JP4469954B2 - Thermostable enzyme having sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity - Google Patents

Thermostable enzyme having sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity Download PDF

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Description

本願発明は、糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する耐熱性蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該DNAを含有する組み換え体DNA、該組み換え体DNAを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質の製造法、および該蛋白質あるいは該形質転換体を用いた糖ヌクレオチドの製造法および異性化リン酸化糖の製造法に関する。   The present invention relates to a heat-resistant protein having sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity, DNA encoding the protein, recombinant DNA containing the DNA, transformant having the recombinant DNA, The present invention relates to a method for producing a protein having sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity using a transformant, and a method for producing a sugar nucleotide and a method for producing an isomerized phosphorylated sugar using the protein or the transformant.

糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する酵素としては、サルモネラ菌（Salmonella enterica） （非特許文献１参照）、豚の肝臓 （非特許文献２参照）、マイコバクテリア菌（Mycobacterium smegmatis）（非特許文献３参照）由来の糖ヌクレオチド合成活性を示す酵素であるGDP-mannose pyrophosphorylase（GMP）、及びヘリコバクター菌（Helicobacter pylori）（非特許文献4参照）のリン酸化糖異性化活性を示す酵素の詳しい性質がすでに報告されている。GMPはGDP-マンノース合成に必須な酵素であり、マンノース−１−リン酸とグアノシン三リン酸（GTP）を基質としてGDP-マンノースを生産する。また、リン酸化糖異性化活性を示す酵素であるPhosphomannose isomerase（PMI）は、マンノース−６−リン酸を基質としてフルクトース−６−リン酸を生産する反応と、フルクトース−６−リン酸を基質としてマンノース−６−リン酸を生産する反応と両方向に働き、マンノース−６−リン酸の異性化に必須の酵素である。その他にも、ヒトや酵母、病原菌からも糖ヌクレオチド合成反応並びにリン酸化糖の異性化反応を触媒する酵素は見出されているが、その多くが常温生物由来のため室温以上では極めて不安定で、活性は80℃程度の加熱処理により速やかに失活する。このため、使用時に反応系を滅菌する等の処理が必要であったり、低温での注意深い保存が必要であった。   Examples of enzymes having sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity include Salmonella enterica (see Non-patent Document 1), pig liver (see Non-patent Document 2), Mycobacterium smegmatis (non-patent document 2) Detailed description of GDP-mannose pyrophosphorylase (GMP), an enzyme that exhibits sugar nucleotide synthesis activity derived from Patent Document 3), and the enzyme that exhibits phosphorylated sugar isomerization activity of Helicobacter pylori (see Non-Patent Document 4) The nature has already been reported. GMP is an enzyme essential for GDP-mannose synthesis, and produces GDP-mannose using mannose-1-phosphate and guanosine triphosphate (GTP) as substrates. Phosphomannose isomerase (PMI), an enzyme that exhibits phosphorylated saccharide isomerization activity, is a reaction that produces fructose-6-phosphate using mannose-6-phosphate as a substrate, and fructose-6-phosphate as a substrate. It is an enzyme essential for isomerization of mannose-6-phosphate, acting in both directions with the reaction to produce mannose-6-phosphate. In addition, enzymes that catalyze sugar nucleotide synthesis reactions and phosphorylated sugar isomerization reactions have been found from humans, yeasts, and pathogens, but most of them are derived from cold organisms and are extremely unstable at room temperature or higher. The activity is rapidly deactivated by heat treatment at about 80 ° C. For this reason, treatment such as sterilization of the reaction system is necessary at the time of use, and careful storage at a low temperature is necessary.

Elling L, RitterJE, Verseck S. “Expression, purification andcharacterization of recombinant phosphomannomutase and GDP-alpha-D-mannosepyrophosphorylase from Salmonella enterica, group B, for the synthesis ofGDP-alpha-D-mannose from D-mannose” (1996) Glycobiology, 6, 591-597.Elling L, RitterJE, Verseck S. “Expression, purification and characterization of recombinant phosphomannomutase and GDP-alpha-D-mannosepyrophosphorylase from Salmonella enterica, group B, for the synthesis of GDP-alpha-D-mannose from D-mannose” (1996) Glycobiology , 6, 591-597. Ning B, Elbein AD.“Cloning, expression and characterization of the pigliver GDP-mannose pyrophosphorylase. Evidence that GDP-mannose and GDP-Glcpyrophosphorylases are different proteins” (2000) European Journal of Biochemistry, 267,6866-6874.Ning B, Elbein AD. “Cloning, expression and characterization of the pigliver GDP-mannose pyrophosphorylase. Evidence that GDP-mannose and GDP-Glcpyrophosphorylases are different proteins” (2000) European Journal of Biochemistry, 267, 6866-6874. Ning B, Elbein AD.“Purification and properties of mycobacterialGDP-mannose pyrophosphorylase” (1999) Archives of Biochemistry and Biophysics,362(2),339-345.Ning B, Elbein AD. “Purification and properties of mycobacterial GDP-mannose pyrophosphorylase” (1999) Archives of Biochemistry and Biophysics, 362 (2), 339-345. Wu B, Zhang Y,Zheng R, Guo C, Wang PG. “Bifunctional phosphomannoseisomerase/GDP-D-mannose pyrophosphorylase is the point of control forGDP-D-mannose biosynthesis in Helicobacter pylori” (2002) FEBS Letter 519,87-92.Wu B, Zhang Y, Zheng R, Guo C, Wang PG. “Bifunctional phosphomannoseisomerase / GDP-D-mannose pyrophosphorylase is the point of control forGDP-D-mannose biosynthesis in Helicobacter pylori” (2002) FEBS Letter 519,87-92 .

糖ヌクレオチドを合成する活性を有し、且つ耐熱性を有する酵素は、糖鎖合成の基質となる糖ヌクレオチドを安定に合成することを可能にするなど極めて有用である。また、糖鎖合成の際の基質として必要な様々な種類の糖を生産する際には、糖の異性化反応は有効な反応である。このリン酸化糖異性化反応活性を有し、且つ耐熱性を有する酵素は、様々な種類の糖を安定に合成することを可能にするなど極めて有用である。すなわち、これら両酵素活性を併せ持つ耐熱性酵素が見出されれば、糖鎖合成の基質となる様々な種類の糖ヌクレオチドを安定に生産することが可能となる。また、これらの反応を一つの酵素が行うことで、様々な種類のリン酸化糖を安定に合成することと、それらを用いて糖ヌクレオチドを合成することを共役させることが出来、効率的な反応として進めることが可能になる。そこで、両酵素活性を有する両反応性酵素で、且つ熱安定性を有する酵素は渇望されていた。   An enzyme having an activity of synthesizing sugar nucleotides and having heat resistance is extremely useful in that it enables stable synthesis of sugar nucleotides that are substrates for sugar chain synthesis. In addition, the isomerization reaction of sugar is an effective reaction when producing various kinds of sugars necessary as a substrate for sugar chain synthesis. This enzyme having phosphorylation sugar isomerization reaction activity and heat resistance is extremely useful, such as making it possible to synthesize various kinds of sugars stably. That is, if a thermostable enzyme having both of these enzyme activities is found, it is possible to stably produce various types of sugar nucleotides that are substrates for sugar chain synthesis. In addition, by performing these reactions with a single enzyme, it is possible to conjugate the stable synthesis of various types of phosphorylated saccharides and the synthesis of sugar nucleotides using them, which is an efficient reaction. It is possible to proceed as. Thus, an amphoteric enzyme having both enzyme activities and an enzyme having heat stability has been desired.

したがって、本発明の課題は、様々な糖ヌクレオシド三リン酸を基質として糖ヌクレオチド合成が可能で、且つリン酸化糖を基質として異なる種類の異性化されたリン酸化糖の合成が可能な、2種類の活性を有し、かつ熱安定な耐熱性を有する新規酵素を提供することにある。   Therefore, the object of the present invention is to synthesize sugar nucleotides using various sugar nucleoside triphosphates as substrates and to synthesize different types of isomerized phosphorylated sugars using phosphorylated saccharides as substrates. It is an object of the present invention to provide a novel enzyme having the activity described above and having heat stability and heat resistance.

本発明は、以上のような課題を解決すべく、90−95℃で生育する超好熱古細菌Pyrococcus horikoshii OT3に着目し、そのゲノム中に本酵素活性を有する遺伝子を見いだした。さらに、大腸菌を使ってその遺伝子がコードする該酵素を生産し、この酵素が高温（90℃）で安定に存在し、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を示すことを確認し、さらに、本酵素を用いることにより様々な糖ヌクレオチドを生産すること並びに種々の糖リン酸の異性体を生産することも見出して、本発明を完成するに至ったものである。   In order to solve the above-mentioned problems, the present invention has focused on the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii OT3 that grows at 90-95 ° C., and has found a gene having this enzyme activity in its genome. Furthermore, using E. coli, producing the enzyme encoded by the gene, confirming that this enzyme is stably present at high temperature (90 ° C.) and exhibits sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity, Furthermore, the inventors have found that various sugar nucleotides are produced by using this enzyme and that various isomers of sugar phosphates are produced, and the present invention has been completed.

即ち、本発明は、以下の（１）〜（１５）に係るものである。
（１） 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するか、あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖ヌクレオチド合成活性及びリン酸化糖異性化活性を有することを特徴とする蛋白質。
（２） 上記（１）に記載の蛋白質をコードするDNA。
（３） 上記（２）に記載の塩基配列を有することを特徴とするDNA。
（４） 配列番号２に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするDNA。
（５） 上記（２）〜（４）のいずれかに記載のDNAがベクターに組み込まれていることを特徴とする組み換え体DNA。
（６） 上記（５）に記載の組み換え体DNAが宿主細胞に導入されていることを特徴とする形質転換体。
（７） 上記（６）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物から、糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、糖ヌクレオチド合成活性及びリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質の製造法。
（８） 糖−１−リン酸及びヌクレオシド三リン酸に、上記（１）に記載の蛋白質を作用させ、糖ヌクレオチドに変換することを特徴とする糖ヌクレオチドの製造方法。
（９） 糖−６−リン酸に、上記（１）に記載の蛋白質を作用させ、糖リン酸を異性化させることを特徴とする異性化された糖−６−リン酸の製造方法。
（１０） 糖−１−リン酸及びヌクレオシド三リン酸に、上記（６）に記載の形質転換体の培養液あるいは培養物の処理物を作用させ、糖ヌクレオチドに変換することを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。
（１１） 糖−６−リン酸に、上記（６）に記載の形質転換体の培養液あるいは培養物の処理物を作用させ、糖−６−リン酸を異性化させることを特徴とする、異性化された糖−６−リン酸の製造方法。
（１２） 糖−１−リン酸及びヌクレオシド三リン酸に、上記（３）又は（４）に記載のDNAにコードされる蛋白質を作用させ、糖ヌクレオチドに変換することを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。
（１３） 糖−６−リン酸に、上記（３）又は（４）に記載のDNAにコードされる蛋白質を作用させ、糖リン酸を異性化させることを特徴とする、異性化された糖−６−リン酸の製造方法。
（１４） リン酸化糖の異性化反応、分子内リン酸基転移反応及び糖−ヌクレオチド合成反応を行い、糖−ヌクレオチドを製造する方法において、上記リン酸化糖の異性化反応およ糖−ヌクレオチド合成反応を、請求項１に記載の蛋白質を用いて行うことを特徴とする、上記方法。
（１５） 請求項１に記載のタンパク質を含有する反応系において、カルシウムイオン、亜鉛イオンまたは銅イオンのうちいずれかを選択して含有させることにより、該タンパクの酵素作用を、糖ヌクレオチド合成作用とリン酸化糖異性化作用との間で切り替えることを特徴とする、酵素反応の切り替え方法。
That is, the present invention relates to the following (1) to (15).
(1) It has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or has an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. And a protein having sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity.
(2) DNA encoding the protein according to (1) above.
(3) DNA having the base sequence described in (2) above.
(4) A DNA that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 2 under a stringent condition and encodes a protein having sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity.
(5) A recombinant DNA, wherein the DNA according to any one of (2) to (4) above is incorporated into a vector.
(6) A transformant, wherein the recombinant DNA according to (5) is introduced into a host cell.
(7) A sugar nucleotide synthesis activity characterized by culturing the transformant according to (6) above in a medium and collecting a protein having a sugar nucleotide synthesis activity and a phosphorylated sugar isomerization activity from the culture. And a method for producing a protein having phosphorylated sugar isomerization activity.
(8) A method for producing a sugar nucleotide, wherein the protein according to (1) is allowed to act on sugar-1-phosphate and nucleoside triphosphate to convert it to a sugar nucleotide.
(9) A method for producing isomerized sugar-6-phosphate, wherein the protein described in (1) is allowed to act on sugar-6-phosphate to isomerize sugar phosphate.
(10) The transformant according to the above (6) is allowed to act on sugar-1-phosphate and nucleoside triphosphate, or the treated product of the transformant is converted into a sugar nucleotide. A method for producing a sugar nucleotide.
(11) The sugar-6-phosphate is isomerized by allowing the culture solution of the transformant or the treated product of the transformant according to (6) to act on sugar-6-phosphate. A process for producing isomerized sugar-6-phosphate.
(12) A sugar nucleotide characterized in that the protein encoded by the DNA according to (3) or (4) is allowed to act on sugar-1-phosphate and nucleoside triphosphate to convert it into a sugar nucleotide. Manufacturing method.
(13) An isomerized sugar characterized in that the protein encoded by the DNA according to (3) or (4) is allowed to act on sugar-6-phosphate to isomerize sugar phosphate -6 Production method of phosphoric acid.
(14) In the method for producing a sugar-nucleotide by carrying out isomerization reaction of phosphorylated sugar, intramolecular phosphate group transfer reaction and sugar-nucleotide synthesis reaction, the phosphorylated sugar isomerization reaction and sugar-nucleotide synthesis The method as described above, wherein the reaction is carried out using the protein according to claim 1.
(15) In the reaction system containing the protein according to claim 1, by selecting and containing any one of calcium ion, zinc ion and copper ion, the enzymatic action of the protein is changed to a sugar nucleotide synthesis action. A method for switching an enzymatic reaction, characterized by switching between phosphorylated sugar isomerization.

本発明により、試験管内での様々な種類の糖ヌクレオチドを合成する事が可能でかつ熱等に安定で、さらに試験管内での様々な種類のリン酸化糖異性体を合成することが可能でかつ熱等に安定な新規な両反応を触媒する酵素が提供できた。その結果、新規な糖ヌクレオチド及びリン酸化糖の合成が可能になった。一方、本酵素により生産が可能となるリン酸化糖異性体や糖ヌクレオチドは糖蛋白質、糖脂質、多糖類の糖合成に糖提供体として機能するものであり、これらの糖鎖合成は、癌転移、器官発生あるいは細胞性免疫等に密接に関与するものとして近年注目されており、本発明はこれらの研究の発展において、その貢献度はきわめて大きい。   According to the present invention, it is possible to synthesize various types of sugar nucleotides in a test tube, is stable to heat, and can synthesize various types of phosphorylated sugar isomers in a test tube, and It was possible to provide a novel enzyme that catalyzes both reactions that is stable to heat and the like. As a result, it was possible to synthesize novel sugar nucleotides and phosphorylated sugars. On the other hand, phosphorylated sugar isomers and sugar nucleotides that can be produced by this enzyme function as sugar donors for glycosynthesis of glycoproteins, glycolipids, and polysaccharides. In recent years, it has been attracting attention as being closely related to organ development or cellular immunity, and the present invention contributes greatly to the development of these studies.

以下に、本願発明を具体的に説明する。
本発明で使用した超好熱古細菌は、超好熱古細菌パイロコッカス、ホリコシイ（JCM登録番号JCM9974）である。本発明者等は超好熱古細菌染色体上の本酵素活性を示す遺伝子領域を、PCR反応で増幅・抽出し、蛋白質発現プラスミドpET28aに挿入後、そのプラスミドにより形質転換した大腸菌を用いて本酵素の生産をおこなった。生産された酵素は加熱処理およびカラムクロマトグラムで単離精製した。精製された酵素は分子量が約53,000の蛋白質で様々な糖ヌクレオチドを合成する活性を有する酵素であることが判明した。
この酵素は50ｍM MOPS緩衝液（pH 7.6）中で、80℃30分以上の加熱後も活性を有し、高い耐熱性を示した。また、該タンパク質溶液の金属塩の種類を変更することにより、該タンパクの酵素作用が、糖ヌクレオチド合成作用とリン酸化糖異性化作用との間で切り替わるという驚くべき性質を有する。
この超好熱古細菌パイロコッカス、ホリコシイが有するGMP/PMI（PHGMP/PMI）のアミノ酸配列およびその遺伝子DNA（PH0925）の塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号１および２に示す。 Below, this invention is demonstrated concretely.
The hyperthermophilic archaea used in the present invention is the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii (JCM registration number JCM9974). The present inventors amplified and extracted the gene region showing the enzyme activity on the hyperthermophilic archaeal chromosome by PCR reaction, inserted it into the protein expression plasmid pET28a, and then transformed the enzyme using the plasmid. Was produced. The produced enzyme was isolated and purified by heat treatment and column chromatogram. The purified enzyme was found to be an enzyme having a molecular weight of about 53,000 and an activity to synthesize various sugar nucleotides.
This enzyme was active in 50 mM MOPS buffer (pH 7.6) even after heating at 80 ° C. for 30 minutes or more, and showed high heat resistance. Further, by changing the type of the metal salt of the protein solution, it has a surprising property that the enzyme action of the protein is switched between a sugar nucleotide synthesis action and a phosphorylated sugar isomerization action.
The amino acid sequence of GMP / PMI (PHGMP / PMI) possessed by the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus and Horikoshii and the base sequence of the gene DNA (PH0925) are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.

本発明における酵素タンパク質は、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するもののみに限定されず、該アミノ酸配列において、1乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であっても、このアミノ酸配列を有する蛋白質が、糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を示すものも含む。また、本発明のこれら酵素遺伝子DNAについても、上記同配列番号２に示す塩基配列を有するもののみに限定されず、上記アミノ酸配列をコードするものを包含する。さらに上記配列２に示されるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするDNAも包含する。 The enzyme protein in the present invention is not limited to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and in the amino acid sequence, one to several amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added. Even if it is a sequence, the protein having this amino acid sequence includes those showing sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity. In addition, these enzyme gene DNAs of the present invention are not limited to those having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 but include those encoding the amino acid sequence. Furthermore, DNA that hybridizes to the DNA represented by the sequence 2 under stringent conditions and encodes a protein having sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity is also included .

本発明の酵素タンパク質を得るには、通常の遺伝子工学的手法が適用でき、上記酵素遺伝子DNAを、例えばpET28a、pHY481等の蛋白質発現プラスミドベクター等に挿入して組み換えベクターを作製し、該組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を培地で培養し、培養物、培養処理物あるいはこれら培養物から分離回収された形質転換体から、酵素タンパク質を通常の蛋白質精製手段により精製し単離する。上記宿主細胞としては、大腸菌・枯草菌等が利用可能である。   In order to obtain the enzyme protein of the present invention, ordinary genetic engineering techniques can be applied. The above-described enzyme gene DNA is inserted into a protein expression plasmid vector such as pET28a, pHY481, etc. to prepare a recombinant vector, and the recombinant vector A host cell is transformed with the above, the transformant is cultured in a medium, and the enzyme protein is purified from the culture, the culture treated product, or the transformant separated and recovered from these cultures by an ordinary protein purification means. And isolate. As the host cell, Escherichia coli, Bacillus subtilis and the like can be used.

本発明においては、さらにこの酵素タンパク質を用いて、糖ヌクレオチドを合成するが、この合成においては、糖−１−リン酸とヌクレオシド三リン酸を含有する溶液に該酵素を添加し、反応温度60〜95℃で反応させ糖ヌクレオチドを得る。
糖−１−リン酸としては、例えば、マンノース−１−リン酸、グルコース−１−リン酸等が挙げられ、ヌクレオシド三リン酸としては、例えばグアノシン三リン酸（GTP）、アデノシン三リン酸（ATP）酸等が挙げられ、さらに、本発明の酵素はデオキシリボヌクレオシド三リン酸も基質とすることができる。 In the present invention, a sugar nucleotide is further synthesized using this enzyme protein. In this synthesis, the enzyme is added to a solution containing sugar-1-phosphate and nucleoside triphosphate, and the reaction temperature is 60. React at ~ 95 ° C to obtain sugar nucleotides.
Examples of sugar-1-phosphate include mannose-1-phosphate and glucose-1-phosphate. Examples of nucleoside triphosphate include guanosine triphosphate (GTP), adenosine triphosphate ( ATP) acid and the like, and the enzyme of the present invention can also use deoxyribonucleoside triphosphate as a substrate.

この糖ヌクレオチド合成活性の反応式として、マンノース−１−リン酸とGTPからGDP-マンノースを合成する場合について以下に示す。
As a reaction formula of this sugar nucleotide synthesis activity, the case where GDP-mannose is synthesized from mannose-1-phosphate and GTP is shown below.

また、本発明においては、さらにこの酵素を用いて、リン酸化糖異性体を合成するが、この合成においては、糖−６−リン酸に該酵素を添加し、反応温度60〜95℃で反応させ糖−６−リン酸異性体を得る。
糖−６−リン酸としては、例えば、マンノース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸等が挙げられる。 In the present invention, this enzyme is further used to synthesize phosphorylated sugar isomers. In this synthesis, the enzyme is added to sugar-6-phosphate and reacted at a reaction temperature of 60 to 95 ° C. To give the sugar-6-phosphate isomer.
Examples of sugar-6-phosphate include mannose-6-phosphate and fructose-6-phosphate.

このリン酸化糖異性化活性の反応式として、マンノース−６−リン酸からフルクトース−６−リン酸を合成する場合について以下に示す。
As a reaction formula of this phosphorylated saccharide isomerization activity, a case where fructose-6-phosphate is synthesized from mannose-6-phosphate is shown below.

また、この反応においては、上記精製した酵素のみならず、粗酵素であってもよい。例えば、宿主として枯草菌等分泌型の系を用いる場合には、培養液中に本酵素が生成蓄積され、大腸菌等の非分泌型の系を用いる場合には、菌体内に生成されるので、本酵素を含有する培養液あるいはその処理物、もしくは菌体破砕物等の培養処理物を用いて、糖ヌクレオチドあるいは糖リン酸異性体を合成してもよい。

本発明の酵素タンパク質は、他の酵素と組み合わせることにより、一連の酵素反応系からなる糖ヌクレオチド合成系を構築することができる。図１１は、本発明の酵素タンパク質と、本発明者等の先の出願（特願２００４−２３６３２１号）に係るリン酸化糖のリン酸基分子内転移酵素とを組み合わせることにより、フルクトース−６−リン酸からＧＤＰ−マンノースを生成する合成系の構築例である。
上記リン酸基分子内転移酵素は、好酸性好気性超好熱古細菌スルフォロバス、トーコーダイイ（JCM登録番号JCM10545）由来の酵素であり、そのアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列は配列番号５、６に示される。使用する糖リン酸のリン酸基分子内転移酵素としては、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するものの他、該アミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するものであって、かつ糖リン酸化糖のリン酸基分子内転移活性を有するものも使用できる。
該酵素は、マンノース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸等の糖−６−リン酸のリン酸基を分子内転移させて、それぞれマンノース−１−リン酸、グルコース−１−リン酸等の糖−１−リン酸を生成する。この酵素は６０〜９５℃で反応可能であり、上記酵素を組み合わせた反応系は耐熱性である。
図１１に示されるＧＤＰ−マンノース合成系においては、まず、本発明の酵素タンパク質の糖異性化作用を利用して、フルクトース−６−リン酸からマンノース−６−リン酸を生成させ、次いで、上記リン酸基分子内転移酵素を用いて、生成したマンノース−６−リン酸のリン酸基を分子内転移させて、マンノース−１−リン酸を生成させる。この後、本発明の酵素タンパク質の糖−ヌクレオチド合成作用を利用して、マンノース−１−リン酸とＧＴＰからＧＤＰ−マンノースを生成させる。
この糖−ヌクレオチド合成系においては、該合成系の各反応工程において、各酵素溶液を順次基質に接触させて各反応を行ってもよいが、本発明の酵素タンパク質と上記リン酸基分子内転移酵素とを共に含有する酵素反応系を用いることにより、異性化反応、分子内リン酸基転移反応及び糖−ヌクレオチド合成反応を一つの反応工程で行い、糖−ヌクレオチドを合成することも可能である。
また、図１２及び図１３に示されるように、本発明の酵素タンパク質は、酵素反応系に含有させる金属イオンによって、その酵素作用を切り替えることが可能である。図１２は、各金属イオンを２ｍＭ濃度で酵素反応系に含有させた場合の、本酵素タンパク質のイソメラーゼ活性を測定した結果を示す図であり、図１３は、同糖−ヌクレオチド合成活性を示す図である。図１２の結果によれば、本酵素タンパク質の糖リン酸化糖の異性化活性は、Ｃａイオンを含有させた場合に高いことが分かる。また、亜鉛イオン、銅イオンを含有させた場合は、糖リン酸化糖の異性化活性は低く、検出限界以下であった。一方、図１３の結果によれば、同糖−ヌクレオチド合成活性は、亜鉛イオン、銅イオンを含有させた場合は高く、カルシウムを含有させた場合には低い。すなわち、本発明の酵素タンパク質の反応系においては、カルシウムイオンを含有させる場合は、リン酸化糖の異性化活性を主に示し、亜鉛イオンあるいは銅イオンを含有させた場合は糖−ヌクレオチド合成活性を示す。
したがって、本発明においては、本発明の酵素タンパク質の作用を含有させる金属イオン種の種類により変更可能であり、このことは、本酵素タンパク質の異なる作用を利用する上記糖−ヌクレオチド合成系に応用可能である。なお、本発明の酵素タンパク質は、上記金属イオンを含有させない場合においては、上記リン酸化糖の異性化活性と上記糖−ヌクレオチド合成活性を併せて有する。

以下に、本発明の実施例を示すが、本発明実施例により限定されるものではない。 In this reaction, not only the purified enzyme but also a crude enzyme may be used. For example, when a secretory system such as Bacillus subtilis is used as a host, the enzyme is produced and accumulated in the culture solution, and when a non-secretory system such as Escherichia coli is used, it is produced in the bacterial body. Sugar nucleotides or sugar phosphate isomers may be synthesized using a culture solution containing the present enzyme, a processed product thereof, or a cultured product such as a crushed bacterial cell.

The enzyme protein of the present invention can be combined with other enzymes to construct a sugar nucleotide synthesis system comprising a series of enzyme reaction systems. FIG. 11 shows fructose-6-6 by combining the enzyme protein of the present invention with the phosphate group intramolecular transferase of the phosphorylated saccharide according to the previous application of the present inventors (Japanese Patent Application No. 2004-236321). It is an example of construction of a synthetic system that generates GDP-mannose from phosphoric acid.
The phosphate intramolecular transferase is an enzyme derived from an acidophilic aerobic hyperthermophilic archaeon Sulfolobus, Tokodaii (JCM registration number JCM10545), and its amino acid sequence and gene base sequence are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively. It is. As the phosphate group intramolecular transferase of the sugar phosphate to be used, in addition to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, one to several amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence. Those having an amino acid sequence and having phosphoric acid group intramolecular transfer activity of sugar phosphorylated saccharides can also be used.
The enzyme transfers the phosphate group of sugar-6-phosphate such as mannose-6-phosphate and glucose-6-phosphate intramolecularly, and mannose-1-phosphate and glucose-1-phosphate, respectively. To produce sugar-1-phosphate. This enzyme can react at 60 to 95 ° C., and the reaction system in which the enzymes are combined is heat resistant.
In the GDP-mannose synthesis system shown in FIG. 11, first, mannose-6-phosphate is produced from fructose-6-phosphate using the glycoisomerization action of the enzyme protein of the present invention, and then the above-mentioned Using a phosphate group intramolecular transferase, the phosphate group of the produced mannose-6-phosphate is transferred intramolecularly to produce mannose-1-phosphate. Thereafter, GDP-mannose is produced from mannose-1-phosphate and GTP by utilizing the sugar-nucleotide synthesis action of the enzyme protein of the present invention.
In this sugar-nucleotide synthesis system, in each reaction step of the synthesis system, each reaction may be carried out by bringing each enzyme solution into contact with a substrate in sequence, but the enzyme protein of the present invention and the above-mentioned phosphate group intramolecular transfer. By using an enzyme reaction system containing both enzymes, it is possible to synthesize sugar-nucleotides by performing isomerization reaction, intramolecular phosphate group transfer reaction and sugar-nucleotide synthesis reaction in one reaction step. .
In addition, as shown in FIGS. 12 and 13, the enzyme protein of the present invention can switch its enzyme action by a metal ion contained in the enzyme reaction system. FIG. 12 is a diagram showing the results of measuring the isomerase activity of the enzyme protein when each metal ion is contained in the enzyme reaction system at a concentration of 2 mM, and FIG. 13 is a diagram showing the sugar-nucleotide synthesis activity. It is. According to the results of FIG. 12, it can be seen that the isomerization activity of the phosphorylated saccharide of this enzyme protein is high when Ca ions are contained. Moreover, when zinc ion and copper ion were contained, the isomerization activity of sugar phosphorylated saccharide was low and was below the detection limit. On the other hand, according to the result of FIG. 13, the sugar-nucleotide synthesis activity is high when zinc ions and copper ions are contained, and is low when calcium is contained. That is, in the reaction system of the enzyme protein of the present invention, when calcium ions are contained, phosphorylation sugar isomerization activity is mainly shown, and when zinc ions or copper ions are contained, sugar-nucleotide synthesis activity is shown. Show.
Therefore, in the present invention, it can be changed depending on the type of metal ion species containing the action of the enzyme protein of the present invention, and this can be applied to the sugar-nucleotide synthesis system utilizing the different action of the enzyme protein. It is. The enzyme protein of the present invention has both the phosphorylated saccharide isomerization activity and the sugar-nucleotide synthesis activity in the case where the metal ion is not contained.

Examples of the present invention will be shown below, but the present invention is not limited to the examples.

[実施例１] 糖ヌクレオチド合成及びリン酸化糖異性化酵素の製造
（１） 菌の培養
好酸性好気性超好熱性古細菌パイロコッカス、ホリコシイJCM9974は次の方法で培養した。
13.85gのNaCl、3.5ｇのMgSO4・7H2O、2.75ｇのMgCl2・6H2O、0.325ｇのKCl、0.05ｇのNaBr、15ｍｇのH3BO3、7.5mgのSrCl2・6H2O、0.05mgのKI、0.75ｇのCaCl2、0.5ｇのKH2PO4、2.0mgの（KH4））2Ni(SO4)2・6H2Oを１Lの蒸留水に溶かしSalt base solutionを作製した。1.5ｇのNitrilotriacetic acidを１Lの蒸留水に溶かし、この溶液のｐHを6.5にKOH溶液で調製した。その溶液に3.0ｇのMgSO4・7H2O、0.5ｇのMnSO4・ｘH２O、1.0ｇのNaCl、0.1ｇのFeSO4・7H2O、0.1ｇのCoSO4・7H2O、0.1ｇのCaCl2・2H2O、0.1ｇのZnSO4・7H2O、0.01ｇのCuSO4・5H2O、0.01ｇのAlK(SO4)2、0.01ｇのH3BO3、0.01ｇのNa2MoO4・2H2Oを加え、この溶液のｐHを7.0にKOH溶液で調製し、Trace mineralsを作製した。1.0LのSalt bace solution、10.0ｍLのTrace minerals、5.0ｍLのクエン酸、1.0ｇのYeast extract、5.0ｇのBacto peptone、30.0ｇの硫黄、1.0ｍｇのレサズリンを作製し、この溶液のｐHを6.5にH2SO4溶液で調製した。この溶液を窒素下でフィルター滅菌し、1日に3時間硫黄蒸気に当てることを連続3日間行った。5％のNaS・9H2Oを窒素下でオートクレーブし、無菌かつ嫌気下で培地に加え、JCM9974を植菌した。この培養液を98℃で培養し、その後遠心分離し集菌した。 [Example 1] Sugar nucleotide synthesis and production of phosphorylated sugar isomerase (1) Bacterial culture The acidophilic aerobic hyperthermophilic archaeon Pyrococcus and Horikoshii JCM9974 were cultured by the following method.
13.85 g NaCl, 3.5 g MgSO 4 .7H 2 O, 2.75 g MgCl 2 .6H 2 O, 0.325 g KCl, 0.05 g NaBr, 15 mg H 3 BO 3 , 7.5 mg SrCl 2 .6H 2 Dissolve O, 0.05 mg KI, 0.75 g CaCl 2 , 0.5 g KH 2 PO 4 , 2.0 mg (KH 4 )) 2Ni (SO 4 ) 2 · 6H 2 O in 1 L distilled water Produced. 1.5 g of Nitrilotriacetic acid was dissolved in 1 L of distilled water, and the pH of this solution was adjusted to 6.5 with a KOH solution. To the solution, 3.0 g MgSO 4 .7H 2 O, 0.5 g MnSO 4 .xH 2 O, 1.0 g NaCl, 0.1 g FeSO 4 .7H 2 O, 0.1 g CoSO 4 .7H 2 O, 0.1 g CaCl 2 · 2H 2 O, 0.1 g ZnSO 4 · 7H 2 O, 0.01 g CuSO 4 · 5H 2 O, 0.01 g AlK (SO 4 ) 2 , 0.01 g H 3 BO 3 , 0.01 g Na 2 MoO 4 · 2H 2 O was added, and the pH of this solution was adjusted to 7.0 with a KOH solution to produce Trace minerals. Make 1.0 L Salt bace solution, 10.0 mL Trace minerals, 5.0 mL citric acid, 1.0 g Yeast extract, 5.0 g Bacto peptone, 30.0 g sulfur, 1.0 mg resazurin, and adjust the pH of this solution to 6.5 Prepared with H 2 SO 4 solution. This solution was filter sterilized under nitrogen and exposed to sulfur vapor for 3 hours a day for 3 consecutive days. 5% NaS · 9H 2 O was autoclaved under nitrogen, added to the medium under aseptic and anaerobic conditions, and JCM9974 was inoculated. This culture solution was cultured at 98 ° C., and then centrifuged to collect bacteria.

（２） 染色体DNAの調製
JCM9974の染色体DNAは以下の方法により調製した。
培養終了後5000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌する。菌体を10mMEDTA(pH 6.0）溶液で洗浄後、50mM Tris/HCl-50mM EDTA(pH8.5）溶液を加えて細胞を溶解させる。さらに、0.5% Na-lauroylsarcosinate、1mg/mlプロテアーゼKとなるように各々を加えた後、50℃で3時間保温する。フェノール処理を3回行った後、溶液を10mM EDTA（pH8.0）溶液に対して透析する。37℃で30分間のRNaseによるRNAの分解後、フェノールクロロフォルム溶液で処理した後、10mM Tris-1mM EDTA（pH8.0）で透析を行った。 (2) Preparation of chromosomal DNA
The chromosomal DNA of JCM9974 was prepared by the following method.
After culturing, the cells are collected by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes. The cells are washed with 10 mM EDTA (pH 6.0) solution, and then 50 mM Tris / HCl-50 mM EDTA (pH 8.5) solution is added to lyse the cells. Further, 0.5% Na-lauroylsarcosinate and 1 mg / ml protease K are added to each, and then kept at 50 ° C. for 3 hours. After three phenol treatments, the solution is dialyzed against a 10 mM EDTA (pH 8.0) solution. After degradation of RNA with RNase at 37 ° C. for 30 minutes, it was treated with a phenol chloroform solution, and dialyzed against 10 mM Tris-1 mM EDTA (pH 8.0).

（３）発現プラスミドの構築
上記（２）で得た染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記Upper primerとLower primerを使用して PCRを行った。ＰＣＲで得られたＤＮＡは、目的の構造遺伝子領域の前後に制限酵素（NdeIとBamHI）サイトを有する。 (3) Construction of expression plasmid PCR was carried out using the chromosomal DNA obtained in (2) above as a template and using the following Upper primer and Lower primer. The DNA obtained by PCR has restriction enzyme (NdeI and BamHI) sites before and after the target structural gene region.

Upper primer、
5’- GGGAATTCCATATGAAGGCTTTGATTCTAG -3’ （配列番号３）
（下線部はNdeIサイトを示す）
Lower primer、
5’- CGCGGATCCTCACCTCCCGTAATCGTCTTG -3’ （配列番号４）
（下線部はBamHIサイトを示す） Upper primer,
5'-GGGAATTC CATATG AAGGCTTTGATTCTAG -3 '(SEQ ID NO: 3)
(Underlined indicates NdeI site)
Lower primer,
5'- CGC GGATCC TCACCTCCCGTAATCGTCTTG -3 '(SEQ ID NO: 4)
(Underlined indicates BamHI site)

PCR反応後、制限酵素（NdeIとBamHI）で完全分解（37℃で2時間）した後、目的の構造遺伝子領域断片を精製した。該遺伝子領域（PH0925）の塩基配列は配列番号２に示される。
制限酵素NdeIとBamHIで切断後精製したpET28a（Novagen社製）と上記の構造遺伝子領域断片とをT4リガーゼを用いて16℃、2時間反応させることによって連結した。連結したDNAの一部を大腸菌DH５αのコンピテントセルに導入し、形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)で精製し、塩基配列を確認して発現プラスミド、pET28a/PH0925を得た。発現プラスミドpET28a/PH0925を用いるとPHGMP/PMIはN末端にヒスチジンタグが付加された融合蛋白質として生産される。 After the PCR reaction, the fragment was completely digested with restriction enzymes (NdeI and BamHI) (2 hours at 37 ° C.), and then the target structural gene region fragment was purified. The base sequence of the gene region (PH0925) is shown in SEQ ID NO: 2.
PET28a (manufactured by Novagen) purified by digestion with restriction enzymes NdeI and BamHI and the above structural gene region fragment were ligated by reacting them at 16 ° C. for 2 hours using T4 ligase. A part of the ligated DNA was introduced into competent cells of E. coli DH5α to obtain transformant colonies. From the obtained colonies, the plasmid was purified by QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by QIAGEN), and the nucleotide sequence was confirmed to obtain an expression plasmid, pET28a / PH0925. When the expression plasmid pET28a / PH0925 is used, PHGMP / PMI is produced as a fusion protein with a histidine tag added to the N-terminus.

（６）組み換え遺伝子の発現
大腸菌 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL、（Novagen社製）のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1ml移す。その中に上記の発現プラスミド10ng分に相当する溶液を加え氷中に30分間放置した後、42℃でヒートショックを30秒間おこない、そこにSOC培地0.9mlを加え、37℃で1時間振とう培養する。その後、カナマイシンを含むLB寒天プレート上に適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体大腸菌BL21-CodonPus(DE3)-RIL/pET28a/PH0925を得た。 (6) Recombinant gene expression Thaw E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL (Novagen) competent cells and transfer 0.1 ml to a Falcon tube. A solution corresponding to 10 ng of the above expression plasmid was added to the solution and allowed to stand in ice for 30 minutes. Then, heat shock was performed at 42 ° C. for 30 seconds, 0.9 ml of SOC medium was added thereto, and the mixture was shaken at 37 ° C. for 1 hour. Incubate. Thereafter, an appropriate amount was sprinkled on an LB agar plate containing kanamycin and cultured at 37 ° C. overnight to obtain transformant E. coli BL21-CodonPus (DE3) -RIL / pET28a / PH0925.

当該形質転換体をカナマイシン含有LB培地（２リットル）中で一晩37℃において振とう培養した後、IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalacopyranoside）を１mMになるように加え、さらに30℃で5時間振とう培養した。培養後、遠心分離機（6000rpm、20分間）により集菌をおこなった。   The transformant was cultured in a kanamycin-containing LB medium (2 liters) overnight at 37 ° C., and then IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalacopyranoside) was added to 1 mM, and further at 30 ° C. for 5 hours. Cultured with shaking. After the culture, the cells were collected by a centrifuge (6000 rpm, 20 minutes).

（７）PHGMP/PMI酵素の精製
2リットル培養液から集菌した菌体に2倍量の20mMリン酸ナトリウム塩緩衝液（pH7.4）、菌体１ｇあたり２mgのLysozyme（Wako社製）、0.1μgのDNaseＩ（Takara社製）を加え懸濁液を得た。氷上で1時間静置後、超音波破砕し、遠心分離（20000ｇ 30分間）により上清液を得た。得られた上清液を80℃で30分間加熱した後、遠心分離（20000g ３０分間）により上清液を得た。この上清液を20mMリン酸ナトリウム塩緩衝液（pH7.4）0.5M NaClで平衡化したHiTrap phenyl sepharose(ファルマシア社製)カラムに吸着させ、同緩衝液中のイミダゾール濃度を0.0 Mから0.5 Mに増加させることにより目的蛋白質の溶出を行った。 (7) Purification of PHGMP / PMI enzyme
Bacteria collected from 2 liters of culture solution are doubled in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 2 mg of Lysozyme (Wako) per gram of cell, 0.1 μg DNase I (Takara) Was added to obtain a suspension. After standing for 1 hour on ice, the mixture was sonicated and centrifuged (20,000 g for 30 minutes) to obtain a supernatant. The obtained supernatant was heated at 80 ° C. for 30 minutes and then centrifuged (20000 g for 30 minutes) to obtain a supernatant. The supernatant was adsorbed on a HiTrap phenyl sepharose (Pharmacia) column equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) 0.5 M NaCl, and the imidazole concentration in the buffer was changed from 0.0 M to 0.5 M. The target protein was eluted by increasing the amount to 1.

[実施例２] 糖ヌクレオチド合成
（１） 糖ヌクレオチド合成反応（糖とヌクレオチドの結合反応）
50mM MOPS緩衝液（pH7.6）、２mM MgSO4、1ｍＭ マンノース−１−リン酸、0.05ｍM GTPからなる酵素反応溶液10μL中に実施例１で得られた精製酵素1 ngを加えた。この酵素反応液を85℃で保温することにより、反応させた。5分後に100μlの500ｍM KH2PO4溶液を加える事により反応を停止させた。この反応により、マンノースがGDPと結合したGDPマンノースが生成する。 [Example 2] Sugar nucleotide synthesis (1) Sugar nucleotide synthesis reaction (binding reaction between sugar and nucleotide)
1 ng of the purified enzyme obtained in Example 1 was added to 10 μL of an enzyme reaction solution consisting of 50 mM MOPS buffer (pH 7.6), 2 mM MgSO 4 , 1 mM mannose-1-phosphate and 0.05 mM GTP. The enzyme reaction solution was kept at 85 ° C. for reaction. After 5 minutes, the reaction was stopped by adding 100 μl of 500 mM KH 2 PO 4 solution. By this reaction, GDP mannose in which mannose is combined with GDP is generated.

（２）糖ヌクレオチド合成反応（糖とヌクレオチドの結合反応）の測定
HPLCを用いて反応生成物であるGDPマンノースの量をヌクレオチド部分の紫外線の吸収を指標に測定した。図２に示すように標準物質であるGDP及びGDPマンノースは、HPLCにおいて溶出位置が異なる。さらに、図３に示すように標準サンプル添加量を変化させたときのピークの面積と標準物質量は正確な比例関係にあり、この検量線を用いることにより反応生成物を定量できることが示された。

そこで、上記（１）で反応させたサンプルに関しても、HPLCで同様の反応の解析を行った。その結果、図４に示すように、確かにGDPマンノースが見出されたことから、該酵素は、糖ヌクレオチドを確かに生成している事が確認された。 (2) Measurement of sugar nucleotide synthesis reaction (sugar-nucleotide binding reaction)
The amount of GDP mannose, which is a reaction product, was measured by HPLC using the ultraviolet absorption of the nucleotide moiety as an index. As shown in FIG. 2, the standard substances GDP and GDP mannose have different elution positions in HPLC. Furthermore, as shown in FIG. 3, the peak area and the standard substance amount when the standard sample addition amount is changed are in an accurate proportional relationship, and it was shown that the reaction product can be quantified by using this calibration curve. .

Therefore, the same reaction was analyzed by HPLC for the sample reacted in (1) above. As a result, as shown in FIG. 4, since GDP mannose was surely found, it was confirmed that the enzyme was surely producing sugar nucleotides.

[実施例３] リン酸化糖異性体合成
（１）リン酸化糖異性化反応
50mM MOPS緩衝液（pH7.6）、２mM MgSO4、1ｍＭ NADP（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、1unit グルコース−６−リン酸異性化酵素、1unit グルコース−６−リン酸脱水素酵素、0.4mMマンノース−６−リン酸、からなる酵素反応溶液2,000μL中に実施例１で得られた精製酵素2.0μgを加えた。この酵素反応液を65℃で保温することにより、反応させた。この反応により、マンノース−６−リン酸が異性化されたフルクトース−６−リン酸が生成する。 [Example 3] Phosphorylated sugar isomer synthesis (1) Phosphorylated sugar isomerization reaction
50 mM MOPS buffer (pH 7.6), 2 mM MgSO 4 , 1 mM NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidation type), 1 unit glucose-6-phosphate isomerase, 1 unit glucose-6-phosphate dehydrogenase, 2.0 μg of the purified enzyme obtained in Example 1 was added to 2,000 μL of an enzyme reaction solution consisting of 0.4 mM mannose-6-phosphate. The enzyme reaction solution was kept at 65 ° C. for reaction. This reaction produces fructose-6-phosphate in which mannose-6-phosphate is isomerized.

（２）糖リン酸異性化反応の測定
反応生成物であるフルクトース−６−リン酸を、グルコース−６−リン酸異性化酵素によりグルコース−６−リン酸に変換し、このグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸脱水素酵素により６−リン酸グルコノラクトンに変換する際の副反応であるNADPの酸化型から還元型への変化量を紫外・可視分光光度計によって波長340nmにおける吸光度の変化を指標に測定した。
NADPの酸化型と還元型では340nmの吸光度が全く異なる。さらに、図５に示すように、酵素反応溶液中の基質であるマンノース−６−リン酸濃度を変化させたときの、吸光度の計時変化とNADP還元型の量は正確な比例関係にあり、この検量線を用いることにより反応生成物を定量できることが示された。
そこで、（１）で反応させたサンプルに関しても、紫外・可視分光光度計による340nmの吸光度を用いて（１）の反応の解析を行った。その結果、図６に示すように、確かに吸光度の増加が見出されたことから、該酵素は、マンノース−６−リン酸を異性化しフルクトース−６−リン酸を確かに生成している事が確認された。 (2) Measurement of sugar phosphate isomerization reaction Fructose-6-phosphate, which is a reaction product, is converted to glucose-6-phosphate by glucose-6-phosphate isomerase, and this glucose-6-phosphate is converted. The amount of change from oxidized form to reduced form of NADP, which is a side reaction when converting acid to 6-phosphate gluconolactone by glucose-6-phosphate dehydrogenase, was measured at a wavelength of 340 nm using an ultraviolet / visible spectrophotometer. The change in absorbance was measured as an index.
The absorbance at 340 nm is completely different between the oxidized and reduced forms of NADP. Further, as shown in FIG. 5, when the concentration of mannose-6-phosphate, which is a substrate in the enzyme reaction solution, is changed, the change in absorbance with time and the amount of NADP reduced form are in an accurate proportional relationship. It was shown that the reaction product can be quantified by using a calibration curve.
Therefore, for the sample reacted in (1), the reaction in (1) was analyzed using absorbance at 340 nm by an ultraviolet / visible spectrophotometer. As a result, as shown in FIG. 6, since an increase in absorbance was surely found, the enzyme isomerized mannose-6-phosphate and surely produced fructose-6-phosphate. Was confirmed.

[実施例４] 酵素の性質
（１） 蛋白質化学的性質
当該酵素は上記の精製プロセスで完全に精製され、SDS-PAGEで分子量約53,000Daであった（図１）。当該酵素は464アミノ酸残基より構成され（配列番号１）、そのアミノ酸配列から予測された分子量は52,888.64 Daであった。また、ヘリコバクター菌のGMP/PMIとの相同性も見出され、（pyrophosphorylase signature）活性中心、金属イオン結合、糖認識に関与するモチーフが保存されていた（図１）。 [Example 4] Properties of enzyme (1) Protein chemical properties The enzyme was completely purified by the purification process described above, and had a molecular weight of about 53,000 Da by SDS-PAGE (Fig. 1). The enzyme was composed of 464 amino acid residues (SEQ ID NO: 1), and the molecular weight predicted from the amino acid sequence was 52,888.64 Da. Furthermore, homology with Helicobacter GMP / PMI was also found, and the (pyrophosphorylase signature) active center, metal ion binding, and motifs involved in sugar recognition were conserved (FIG. 1).

（２）糖ヌクレオチド合成活性（糖ヌクレオチドの結合活性）
実施例１により精製された該酵素を用いて、マンノース−１−リン酸とGTPとの結合活性を実施例２に従って測定した。その結果、図４にあるように時間に依存したGDPマンノースの合成が８５℃の反応温度で検出された。従って耐熱性の高い糖ヌクレオチド合成活性を示すことが確認された。 (2) Sugar nucleotide synthesis activity (sugar nucleotide binding activity)
Using the enzyme purified according to Example 1, the binding activity between mannose-1-phosphate and GTP was measured according to Example 2. As a result, time-dependent synthesis of GDP mannose was detected at a reaction temperature of 85 ° C. as shown in FIG. Therefore, it was confirmed that sugar nucleotide synthesis activity with high heat resistance was exhibited.

（３）pH依存性
２mM MgSO4、1ｍM Mannose-1-リン酸、0.05ｍM GTPからなる酵素反応溶液10μ 中の50mM緩衝液をリン酸ナトリウム塩緩衝液pH6.0、pH6.5、MOPS緩衝液pH7.0、Tris-HCl緩衝液pH8.0、グリシン-NaOH緩衝液pH9.0、pH10.0に変化させ実施例１で得られた精製酵素1ngを加えた。この酵素反応液を85℃で5分間保温することにより反応させた後に、100μLの500ｍM KH2PO4溶液を加えることにより反応を停止させた。反応の進行は、実施例2の（２）にあるようにHPLCで測定した。図８に示すように、本酵素の活性はいずれのpHにおいても高い活性を示した。 (3) pH dependence 50 mM buffer solution in 10 μm enzyme reaction solution consisting of 2 mM MgSO 4 , 1 mM Mannose-1-phosphate, 0.05 mM GTP, sodium phosphate buffer pH 6.0, pH 6.5, MOPS buffer After changing to pH 7.0, Tris-HCl buffer pH 8.0, glycine-NaOH buffer pH 9.0, pH 10.0, 1 ng of the purified enzyme obtained in Example 1 was added. The enzyme reaction solution was allowed to react at 85 ° C. for 5 minutes, and then the reaction was stopped by adding 100 μL of 500 mM KH 2 PO 4 solution. The progress of the reaction was measured by HPLC as in Example 2 (2). As shown in FIG. 8, the activity of this enzyme was high at any pH.

（４）ヌクレオシド三リン酸基質の多様性
50mM MOPS緩衝液（pH7.6）、２mM MgSO4、1ｍＭ Mannose-1-リン酸及び0.05ｍM GTPまたは0.05mM ATP等からなる酵素反応溶液10μL中に実施例１で得られた精製酵素1 ngを加えた。この酵素反応液を85℃で5分間保持することにより反応させた後に、100μLの500ｍM KH2PO4溶液を加えることにより反応を停止させた。結果を図９に示す。図９から分かるように、本酵素はGTP以外にATP、dGTPを基質として利用できる事が示された。 (4) Diversity of nucleoside triphosphate substrates
1 ng of the purified enzyme obtained in Example 1 in 10 μL of an enzyme reaction solution consisting of 50 mM MOPS buffer (pH 7.6), 2 mM MgSO 4 , 1 mM Mannose-1-phosphate and 0.05 mM GTP or 0.05 mM ATP. added. The enzyme reaction solution was allowed to react at 85 ° C. for 5 minutes, and then the reaction was stopped by adding 100 μL of 500 mM KH 2 PO 4 solution. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 9, it was shown that this enzyme can use ATP and dGTP as substrates in addition to GTP.

（５）糖−１−リン酸基質の多様性
50mM MOPS緩衝液（pH7.6）、２mM MgSO4、0.05ｍM dGTP及び1ｍＭ マンノース−１−リン酸、または1mM グルコース−１−リン酸からなる酵素反応溶液10μL中に実施例１で得られた精製酵素1 ngを加えた。この酵素反応液を85℃で5分間保持することにより反応させた後に、100μLの500ｍM KH2PO4溶液を加えることにより反応を停止させた。結果を図１０に示す。図１０から分かるように、本酵素はマンノース−１−リン酸以外にグルコース−１−リン酸を基質として利用できる事が示された。 (5) Diversity of sugar-1-phosphate substrates
Purification obtained in Example 1 in 10 μL of an enzyme reaction solution consisting of 50 mM MOPS buffer (pH 7.6), 2 mM MgSO 4 , 0.05 mM dGTP and 1 mM mannose-1-phosphate or 1 mM glucose-1-phosphate 1 ng of enzyme was added. The enzyme reaction solution was allowed to react at 85 ° C. for 5 minutes, and then the reaction was stopped by adding 100 μL of 500 mM KH 2 PO 4 solution. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 10, it was shown that this enzyme can use glucose-1-phosphate as a substrate in addition to mannose-1-phosphate.

（６）リン酸化糖異性化活性
実施例１により精製された該酵素を用いて、マンノース−６−リン酸の糖分子を異性化することでフルクトース−６−リン酸に変化させる活性を実施例３に従って測定した。その結果、図６に有るように、基質であるフルクトース−６−リン酸が反応時間に従って生産される活性が65℃で検出された。この事から、本酵素はリン酸化糖異性化活性を有する熱に安定な酵素であることが示された。 (6) Phosphorylated sugar isomerization activity Using the enzyme purified in Example 1, the activity of changing the sugar molecule of mannose-6-phosphate to fructose-6-phosphate by isomerization is shown in Example Measured according to 3. As a result, as shown in FIG. 6, the activity of producing the substrate fructose-6-phosphate according to the reaction time was detected at 65 ° C. This indicates that this enzyme is a heat-stable enzyme having phosphorylation sugar isomerization activity.

［参考例］
以下に、本発明の糖−ヌクレオチド生産に用いる、特願２００４−２３６３２１号に係るリン酸化糖のリン酸基分子内転移酵素の製造例及び該酵素の酵素作用の試験結果を参考例１、２として示す。 [Reference example]
Examples of production of a phosphorylated sugar phosphate group intramolecular transferase according to Japanese Patent Application No. 2004-236321 used for sugar-nucleotide production of the present invention and test results of enzyme action of the enzyme are shown in Reference Examples 1 and 2 below. As shown.

[参考例１］
（１） 菌の培養
好酸性好気性超好熱性古細菌スルフォロバス、トーコーダイイJCM10545は次の方法で培養した。
1.3g の(NH4)2SO4、0.28gのKH2PO4、0.25gのMgSO4・7H2O、0.07gのCaCl2・2H2O、0.02gのFeCl3・6H2O、1.8mgのMnCl2・4H2O、4.5mgのNa2B4O7・10H2O、0.22mgのZnSO4・7H2O、0.05mgのCuCl2・2H2O、0.03mgのNa2MoO4・2H2O、0.03mgのVoSO4・xH2O、0.01mgのCoSO4・7H2O、1.0ｇの酵母エキスを1リッターの蒸留水に溶かし、この溶液のpHを3.5に10規定H2SO4溶液で調製した。加圧殺菌した後、JCM10545を植菌した。この培養液を80℃で1〜2日培養し、その後遠心分離し集菌した。 [Reference Example 1]
(1) Bacterial culture The acidophilic aerobic hyperthermophilic archaeon sulforobes and Tokodai JCM10545 were cultured by the following method.
1.3 g of (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.28 g of KH 2 PO 4 , 0.25 g of MgSO 4 .7H 2 O, 0.07 g of CaCl 2 .2H 2 O, 0.02 g of FeCl 3 .6H 2 O, 1.8 mg MnCl 2 4H 2 O, 4.5 mg Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O, 0.22 mg ZnSO 4 · 7H 2 O, 0.05 mg CuCl 2 · 2H 2 O, 0.03 mg Na 2 MoO 4・ 2H 2 O, 0.03 mg VoSO 4 xH 2 O, 0.01 mg CoSO 4 .7H 2 O, 1.0 g yeast extract were dissolved in 1 liter of distilled water, and the pH of this solution was adjusted to 3.5 and 10N H 2 Prepared with SO 4 solution. After sterilization under pressure, JCM10545 was inoculated. This culture solution was cultured at 80 ° C. for 1-2 days, and then centrifuged to collect bacteria.

（２） 染色体DNAの調製
JCM10545の染色体DNAは以下の方法により調製した。
培養終了後5,000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌する。菌体を10mM EDTA(pH 6.0)溶液で洗浄後、50mM Tris/HCl-50mM EDTA(pH8.5)溶液を加えて細胞を溶解させる。さらに、0.5% Na-lauroylsarcosinate、1mg/mL プロテアーゼKとなるように各々を加えた後、50℃で3時間保温する。フェノール処理を3回行った後、溶液を10mM EDTA (pH8.0)溶液に対して透析する。37℃で30分間のRNaseによるRNAの分解後、フェノールクロロフォルム溶液で処理した後、10mM Tris-1mM EDTA(pH8.0)で透析を行った。 (2) Preparation of chromosomal DNA
The chromosomal DNA of JCM10545 was prepared by the following method.
After culturing, the cells are collected by centrifugation at 5,000 rpm for 10 minutes. The cells are washed with 10 mM EDTA (pH 6.0) solution, and then 50 mM Tris / HCl-50 mM EDTA (pH 8.5) solution is added to lyse the cells. Further, 0.5% Na-lauroylsarcosinate and 1 mg / mL protease K are added to each, and then the mixture is kept at 50 ° C. for 3 hours. After three phenol treatments, the solution is dialyzed against 10 mM EDTA (pH 8.0) solution. After degradation of RNA with RNase at 37 ° C. for 30 minutes, it was treated with a phenol chloroform solution and dialyzed against 10 mM Tris-1 mM EDTA (pH 8.0).

（３） 染色体DNAを含むショットガンライブラリークローンの作製
上記（２）の工程で得られた染色体DNAを超音波処理することにより断片化した後、アガロースゲル電気泳動により1kb及び2kb長のDNA断片を回収した。この断片をプラスミドベクターpUC118のHincII制限酵素部位に挿入したショットガンライブラリーを作製した。各ショットガンクローンの末端塩基配列を、ABI社製自動塩基配列読み取り装置377を用いて解読していった。 (3) Preparation of shotgun library clones containing chromosomal DNA Fragmentation of the chromosomal DNA obtained in step (2) above by sonication followed by 1 kb and 2 kb long DNA fragments by agarose gel electrophoresis Was recovered. A shotgun library was prepared by inserting this fragment into the HincII restriction enzyme site of plasmid vector pUC118. The terminal base sequence of each shotgun clone was decoded using an automatic base sequence reader 377 manufactured by ABI.

（４） STPMM/PGM遺伝子の同定
上記手法で決定された好酸性好気性超好熱古細菌スルフォロバス、トーコーダイイのゲノム塩基配列の大型計算機による解析を行い、phosphomannomutase/phosphoglucomutase酵素の機能を含むであろう蛋白質をコードする遺伝子(ST0242)を同定した。この超好熱性古細菌スルフォロバス、トーコーダイイのST0242遺伝子の開始コドンはATGで、455アミノ酸残基の蛋白質（配列番号５）をコードする遺伝子として同定された（配列番号６）。 (4) Identification of the STPMM / PGM gene The genome sequence of the acidophilic aerobic hyperthermophilic archaeon Sulfolobus and Tokodaii determined by the above method will be analyzed by a large computer and may contain the functions of phosphomannomutase / phosphoglucomutase enzymes. A gene encoding the protein (ST0242) was identified. The initiation codon of ST0242 gene of this hyperthermophilic archaea Sulfolobus, Tokodaii was ATG, and was identified as a gene encoding a protein of 455 amino acid residues (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6).

（５）発現プラスミドの構築
構造遺伝子領域の前後に制限酵素(NdeIとXhoI）サイトを構築する目的でDNAプライマーを合成し、PCRでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。 (5) Construction of expression plasmid DNA primers were synthesized for the purpose of constructing restriction enzyme (NdeI and XhoI) sites before and after the gene region, and restriction enzyme sites were introduced before and after the gene by PCR.

Upper primer、
5’- TTAATTCCATATGGGTAAGCTTTTTGGTACTGAC -3’ （配列番号７）
（下線部はNdeIサイトを示す）
Lower primer、
5’- ATATACTCGAGTCATTTACCCTCTACAATC -3’ （配列番号８）
（下線部はXhoIサイトを示す） Upper primer,
5'- TTAATTC CATATG GGTAAGCTTTTTGGTACTGAC -3 '(SEQ ID NO: 7)
(Underlined indicates NdeI site)
Lower primer,
5'- ATATA CTCGAG TCATTTACCCTCTACAATC -3 '(SEQ ID NO: 8)
(Underlined portion indicates XhoI site)

Upper primerとLower primerを組み合わせたPCR反応後、制限酵素（NdeIとXhoI）で完全分解（37℃で2時間）した後、その構造遺伝子領域断片を精製した。
制限酵素NdeIとXhoIで切断後精製したpET28a（Novagen社製）と上記の構造遺伝子（ST0242）領域断片とT4リガーゼを用いて16℃、2時間反応させることによって連結した。連結したDNAの一部を大腸菌DH5αのコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)で精製し、塩基配列を確認して発現プラスミド、pET28a/ST0242を得た。発現プラスミドpET28a/ST0242を用いるとSTPMM/PGMはN末端にヒスチジンタグが付加された融合蛋白質として生産される。 After the PCR reaction combining the upper primer and the lower primer, complete digestion with restriction enzymes (NdeI and XhoI) (2 hours at 37 ° C.), and then the structural gene region fragment was purified.
PET28a (manufactured by Novagen) purified after digestion with restriction enzymes NdeI and XhoI, the above structural gene (ST0242) region fragment, and T4 ligase were used to react at 16 ° C. for 2 hours. A part of the ligated DNA was introduced into competent cells of E. coli DH5α to obtain transformant colonies. From the obtained colonies, the plasmid was purified by QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by QIAGEN), and the nucleotide sequence was confirmed to obtain an expression plasmid, pET28a / ST0242. When the expression plasmid pET28a / ST0242 is used, STPMM / PGM is produced as a fusion protein with a histidine tag added to the N-terminus.

（６）組み換え遺伝子の発現
大腸菌 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL、(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1ml移す。その中に上記の発現プラスミド10ng分に相当する溶液を加え氷中に30分間放置した後、42℃でヒートショックを30秒間おこない、そこにSOC培地0.9mlを加え、37℃で1時間振とう培養する。その後、カナマイシンを含むLB寒天プレート上に適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体大腸菌BL21-CodonPus(DE3)-RIL/pET28a/ST0242を得た。 (6) Recombinant gene expression Thaw E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL (Novagen) competent cells and transfer 0.1 ml to a falcon tube. A solution corresponding to 10 ng of the above expression plasmid was added to the solution and allowed to stand in ice for 30 minutes. Then, heat shock was performed at 42 ° C. for 30 seconds, 0.9 ml of SOC medium was added thereto, and the mixture was shaken at 37 ° C. for 1 hour. Incubate. Thereafter, an appropriate amount was sprinkled on an LB agar plate containing kanamycin and cultured at 37 ° C. overnight to obtain transformant E. coli BL21-CodonPus (DE3) -RIL / pET28a / ST0242.

当該形質転換体をカナマイシン含有LB培地(2リットル)中で一晩37℃において振とう培養した後、IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalacopyranoside）を1mMになるように加え、さらに30℃で5時間振とう培養した。培養後、遠心分離（6000rpm、20分間）により集菌をおこなった。   The transformant was cultured in a kanamycin-containing LB medium (2 liters) with shaking overnight at 37 ° C., and then IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalacopyranoside) was added to 1 mM, and further at 30 ° C. for 5 hours. Cultured with shaking. After culture, the cells were collected by centrifugation (6000 rpm, 20 minutes).

［参考例２］
リン酸化糖のリン酸基分子内転移反応の測定
ａ．グルコース−１−リン酸のリン酸基分子内転移反応
（１）グルコース−１−リン酸のリン酸基分子内転移反応の酵素反応溶液
50mM MOPS緩衝液(pH7.6)、2mM MgSO4、10μM グルコース 1,6-ビスリン酸、1mM NADP（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、1unit グルコース−６−リン酸脱水素酵素、0.4mMグルコース−１−リン酸、からなる酵素反応溶液2,000μL中に参考例１で得られた精製酵素3.5μgを加えた。この酵素反応液を65℃で保温することにより、反応させた。この反応により、グルコース−１−リン酸のリン酸基が分子内転移しグルコース−６−リン酸が生成する。 [Reference Example 2]
Measurement of phosphoric acid group intramolecular transfer reaction of phosphorylated saccharide a. Phosphorus group intramolecular transfer reaction of glucose-1-phosphate (1) Enzyme reaction solution for phosphate group intramolecular transfer reaction of glucose-1-phosphate
50 mM MOPS buffer (pH 7.6), 2 mM MgSO 4 , 10 μM glucose 1,6-bisphosphate, 1 mM NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidation type), 1 unit glucose-6-phosphate dehydrogenase, 0.4 mM 3.5 μg of the purified enzyme obtained in Reference Example 1 was added to 2,000 μL of an enzyme reaction solution consisting of glucose-1-phosphate. The enzyme reaction solution was kept at 65 ° C. for reaction. By this reaction, the phosphate group of glucose-1-phosphate is transferred intramolecularly to produce glucose-6-phosphate.

（２） グルコース−１−リン酸のリン酸基分子内転移反応の測定
本酵素を用いた反応の反応生成物であるグルコース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸脱水素酵素により６−リン酸グルコノラクトンに変換する際に、副反応としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）が酸化型から還元型へ変化する。その変化量を340nmにおける吸光度の変化として紫外・可視分光光度計を用いて測定した（Klingenberg M “Methods of Enzymatic Analysis” (1974) Weinheim-Academic Press, New York, vol. 4, pp. 2045参照）。NADPの酸化型と還元型では波長に依存した吸光度プロファイルが全く異なる。特に340nmの吸光度が全く異なる事から、この波長の吸光度を利用して生成された還元型NADPの量を定量する。 (2) Measurement of phosphate group intramolecular transfer reaction of glucose-1-phosphate Glucose-6-phosphate, which is a reaction product of the reaction using this enzyme, is converted to 6-phosphate by glucose-6-phosphate dehydrogenase. When converting to gluconolactone phosphate, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) is changed from an oxidized form to a reduced form as a side reaction. The amount of change was measured using an ultraviolet / visible spectrophotometer as the change in absorbance at 340 nm (see Klingenberg M “Methods of Enzymatic Analysis” (1974) Weinheim-Academic Press, New York, vol. 4, pp. 2045). . The NADP oxidized and reduced forms have completely different absorbance profiles depending on the wavelength. In particular, since the absorbance at 340 nm is completely different, the amount of reduced NADP produced using the absorbance at this wavelength is quantified.

そこで、（１）で反応させたサンプルに関しても、紫外・可視分光光度計による340nmの吸光度を用いて（１）の反応の解析を行った。図１４に示すように、基質であるグルコース−１−リン酸の濃度に依存した活性が65℃で検出された。
実施例１により精製された該酵素を用いて、グルコース−１−リン酸及びマンノース−１リン酸が有するリン酸基の分子内転移活性を実施例３，４に従って測定した。その結果、図１４に有るように、基質であるグルコース−１−リン酸の濃度に依存した活性が65℃で検出された。また、図１５に有るように、同様の活性がマンノース−１−リン酸を基質としたときにも検出されたことから、該酵素は耐熱性PGM/PMM活性を有する事が確認された。また、グルコース−６−リン酸を基質とした場合にも、図1６に示されたように、確かに分子内リン酸基が一位に転移している事からＴＤＰグルコースの生産が確認された。
Therefore, for the sample reacted in (1), the reaction in (1) was analyzed using absorbance at 340 nm by an ultraviolet / visible spectrophotometer. As shown in FIG. 14, the activity depending on the concentration of the substrate glucose-1-phosphate was detected at 65 ° C.
Using the enzyme purified in Example 1, the intramolecular transfer activity of the phosphate group of glucose-1-phosphate and mannose-1-phosphate was measured according to Examples 3 and 4. As a result, as shown in FIG. 14, the activity depending on the concentration of the substrate glucose-1-phosphate was detected at 65 ° C. Further, as shown in FIG. 15, since the same activity was detected when mannose-1-phosphate was used as a substrate, it was confirmed that the enzyme had thermostable PGM / PMM activity. In addition, even when glucose-6-phosphate was used as a substrate, as shown in FIG. 16, production of TDP glucose was confirmed because the phosphate group in the molecule was certainly transferred to the first position. .

ｂ．マンノース−１−リン酸のリン酸基分子内転移反応
（1） マンノース−１−リン酸のリン酸基分子内転移反応の酵素反応溶液
50mM MOPS緩衝液(pH7.6)、2mM MgSO4、10μM グルコース 1,6-ビスリン酸、1mM NADP、1unit グルコース−６−リン酸脱水素酵素、１unit マンノース−６−リン酸異性化酵素、１unit グルコース−６−リン酸異性化酵素、0.4mMマンノース−１−リン酸、からなる酵素反応溶液2,000μL中に実施例１で得られた精製酵素7.0μgを加えた。 この酵素反応液を65℃で保温することにより、反応させた。この反応により、マンノース−１−リン酸のリン酸基が分子内転移しマンノース−６−リン酸が生成する。 b. Phosphoric group intramolecular transfer reaction of mannose-1-phosphate (1) Enzyme reaction solution for phosphonic group intramolecular transfer reaction of mannose-1-phosphate
50 mM MOPS buffer (pH 7.6), 2 mM MgSO 4 , 10 μM glucose 1,6-bisphosphate, 1 mM NADP, 1 unit glucose-6-phosphate dehydrogenase, 1 unit mannose-6-phosphate isomerase, 1 unit glucose 7.0 μg of the purified enzyme obtained in Example 1 was added to 2,000 μL of an enzyme reaction solution consisting of -6-phosphate isomerase and 0.4 mM mannose-1-phosphate. The enzyme reaction solution was kept at 65 ° C. for reaction. By this reaction, the phosphate group of mannose-1-phosphate is transferred intramolecularly to produce mannose-6-phosphate.

（２）マンノース−６−リン酸化合物のリン酸基分子内転移反応の測定
本酵素を用いた反応の反応生成物であるマンノース−６−リン酸をマンノース−６−リン酸異性化酵素によりフルクトース−６−リン酸に変換し、フルクトース−６−リン酸をグルコース−６−リン酸異性化酵素によりグルコース−６−リン酸に変換し、グルコース−６−リン酸脱水素酵素により６−リン酸グルコノラクトンに変換する際に、副反応としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）が酸化型から還元型へ変化する。その変化量を340nmにおける吸光度の変化として紫外・可視分光光度計を用いて測定した（非特許文献４参照）。NADPの酸化型と還元型では波長に依存した吸光度プロファイルが全く異なる。特に340nmの吸光度が全く異なる事から、この波長の吸光度を利用して生成された還元型NADPの量を定量する。
そこで、（１）で反応させたサンプルに関しても、紫外・可視分光光度計による340nmの吸光度を用いて（１）の反応の解析を行った。図１５に示すように、基質であるマンノース−１−リン酸の濃度に依存した活性が65℃で検出された。
(2) Measurement of phosphate group intramolecular transfer reaction of mannose-6-phosphate compound Mannose-6-phosphate, which is a reaction product of the reaction using this enzyme, is converted to fructose by mannose-6-phosphate isomerase. Converted to -6-phosphate, fructose-6-phosphate converted to glucose-6-phosphate by glucose-6-phosphate isomerase, and 6-phosphate by glucose-6-phosphate dehydrogenase When converting to gluconolactone, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) is changed from an oxidized form to a reduced form as a side reaction. The amount of change was measured as a change in absorbance at 340 nm using an ultraviolet / visible spectrophotometer (see Non-Patent Document 4). The NADP oxidized and reduced forms have completely different absorbance profiles depending on the wavelength. In particular, since the absorbance at 340 nm is completely different, the amount of reduced NADP produced using the absorbance at this wavelength is quantified.
Therefore, for the sample reacted in (1), the reaction in (1) was analyzed using absorbance at 340 nm by an ultraviolet / visible spectrophotometer. As shown in FIG. 15, the activity depending on the concentration of the substrate mannose-1-phosphate was detected at 65 ° C.

ｃ．グルコース−６−リン酸のリン酸基分子内転移反応
（１）グルコース−６−リン酸のリン酸基分子内転移反応の酵素反応溶液
50mM MOPS緩衝液(pH7.6)、2mM MgSO４、10μl グルコース1,6ビスリン酸、0.4mM TTP、2.5μg スルフォロバス・トーコーダイイ由来のRmlA（glucose-1-phosphate thymidylyltransferase ）、1mMグルコース−６−リン酸からなる酵素反応溶液2,000μL中に、実施例１で得られた精製酵素2.5μgを加えた。この酵素反応液を80℃で30分間保温することにより反応させた。反応後、100μLの500mM リン酸二水素カリウム溶液を加えることにより反応を停止させた。この反応により、グルコース−６−リン酸のリン酸基が分子内転移しグルコース−１−リン酸が生成する。 c. Phosphorus group intramolecular transfer reaction of glucose-6-phosphate (1) Enzyme reaction solution for phosphate group intramolecular transfer reaction of glucose-6-phosphate
50 mM MOPS buffer (pH 7.6), 2 mM MgSO 4 , 10 μl glucose 1,6 bisphosphate, 0.4 mM TTP, 2.5 μg RmlA (glucose-1-phosphate thymidylyltransferase) derived from Sulfolobus tokodaiii, 1 mM glucose-6-phosphate 2.5 μg of the purified enzyme obtained in Example 1 was added to 2,000 μL of the enzyme reaction solution consisting of The enzyme reaction solution was allowed to react at 80 ° C. for 30 minutes. After the reaction, the reaction was stopped by adding 100 μL of 500 mM potassium dihydrogen phosphate solution. By this reaction, the phosphate group of glucose-6-phosphate is transferred intramolecularly to produce glucose-1-phosphate.

（２）グルコース−６−リン酸のリン酸基分子内転移反応の測定
HPLCを用いて、反応性生物であるグルコース−１−リン酸をRmlAによりTDP-グルコースに変換し、TDP-グルコースの量をヌクレオチド部分の紫外線の吸収を目安に測定した。図２からも明らかなように、標準物質であるTTPおよびTDP-グルコースは、HPLCにおいて溶出位置がまったく異なる。そこで、上記（１）で反応させたサンプルに関しても、HPLCで同様の解析をおこなった。その結果、図１６に示すように、確かにTDP-グルコースが見出されたことから、該酵素は、グルコース−６−リン酸の分子内リン酸基を転移させたグルコース−１−リン酸を確かに生成している事が確認された。

(2) Measurement of the intramolecular transfer reaction of phosphate group of glucose-6-phosphate
Using HPLC, glucose-1-phosphate, which is a reactive organism, was converted to TDP-glucose by RmlA, and the amount of TDP-glucose was measured using UV absorption at the nucleotide moiety as a guide. As is apparent from FIG. 2, the elution positions of TTP and TDP-glucose which are standard substances are completely different in HPLC. Therefore, the same analysis was performed on the sample reacted in (1) above by HPLC. As a result, as shown in FIG. 16, since TDP-glucose was surely found, the enzyme converted glucose-1-phosphate to which the intramolecular phosphate group of glucose-6-phosphate was transferred. It was confirmed that it was generated.

精製されたPHGMP/PMI蛋白質のSDS-PAGEパターンを示す図である。It is a figure which shows the SDS-PAGE pattern of purified PHGMP / PMI protein. HPLCによるGTP及びGDP-Mannoseの分離パターンを測定した図である。It is the figure which measured the separation pattern of GTP and GDP-Mannose by HPLC. GDPマンノース標準物質の添加量とピーク面積変化の関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the addition amount of GDP mannose standard substance, and a peak area change. PHGMP/PMI蛋白質の85℃における糖ヌクレオチド合成活性を示す図である。It is a figure which shows sugar nucleotide synthetic activity in 85 degreeC of PHGMP / PMI protein. マンノース−６−リン酸を基質とし、その濃度を変化させたときの吸光度の経時変化を示す図である。It is a figure which shows a time-dependent change of the light absorbency when mannose-6-phosphate is used as a substrate and the concentration is changed. PHGMP/PMI蛋白質による波長340nmにおける吸光度の経時変化を示す図である。It is a figure which shows the time-dependent change of the light absorbency in wavelength 340nm by PHGMP / PMI protein. PHGMP/PMI蛋白質とへリコバクター菌のGMP/PMI蛋白質との相同性を示す図である。It is a figure which shows the homology with PHGMP / PMI protein and GMP / PMI protein of Helicobacter bacteria. PHGMP/PMI蛋白質のpHの違いによる活性変化を示す図である。It is a figure which shows the activity change by the difference in pH of PHGMP / PMI protein. PHGMP/PMI蛋白質のヌクレオシド三リン酸基質の多様性を示す図である。It is a figure which shows the diversity of the nucleoside triphosphate substrate of PHGMP / PMI protein. PHGMP/PMI蛋白質の糖リン酸基質の多様性を示す図である。It is a figure which shows the diversity of the sugar phosphate substrate of PHGMP / PMI protein. 本発明の酵素タンパク質および特願２００４−２３６３２１号の酵素を用いてフルクトース−６−リン酸からＧＤＰ−マンノースを合成する反応工程を示す概略図である。It is the schematic which shows the reaction process which synthesize | combines GDP-mannose from fructose-6-phosphate using the enzyme protein of this invention, and the enzyme of Japanese Patent Application No. 2004-236321. 本発明の酵素のリン酸化糖の異性化活性に対する各金属イオン種の影響を示す図である。It is a figure which shows the influence of each metal ion species with respect to the isomerization activity of the phosphorylated saccharide | sugar of the enzyme of this invention. 本発明の酵素の糖−ヌクレオチド合成活性に対する各金属イオン種の影響を示す図である。It is a figure which shows the influence of each metal ion species with respect to the sugar-nucleotide synthetic activity of the enzyme of this invention. 参考例２において、グルコース−１−リン酸を基質とし、その濃度を変化させた場合の波長340nmにおける吸光度の経時変化を示す図である。In the reference example 2, it is a figure which shows the time-dependent change of the light absorbency in wavelength 340nm when glucose-1-phosphate is made into a substrate and the density | concentration is changed. 参考例２において、マンノース−１−リン酸を基質とし、その濃度を変化させた場合の波長340nmにおける吸光度の経時変化を示す図である。In the reference example 2, it is a figure which shows the time-dependent change of the light absorbency in wavelength 340nm at the time of using mannose-1-phosphate as a substrate and changing the density | concentration. 参考例２において、グルコース−６−リン酸を基質とした場合において、TDP-グルコース生成の経時変化を示す図である。In the reference example 2, it is a figure which shows a time-dependent change of TDP-glucose production in the case of using glucose-6-phosphate as a substrate.

Claims (15)

配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質を含むことを特徴とする、マンノース−６−リン酸又はフルクトース−６−リン酸合成用の糖異性化酵素製剤。 A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one to several amino acid residues have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; nucleotide synthesis activity and characterized in that it comprises a 蛋 white matter that have a phosphorylated sugar isomerization activity, mannose-6-phosphate or fructose 6-phosphate sugar isomerase preparation for synthesis. さらに、カルシウムイオンを共存させることを特徴とする、請求項１に記載の酵素製剤。 Furthermore, calcium ion is made to coexist, The enzyme formulation of Claim 1 characterized by the above-mentioned . 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質を含むことを特徴とする、マンノース−１−リン酸又はグルコース−１−リン酸に対して、ＧＴＰ、ＡＴＰ及びｄＧＴＰから選択されるヌクレオシド三リン酸を結合させる糖ヌクレオチド合成用（但しマンノース−１−リン酸とＧＴＰとを結合させる場合を除く）酵素製剤。 A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one to several amino acid residues have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; characterized in that it comprises a 蛋 white matter that have a nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity for mannose-1-phosphate or glucose-1-phosphate, it is selected GTP, from ATP and dGTP An enzyme preparation for synthesizing sugar nucleotides to which nucleoside triphosphates are bound (except when mannose-1-phosphate and GTP are bound) . さらに、銅イオン又は亜鉛イオンを共存させることを特徴とする、請求項３に記載の酵素製剤。 Furthermore, copper ion or zinc ion is made to coexist, The enzyme formulation of Claim 3 characterized by the above-mentioned . マンノース−６−リン酸又はフルクトース−６−リン酸に、請求項１又は２に記載の酵素製剤を作用させることを特徴とする、異性化されたフルクトース−６−リン酸又はマンノース−６−リン酸の製造方法。 The mannose-6-phosphate or fructose 6-phosphate, characterized in that the action of the enzyme preparation according to claim 1 or 2, isomerized fructose 6-phosphate or mannose-6-phosphate Acid production method. マンノース−６−リン酸又はフルクトース−６−リン酸に、下記（１）〜（３）のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡであって、糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを用いて形質転換された形質転換体の培養液あるいは培養物の処理物を作用させることを特徴とする、異性化されたフルクトース−６−リン酸又はマンノース−６−リン酸の製造方法；
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、もしくは当該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 Mannose-6-phosphate or fructose-6-phosphate is a DNA comprising the base sequence described in any of (1) to (3) below , and has sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity An isomerized fructose-6-phosphate or mannose-6-phosphorus characterized in that a culture solution of a transformant transformed with a DNA encoding a protein having a protein or a treated product of the culture is allowed to act. Acid production method ;
(1) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(2) It has an amino acid sequence in which 1 to several amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity DNA encoding a protein having,
(3) DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 or DNA encoding a protein that hybridizes with the DNA under stringent conditions and has sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity . さらに、カルシウムイオンを共存させることを特徴とする、請求項５又は６に記載の製造方法。Furthermore, calcium ion is made to coexist, The manufacturing method of Claim 5 or 6 characterized by the above-mentioned. マンノース−１−リン酸又はグルコース−１−リン酸と共に、ＧＴＰ、ＡＴＰ及びｄＧＴＰから選択されるヌクレオシド三リン酸を含む系（但しマンノース−１−リン酸とＧＴＰとを含む系を除く）に対して、請求項３又は４に記載の酵素製剤を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。 For systems containing a nucleoside triphosphate selected from GTP, ATP and dGTP together with mannose-1-phosphate or glucose-1-phosphate (excluding systems containing mannose-1-phosphate and GTP) A method for producing a sugar nucleotide, characterized in that the enzyme preparation according to claim 3 or 4 is allowed to act. マンノース−１−リン酸又はグルコース−１−リン酸と共に、ＧＴＰ、ＡＴＰ及びｄＧＴＰから選択されるヌクレオシド三リン酸を含む系（但しマンノース−１−リン酸とＧＴＰとを含む系を除く）に対して、下記（１）〜（３）のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡであって、糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを用いて形質転換された形質転換体の培養液あるいは培養物の処理物を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法；
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖−ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、もしくは当該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 For systems containing a nucleoside triphosphate selected from GTP, ATP and dGTP together with mannose-1-phosphate or glucose-1-phosphate (excluding systems containing mannose-1-phosphate and GTP) A DNA comprising the base sequence described in any one of (1) to (3) below, and transformed with a DNA encoding a protein having a sugar nucleotide synthesis activity and a phosphorylated sugar isomerization activity A method for producing a sugar nucleotide, which comprises reacting a culture solution of a transformant or a treated product of the culture ;
(1) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(2) having an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and sugar-nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity DNA encoding a protein having
(3) DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 or DNA encoding a protein that hybridizes with the DNA under stringent conditions and has sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity . さらに、銅イオン又は亜鉛イオンを共存させることを特徴とする、請求項８又は９に記載の製造方法。Furthermore, copper ion or zinc ion is made to coexist, The manufacturing method of Claim 8 or 9 characterized by the above-mentioned. マンノース−１−リン酸及びＧＴＰと共に銅イオン又は亜鉛イオンを含む系に対して、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質を含む糖ヌクレオチド合成用酵素製剤を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法。 For a system containing copper ion or zinc ion together with mannose-1-phosphate and GTP, a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or 1 to several amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 It is characterized by acting an enzyme preparation for sugar nucleotide synthesis containing a protein having an amino acid sequence in which residues are deleted, substituted, inserted or added and having sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity. And a method for producing a sugar nucleotide . マンノース−１−リン酸及びＧＴＰと共に銅イオン又は亜鉛イオンを含む系に対して、下記（１）〜（３）のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡであって、糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを用いて形質転換された形質転換体の培養液あるいは培養物の処理物を作用させることを特徴とする、糖ヌクレオチドの製造方法；
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖−ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、もしくは当該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖ヌクレオチド合成活性並びにリン酸化糖異性化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 For a system containing copper ions or zinc ions together with mannose-1-phosphate and GTP, the DNA comprising the base sequence according to any one of the following (1) to (3), comprising sugar nucleotide synthesis activity and phosphorus A method for producing a sugar nucleotide, which comprises reacting a culture solution of a transformant transformed with a DNA encoding a protein having oxidative sugar isomerization activity or a treated product of the culture;
(1) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(2) having an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and sugar-nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity DNA encoding a protein having
(3) DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2 or DNA encoding a protein that hybridizes with the DNA under stringent conditions and has sugar nucleotide synthesis activity and phosphorylated sugar isomerization activity . フルクトース−６−リン酸を、マンノース−６−リン酸に異性化し、次いで６位の位置のリン酸基を１位の位置に転移させる分子内リン酸基転移反応を行った後、得られたマンノース−１−リン酸に対して、ＧＴＰ、ＡＴＰ及びｄＧＴＰから選択されるヌクレオシド三リン酸を結合させる糖ヌクレオチド合成反応を行い、ＧＤＰ−マンノース、ＡＤＰ−マンノース又はｄＧＤＰ−マンノースを製造する方法において、上記異性化反応および糖ヌクレオチド合成反応を、請求項１又は３に記載の酵素製剤を用いて行うことを特徴とする、上記方法。 Obtained after isomerization of fructose-6- phosphate to mannose-6-phosphate , followed by an intramolecular phosphate transfer reaction in which the phosphate group at the 6-position is transferred to the 1-position. how relative mannose-1-phosphate, GTP, performs Tonu Kureochido synthesis reactions for coupling the nucleoside triphosphate selected from ATP and dGTP, to produce a GDP- mannose, ADP-mannose or dGDP- mannose in the upper Kikoto of reaction and Tonu Kureochido synthesis reaction, and performing with the enzyme preparation according to claim 1 or 3, the method described above. 前記異性化反応をカルシウムイオン共存下で行い、前記糖ヌクレオチド合成反応を銅イオン又は亜鉛イオン共存下で行うことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。 The method according to claim 13, wherein the isomerization reaction is performed in the presence of calcium ions, and the sugar nucleotide synthesis reaction is performed in the presence of copper ions or zinc ions . 請求項１又は３に記載の酵素製剤を用いたフルクトース−６−リン酸の異性化反応工程、並びにマンノース−１−リン酸に対して、ＧＴＰ、ＡＴＰ及びｄＧＴＰから選択されるヌクレオシド三リン酸を結合させる糖ヌクレオチド合成反応工程を含む一連の反応系において、カルシウムイオン、亜鉛イオンまたは銅イオンのうちいずれかを選択して含有させることにより、前記酵素製剤の酵素作用を、リン酸化糖異性化作用と糖ヌクレオチド合成作用との間で切り替えることを特徴とする、酵素作用の切り替え方法。 An isomerization reaction step of fructose-6-phosphate using the enzyme preparation according to claim 1 or 3 , and a nucleoside triphosphate selected from GTP, ATP and dGTP with respect to mannose-1-phosphate In a series of reaction systems including a sugar nucleotide synthesis reaction step to be bound, by selecting and containing either calcium ion, zinc ion or copper ion, the enzyme action of the enzyme preparation is converted to a phosphorylated sugar isomerization action. And a method for switching enzyme action, characterized in that it is switched between sugar sugar synthesis action .
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