンジリデンカンフル、4-メチルベンジリデンカンフル(「EUSOLEX 6300」の名称でMERCKによって市販)、ベンジリデンカンフルスルホン酸、カンフルベンザルコニウムメトサルフェート、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸、およびポリアクリルアミドメチルベンジリデンカンフル、
- フェニルベンゾイミダゾールの誘導体:フェニルベンゾイミダゾールスルホン酸(特に、商品名「EUSOLEX 232」でMERCKによって市販)、およびベンゾイミダジラート(benzimidazilate)(商品名「NEOHELIOPAN AP」でHAARMANN and REIMERによって市販)、
- トリアジンの誘導体:アニソトリアジン(商品名「TINOSORB S」でCIBA GEIGYによって市販)、エチルヘキシルトリアゾン(特に、商品名「UVINUL T150」でBASFによって市販)、およびジエチルヘキシルブタミドトリアゾン(商品名「UVASORB HEB」でSIGMA 3Vによって市販)
- フェニルベンゾトリアゾールの誘導体:
ドロメトリゾールトリシロキサン(「SILATRIZOLE」の名称でRHODIA CHIMIEによって市販)
- アントラニル誘導体:メンチルアントラニル酸塩(商品名「NEO HELIOPAN MA」でHAARMANN and REIMERによって市販)
- イミダゾリン誘導体:プロピオン酸エチルヘキシルジメトキシベンジリデンジオキソイミダゾリン、
- ベンザルマロン酸の誘導体:ベンザルマロン酸官能基を有するポリオルガノシロキサン(商品名「PARSOL SLX」でHOFFMANN LA ROCHEによって市販)、
- およびそれらの混合物。

特により好ましい有機UVフィルタは、以下の化合物から選択される。
- サリチル酸エチルヘキシル、
- ブチルメトキシジベンゾイルメタン、
- メトキシケイ皮酸エチルヘキシル、
- オクトクリレン、
- フェニルベンゾイミダゾールスルホン酸、
- テレフタリリデンジカンフルスルホン酸、
- ベンゾフェノン-3、
- ベンゾフェノン-4、
- ベンゾフェノン-5、
- 4-メチルベンジリデンカンフル、
- ベンゾイミダジラート(benzimidazilate)、
- アニソトリアジン、
- エチルヘキシルトリアゾン、
- ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン、
- メチレンビス-ベンゾトリアゾイルテトラメチルブチルフェノール、
- ドロメトリゾールトリシロキサン、
- およびそれらの混合物。

本発明による組成物において使用可能な無機フィルターは、特に、コーティングされている、またはコーティングされていない金属酸化物のナノピグメント(主要粒子の平均サイズが、一般に5nm〜100nm、好ましくは10nm〜50nm)である。酸化チタン(ルチルおよび/または鋭錐石形状でのアモルファスまたは結晶状)、酸化鉄、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、または酸化セリウムのナノピグメントなどである。さらに、コーティング剤は、アルミナおよび/またはアルミニウムステアリン酸塩である。コーティングされた、またはコーティングされていないこれらの金属酸化物ナノピグメントは、特に、特許出願EP-A-0518772およびEP-A-0518773に記載されている。

本発明の組成物はまた、周知の方法で、美容的および皮膚病学的な分野において慣習的な補助的物質(親水性または脂肪親和性ゼラチン化剤、防腐剤、抗酸化剤、溶媒、界面活性剤、増粘剤、香水、充填材、ピグメント、臭気吸収剤、および着色物質など)を含むことができる。これら補助的物質の量は、当該分野で通常使用される量であり、例えば、組成物合計重量の0.01〜20%である。これら補助的物質は、その性質に従って、脂肪相へも水相へも導入することができる。これら補助的物質およびその濃度は、パントテインスルホン酸またはその塩の有利な特性を損なわないようなものであるべきである。本発明の組成物がエマルジョンである場合、脂肪相の割合は、組成物の合計重量の5%〜80%、好ましくは5%〜50%重量の範囲であることができる。エマルジョン状の組成物において使用する、油、乳化剤および共乳化剤は、当該分野で通常使用されるものから選択する。乳化剤および共乳化剤は、組成物合計重量の0.3%〜30%、好ましくは0.5%〜20%重量の範囲の割合で、組成物内に存在する。

本発明の組成物内に使用することができ、挙げることのできる油の例は、以下の通りである。
- 動物起源の炭化水素油(ペルヒドロスクアレンなど);
- 野菜起源の炭化水素油(4〜10個の炭素原子を含む液体脂肪酸トリグリセリドおよびカリテバターの液体留分など);
- 合成エステルおよびエーテル(特に脂肪酸の)。例えば、化学式R¹COOR²およびR¹OR²の油(式中、R¹は8〜29個の炭素原子を有する脂肪酸の残基を表し、R²は3〜30個の炭素原子を有する分岐状または非分岐状の炭化水素鎖を表す)。パーセリン油、イソノナン酸イソノニル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸エチル-2-ヘキシル、ステアリン酸オクチル-2-ドデシル、オクチル-2-ドデシルエルカート、およびイソステアリン酸イソステアリルなどである;ヒドロキシル化エステル(乳酸イソステアリル、ステアリン酸オクチルヒドロキシ、ステアリン酸オクチルドデシルヒドロキシ、リンゴ酸ジイソステアリル、クエン酸トリイソセチル、ヘプタノエートなど)、ならびに脂肪アルコールのオクタノアートおよびデカノアート;多価アルコールエステル(プロピレングリコールジオクタノアート、ネオペンチルグリコールジヘプタノエート、およびジエチレングリコールジイソノナノアートなど);およびペンタエリスリトールエステル(テトライソステアリン酸ペンタエリスリチルなど);
- 鉱物起源または合成起源の直鎖状または分岐状炭化水素(揮発性または不揮発性パラフィン油およびそれらの誘導体、ペトロラタム、ポリデセン、ならびにパーリーム(parleam)油などの水添ポリイソブテンなど);
- 8〜26個の炭素原子を有する脂肪アルコール。セチルアルコールおよびステアリルアルコールならびにそれらの混合物(セチルステアリルアルコール)、オクチルドデカノール、2ブチルオクタノール、2-ヘキシルデカノール、2-ウンデシルペンタデカノール、オレイン(oleic)アルコール、またはリノール(linoleic)アルコールなど;
- 部分的に炭化水素質(hydrocarbonaceous)および/またはケイ素質(siliconaceous)であるフッ化油(文書JP-A-2-295912に記載されているものなど);
- 直鎖状または環状ケイ素質鎖を有し、周囲温度で液状または糊状である、揮発性または不揮発性ポリメチルシロキサン(PDMS)などのシリコーン油、特に、シクロヘキサシロキサンなどのシクロポリジメチルシロキサン(シクロメチコン);垂下したまたはケイ素質鎖の末端に、アルキル基、アルコキシル基またはフェニル基を含むポリジメチルシロキサン(基は2〜24個の炭素原子を有する);フェニルトリメチコン、フェニルジメチコン、フェニルトリメチルシロキシジフェニルシロキサン、ジフェニルジメチコン、ジフェニルメチルジフェニルトリシロキサン、2-フェニルエチルトリメチルシロキシシリカート、およびポリメチルフェニルシロキサンなどのフェニル化シリコーン;
- それらの混合。

本発明に使用することができ、挙げることのできる乳化剤および共乳化剤の例は、以下のものである。脂肪酸およびポリエチレングリコールのエステル(特に、PEG-100ステアラート)などのO/W乳化剤、ならびに脂肪酸およびグリセロールのエステル(ステアリン酸グリセリルなど)、同様に商品名ABIL WE09でDegussa Goldschmidtから入手可能なオキシエチレン化ポリ(メチルセチル)(ジメチル)メチルシロキサンなどのW/O乳化剤、または商品名UNITWIXでGuardianによって市販されている、エチレングリコールアセチルステアラートとトリステアリン酸グリセリルの混合物。

挙げることのできる親水性ゼラチン化剤は、特に、カルボキシビニル重合体(カルボマー)、アクリル重合体(アクリル酸塩/アルキルアクリル酸塩共重合体など)、ポリアクリルアミド、多糖体、天然ゴム、および粘土である。一方、挙げることのできる脂肪親和性ゼラチン化剤は、ベントナイトなど修飾された粘土、脂肪酸の金属塩、疎水性二酸化ケイ素、およびポリエチレンである。

本発明の組成物において使用することができ、挙げることのできる充填材の例は以下のものである。色素に加えて、二酸化ケイ素粉末;タルク;DRY FLO PLUS(28-1160)の名称でNational Starchによって市販されているオクテニルコハク酸無水物と架橋された澱粉;ポリアミド粒子(特に、ORGASOLの名称でAtochemによって販売されているもの);ポリエチレン粉末;アクリル共重合体をベースとするマイクロスフィア(ジメタクリル酸エチレングリコール/メタクリル酸ラウリル共重合体でできており、POLYTRAPの名称でDow Corning によって販売されているものなど);中空のマイクロスフィアなど膨張させた粉末。特に、EXPANCELという名称でKemanord Plastによって市販されているマイクロスフィア、またはMICROPEARL F 80 EDの名称でMatsumotoによって市販されているマイクロスフィア;TOSPEARLの名称でToshiba Siliconeによって市販されているものなどシリコーン樹脂マイクロビーズ;および、それらの混合物。これらの充填材は、本発明による組成物または製剤の合計重量に基づく、0〜20%重量、好ましくは1〜l0%重量の範囲の量で存在することができる。

当業者は、本発明による組成物内に存在する二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの活性を損なわない成分および活性化合物を使用するように注意するであろう。

本発明のもう1つの目的は、前に定義したように、生理学的に許容される媒体内に、少なくとも1つの二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含む組成物を、治療部位に、局所適用することを含む美容的治療方法に関する。有利なことに、上記組成物は、皮膚および/もしくは頭皮ならびに/または毛および爪に、一度だけまたは繰り返し何度も適用される。

上記方法は、皮膚または爪および毛を色素脱失かつ/または漂白する方法であることもできる。その方法は、本発明による組成物(特にチロシナーゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、および/またはTRP-1をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含む組成物)を治療部位に適用すことを特徴とする。

本発明はまた、老化の皮膚的徴候の予防および/または抑制のための美容的治療方法に関する。この方法は、好中球エラスターゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、および/またはヒアルロニダーゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、および/またはメタロプロテイナーゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、および/またはHMG-CoA還元酵素をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、および/またはカルモジュリン様皮膚タンパク質(CLSP)をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、および/またはNOシンターゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含む組成物を、治療部位に適用することを特徴とする。

本発明はまた、頭髪および/または体毛の成長を誘発かつ/または刺激するための、および/または頭髪の喪失を遅延させるための美容的治療方法に関する。この方法は、メタロプロテイナーゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、および/またはI型またはII型5α還元酵素をコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、および/またはNOシンターゼをコードするメッセンジャーRNAの発現を阻害することができる二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含む組成物を、治療部位に適用することを特徴とする。

以下の実施例は、本発明の例示を意図したものである。これらの例において、以下の図を参照する。

RNA干渉を使用してチロシナーゼの発現を阻害する
材料と方法:
実験の条件は、Tuschlら(Journal of Cell Science 2001、114、4557-4565)によって記載されたものである。

トランスフェクションの24時間前、メラニン形成細胞(MeWo細胞)を、24ウェルプレートに入れたDMEM培養液500μl+10%血清内に、40000細胞/ウェルの割合で植え付ける。0.84μgまたは2.52μgの二重鎖siRNA(下記参照)、すなわち、アニーリング緩衝液(Dharmacon)3μl中のチロシナーゼsiRNA60pmol、またはアニーリング緩衝液9μl中のチロシナーゼsiRNA180pmolを、それぞれ、ウェル毎に使用する。20μMチロシナーゼ二重鎖siRNA3μlまたは9μlを、50μlのOpti-MEM(Gibco)内で希釈する。もう1つの試験管内で、オリゴフェクタミン(Invitrogen)3μlを、12μlのOpti-MEM内で希釈し、10分間室温でインキュベートする。2つの溶液を混合し、20分間室温でインキュベートした後、細胞に加える。その後、上記細胞を37℃で96時間インキュベートする(24時間後、培地を取り替える)。そしてその後、Tris-HCl10mM、pH7.2、2%SDS、1%Triton X-100、10%グリセロール+1%タンパク質分解酵素インヒビターを含有する緩衝液内で溶解させる。その後、ポリアクリルアミドゲル(NuPAGE Novex bis-Tris gels、Invitrogen)に、ウェル毎にタンパク質34μgを加え、電気泳動法によって分離し、供給元の指示に従ってウエスタンブロット法でトランスファーさせる。膜上のチロシナーゼの有無は、1/500に希釈した抗チロシナーゼ抗体(NCL-TYR、Novocastra)とハイブリダイズして分析する。そして、加えたタンパク質の量は、1/40000に希釈した抗ビメンチン抗体(VIM3B4 clone、Cymbus Biotechnologies)とハイブリダイズして確認する。その膜を、PBSTween 20内ですすぎ、1/2000に希釈したペルオキシダーゼ結合型抗マウス二次抗体(ヤギ抗マウスHRP、Dako)とハイブリダイズする。検出は、「ECL Plusウェスタンブロット法検出システム(ECL Plus western blotting detection system)」キットを使用し、供給元(Amersham)の指示に従って行う。

以下のsiRNA二重鎖は、ヒトチロシナーゼcDNA(登録番号M27160)をコードする配列から選択する。隣にある数は、核酸配列内の第1ヌクレオチドの位置と一致する。二重鎖は、Dharmaconによって合成、またはProligoによって提供されるDNAオリゴヌクレオチドから合成し、「siRNA構築キット」(Ambion)を使用し、その供給元の指示に従ってRNA内に転写する。RNAセンス鎖とRNAアンチセンス鎖を有する7つの二重鎖は、以下の配列から成る。AUGはリボ核酸塩基であり、dTはデオキシリボ核酸塩基である。
・siRNA-TYR266 duplex:
siRNA 5'センス鎖(配列番号1):UGCACCACUUGGGCCUCAAdTdT
siRNA 5'アンチセンス鎖(配列番号2):UUGAGGCCCAAGUGGUGCAdTdT
・siRNA-TYR359 duplex:
siRNA 5'センス鎖(配列番号11):AAGUGUUUGAUGCUGGAGGdTdT
siRNA 5'アンチセンス鎖(配列番号12):CCUCCAGCAUCAAACACUUdTdT
・siRNA-TYR690 duplex:
siRNA 5'センス鎖(配列番号13)::GCACCAGCUUUUCUGCCUUdTdT
siRNA 5'アンチセンス鎖(配列番号14):AAGGCAGAAAAGCUGGUGCdTdT
・siRNA TYR832 duplex:
siRNA5'センス鎖(配列番号15):ACUGCACAGAGAGACGACUdTdT
siRNA 5'およびセンス鎖、(配列番号16):AGUCGUCUCUCUGUGCAGUdTdT
・siRNA-TYR1110 duplex:
siRNA 5'センス鎖(配列番号17):GCACCAGCUUUUCUGCCUUdTdT
siRNA 5'アンチセンス鎖(配列番号18):AAGGCAGAAAAGCUGGUGCdTdT
・siRNA-TYR1578 duplex:
siRNA 5'センス鎖(配列番号19):AGCAGCAUGCACAAUGCCUdTdT
siRNA 5'アンチセンス鎖(配列番号20):AGGCAUUGUGCAUGCUGCUdTdT
・siRNA-TYR2120 duplex:
siRNA 5'センス鎖(配列番号21):AGCCUGACCUCACUCUAACdTdT
siRNA 5'アンチセンス鎖(配列番号22):GUUAGAGUGAGGUCAGGCUdTdT

結果を、図2に示す。

列は、以下の生成物に対応する。
L:分子量ラダー(ladder)
C:MeWo対照(control)
1:MeWo+TYR266 siRNA、0.84μg
2:MeWo+TYR266 siRNA、2.52μg
3:MeWo+TYR359 siRNA、0.84μg
4:MeWo+TYR359 siRNA、2.52μg
5:MeWo+TYR690 siRNA、0.84μg
6:MeWo+TYR690 siRNA、2.52μg
7:MeWo+TYR832 siRNA、0.84μg
8:MeWo+TYR832 siRNA、2.52μg
9:MeWo+TYR1110 siRNA、0.84μg
10:MeWo+TYR1110 siRNA、2.52μg
11:MeWo+TYR1578 siRNA、0.84μg
12:MeWo+TYR1578 siRNA、2.52μg
13:MeWo+TYR2120 siRNA、0.84μg
14:MeWo+TYR2120 siRNA、2.52μg

チロシナーゼ発現の消滅は、ウエスタンブロット法によって確認する。選択した7つの二重鎖のうち、1つの二重鎖は効果がなく(359 siRNA)、1つの二重鎖はわずかに効果があり(1578 siRNA)、他の5つの二重鎖は有効であるように見える。二重鎖1110および2120の場合、非常に強力な有効性を有するように見える。それは、チロシナーゼが検出されないことによって示される。したがって、チロシナーゼの特異的インヒビターは、表皮細胞によるタンパク質の発現を「RNA干渉」によって阻害するために使用される。

組成物
組成物1:二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを、陽イオン小胞の表面で複合化する。
小胞の調製:
イソステアリン酸PEG 400 8%
イソステアリン酸でアミド化したポリエチレンイミン(200〜100000MWのPEI) 2%
蒸留水 100%にメスアップ

配列番号1および配列番号2の二本鎖RNAオリゴヌクレオチド(dsRNA/PEI比率は0.1〜1000)。

小胞の調製に関係する工程:
- メタノール/クロロホルム混合物内で、脂質を可溶化する;
- 脂質フィルムを得るために、減圧下の回転式蒸発器内で溶媒を蒸発させる;
- 超音波処理をしながら、上記フィルムを水和させる;
- 小胞の直径を確認する(1μm未満、好ましくは200nm);
- 二本鎖RNAオリゴヌクレオチド溶液を追加する。

化粧用組成物:
その後、小胞を、局所適用に適した化粧用製剤に組み込む。

この製剤を毎日適用(好ましくは夕方)すると、色素斑が減少する。規則的かつ長期的な適用によって、これらの色素斑は消滅する。

組成物2:dsRNAを、陽イオン小胞の内部で複合化する
A)ポリカチオン/二本鎖RNAオリゴヌクレオチド複合体を被包する:
ステアリン酸POE(8) 5.5%
コレステロール 4%
イソステアリン酸でアミド化したポリエチレンイミン(200〜100000MW) 0.5%
水溶液A:蒸留水、30%、PEI(200〜100000MW)、1%、および二本鎖RNAオリゴヌクレオチド、(補うためにメスアップ)。
水溶液B:蒸留水、100%にメスアップ

B)小胞を調製する工程
組成物1の製法を参照。この場合、水和工程は、超音波処理によって、上記脂質混合物に適した温度で、溶液Aで行われ、その後、水溶液Bで希釈する工程が行われる。

化粧用組成物:
小胞を、その後、局所適用に適した化粧用製剤に組み込む。

このように、その後、組成物1および組成物2を、当業者に慣習的な方法で、以下の製剤に導入することができる。成分はCTFA命名法に従って同定される。
グリセロール 5%
防腐剤 1%
EDTA二ナトリウム 0.2%
カルボマー 0.5%
トリエタノールアミン 0.25%
ポリアクリロイルジメチルタウリン酸アンモニウム* 0.3%
ヒアルロン酸ナトリウム 0.1%
植物油 3%
アクリルアミド/アクリロイルジメチルタウリン酸ナトリウム、
ならびにイソドデカンおよびポリソルベート-80** 2%
シクロペンタシロキサンおよびジメチコノール 3%
例1または2による小胞懸濁液 1〜25%
水 100%にメスアップ
* CLARIANTによって供給されるHostacerin AMPS
** SEPPICによって供給されるSimulgel 600

二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを投与するために使用することができる極微針パッチを表す図である。 RNA干渉による、ヒトメラニン形成細胞(MeWo)内チロシナーゼの発現の特異的消滅を表す図である。

配列表

Claims (7)

1. センス鎖およびアンチセンス鎖の配列が、配列番号1および2、配列番号13および14、配列番号15および16、配列番号17および18、配列番号19および20、ならびに、配列番号21および22で規定されたsiRNA二重鎖からなる群から選択される、二本鎖RNAオリゴヌクレオチド。
2. 皮膚または毛および爪を色素脱失かつ/または漂白することを意図する薬剤を作製するための、少なくとも1つの請求項1に記載の二本鎖RNAオリゴヌクレオチドの使用。
3. 生理学的に許容される媒体内に、少なくとも1つの請求項1に記載の二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを含む、皮膚または毛および爪を色素脱失かつ/または漂白するための局所用組成物。
4. 前記二本鎖RNAオリゴヌクレオチドが、被膜中に被包された、請求項3に記載の局所用組成物。
5. 前記被膜が、マイクロスフィア、ナノスフィア、オレオソーム、およびナノカプセルから選択されることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
6. 前記被膜の直径が2μm以下であることを特徴とする、請求項4または5に記載の組成物。
7. 前記二本鎖RNAオリゴヌクレオチドが、前記組成物の合計重量に基づき5×10^-7〜5重量%を示すことを特徴とする、請求項3から6のいずれか一項に記載の組成物。

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