JP4475237B2 - Ｎｍｒシグナル帰属方法 - Google Patents

Description

本発明は、^１５Ｎ／^１３Ｃ標識アミノ酸と^１５Ｎ標識アミノ酸等を組み合わせた蛋白質を用いてＮＭＲ測定を行うことにより、低濃度の蛋白質で迅速確実にアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナル（本明細書中では、これを「^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル」あるいは「^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナル」と称することがある）等の蛋白質の主鎖を構成する原子のシグナルのアミノ酸残基番号を帰属する方法、さらにそれらを基にした蛋白質の側鎖を含めた全ての原子のシグナルの帰属を決定する方法に関する。

蛋白質中の窒素原子を、安定同位体でＮＭＲ観測可能な^１５Ｎを用いて標識し、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣ（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｎｇｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）スペクトルを観測することにより、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル等のＮＭＲ測定により得られた各シグナルのアミノ酸の種類と番号まで含めた帰属を行い（例えばＣａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照）、それらのデータを基に、蛋白質立体構造を決定したり（例えばＭｏｎｔｅｌｉｏｎｅ，Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７，Ｓｕｐｐｌ，９８２−９８５（２０００）を参照）、蛋白質に結合するリガンドのスクリーニングや結合部位の同定（例えばＺｅｒｂｅ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＮＭＲ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｉｌｅｙ（２００３）を参照）を行うことができる。
^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣの測定方法は、蛋白質のＮＭＲ測定法の中でも最も感度の高い方法の一つであるが、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルの各シグナルのアミノ酸の種類と番号まで含めた帰属を決定する場合には、高濃度の標的蛋白質試料（１ｍＭで２５０μＬ程度）を何らかの手段を用いて調製し、室温以上の温度で、数週間に及ぶ複数の３次元ＮＭＲ測定を行い、さらには複雑な解析を行う必要があった（例えばＭｏｎｔｅｌｉｏｎｅ，Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７，Ｓｕｐｐｌ，９８２−９８５（２０００）を参照）。特に、分子量１万を越えるような蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルの帰属は従来法では、シグナルの重なりを回避するため、シグナルの分離を良くする３次元ＮＭＲ測定法を複数種類用いないと行えなかった。また、帰属の曖昧さを回避するために感度の低い測定法（例えばＳａｔｔｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，３４（１９９９）９３−１５８を参照）を併用せざるを得ず、そのために、最も感度のよい多核２次元ＮＭＲ法である^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法に必要な蛋白質試料の１０〜２０倍程度濃度の高い^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化蛋白質を調製する必要があり、溶解度の低い蛋白質については、解析が行えなかった。
一般的に、高分子量蛋白質を１ｍＭ程度の高濃度に溶解させることは困難であることが多く、また、室温以上の温度で数週間安定に存在させることも困難であることが多い。さらに、この２つの条件を満たして各種スペクトルが測定できても、その後の解析は、熟練者が行って数週間以上要するものであった。
また、３次元ＮＭＲ法を使わないシグナルの帰属方法としては、１種類のアミノ酸のＣのみを^１３Ｃ標識化し、別の１種類のアミノ酸のみを^１５Ｎ標識化した標的蛋白質を用いて、１つの残基の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣシグナルを同定する方法（例えばＹａｂｕｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，１１，２９５−３０６（１９９８）を参照）が報告されている。この方法は目的蛋白質の濃度の問題と蛋白質の安定性の問題を解決はしているが、実際にこの方法を^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣの全てのシグナルの帰属に用いるためには、数十種類から数百種類のさまざまな標識化を行った目的蛋白質を調製し、なおかつ、サプレッサーｔＲＮＡを用いた複雑な鋳型の作成を行わなくてはならない。よって、この方法が実際に蛋白質の全ての^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣ等のＮＭＲで得られるシグナルの帰属に使われたことはなかった。また、ＷＯ２００２／３３４０６号公報にも、上記と同様、目的アミノ酸を^１３Ｃで標識し、隣接アミノ酸を^１５Ｎで標識し、^１３Ｃの隣の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルを検出する方法が記載されている。しかし、この方法においても、隣接するアミノ酸の全ての組み合わせをラベルした蛋白質を合成する必要があり、また隣接するアミノ酸が同じ並びで２箇所以上に存在した場合にはシグナルの帰属を行うことができないという問題があった。
そこで、目的蛋白質を低濃度で少量用いて、かつ簡便に、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル等のＮＭＲにより得られたシグナルのアミノ酸の種類と番号の帰属を決定する方法が求められていた。

本発明が解決しようとする課題は、感度のよい^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣ測定方法で観測可能な蛋白質最低濃度の、数倍から１０倍以上の蛋白質濃度が必要であった従来のシグナル帰属方法に代わり、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣ測定等で得られたシグナルを高効率かつ迅速に帰属する方法の提供、該方法を用いた高効率または迅速な標的蛋白質の立体構造特定方法あるいは目的蛋白質とリガンドとの結合部位を特定する方法を提供することにある。本発明が解決しようとする別の課題は、上記した本発明による蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法に用いられる試薬キットを提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、目的タンパク質を、構成するアミノ酸ごとに^１５Ｎ／^１３Ｃ二重標識化アミノ酸と^１５Ｎ標識化アミノ酸等、および標識化されていないアミノ酸を系統的に組み合わせて基質に用いて複数の蛋白質を合成し（最大２０種類あるいは３９種類）、これを隣接する２つのアミノ酸残基の相関シグナルを同定し得る測定方法でＮＭＲ測定を行って、得られたシグナルを比較したところ、ＮＭＲ測定によって得られたシグナルを帰属できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法であって、
（ｉ）蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸の２位および／又は１位の炭素原子と２位の窒素原子が、それぞれＮＭＲで測定可能なように二重標識され、さらに少なくとも同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子、炭素原子、水素原子のいずれかがＮＭＲで測定可能なように標識された蛋白質を調製し、
（ｉｉ）該蛋白質について、二重標識されたアミノ酸に隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと標識された原子との相関シグナルのみを同定可能なＮＭＲ測定を行い、
（ｉｉｉ）該シグナルを、同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子、炭素原子、水素原子のいずれかが標識された蛋白質をＮＭＲ測定することにより得られた、同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと標識された原子との相関シグナルと比較して、同定しようとするアミノ酸のシグナルの帰属を決定することを特徴とする方法。
（２）蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法であって、
（ｉ）蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸が、その２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで、また２位の窒素原子が^１５Ｎで二重標識され、さらに少なくとも同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質を調製し、
（ｉｉ）該蛋白質について、二重標識されたアミノ酸に隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルのみが同定可能なＮＭＲ測定を行い、
（ｉｉｉ）該シグナルを、同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子のみが^１５Ｎ標識された蛋白質をＮＭＲ測定することにより得られた同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルと比較して、同定しようとするアミノ酸のシグナルの帰属を決定することを特徴とする方法。
（３）蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法であって、
（ａ）蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸について上記（２）に記載の方法で帰属を決定し、
（ｂ）該アミノ酸の２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで、また２位の窒素原子が^１５Ｎで二重標識され、さらに少なくとも同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質を調製し、
（ｃ）該蛋白質について、二重標識されたアミノ酸残基の^１３Ｃとアミドプロトンの相関シグナルと、二重標識したアミノ酸残基の^１３Ｃと隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンの相関シグナルのみを同定可能なＮＭＲ測定を行い、
（ｄ）同定しようとするアミノ酸と上記で二重標識したアミノ酸のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルを取得し、
（ｅ）（ｄ）で得られたシグナル中の帰属が決定されているアミノ酸のアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナル中から選択し、
（ｆ）選択されたシグナルの^１３Ｃの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナル中から選択し、
（ｇ）選択されたシグナルのアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナル中から選択し、該シグナルを、帰属が決定されているアミノ酸と隣接するアミノ酸のものであることを利用して帰属することを特徴とする方法。
（４）上記（３）に記載の方法において、（ｃ）の工程で、さらに二重標識したアミノ酸残基の^１３Ｃと隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンの相関シグナルのみを同定可能なＮＭＲ測定を行い、（ｆ）の工程で選択されるシグナルが、上記で得られたシグナルと重なることを確認することを特徴とする上記（３）に記載の方法。
（５）蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法であって、
（ｉ）蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸が、その１位の炭素原子が^１３Ｃで標識され、さらに同定しようとするアミノ酸を含む複数のアミノ酸の２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質を調製し、
（ｉｉ）該蛋白質について、^１３Ｃ標識されたアミノ酸に隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルのみを同定可能なＮＭＲ測定を行い、
（ｉｉｉ）該シグナルを、同定しようとするアミノ酸のみの２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質をＮＭＲ測定することにより得られた、同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルと比較して、同定しようとするアミノ酸のシグナルの帰属を決定することを特徴とする方法。
（６）上記（１）または（５）に記載の方法を繰り返す、あるいは上記（３）および（４）に記載の方法を組み合わせることを特徴とする、蛋白質のＮＭＲ測定により得られた全てのシグナルの帰属方法。
（７） 蛋白質のＮＭＲ測定により得られたアミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルの帰属方法であって、
（ｉ）蛋白質のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルについて上記（２）〜（６）に記載の方法によりその帰属を決定し、
（ｉｉ）該蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸の２位および／又は１位の炭素原子あるいは水素原子がＮＭＲで測定可能なように二重標識された蛋白質を調製し、
（ｉｉｉ）該蛋白質について、同定しようとするアミノ酸中のアミドプロトンと、同じアミノ酸のＮＭＲで測定可能なように標識された炭素原子あるいは水素原子との相関シグナルを取得して、
（ｉｖ）上記（ｉ）のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルと（ｉｉｉ）のアミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルに共通するアミドプロトンの化学シフトが同じであることを指標として、アミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルを該アミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルに対応付けてアミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルの帰属を決定することを特徴とする方法。
（８）上記（６）または（７）に記載の方法により帰属されたＮＭＲシグナルの化学シフト情報を用いることを特徴とする蛋白質の立体構造特定方法。
（９）蛋白質と特定のリガンドとの複合体のＮＭＲ測定により得られたシグナルと、蛋白質のみのＮＭＲ測定により得られたシグナルとを比較し、化学シフトが変化したシグナルを、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法により帰属して、蛋白質とリガンドとの結合部位を特定する方法。
（１０）少なくとも２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識され、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されている１種類以上のアミノ酸と、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されて、かつ２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識されていない複数のアミノ酸を含む、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法による蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法に用いられる試薬キット。
（１１）少なくとも２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識され、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されている１種類以上のアミノ酸、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されて、かつ２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識されていない複数のアミノ酸、無細胞蛋白質合成用小麦胚芽抽出液、及びアミノ酸代謝酵素阻害剤を含む、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法による蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法に用いられる試薬キット。

図１は、大腸菌チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列および^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。
図２は、大腸菌チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列、Ｈ（Ｎ）ＣＡ測定およびＨ（ＮＣＯ）ＣＡ測定を示す図である。
図３は、主鎖の全てのアミド窒素を^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を示す図である。
図４は、アラニンだけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識し、その他のアミノ酸は全て^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトルを測定した結果を示す図である。
図５は、フェニルアラニンだけを^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（ａ）、および、セリンだけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識し、その他のアミノ酸は全て^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（ｂ）を測定した図である。
図６は、フェニルアラニンだけを^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（ａ）、および、アスパラギン酸だけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識し、その他のアミノ酸は全て^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（ｂ）を測定した図である。
図７は、フェニルアラニンだけを^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（ａ）、および、ロイシンだけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識し、その他のアミノ酸は全て^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（ｂ）を測定した図である。
図８は、フェニルアラニンだけを^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（ａ）、および、グルタミン酸だけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識し、その他のアミノ酸は全て^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（ｂ）を測定した図である。
図９は、イソロイシンだけを^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（ａ）、および、グリシンだけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識し、その他のアミノ酸は全て^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（ｂ）を測定した図である。
図１０は、図９において、確定できなかった７２番と７５番のイソロイシンの帰属の方法を示した図である。
図１１は、本発明により、主鎖の全てのアミド窒素を^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルのほぼ全てのシグナルを帰属した結果を示す図である。
図１２は、フェニルアラニンだけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識しその他のアミノ酸は全て^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＡ）スペクトル（ａ）とＨＮ（ＣＯ）スペクトル（ｂ）、および、フェニルアラニンだけを^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（ｃ）を示す図である。
図１３は、主鎖の全てのアミド窒素を^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（ａ）とフェニルアラニンだけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識しその他のアミノ酸は全て^１５Ｎ標識した大腸菌チオレドキシン蛋白質において、^１３Ｃカルボニル基に隣接していない全ての^１Ｈ−^１５Ｎ相関を測定したスペクトル（ｂ）とＨＮ（ＣＯ）スペクトル（ｃ）を示す図である。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１−１）ＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属方法１
本発明の帰属方法は、目的蛋白質を、構成するアミノ酸ごとに^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化アミノ酸、^１５Ｎ、^１３Ｃ、^２Ｈのいずれかで標識化されたアミノ酸、および標識化されていないアミノ酸を系統的に組み合わせて合成した後に、これを隣接する２つのアミノ酸残基の相関シグナルを取得し得る測定方法でＮＭＲ測定を行って、得られたシグナルを各アミノ酸を標識化した蛋白質から得られたシグナルと比較することによって帰属する方法である。以下に目的蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルの場合を例に帰属方法の概略を記載する。用いられる構成成分等やその製法、並びにＮＭＲ測定法の詳細は、以下の（２）〜（５）に記載のとおりである。
シグナルの帰属を行う目的蛋白質は、そのアミノ酸配列が同定されていれば如何なるものでもよいが、具体的には下記の（２）に記載したものを使用することができる。まず、相関シグナルの帰属を同定しようとするアミノ酸（例えば、図１Ａの２７Ｆ）について、アミノ酸配列上で隣接するどちらか一方のアミノ酸を特定し（例えば、図１Ａの２７Ｆの場合は２６Ｄ）、該アミノ酸（例えば、アスパラギン酸）についてはその２位（α位）および１位（カルボニル位）の炭素原子が^１３Ｃで、また２位の窒素原子が^１５Ｎで二重標識されているアミノ酸（以下、これを「^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化アミノ酸」と称することがある）と、それ以外のアミノ酸については、２位の窒素原子のみが^１５Ｎで標識されたアミノ酸を基質として、目的蛋白質を合成する。合成された蛋白質は、図１Ａに示したアミノ酸配列を有する蛋白質の２７Ｆの相関シグナルを同定しようとする場合、アスパラギン酸（Ｄ）が^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化されていて、それ以外のアミノ酸は窒素原子のみが^１５Ｎで標識された蛋白質として合成する。
次に、得られた蛋白質について、^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化アミノ酸に隣接するアミノ酸残基のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルのみが取得可能なＮＭＲ解析を行う。具体的には、図１Ｂの四角で囲った部分の原子間の相関シグナルのみが同定される解析方法等である。このＮＭＲ測定法としては、例えばＨＮ（ＣＯ）測定等が挙げられるが、以下、このように二重標識したアミノ酸に隣接するアミノ酸のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルのみを測定する方法を「ＨＮ（ＣＯ）測定」と称することがある。例えば、上記のように標識した図１Ａのアミノ酸配列を有する蛋白質についてこのＮＭＲ測定を行った結果は図６（ｂ）に示される。ＨＮ（ＣＯ）測定により得られたシグナルは、二重標識化アミノ酸のＣ末側に隣接するアミノ酸残基のものである。例えば、図６（ｂ）に示されるシグナルは、二重標識したアミノ酸ＤのＣ末側に隣接するアミノ酸、図１Ａに示されるアミノ酸配列中の３Ｋ、１０Ｄ、１１Ｓ、１４Ｔ、１６Ｖ、２１Ｇ、２７Ｆ、４４Ｅ、４８Ｅ、６１Ｑ、１０５Ａのものである。
ここでは、二重標識化したアミノ酸のＣ端側に隣接するアミノ酸の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルのみを取得できるＨＮ（ＣＯ）測定を行っているが、二重標識化したアミノ酸のＮ端側に隣接するアミノ酸の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルのみを取得できる測定法が有れば、その測定法を用いてもよい。
これらのシグナルの中から、目的アミノ酸（２７Ｆ）のシグナルを選択する方法としては、目的アミノ酸の２位の窒素原子のみが^１５Ｎで標識されたアミノ酸を基質として目的蛋白質を合成し、該蛋白質についてＮＭＲ測定により^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルを取得して、上記ＨＮ（ＣＯ）測定により得られた^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルと比較することにより行うことができる。具体的には、例えば、図１Ａに示されるアミノ酸配列を有する蛋白質について、フェニルアラニン（Ｆ）の２位の窒素原子のみが^１５Ｎで標識されたアミノ酸を基質として目的蛋白質を合成し、該蛋白質についてＮＭＲ測定により^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルを取得した場合、得られたシグナルは、２７Ｆを含むフェニルアラニンに対応するアミノ酸の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルである。このシグナルは、例えば図６（ａ）に示されるものが挙げられる。このシグナル（図６（ａ））とＨＮ（ＣＯ）測定により得られたシグナル（図６（ｂ））を比較して、重なるシグナル（図６（ｂ）の○で示したシグナル）が同定しようとするアミノ酸（２７Ｆ）のものであると同定できる。
上記のＨＮ（ＣＯ）測定により得られた^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルと比較するための同定しようとするアミノ酸の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルは、以下の方法で取得してもよい。まず、同定しようとするアミノ酸を^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化アミノ酸、その他は^１５Ｎ標識化アミノ酸を基質として目的蛋白質を合成し、該蛋白質について二重標識化されたアミノ酸中のアミドプロトンと^１５Ｎとの相関シグナルと、それに隣接するアミノ酸中のアミドプロトンと^１５Ｎとの相関シグナルの両方が検出されるＮＭＲ測定（これを以下、「ＨＮ（ＣＡ）測定」と称することがある）を行う。また、同じ蛋白質についてＨＮ（ＣＯ）測定を行ってシグナルを取得し、ＨＮ（ＣＡ）測定で得られたシグナルと比較する。ここで、重なっていないシグナルが目的アミノ酸を含む同じアミノ酸のシグナルである。
ここで、「同定しようとするアミノ酸」は１つでもよいし、複数個でもよい。以下に、二重標識化したアミノ酸を２種類用いて３個のアミノ酸の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルを同定する例を説明する。例えば、図１Ａに示されるアミノ酸配列を有する蛋白質について、ヒスチジン残基（Ｈ６）とトリプトファン残基（Ｗ２８、Ｗ３１）のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他のアミノ酸残基を^１５Ｎのみで標識化した目的蛋白質を用いた場合、上記の方法を用いることにより、それぞれのアミノ酸残基の一つ後ろのアミノ酸残基（Ｌ７、Ａ２９、Ｃ３２）を一意的に決定することが可能である。この場合には、帰属の手順が若干複雑にはなるが、試料の数を２０種類より減らすことが可能である。
また、^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルの全てのシグナルを帰属する必要がない場合、言い換えれば、同定しようとするアミノ酸と隣接するアミノ酸の組み合わせがその目的蛋白質配列中に１つしか存在しないようなアミノ残残基についてのみ帰属を行えばよい場合には、同定しようとするアミノ酸に隣接するアミノ酸の標識は、必ずしも^１３Ｃ／^１５Ｎの二重の標識が必要ではない。すなわち、その１位の炭素原子が^１３Ｃ標識されていればよい。この場合には、目的蛋白質として、さらに同定しようとするアミノ酸を含む複数のアミノ酸の２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されているものを合成する。合成された蛋白質をＨＮ（ＣＯ）測定等を行ってシグナルを取得し、これらのシグナルの組み合わせと、同定しようとするアミノ酸だけを^１５Ｎで標識化した蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルと比較することによって、上記と同様にシグナルを帰属することができる。この方法を用いることによれば、１位の炭素原子が^１３Ｃ標識されていて、同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されているものを合成し、このＨＮ（ＣＯ）測定によるシグナルを取得していく従来の方法に比べて、標識蛋白質の種類が少なくてすむという効果がある。
上記の方法は、これを繰り返すことによって、目的蛋白質の全てのアミノ酸に対してＮＭＲで得られるシグナルの帰属を行うことができるが、同定しようとするアミノ酸と隣接するアミノ酸の組み合わせ（図１ＡではＤとＦ）がその目的蛋白質配列中に１つしか存在しない場合にのみ用いることができる方法である。
（１−２）ＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属方法２
目的蛋白質中に同定しようとするアミノ酸と隣接するアミノ酸の組み合わせが２つ以上が存在する場合（例えば、図２Ａに示すアミノ酸配列を有する蛋白質では、７１Ｇ／７２Ｉと７４Ｇ／７５Ｉ等が挙げられる）、まず、（ｉ）目的蛋白質のアミノ酸配列上で同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸について、その特定の原子とアミドプロトンとの相関シグナルを上記の方法で帰属を決定する。次に、（ｉｉ）帰属が決定されたアミノ酸残基中の特定の原子とアミドプロトンとの相関シグナルと、（ｉｉｉ）同定しようとするアミノ酸中の（ｉ）と同じ特定の原子とアミドプロトンの相関シグナルを、（ｉｖ）それらの間に存在する原子と各アミドプロトンとの相関シグナルを取得して、共通する原子の化学シフトが同じであることをもとに対応つけていくことにより、帰属が決定されたアミノ酸に隣接するアミノ酸の相関シグナルであることを同定して帰属を決定することができる。
例えば、特定の原子が２位の炭素原子である場合、既に取得されている帰属が決定されたアミノ酸残基中の２位の炭素原子とアミドプロトンとの相関シグナルに対し、帰属が決定されたアミノ酸残基中の２位の炭素原子と同定しようとする（隣接する）アミノ酸残基中のアミドプロトンとの相関シグナルを、この２つのシグナルに共通する帰属が決定されたアミノ酸残基中の２位の炭素原子の化学シフトが同一であることから選択する。さらに、選択した帰属が決定されたアミノ酸残基中の２位の炭素原子と同定しようとする（隣接する）アミノ酸残基中のアミドプロトンとの相関シグナルに対し、同定しようとするアミノ酸残基中の２位の炭素原子と該アミノ酸残基中のアミドプロトンとの相関シグナルを、この２つのシグナルに共通する同定しようとするアミノ酸残基中のアミドプロトンの化学シフトが同一であることから選択し、同定しようとするアミノ酸のシグナルの帰属を決定することができる。このような相関シグナルは、例えば、上記Ｈ（Ｎ）ＣＡ法により取得することができる。
また、特定の原子が２位の窒素原子である場合は、以下に示す方法によりアミドプロトンと窒素原子との相関シグナルの帰属を決定することができる。
まず、（ａ）目的蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸について、上記（１）の方法でその帰属を決定する。図２Ａに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質において、例えば７２Ｉおよび７５Ｉのシグナルを同定しようとする場合（以下、この場合を「例示の蛋白質の場合」と称することがある）、同定しようとする７２Ｉに隣接する７１Ｇと、同じく同定しようとする７５Ｉに隣接する７４Ｇについて、それぞれ上記（１）の方法で隣接するアミノ酸（例示の場合は７０Ｙ、７３Ｒ）との関係で^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルの帰属を決定する。
次に、（ｂ）同定しようとするアミノ酸に隣接するアミノ酸の２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで、また２位の窒素原子が^１５Ｎで二重標識され、さらに少なくとも同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質を合成する。例示の蛋白質の場合、７２Ｉおよび７５Ｉに隣接するグリシンの２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで、また２位の窒素原子が^１５Ｎで二重標識され、さらに少なくとも同定しようとするイソロイシンの２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質を合成する。
（ｃ）得られた蛋白質について、二重標識されたアミノ酸残基（例示の蛋白質ではグリシン）の^１３Ｃとアミドプロトンの相関シグナル（図２Ｂの点線部分）と、二重標識したアミノ酸残基（例示の蛋白質ではグリシン）の^１３Ｃと隣接する同定しようとするアミノ酸残基（例示の蛋白質ではイソロイシン）のアミドプロトンの相関シグナル（図２Ｂの実線部分）が取得可能なＨ（Ｎ）ＣＡ法等のＮＭＲ測定（以下、これを「Ｈ（Ｎ）ＣＡ測定」と称することがある）を行い、シグナルを取得する。例示の蛋白質の場合、取得されたシグナルは図１０（ｂ）に示される。さらに、（ｄ）同定しようとするアミノ酸残基（例示の蛋白質ではイソロイシン）と、上記で二重標識したアミノ酸残基（例示の蛋白質ではグリシン）のアミドプロトンの相関シグナルをＨ（ＮＣＯ）ＣＡ法等で取得する（以下、これを「Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡ測定」と称することがある）。例示の蛋白質の場合、本測定方法によって得られたシグナルは、例えば、図１０（ｃ）に示すものが挙げられる。
次に、（ｄ）で取得したシグナル中の帰属が決定されているアミノ酸（例示の蛋白質の場合は、７１Ｇあるいは７４Ｇ）のアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナルの中から選択する。例示の蛋白質の場合、図１０（ａ）の７１Ｇあるいは７４Ｇのシグナルのアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを図１０（ｂ）のシグナルの中から選択する（図１０（ｂ）では、矢印で示される）。
さらに、（ｆ）選択されたシグナルの^１３Ｃの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナルの中から選択し、（ｇ）選択されたシグナルのアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｄ）で得られたシグナルの中から選択する。ここで、選択されたシグナルが、もとのシグナルに帰属されるアミノ酸と隣接するアミノ酸のシグナルであると決定される。例示の蛋白質の場合、図１０（ｂ）の矢印で示されるシグナルの^１３Ｃの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを、図１０（ｃ）のシグナルの中から選択する（図１０（ｃ）で矢印で示されるシグナル）。さらに選択されたシグナルのアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを図１０（ｄ）で得られたシグナルの中から選択する（図１０（ｄ）で矢印で示されるシグナル）。これらのシグナルが、それぞれ、７１Ｇに隣接する７２Ｉ、および７４Ｇに隣接する７５Ｉのシグナルとして帰属することができる。
（１−３）ＮＭＲ測定で得られるシグナルの帰属方法３
上記（１−１）および（１−２）の方法を用いて、まず目的蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎの相関シグナルの帰属を決定した後に、これをもとに該目的蛋白質のアミノ酸のアミドプロトンと^１３Ｃの相関シグナル（以下、これを「^１Ｈ−^１３Ｃ相関シグナル」と称することがある）やアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルを決定することができる。具体的には、（ｉ）蛋白質のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルについて上記の方法によりその帰属を決定し、（ｉｉ）該蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸の２位および／又は１位の炭素原子あるいは水素原子がＮＭＲで測定可能なように二重標識された蛋白質を調製し、
（ｉｉｉ）該蛋白質について、同定しようとするアミノ酸中のアミドプロトンと、同じアミノ酸のＮＭＲで測定可能なように標識された炭素原子あるいは水素原子との相関シグナルを取得して、（ｉｖ）上記（ｉ）のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルと（ｉｉｉ）のアミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルに共通するアミドプロトンの化学シフトが同じであることを指標として、アミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルを該アミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルに対応付けてアミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルの帰属を決定する方法である。
同定しようとするアミノ酸とは、１種類でもよく、複数種類でもよく、また、全部のアミノ酸でもよいが、後述するシグナルの対応付けでシグナルが重ならずに対応付けが可能な範囲であれば何れでもよい。同定しようとするアミノ酸が二重標識された目的蛋白質の合成方法および、該蛋白質の同定しようとするアミノ酸中のアミドプロトンと、同じアミノ酸のＮＭＲで測定可能なように標識された炭素原子あるいは水素原子との相関シグナルの取得方法は、上記（１−１）および（１−２）に記載のとおりである。具体的には、上記の二重標識を行った目的蛋白質に対して、Ｈ（Ｎ）ＣＯ、Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡの測定を行う方法が用いられる。例えば、Ｈ（Ｎ）ＣＯでは二重標識されているアミノ酸の次のアミノ酸中のアミドプロトンと二重標識されているアミノ酸の１位の炭素（^１３Ｃ）との相関シグナルが、Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡでは、二重標識されているアミノ酸の次のアミノ酸中のアミドプロトンと二重標識されているアミノ酸の２位の炭素（^１３Ｃ）との相関シグナルが得られる。
次に、上記で取得された相関シグナルのアミドプロトンの化学シフトに注目し、すでに帰属されている^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルのアミドプロトンのうち同一の化学シフトをもつシグナルを選択して帰属を参照することにより、Ｈ（Ｎ）ＣＯ、Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡの測定で得られるシグナルの帰属が容易に行える。Ｈ（Ｎ）ＣＯ、Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡの測定だけではなく、Ｈ（ＮＣＡ）ＣＯ、Ｈ（Ｎ）ＣＡ等の測定を行っても、全く同様の方法により、シグナルの帰属が可能である。
上記の方法は、^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルの帰属を行った後に、１位あるいは２位の炭素原子の化学シフトによる帰属を行う方法であるが、帰属の方法はこれに限らない。例えば、上記と同じ標識を行った目的タンパク質のＨ（Ｎ）ＣＡとＨ（ＮＣＯ）ＣＡのスペクトルの組み合わせ、あるいはＨ（Ｎ）ＣＯとＨ（ＮＣＡ）ＣＯのスペクトルの組み合わせを順次取得し、前後のアミノ酸中の１位または２位の炭素原子の化学シフトとアミドプロトンの化学シフトの相関関係を上記と同様の方法によって順次対応つけることによっても、アミドプロトンと^１３Ｃの相関シグナルの帰属を行うことが可能である。
以上、代表的な標識方法と測定方法、帰属方法について述べたが、本発明の方法は、上記の方法に限定されるものではない。
例えば標識方法についてであるが、上記標識法ではアミノ酸Ｃ（任意のアミノ酸）だけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他のアミノ酸は^１５Ｎ標識化した目的蛋白質を調製したが、実際に測定シグナルを与えるのはアミノ酸Ｃ及びその一つ後ろにあるアミノ酸残基だけであるから、目的蛋白質のアミノ酸配列から、アミノ酸残基Ｃの後ろにあるアミノ酸の種類のみを^１５Ｎ標識化してもＨＮ（ＣＯ）、ＨＮ（ＣＡ）、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡに関して、残りのアミノ酸全てを^１５Ｎ標識化したものと全く同じスペクトルが得られる。また、^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化するアミノ酸の種類は一蛋白質試料に一種類である必要はなく、適宜数種類のアミノ酸を^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、他のアミノ酸を^１５Ｎ標識化しても、シグナルの帰属は可能である。この場合は、必要な標識蛋白質が２０種類より減らすことができるが、解析が若干複雑になるので、必要に応じて標識の仕方を変更すればよい。
（２）目的蛋白質
本発明の方法に用いられる目的蛋白質は、後述する方法によりアミノ酸が選択的に標識される方法で合成され得るのであれば、化学合成、組換体を用いた合成、無細胞蛋白質合成など如何なる方法で作成されたものでもよい。具体的には例えば、ポリペプチド、糖蛋白質これらの誘導体、共有結合体および複合体等が挙げられる。ポリペプチドは１０以上１０００以下のアミノ酸残基からなるものが好ましく用いられる。また、糖蛋白質としては分子量１０００以上１０万以下のものが好ましい。具体的には、天然に存在する蛋白質、またはその一部、さらに人工的に産生されたポリペプチド、および天然に存在する蛋白質のＮ末端またはＣ末端に１以上のアミノ酸残基が付加されている蛋白質等が含まれるが、これらに限らず、この場合、これらの蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸残基において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。
（３）標識化アミノ酸
本発明の方法では、２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで、また２位の窒素原子が^１５Ｎで二重標識されたアミノ酸（以下、これを「^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化アミノ酸」と称することがある）と２位の窒素原子、炭素原子、または水素原子のいずれかがＮＭＲで測定可能なように標識されたアミノ酸、さらに標識化されていないアミノ酸を基質に、目的蛋白質を系統的に、複数個合成し、ＮＭＲ測定を行って、得られたシグナルの帰属を上記（１）に記載の通り決定するものである。^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化アミノ酸は、２位および／または１位の炭素原子が^１３Ｃで、また２位の窒素原子が^１５Ｎで、さらに主鎖のアミド基が^１Ｈであれば何れのものでもよく、その他の部位については、^１３Ｃおよび^１５Ｎ標識化されていてもされていなくてもよい。同定しようとするアミノ酸は、例えば、２位の窒素原子が^１５Ｎ標識化されていて、１位および２位の炭素原子が^１３Ｃで標識化されておらず、さらにアミドプロトンが^１Ｈのもの（以下、これを「^１５Ｎ標識化アミノ酸」と称することがある）や、１位および／または２位の炭素原子が^１３Ｃであって、２位の窒素原子やアミドプロトンが標識されていないもの（以下、これを「^１３Ｃ標識化アミノ酸」と称することがある）、あるいはアミドプロトンおよび／または２位の水素原子が重水素であって、２位の窒素原子や１位および２位の炭素原子が標識されていないもの（以下、これを「重水素標識化アミノ酸」と称することがある）等であれば何れのものでもよく、その他の部分については、標識されていてもされていなくてもよい。
また、上記の^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化アミノ酸、^１５Ｎ標識化アミノ酸、^１３Ｃ標識化アミノ酸における水素原子は、主鎖のアミド基のみ^１Ｈであることが必要であり、他の部位については、Ｄなどの同位体で置換されたものを用いてもよい。特に、高分子量の蛋白質においては、アミド基以外の水素原子が重水素化されていると、上記ＮＭＲにより得られるシグナル強度が著しく増強されるのでアミド基以外の水素原子の一部または全部を重水素化したアミノ酸を用いることが好ましい。
標識化されていないアミノ酸とは、１位と２位の炭素原子の両方ともが^１３Ｃで標識化されておらず、かつ２位の窒素原子が^１５Ｎ標識化されていないものであれば如何なるものであってもよい。
プロリンについては、そもそもアミドプロトンが存在しないので後述する^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを与えない。よって、^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識アミノ酸を用いても^１３Ｃ標識化アミノ酸を用いても同じ結果を与えるし、^１５Ｎ標識化アミノ酸を用いても非標識のプロリンを用いても同じ結果を与えるのでこれらの何れを用いてもよい。
^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化アミノ酸、^１５Ｎ標識化アミノ酸、^１３Ｃ標識化アミノ酸、及び重水素標識化アミノ酸の作製法は、通常用いられる方法により行うことができる。また、市販の標識化アミノ酸（例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いることもできる。
（４−１）標識化蛋白質の合成方法
上記（２）に記載された標識化または非標識化アミノ酸を、系統的に組み合わせて基質として目的蛋白質を複数個合成する方法について^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルの帰属決定に用いられる標識化アミノ酸を例に以下に説明する。
標識化または非標識化アミノ酸の組み合わせは、上記（１）で詳述したとおりである。
ここで、２０種類のアミノ酸についてＮＭＲ測定により得られたシグナルを同定しようとする場合に用意する目的蛋白質は、次のとおりである。まず、１種類のアミノ酸だけが^１５Ｎ標識化アミノ酸でその他が非標識化アミノ酸である１９種類（プロリンを除く）の蛋白質と、１種類のアミノ酸だけが^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化アミノ酸で、その他が^１５Ｎ標識化アミノ酸である２０種類の蛋白質が挙げられる。このうち、１種類のアミノ酸だけが^１５Ｎ標識化アミノ酸でその他が非標識化アミノ酸である１９種類（プロリンを除く）の蛋白質はなくてもよい。
標識化および非標識化アミノ酸を基質として行う蛋白質合成方法は、目的蛋白質が、ＮＭＲ測定可能な形態で合成され得るものであれば如何なる方法でもよい。具体的には、無細胞蛋白質合成系が好ましく用いられ、特にコムギ胚芽抽出液を用いる無細胞蛋白質合成系が好ましく用いられる。コムギ胚芽抽出液は、例えば、Ｓａｗａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，５５９−５６４（２０００）、特開２０００−２３６８９９６号公報、特開２００２−１２５６９３号公報、特開２００２−２０４６８９号公報等に従って調製されたものや、あるいはＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等の市販のものが挙げられる。
目的蛋白質の鋳型としては、目的蛋白質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが適当な発現制御領域の制御下となるように結合され、これをＲＮＡに転写して用いることが好ましい。また、その下流に転写終了のための配列、および非翻訳領域等が連結しているものが好ましく用いられる。発現制御領域とは、プロモーター、エンハンサー等が含まれる。具体的には、Ｓａｗａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，５５９−５６４（２０００）に記載のもの等が挙げられる。
目的蛋白質の鋳型をＲＮＡに転写した後、エタノール沈殿等で精製して、これを上記のコムギ胚芽等の細胞抽出液、基質、エネルギー源、各種イオン等を添加して適当時間反応させることにより蛋白質合成が行われる。
ここで、コムギ胚芽抽出液を目的蛋白質合成に用いる場合、該抽出液中に含まれるアミノ酸代謝酵素によって、アラニンがアスパラギン酸およびグルタミン酸に代謝され、アスパラギン酸がグルタミン酸に代謝され、さらにグルタミン酸がアスパラギン酸またはグルタミンに代謝される特徴があるため、上記のアミノ酸として標識化アミノ酸を用いる場合には、該アミノ酸代謝酵素の活性を阻害して、かつ鋳型ＲＮＡの蛋白質への翻訳を阻害しない条件下で目的蛋白質合成を行う必要がある。
該アミノ酸代謝酵素の活性を阻害して、かつ鋳型ＲＮＡの蛋白質への翻訳を阻害しない条件とは、以下のようにして検討して選択することができる。まず該アミノ酸代謝酵素阻害剤候補として選択された物質が該蛋白質合成系における蛋白質合成能を阻害しない濃度を決定する。例えば、適当な蛋白質の鋳型ＲＮＡを、標識されていない基質を用いて翻訳し、翻訳後取得された蛋白質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などで分離し、定量する。あるいは、活性測定法が分かっている酵素蛋白質などや、蛍光を持つような蛋白質を翻訳して、該蛋白質の酵素活性あるいは蛍光量を指標として定量してもよい。この定量によって、該蛋白質合成系に存在するアミノ酸代謝酵素阻害剤が、合成される蛋白質の量を減少させない濃度範囲を決定する。さらに、目的のアミノ酸の代謝を阻害する物質を、上記で決定された鋳型ＲＮＡの蛋白質への翻訳を阻害しない濃度範囲で加え、例えば、アミノ酸配列がわかっている蛋白質の鋳型ＲＮＡを、好ましくは目的のアミノ酸のみが安定同位体で標識された基質を用いて該無細胞タンパク質合成系において翻訳し、翻訳後取得された蛋白質を後述するＮＭＲ測定し、投入した基質の標識が他のアミノ酸について観察されないかを確認することにより選択する。該合成反応に存在する候補物質の濃度によって目的のアミノ酸の代謝の阻害度が変化する場合には、充分にアミノ酸の代謝が阻害される濃度を測定する。この選択方法は、アミノ酸代謝酵素の阻害剤としてすでに知られているものを用いることによって換えることもできる。
本発明で用いることができるアミノ酸代謝酵素阻害剤の具体例としては、トランスアミナーゼ阻害剤およびグルタミン合成酵素阻害剤などが挙げられる。
かくして選択される具体的な条件としては、標識化アラニンを基質として用いて蛋白質を合成する場合、および標識化アスパラギン酸を基質として用いる場合には、下述の無細胞タンパク質合成方法の翻訳反応液に、トランスアミナーゼ阻害剤を、蛋白質合成活性を阻害しない濃度範囲で存在させること等が挙げられる。ここで、トランスアミナーゼは、上記コムギ胚芽抽出液中に残存し、アラニンをアスパラギン酸およびグルタミン酸に代謝する活性、および／またはアスパラギン酸をグルタミン酸に代謝する活性を有するものである。このようなトランスアミナーゼの活性阻害剤としては、該合成系において、トランスアミナーゼ活性を阻害する濃度範囲と目的蛋白質合成を阻害しない濃度範囲が重複するものが好ましく用いられる。具体的には、例えば、アミノオキシ酢酸等があげられ、その濃度としては０．０１〜１０ｍＭの範囲が好ましい。
また、標識化グルタミン酸を基質として用いる場合の条件としては、下述の無細胞タンパク質合成方法の翻訳反応液に、トランスアミナーゼ阻害剤およびグルタミン合成酵素阻害剤を、蛋白質合成活性を阻害しない濃度範囲で存在させること等が挙げられる。ここで、トランスアミナーゼは、上記コムギ胚芽抽出液中に残存し、グルタミン酸をアスパラギン酸に代謝する活性を有するものであり、グルタミン合成酵素とは、上記小麦胚芽抽出液中に残存し、グルタミン酸に代謝する活性を有するものである。このようなトランスアミナーゼの活性阻害剤としては、該合成系において、トランスアミナーゼ活性を阻害する濃度範囲と目的蛋白質合成を阻害しない濃度範囲が重複するものが好ましく用いられる。具体的には、トランスアミナーゼ阻害剤としては、例えば、アミノオキシ酢酸等があげられ、その濃度としては０．０１〜１０ｍＭの範囲が好ましい。また、グルタミン合成酵素阻害剤としては、例えば、Ｌ−メチオニンサルフォキシイミンが挙げられ、その濃度としては０．０１〜２０ｍＭの範囲が好ましく用いられる。
このような条件下で行われる無細胞タンパク質合成方法とは、上記コムギ胚芽抽出液に鋳型ＲＮＡや基質、エネルギー源等を添加し、さらに上記の必要なアミノ酸代謝活性を阻害する物質を添加して、目的蛋白質が合成される方法であれば特に制限はない。合成反応溶液の組成としては、上記細胞抽出液、鋳型ＲＮＡ、基質となる標識化、および非標識化アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等が含まれる。これらは目的蛋白質によって適宜選択して調製される。
基質の濃度としては、０．０５〜０．４ｍＭの範囲が適当である。またエネルギー源としては、ＡＴＰ、またはＧＴＰが挙げられ、ＡＴＰは１．０〜１．５ｍＭ、ＧＴＰは０．２〜０．３ｍＭ添加することが好ましい。各種イオン、及びその適当な反応溶液中の濃度としては、６０〜１２０ｍＭの酢酸カリウム、１〜１０ｍＭの酢酸マグネシウム等が挙げられる。緩衝液としては、１５〜３５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、あるいは１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸等が用いられる。またＡＴＰ再生系としては、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ、または１２〜２０ｍＭのクレアチンリン酸（クレアチンホスフェート）と０．２〜１．６μｇ／μｌのクレアチンキナーゼの組み合わせが挙げられる。核酸分解酵素阻害剤としては、反応溶液１μｌあたり０．３〜３．０Ｕのリボヌクレアーゼインヒビターや、０．３〜３Ｕのヌクレアーゼインヒビター等が挙げられる。
このうち、リボヌクレアーゼインヒビターの具体例としては、ヒト胎盤由来のＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ社製等）等が用いられる。ｔＲＮＡは、Ｍｏｎｉｔｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，４３，１（１９６０）等に記載の方法により取得することができるし、市販のものを用いることもできる。還元剤としては、０．１〜３．０ｍＭのジチオスレイトール等が挙げられる。抗菌剤としては、０．００１〜０．０１％のアジ化ナトリウム、又は０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌのアンピシリン等が挙げられる。核酸安定化剤としては、０．３〜０．５ｍＭスペルミジン等が用いられる。
合成温度は１０〜４０℃、好ましくは１５〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で行われる。反応時間はタンパク質合成が行われる限り特に制限はないが、本発明のように、翻訳反応で消費される物質を供給する系を用いると２４〜７５時間反応が持続する。
蛋白質合成のためのシステムあるいは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））のように、該細胞抽出液に無細胞タンパク質合成に必要なエネルギー源やアミノ酸、あるいはｔＲＮＡを添加して行う方法や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（Ｓａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．，５１４，１０２−１０５（２００２））等が挙げられる。また、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３号公報：以下これを「不連続ゲルろ過法」と称することがある）等を用いることができる。
（４−２）目的タンパク質の回収および精製
かくして合成された目的蛋白質は、これを反応溶液から回収し、必要であれば適当な方法により精製することにより取得することができる。しかし、目的蛋白質をＮＭＲ測定に用いる場合には、精製は必ずしも必要なく、それ自体公知の方法により適当な濃度に濃縮して、かつ緩衝液をＮＭＲ測定用に交換することで十分なことが多い。濃縮方法としては、例えば、限外濾過濃縮装置を用いる方法が挙げられる。また、緩衝液の交換は、市販のスピンカラムを用いる方法等が好ましく用いられる。
（５）ＮＭＲ測定
かくして合成された目的蛋白質を（１）に記載の方法でＮＭＲ測定を行い、得られたシグナルを比較することによりシグナルの帰属を行う。ここで用いられるＮＭＲ測定法としては、ＮＭＲに用いられ得る方法であれば溶液、固体にかかわらず如何なる方法も用いることができる。具体的には、異種核多次元ＮＭＲ測定法であればいずれでもよく、例えば、ＨＳＱＣ、ＨＭＱＣ、ＣＨ−ＣＯＳＹ、ＣＢＣＡＮＨ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＨＡ、Ｈ（ＣＡＣＯ）ＮＨ、ＨＣＡＣＯ、^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、^１３Ｃ／^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ、^１３Ｃ／^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ、^１５Ｎ／^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＨＳＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡＣＢ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＢ、ＨＮ（ＣＯＣＡ）ＣＢ（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６（１９９４）１１６５５−１１６６６）、Ｈ（ＣＣＯ）ＮＨ、Ｃ（ＣＯ）ＮＨ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，Ｂ １０１（１９９３）１１４−１１９）、ＣＲＩＰＴ、ＣＲＩＮＥＰＴ（Ｒｉｅｋ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６（１９９９）４９１８−４９２３）、ＨＭＢＣ、ＨＢＨＡ（ＣＢＣＡＣＯ）ＮＨ（Ｅｖａｎｓ Ｊ．Ｎ．Ｓ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）７１）、ＩＮＥＰＴ（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０１（１９７９）７６０−７６２）、ＨＮＣＡＣＢ（Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｂ １０１（１９９３）２０１）、ＨＮ（ＣＯ）ＨＢ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．９６（１９９２）２１５−２２２．）、ＨＮＨＢ（Ａｒｃｈｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，９５（１９９１）６３６−６４１）、ＨＢＨＡ（ＣＢＣＡ）ＮＨ（Ｗａｎｇ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，Ｂ １０５（１９９４）１９６−１９８．）、ＨＮ（ＣＡ）ＨＡ（Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，９８（１９９２）４４３−４５０）、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ（Ｂａｘ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，８８（１９９０）４２５−４３１）、ＴＲＯＳＹ（Ｐｅｒｖｕｓｈｉｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４（１９９７）１２３６６−１２３７１）、^１３Ｃ／^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ（Ｊｅｒａｌａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，１０８（１９９５）２９４−２９８）、ＨＮ（ＣＡ）ＮＨ（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，１２４（１９９７）２１４２１７）、およびＨＮ（ＣＯＣＡ）ＮＨ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ，３（１９９３）６２７−６３８．）等の測定法が含まれるが、これらに限らない。
これらのうちＨＳＱＣ、ＨＭＱＣの２次元ＮＭＲ法と、ＨＮＣＯ、ＨＮＣＡ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡの３次元ＮＭＲ法の１次元を省略して２次元ＮＭＲ法にしたものが好ましく用いられる。
また、測定方法であるが、上記測定法では、ＨＮ（ＣＯ）、ＨＮ（ＣＡ）、Ｈ（Ｎ）ＣＡ、Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡの４つの測定方法を用いたが、ＨＮ（ＣＯ）やＨＮ（ＣＡ）のかわりに、Ｉｓｏｔｏｐｅ ｆｉｌｔｅｒ法（Ｂｒｅｅｚｅ，Ａ．Ｌ．，Ｐｒｏｇ．ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，３６（２０００）３２３−３７２）を用いて、ＨＮ（ＣＯ）やＨＮ（ＣＡ）と同様のスペクトルを得ることが可能である。また、Ｈ（Ｎ）ＣＡ、ＨＮ（ＮＣＯ）ＣＡのかわりにＨ（Ｎ）ＣＯとＨ（ＮＣＡ）ＣＯの組み合わせを使っても、アミノ酸の前後関係を特定できるが、Ｈ（ＮＣＡ）ＣＯは測定感度が低いので、目的蛋白質の２位（α位）の水素原子を重水素に置き換えることが好ましい（Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｋ．Ｈ．ａｎｄ Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２７（１９９８）３５７−４０６）。また分子量２万を越えるような蛋白質の場合、上記測定法をＴＲＯＳＹ効果（Ｐｅｒｖｕｓｈｉｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４（１９９７）１２３６６−１２３７１）を用いた同様の測定法に置き換えることにより、感度の減少を抑えることが可能である。また、主鎖のアミド水素原子以外の水素原子を重水素原子に置き換えることも有効である（Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｋ．Ｈ．ａｎｄ Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２７（１９９８）３５７−４０６）。
（６）立体構造解析方法
本方法を用いると^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルの全てシグナルの帰属が可能なだけではなく、全ての２位の炭素原子の化学シフトも上述の方法により同時に決定される。また、Ｈ（Ｎ）ＣＯやＣＢＣＡ（ＣＯＮ）Ｈ、ＨＢＨＡ（ＣＢＣＡＣＯ）ＮＨ等の２次元測定を追加することにより、原理的には、目的蛋白質の全てのカルボニル炭素の化学シフト、β炭素の化学シフト、αβ水素の化学シフトが決定可能である。これらの情報を用いてＣｈｅｍｉｃａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｉｎｄｅｘ法（Ｗｉｓｈａｒｔ，Ｄ．ａｎｄ Ｃａｓｅ，Ｄ．Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３３８（２００１）３−３４）を用いることにより、目的蛋白質の２次構造が推定できる。さらに、ＨＣＣＨ ＴＯＣＳＹ等の測定を追加することによって、側鎖を含めた炭素原子、窒素原子、水素原子の化学シフトが決定可能になる。この情報を用いれば、常法にしたがって目的蛋白質の立体構造決定が可能である（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。また、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣの全シグナルが帰属できることより、Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｄｉｐｏｌａｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ法（Ｂａｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３３９（２００１）１２７−１７４）の測定を行うことが可能であり、目的蛋白質の立体構造情報を得ることができる。
（７）蛋白質とリガンドの結合部位特定方法
目的蛋白質と、目的蛋白質とそのリガンドの複合体について、ＮＭＲ測定し、得られたシグナルを比較して、化学シフトが変化したシグナルを上記（１）〜（５）に記載の方法により帰属することによれば、目的蛋白質とリガンドとの結合部位を決定することができる。上記で化学シフトが変化したシグナルが示すアミノ酸は、目的蛋白質において少なくともリガンドの結合部位であると決定することができる。
（８）シグナル帰属方法に用いられる試薬キット
本発明の帰属方法を行うために、少なくとも２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識され、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されている１種類以上のアミノ酸と、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されて、かつ２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識されていない複数のアミノ酸を含む試薬キットが提供される。本キットの構成成分は、上記に限られるものではなく、その他、１位および／又は２位の炭素原子が^１３Ｃで標識された１種類以上のアミノ酸や、上記（４−１）の無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽抽出液や該合成系に必要な試薬、ＮＭＲ測定用緩衝液等を含んでいてもよい。特に、コムギ胚芽抽出液を含む場合、該無細胞タンパク質合成系において必要とされるアミノ酸代謝阻害剤を含むことも好ましい。具体的には、（４−１）に記載のトランスアミナーゼ阻害剤、グルタミン合成阻害剤等が挙げられる。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］ １種類のアミノ酸のみを ^１３ Ｃ／ ^１５ Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を ^１５ Ｎのみで標識した基質により合成した目的蛋白質のＮＭＲ測定
（１）鋳型ｍＲＮＡの調製
大腸菌チオレドキシン蛋白質（アミノ酸配列は、配列表の配列番号３に示される）の遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ５４８８１）は、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ Ｋ−１２株より、ＭａｇＰｒｅｐ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）により調製した大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１および２に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法を用いて増幅し、プラスミドｐＥＵ３ｂ（Ｓａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（２３），１４６５２−１４６５７（２００２））のＳｐｅ ＩとＳａｌ Ｉの部位に導入した。１６ｍＭのマグネシウムイオン存在下で上記プラスミドを鋳型として、大腸菌チオレドキシン蛋白質のｍＲＮＡをＳＰ６ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で転写し、合成した。
（２）すべて^１５Ｎ標識化したアミノ酸を基質に用いた目的蛋白質合成
上記実施例１で合成したｍＲＮＡを１００μｇ／１３０μｌに成るように濃縮し、コムギ胚芽抽出液（Ｐｒｏｔｅｉｏｓ^ＴＭ、ＴＯＹＯＢＯ社製）と混合した（２ｍｌ）。その混合液を、２０種類すべてのアミノ酸が^１５Ｎ標識化された（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）透析緩衝液に対して、２日間反応を行い、透析緩衝液を交換しさらに２日間の蛋白質合成反応を行った。２ｍｌの反応液は、ミリポア製のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３限外濾過濃縮装置で２５０ｕｌまで濃縮した。この濃縮液中の大腸菌チオレドキシン蛋白質は１００μＭとなった。濃縮液を、あらかじめＮＭＲ測定用緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化されたアマシャム社製Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｇ−２５ゲル濾過カラムを通すことにより、測定用緩衝液に交換し、ＮＭＲ測定試料とした。
（３）１種類のアミノ酸のみを^１５Ｎ標識化した基質を用いた目的蛋白質合成
上記実施例１で合成したｍＲＮＡを１００μｇ／１３０μｌに成るように濃縮し、コムギ胚芽抽出液（Ｐｒｏｔｅｉｏｓ^ＴＭ、ＴＯＹＯＢＯ社製）と混合した（２ｍｌ）。その混合液を、２０種類のうち１種類だけ^１５Ｎ標識され（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、残りの１９種類のアミノ酸は通常のアミノ酸である透析緩衝液に対して、２日間反応を行い、透析緩衝液を交換しさらに２日間の蛋白質合成反応を行った。この時に、アミノ酸代謝酵素によるアミノ酸変換を阻害するために、アミノオキシ酢酸とＬ−メチオニンサルフォキシイミンをそれぞれ１ｍＭ、０．１ｍＭになるように透析外液に加えた。２ｍｌの反応液は、ミリポア製のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３限外濾過濃縮装置で２５０ｕｌまで濃縮した。この濃縮液中の大腸菌チオレドキシン蛋白質は１００μＭとなった。濃縮液を、あらかじめＮＭＲ測定用緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化されたアマシャム社製Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｇ−２５ゲル濾過カラムを通すことにより、測定用緩衝液に交換し、ＮＭＲ測定試料とした。
（４）１種類のアミノ酸のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した基質を用いた蛋白質合成
上記実施例１で合成したｍＲＮＡを１００μｇ／１３０μｌに成るように濃縮し、コムギ胚芽抽出液（Ｐｒｏｔｅｉｏｓ^ＴＭ、ＴＯＹＯＢＯ社製）と混合した（２ｍｌ）。その混合液を、２０種類のうち１種類だけ^１３Ｃ／^１５Ｎ標識され（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、残りの１９種類のアミノ酸はアミドの窒素原子が^１５Ｎで標識され、なおかつ^１３Ｃの標識が入っていないアミノ酸である透析緩衝液に対して、２日間反応を行い、透析緩衝液を交換しさらに２日間の蛋白質合成反応を行った。この時に、アミノ酸代謝酵素によるアミノ酸変換を阻害するために、アミノオキシ酢酸とＬ−メチオニンサルフォキシイミンをそれぞれ１ｍＭ、０．１ｍＭになるように透析外液に加えた。２ｍｌの反応液は、ミリポア製のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３限外濾過濃縮装置で２５０ｕｌまで濃縮した。この濃縮液中の大腸菌チオレドキシン蛋白質は１００μＭとなった。濃縮液を、あらかじめＮＭＲ測定用緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化されたアマシャム社製Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｇ−２５ゲル濾過カラムを通すことにより、測定用緩衝液に交換し、ＮＭＲ測定試料とした。
（５）ＮＭＲ測定
ＮＭＲ測定には、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ−５００スペクトロメーターを用い、測定試料には磁場の安定性を保つためのＮＭＲロック用に５％Ｄ_２Ｏを添加し、測定を行った。測定温度は３５℃とした。
まず、すべて^１５Ｎ標識化したアミノ酸を基質に用いて合成した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを測定した（図３）。
それぞれのアミノ酸（プロリン以外の１９種類）を１種類のみ^１５Ｎ標識し、それ以外のアミノ酸を非標識のもので合成した大腸菌チオレドキシン蛋白質については、それぞれ^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルを測定した。このスペクトルより、全^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＳＱＣスペクトルのそれぞれのシグナルが、どのアミノ酸由来のものかがわかった。
また、１種類のアミノ酸のみを上記（４）に記載の方法で^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質については（計２０種類）、ＨＮ（ＣＯ）（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載のＨＮＣＯ３次元測定法において、ＣＯの展開時間を省略した２次元測定）、ＨＮ（ＣＡ）（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載のＨＮＣＡ３次元測定法において、ＣＡの展開時間を省略した２次元測定）、Ｈ（Ｎ）ＣＡ（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載のＨＮＣＡ３次元測定法において、Ｎの展開時間を省略した２次元測定）、Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡ（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載のＨＮ（ＣＯ）ＣＡ３次元測定法ににおいて、Ｎの展開時間を省略した２次元測定）の測定を行った。
蛋白質を構成するアミノ酸２０種類のうち１種類のみ^１３Ｃ／^１５Ｎ標識し、それ以外の１９種類のアミノ酸は^１５Ｎで標識された大腸菌チオレドキシン蛋白質（合計２０種類）のＨＮ（ＣＯ）スペクトルそれぞれ測定した。このうち、例えばアラニンのみ^１３Ｃ／^１５Ｎ標識し、それ以外の１９種類のアミノ酸は^１５Ｎで標識された大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（図４）には、アラニンの一つ後ろのアミノ酸残基のアミドＨＮの相関シグナルのみが観測される。以下の１９種類についても同様に、二重標識化したアミノ酸残基の一つ後ろのアミノ酸残基のＨＮ相関シグナルだけが観測される。
また、上記２０種類の蛋白質に対して、それぞれＨＮ（ＣＡ）の測定を行うと、二重標識化したアミノ酸残基および、二重標識化したアミノ酸残基の一つ後ろのアミノ酸残基のＨＮ相関シグナルだけが観測される。
さらに、上記２０種類の蛋白質に対して、それぞれＨ（ＮＣＯ）ＣＡの測定を行うと、二重標識化したアミノ酸残基の一つ後ろのアミノ酸残基のアミド水素原子と二重標識化したアミノ酸残基のα位の炭素原子との相関シグナルだけが観測される。また、それぞれＨ（Ｎ）ＣＡの測定を行うと、二重標識化したアミノ酸残基の一つ後ろのアミノ酸残基のアミド水素原子と二重標識化したアミノ酸残基のα位の炭素原子との相関シグナル、および、二重標識化したアミノ酸残基のアミノ酸残基のアミド水素原子と二重標識化したアミノ酸残基のα位の炭素原子との相関シグナルだけが観測される。
（６）^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣの各シグナルアミノ酸残基番号の帰属方法（１）
最初に、例として、大腸菌チオレドキシンに４つあるフェニルアラニン残基（Ｆ１２、Ｆ２７、Ｆ８１、Ｆ１０２）の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣシグナルの帰属について述べる。まず、フェニルアラニン残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（図５ａ）より、フェニルアラニン残基由来の４つのシグナルの位置を決定する。次に、４つのフェニルアラニン残基の手前にある残基（Ｓ１１、Ｄ２６、Ｌ８０、Ｅ１０１）に注目する（図１Ａ参照）。
セリン残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（図５ｂ）には、セリンの一つ後ろの残基のアミドの^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルのみが観測されるので、図５ａと図５ｂにおいて位置が一致するシグナルは、セリンの一つ後ろにあるフェニルアラニンの残基であると確定することができる。その条件を満たすフェニルアラニン残基は、大腸菌チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列においては、Ｆ１２だけであることから（図１Ａ）、この一致したシグナルは、Ｆ１２のものであると決定できる。
同様にして、フェニルアラニン残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（図６ａ）とアスパラギン酸残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（図６ｂ）において、唯一一致するシグナルは、アスパラギン酸の後ろにあるフェニルアラニンの残基由来のものであるから（図１Ａ参照）、Ｆ２７のものであると決定できる。さらに、同様に、フェニルアラニン残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（図７ａ）とロイシン残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（図７ｂ）において、唯一つ一致するシグナルは、ロイシンの後ろにあるフェニルアラニンの残基（図１Ａ参照）、すなわち、Ｆ８１のものであり、フェニルアラニン残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（図８ａ）とグルタミン酸残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（図８ｂ）において、唯一つ一致するシグナルは、グルタミン酸の後ろにあるフェニルアラニンの残基由来のものであるから（図１Ａ参照）、Ｆ１０２のものであると決定できる。
他のアミノ酸残基についても、全く同様の方法にして、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルにおけるシグナルの位置を決定できる。
以上述べた方法は、２つのアミノ酸残基の並び方が大腸菌チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列において、一回だけ現れるようなアミノ酸残基すべてについて適用できる。
（７）^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣの各シグナルアミノ酸残基番号の帰属方法（２）
上記の方法を用いることにより、大腸菌のチオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルにおいて、全体の７５％ほどのシグナルについて、そのアミノ残残基番号を特定することができる。しかし、残りのアミノ酸については、上記の方法だけでは、アミノ酸残基番号を特定することができない。その場合の帰属方法について以下に述べる。
大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルのイソロイシン残基の帰属について、上記実施例（６）の方法を適用した場合、以下のような問題点を生ずる。
イソロイシン残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（図９（ａ））と、グリシン酸残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトル（図９（ｂ））を比較すると、一致するシグナルが２つ存在する。なぜならば、グリシン残基の一つ後ろにあるイソロイシン残基はＩ７２とＩ７５の２つが存在するからである（図２Ａ参照）。このような場合、上記実施例（６）の方法では、この２つのシグナルのどちらがＩ７２でどちらがＩ７５であるかを決定することはできない。この場合は、上記実施例（６）の方法でまず、Ｉ７２の一つ手前のＧ７１とＧ７４の位置を決定する（図１０（ａ））。次に、グリシン酸残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨ（Ｎ）ＣＡスペクトルとＨ（ＮＣＯ）ＣＡスペクトルを用いる。すでに決定したＧ７１の^１Ｈ−^１５Ｎシグナルからアミド水素原子の化学シフトが決定でき、Ｈ（Ｎ）ＣＡスペクトル上のシグナルのうち、アミド水素原子の位置が一致するシグナルを決定する（図１０（ｂ））。このシグナルはＧ７１のアミド水素原子とα炭素原子の化学シフト相関を表すので、Ｇ７１のα炭素原子の化学シフトが決定できる。次に、Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡスペクトルからα炭素原子の化学シフトが同一のシグナルを決定する（図１０ｃ）。Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡは、Ｌ７２のアミド水素原子の化学シフトとＧ７１のα炭素原子の化学シフト相関を表すので、Ｌ７２のアミド水素原子の化学シフトが決定できる。そこで、このＬ７２のアミド水素原子の化学シフトと一致するイソロイシンの^１Ｈ−^１５Ｎシグナルをイソロイシン残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルから決定すれば、それがＬ７２のシグナルであると決定できる（図１０ｄ）。Ｌ７５についても全く同様に帰属ができる。
他のアミノ酸残基についても全く同様の方法を適用することにより、アミノ酸の並び方が同じであるシグナルについても一意的にシグナル帰属が可能となる。この方法を、上記実施例（６）の方法と組み合わせることにより、大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣにおけるシグナルのほぼ全て残基番号を含めて帰属することができた（図１１）。
（８）^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣの各シグナルアミノ酸残基番号の帰属方法（３）
上記実施例（６）及び（７）を用いて^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣにおけるすべてのシグナルを帰属するためは、一種類のアミノ酸残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質が１９種類（プロリン残基はＨＳＱＣシグナルが観測できない）と、一種類のアミノ酸残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質が２０種類必要であった。しかし、以下に述べる方法を用いれば、一種類のアミノ酸残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質が１９種類は不要となる。
フェニルアラニン残基を例にして、フェニルアラニン残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（図１２ｃ）から得られる情報と同じ情報を、フェニルアラニン残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質を用いて得る方法について述べる。フェニルアラニン残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＡ）スペクトル（図１２ａ）からは、フェニルアラニン残基とフェニルアラニン残基の一つ後ろにあるアミノ酸残基の^１Ｈ−^１５Ｎシグナルが得られる。また同じ蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトルから（図１２ｂ）は、フェニルアラニン残基の一つ後ろにあるアミノ酸残基の^１Ｈ−^１５Ｎシグナルが得られる。よって、このＨＮ（ＣＡ）スペクトルのシグナルのうち、ＨＮ（ＣＯ）スペクトルにも存在するシグナルを除去したものはすべて、フェニルアラニン残基の^１Ｈ−^１５Ｎシグナルであり、フェニルアラニン残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルから得られるシグナルと全く同じとなる。同様にして、あるアミノ酸残基について、そのアミノ酸残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルから得られる情報は、そのアミノ酸残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＡ）スペクトルとＨＮ（ＣＯ）スペクトルを比較することにより容易に得られる。
（９）^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣの各シグナルアミノ酸残基番号の帰属方法（４）
上記実施例（６）（７）（８）において、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルのシグナルの帰属法について述べたが、実際に全てのシグナルを帰属する手順は以下のようになる。
（ａ）一種類のアミノ酸残基だけを^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の１９種類のＨＳＱＣスペクトルあるいは、一種類のアミノ酸残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）及びＨＮ（ＣＡ）スペクトルから、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルにおける各シグナルが、どのアミノ酸の種類に属するかを決定する。
（ｂ）一種類のアミノ酸残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質のＨＮ（ＣＯ）スペクトルから、それぞれのシグナルがどの種類アミノ酸の後ろにある残基かを決定する。
（ｃ）アミノ酸配列表（表１のように、それぞれのアミノ酸の後ろにどの種類のアミノ酸があうかを記したものを用意しておくと分かりやすい）から、アミノ酸の並びを利用してシグナルの帰属を行う。
（ｄ）連続するアミノ酸の並び方が同一のものが２ヶ所以上あるものについては、Ｈ（Ｎ）ＣＡとＨ（ＮＣＯ）ＣＡスペクトルを用いて、さらに手前の帰属済みの残基から帰属を決定する。手前の残基が同様の状況により帰属が不確定である場合は、さらに手前の残基から順次帰属決定を行う。

（１０）^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣの各シグナルアミノ酸残基番号の帰属方法（５）
上記実施例（６）（７）（８）（９）においては、一種類の残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、その他の１９種類のアミノ酸を^１５Ｎのみで標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質を用いたが、必ずしも二重標識化したアミノ酸残基以外のアミノ酸全てを^１５Ｎで標識化する必要はない。まず、プロリン残基については、もともと^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣシグナルを与えないので^１５Ｎのみで標識化する必要がない。また、例えば、トリプトファン残基（Ｗ２８、Ｗ３１）を^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化する場合においては，大腸菌チオレドキシン蛋白質について，システイン残基の後ろにあるアミノ散は、アラニン残基（Ａ２９）とシステイン残基（Ｃ３２）だけであるから，この場合は，トリプトファン残基のみを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化し、アラニン残基とシステイン残基を^１５Ｎのみで標識化し、他のアミノ酸については非標識のアミノ酸を用いても、上記実施例と同様の結果が得られる。言い換えれば、二重標識化したアミノ酸の後ろにあるアミノ酸だけを^１５Ｎ標識化すれば良いことになる。
上記実施例（６）および（８）においては、ＨＮ（ＣＯ）およびＨＮ（ＣＡ）のスペクトルから得られたシグナルを解析に用いたが、これらの測定法は、二重標識化したアミノ酸に隣接したアミノ酸の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルを観測する方法である。しかし、二重標識化したアミノ酸に隣接したアミノ酸の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルを同定するためには、以下のような測定法を用いることができる。^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法において、同位体フィルター法（Ｂｒｅｅｚｅ，Ａ．Ｌ．，Ｐｒｏｇ．ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，３６（２０００）３２３−３７２）を用いると、^１３Ｃに隣接した^１５Ｎのシグナルを消去することができる。このようにして測定した結果を図１３ｂに示す。図１３ｂのように、フェニルアラニンだけを^１３Ｃ／^１５Ｎ二重標識化しその他のアミノ酸は全て^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質において、この同位体フィルター法を用いると、フェニルアラニン残基に隣接していないすべてのアミノ酸残基の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルを得ることができる。このシグナルと主鎖の全てのアミド窒素を^１５Ｎ標識化した大腸菌チオレドキシン蛋白質の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトル（図１３ａ）とを比較し、図１２ｂにおいて消失しているシグナルが、同試料のＨＮ（ＣＯ）スペクトルで得られるシグナル（図１３ｃ）と同一となる。ＨＮ（ＣＡ）スペクトルにおいても同様な方法を用いて、２位（α位）が^１３Ｃ標識化されたアミノ酸に隣接するアミノ酸残基の^１Ｈ−^１５Ｎ相関シグナルを同定することができる。この測定法を用いる場合には、目的の蛋白質を二重標識化したアミノ酸以外の全てのアミノ酸を^１５Ｎ標識化することが望ましい。

本発明の方法によれば、３次元ＮＭＲ測定法より圧倒的に測定時間の短い２次元ＮＭＲ測定法のみを用いることにより、合計測定時間の短縮あるいは、積算時間を増大させることによる感度の上昇をさせることができる。また、必要な２次元ＮＭＲ測定法も、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣの感度の半分以上の高感度を持つ、ＨＮ（ＣＯ）、ＨＮ（ＣＡ）、Ｈ（Ｎ）ＣＡ、Ｈ（ＮＣＯ）ＣＡの４つだけを用いることにより、^１Ｈ−^１５Ｎシグナルの帰属に必要な全ての情報が得られる。このことにより、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣ測定法に必要な蛋白質試料の１〜２倍程度の濃度の蛋白質試料で、必要な帰属情報が得られる。また、本発明の方法は、２０種類程度の蛋白質試料を用意し、順次測定を行うので、試料１つあたりの測定時間は従来法の１／２０以下に短縮される。よって、室温以上の温度に数週間も耐えられないような不安定な蛋白質試料に対しても、^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルのシグナルの帰属を行うことができる。
本発明の方法は、単純な２次元ＮＭＲスペクトルを解析するだけで^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルの全てシグナルの帰属を行うことができる。発明者が実際に帰属したところでは、帰属に要する解析時間は、従来法の１／２０以下であった。また、それほど解析のスキルを有していなくても解析が可能であることも本発明の特徴である。
本発明により得られた帰属情報によれば、それぞれのアミノ酸残基の主に蛋白質の主鎖を構成するさまざまな原子の化学シフト情報が得られるので、目的蛋白質の２次構造を推定することも可能となり、さらには、他の測定法と組み合わせることで、３次構造の決定においても使用することが可能である。
さらに本発明の方法は、目的蛋白質とそのリガンドとの結合部位を特定するのに有利である。本発明の方法により、簡便な試料作製と低濃度の試料で、かつ短いＮＭＲ測定時間が実現されたことにより、低溶解性で不安定な蛋白質に対してもリガンドの結合部位の同定を含むリガンドスクリーニングが可能となった。
本出願は、２００４年２月２日付の日本特許出願（特願２００４−２５５９２）に基づく優先権を主張する出願であり、その内容は本明細書中に参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容も本明細書中に参照として取り込まれる。

Claims (11)

1. 蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法であって、
   （ｉ）蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸の２位および／又は１位の炭素原子と２位の窒素原子が、それぞれＮＭＲで測定可能なように二重標識され、さらに少なくとも同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子、炭素原子、水素原子のいずれかがＮＭＲで測定可能なように標識された蛋白質を調製し、
   （ｉｉ）該蛋白質について、二重標識されたアミノ酸に隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと標識された原子との相関シグナルのみを同定可能なＮＭＲ測定を行い、
   （ｉｉｉ）該シグナルを、同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子、炭素原子、水素原子のいずれかが標識された蛋白質をＮＭＲ測定することにより得られた、同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと標識された原子との相関シグナルと比較して、同定しようとするアミノ酸のシグナルの帰属を決定することを特徴とする方法。
2. 蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法であって、
   （ｉ）蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸が、その２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで、また２位の窒素原子が^１５Ｎで二重標識され、さらに少なくとも同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質を調製し、
   （ｉｉ）該蛋白質について、二重標識されたアミノ酸に隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルのみを同定可能なＮＭＲ測定を行い、
   （ｉｉｉ）該シグナルを、同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子のみが^１５Ｎ標識された蛋白質をＮＭＲ測定することにより得られた同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルと比較して、同定しようとするアミノ酸のシグナルの帰属を決定することを特徴とする方法。
3. 蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法であって、
   （ａ）蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸について請求項２に記載の方法で帰属を決定し、
   （ｂ）該アミノ酸の２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで、また２位の窒素原子が^１５Ｎで二重標識され、さらに少なくとも同定しようとするアミノ酸の２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質を調製し、
   （ｃ）該蛋白質について、二重標識されたアミノ酸残基の^１３Ｃとアミドプロトンの相関シグナルと、二重標識したアミノ酸残基の^１３Ｃと隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンの相関シグナルのみを同定可能なＮＭＲ測定を行い、
   （ｄ）同定しようとするアミノ酸と上記で二重標識したアミノ酸のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルを取得し、
   （ｅ）（ｄ）で得られたシグナル中の帰属が決定されているアミノ酸のアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナル中から選択し、
   （ｆ）選択されたシグナルの^１３Ｃの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナル中から選択し、
   （ｇ）選択されたシグナルのアミドプロトンの化学シフトと同一の化学シフトを有するシグナルを（ｃ）で得られたシグナル中から選択し、該シグナルを、帰属が決定されているアミノ酸と隣接するアミノ酸のものであることを利用して帰属することを特徴とする方法。
4. 請求項３に記載の方法において、（ｃ）の工程で、さらに二重標識したアミノ酸残基の^１３Ｃと隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンの相関シグナルのみを同定可能なＮＭＲ測定を行い、（ｆ）の工程で選択されるシグナルが、上記で得られたシグナルと重なることを確認することを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法であって、
   （ｉ）蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸に隣接するどちらか一方のアミノ酸が、その１位の炭素原子が^１３Ｃで標識され、さらに同定しようとするアミノ酸を含む複数のアミノ酸の２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質を調製し、
   （ｉｉ）該蛋白質について、^１３Ｃ標識されたアミノ酸に隣接する同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルのみを同定可能なＮＭＲ測定を行い、
   （ｉｉｉ）該シグナルを、同定しようとするアミノ酸のみの２位の窒素原子が^１５Ｎで標識された蛋白質をＮＭＲ測定することにより得られた、同定しようとするアミノ酸残基のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルと比較して、同定しようとするアミノ酸のシグナルの帰属を決定することを特徴とする方法。
6. 請求項１または５に記載の方法を繰り返す、あるいは請求項３および４に記載の方法を組み合わせることを特徴とする、蛋白質のＮＭＲ測定により得られた全てのシグナルの帰属方法。
7. 蛋白質のＮＭＲ測定により得られたアミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルの帰属方法であって、
   （ｉ）蛋白質のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルについて請求項２〜６に記載の方法によりその帰属を決定し、
   （ｉｉ）該蛋白質のアミノ酸配列上で、同定しようとするアミノ酸の２位および／又は１位の炭素原子あるいは水素原子がＮＭＲで測定可能なように二重標識された蛋白質を調製し、
   （ｉｉｉ）該蛋白質について、同定しようとするアミノ酸中のアミドプロトンと、同じアミノ酸のＮＭＲで測定可能なように標識された炭素原子あるいは水素原子との相関シグナルを取得して、
   （ｉｖ）上記（ｉ）のアミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルと（ｉｉｉ）のアミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルに共通するアミドプロトンの化学シフトが同じであることを指標として、アミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルを該アミドプロトンと^１５Ｎの相関シグナルに対応付けてアミドプロトンと^１３Ｃまたはアミドプロトンと^２Ｈの相関シグナルの帰属を決定することを特徴とする方法。
8. 請求項６または７に記載の方法により帰属されたＮＭＲシグナルの化学シフト情報を用いることを特徴とする蛋白質の立体構造特定方法。
9. 蛋白質と特定のリガンドとの複合体のＮＭＲ測定により得られたシグナルと、蛋白質のみのＮＭＲ測定により得られたシグナルとを比較し、化学シフトが変化したシグナルを、請求項１〜７のいずれかに記載の方法により帰属して、蛋白質とリガンドとの結合部位を特定する方法。
10. 少なくとも２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識され、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されている１種類以上のアミノ酸と、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されて、かつ２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識されていない複数のアミノ酸を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法による蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法に用いられる試薬キット。
11. 少なくとも２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識され、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されている１種類以上のアミノ酸、２位の窒素原子が^１５Ｎで標識されて、かつ２位および１位の炭素原子が^１３Ｃで標識されていない複数のアミノ酸、無細胞蛋白質合成用小麦胚芽抽出液、及びアミノ酸代謝酵素阻害剤を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法による蛋白質のＮＭＲ測定により得られたシグナルの帰属方法に用いられる試薬キット。

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