JP2017216930A - Isomerase for amino sugar phosphate, dna, expression vector, transformant, process for producing isomerase, and process for producing galactosamine-6-phosphate - Google Patents

Isomerase for amino sugar phosphate, dna, expression vector, transformant, process for producing isomerase, and process for producing galactosamine-6-phosphate Download PDF

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裕 河原林
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an isomerase for an amino sugar phosphate derived from the genus Sulfolobus for the synthesis of galactosamine-6-phosphate, and a method for producing the same, etc.SOLUTION: According to the present invention, there is provided an isomerase for amino sugar phosphate derived from the genus Sulfolobus. There is also provided a method for producing galactosamine-6-phosphate from glucosamine-6-phosphate by reaction of an isomerase having a specific amino acid sequence at a temperature of 25 to 98°C. Here, the isomerase may be an intramolecular transferase for amino sugar phosphate, and capable of producing galactosamine-6-phosphate from galactosamine-1-phosphate. According to the present invention, there is provided a DNA encoding the enzyme for isomerization. There are also provided a DNA capable of hybridizing with the DNA under stringent conditions and encoding a protein having amino sugar phosphate isomerization activity and an expression vector comprising the DNA. There are further provided a transformant obtained by introducing the expression vector into a host cell and a method for producing galactosamine-6-phosphate by culturing the transformant.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、アミノ糖リン酸の異性化酵素、前記酵素をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む発現ベクター、前記発現ベクターを導入してなる形質転換体、前記形質転換体を培養してなるアミノ糖リン酸の異性化酵素の製造方法、および前記異性化酵素を作用させるガラクトサミン−６−リン酸の製造方法に関する。   The present invention relates to an amino sugar phosphate isomerase, a DNA encoding the enzyme, an expression vector containing the DNA, a transformant introduced with the expression vector, and an amino sugar obtained by culturing the transformant. The present invention relates to a method for producing a phosphate isomerase, and a method for producing galactosamine-6-phosphate by allowing the isomerase to act.

糖リン酸化合物は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＴＤＰ−Ｇｌｃ等の糖ヌクレオチドの合成や、修飾糖合成の基質となる重要な化合物である。例えば、グルコース−６−リン酸、マンノース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、マンノース−１−リン酸に、リン酸基分子内転移活性を有する酵素製剤を作用させ、グルコース−１−リン酸、マンノース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸およびマンノース−６−リン酸を生成する方法がある（特許文献１）。特許文献１記載の酵素製剤は、超好熱アーキア(Sulfolobus tokodaii)に由来する特定アミノ酸配列を有することを特徴とし、この酵素をコードする遺伝子は、ＳＴ０２４２と特定されている。また、マンノース−６−リン酸またはフルクトース−６−リン酸に糖異性化酵素製剤を作用させ、フルクトース−６−リン酸またはマンノース−６−リン酸を製造する方法もある（特許文献２）。特許文献２記載の酵素製剤は、超好熱アーキア（Pyrococcus horikoshii)に由来する特定アミノ酸配列を有することを特徴とする。その他、糖ヌクレオチド合成活性を有する酵素として結核菌(Mycobacterium tuberculosis)（非特許文献１参照）、シュードモナス菌(Pseudomonas aeruginosa)（非特許文献２参照）、サルモネラ菌(Salmonella enterica)（非特許文献３参照）由来のＲｍｌＡ（Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase）がある。また、超好熱アーキア(Sulfolobus tokodaii)由来のＳＴ０４５２タンパク質（非特許文献４参照）も知られている。   Sugar phosphate compounds are important compounds that serve as substrates for the synthesis of sugar nucleotides such as UDP-GlcNAc, UDP-GalNAc, GDP-Man, TDP-Glc, and modified sugar synthesis. For example, glucose-6-phosphate, mannose-6-phosphate, glucose-1-phosphate, and mannose-1-phosphate are allowed to act on an enzyme preparation having phosphate group intramolecular transfer activity, and glucose-1- There is a method for producing phosphoric acid, mannose-1-phosphate, glucose-6-phosphate and mannose-6-phosphate (Patent Document 1). The enzyme preparation described in Patent Document 1 has a specific amino acid sequence derived from a hyperthermophilic archaea (Sulfolobus tokodaii), and the gene encoding this enzyme is identified as ST0242. There is also a method for producing fructose-6-phosphate or mannose-6-phosphate by allowing a sugar isomerase preparation to act on mannose-6-phosphate or fructose-6-phosphate (Patent Document 2). The enzyme preparation described in Patent Document 2 is characterized by having a specific amino acid sequence derived from Pyrococcus horikoshii. In addition, as an enzyme having sugar nucleotide synthesis activity, Mycobacterium tuberculosis (see Non-Patent Document 1), Pseudomonas aeruginosa (see Non-Patent Document 2), Salmonella enterica (see Non-Patent Document 3) Derived RmlA (Glucose-1-phosphate thymidylyltransferase). In addition, ST0452 protein derived from Sulfolobus tokodaii (see Non-Patent Document 4) is also known.

一方、アミノ糖リン酸を製造しうる酵素として、フルクトース−６−リン酸とアンモニアからグルコサミン−６−リン酸を生成する改変されたグルコサミン−６−リン酸合成酵素がある（特許文献３）。ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒで特定されるアミノ酸配列中で、グルコサミン−６−リン酸合成活性を有するタンパク質のアミノ酸配列の所定番目のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換した、改変グルコサミン−６−リン酸合成酵素である。特許文献３の表１には、グルコサミン−６−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を有する複数の微生物とＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒとが列記されている。例えば、このような微生物として大腸菌（Escherichia coli）があり、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒはＡＡＣ７６７５２である。特許文献３記載の改変グルコサミン−６−リン酸合成酵素は、例えば、大腸菌由来のＡＡＣ７６７５２で示されるグルコサミン−６−リン酸合成酵素を改変したものとなる。実施例では、この合成酵素をコードするＤＮＡで形質転換した形質転換体の粗抽出液にアンモニアとフルクトース−６−リン酸とを加えて３４℃、４時間反応させ、グルコサミン−６−リン酸を得ている。   On the other hand, as an enzyme capable of producing amino sugar phosphate, there is a modified glucosamine-6-phosphate synthase that generates glucosamine-6-phosphate from fructose-6-phosphate and ammonia (Patent Document 3). A modified glucosamine-6-phosphate synthase in which a predetermined amino acid in the amino acid sequence of a protein having glucosamine-6-phosphate synthesizing activity is replaced with a specific amino acid in the amino acid sequence specified by GenBank Accession Number . In Table 1 of Patent Document 3, a plurality of microorganisms having a protein having glucosamine-6-phosphate synthase activity and GenBank Accession Number are listed. For example, there is Escherichia coli as such a microorganism, and GenBank Accession Number is AAC76752. The modified glucosamine-6-phosphate synthase described in Patent Document 3 is, for example, a modified glucosamine-6-phosphate synthase shown by E. coli-derived AAC76752. In Examples, ammonia and fructose-6-phosphate were added to a crude extract of a transformant transformed with a DNA encoding this synthase and reacted at 34 ° C. for 4 hours to give glucosamine-6-phosphate. It has gained.

特許第４４６５４４８号公報Japanese Patent No. 4465448 特許第４４６９９５４号公報Japanese Patent No. 4469954 国際公開第２００８／１１１５０７号International Publication No. 2008/111507

Yufang Ma, Jonathan A. Mills, John T. Belisle, Vara Vissa, Mark Howell, Kelly Bowlin, Michael S. Scherman and Michael McNeil "Determination of the pathway for rhamnose biosynthesis in mycobacteria: cloning, sequencing and expression of the Mycobacterium tuberculosis gene encoding α-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase“ (1997) Microbiology, 143, 937-945.Yufang Ma, Jonathan A. Mills, John T. Belisle, Vara Vissa, Mark Howell, Kelly Bowlin, Michael S. Scherman and Michael McNeil "Determination of the pathway for rhamnose biosynthesis in mycobacteria: cloning, sequencing and expression of the Mycobacterium tuberculosis gene encoding α-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase “(1997) Microbiology, 143, 937-945. Wulf Blankenfeldt, Miryam Asuncion, Joseph S. Lam and James H. Naismith “The structural basis of the catalytic mechanism and regulation of glucose-1-phosphate thymidylyltransferase (RmlA)" (2000) EMBO J., 19, 6652-6663.Wulf Blankenfeldt, Miryam Asuncion, Joseph S. Lam and James H. Naismith “The structural basis of the catalytic mechanism and regulation of glucose-1-phosphate thymidylyltransferase (RmlA)” (2000) EMBO J., 19, 6652-6663. Lennart Lindquist, Rudorf Kaiser, Peter R. Reeves and Alf A. Lindberg "Purification, characterization and HPLC assay of Salmonella glucose-1-phosphate thymidylyltransferase from the cloned rfbA gene" (1993) Eur. J. Biochem., 211, 763-770.Lennart Lindquist, Rudorf Kaiser, Peter R. Reeves and Alf A. Lindberg "Purification, characterization and HPLC assay of Salmonella glucose-1-phosphate thymidylyltransferase from the cloned rfbA gene" (1993) Eur. J. Biochem., 211, 763- 770. Zhang Z, Tsujimura M, Akutsu JI, Sasaki M, Tajima H. and Kawarabayasi Y. “Identification of an extremely thermostable enzyme with dual sugar-1-phosphate nucleotidylyltransferase activities from an acidothermophilic archaeon, Sulfolobus tokodaii strain7” (2005) J Biol Chem. 280, 9698-9705.Zhang Z, Tsujimura M, Akutsu JI, Sasaki M, Tajima H. and Kawarabayasi Y. “Identification of an extremely thermostable enzyme with dual sugar-1-phosphate nucleotidylyltransferase activities from an acidothermophilic archaeon, Sulfolobus tokodaii strain7” (2005) J Biol Chem 280, 9698-9705.

使用原料種が少なく、かつ１段反応で目的物を製造する酵素として異性化酵素がある。異性化反応によれば、例えば基質の糖を異なる糖に異性化でき、または置換基を分子内転移することができる。しかしながら、アミノ糖リン酸を製造するための異性化酵素は知られていない。したがって、例えば前記特許文献３では、グルコサミン−６−リン酸を合成するために、フルクトース−６−リン酸とアンモニアとを必要としている。また、特許文献３記載の改変グルコサミン−６−リン酸合成酵素は、グルコサミン−６−リン酸の製造に限定され、例えばガラクトサミン−６−リン酸などの他のアミノ糖リン酸化合物を製造することはできない。したがって、簡便にアミノ糖リン酸化合物を製造できる酵素として、アミノ糖リン酸の異性化酵素の開発が望まれる。   There is an isomerase as an enzyme that uses few raw material species and produces a target product by a one-stage reaction. According to the isomerization reaction, for example, a substrate sugar can be isomerized to a different sugar, or a substituent can be transferred intramolecularly. However, an isomerase for producing amino sugar phosphate is not known. Therefore, for example, in Patent Document 3, fructose-6-phosphate and ammonia are required to synthesize glucosamine-6-phosphate. Further, the modified glucosamine-6-phosphate synthase described in Patent Document 3 is limited to the production of glucosamine-6-phosphate, for example, producing other amino sugar phosphate compounds such as galactosamine-6-phosphate. I can't. Therefore, development of an isomerase of amino sugar phosphate is desired as an enzyme that can easily produce an amino sugar phosphate compound.

一方、ガラクトサミン−６−リン酸を含む代謝経路は、微生物その他の生物で見出されていない。このためガラクトサミン−６−リン酸の合成および分解に関する酵素も不明である。特に、異性化酵素をアミノ糖リン酸化合物に作用させてガラクトサミン−６−リン酸を製造することは知られておらず、ガラクトサミン−６−リン酸研究が遅滞する一因ともなっている。したがって、ガラクトサミン−６−リン酸その他のアミノ糖リン酸化合物の安定供給のためにも、アミノ糖リン酸を合成しうる異性化酵素の開発が望まれる。   On the other hand, a metabolic pathway containing galactosamine-6-phosphate has not been found in microorganisms and other organisms. For this reason, the enzyme relating to the synthesis and degradation of galactosamine-6-phosphate is also unknown. In particular, it is not known that galactosamine-6-phosphate is produced by causing an isomerase to act on an amino sugar phosphate compound, which contributes to the delay in research on galactosamine-6-phosphate. Therefore, development of an isomerase capable of synthesizing amino sugar phosphate is also desired for the stable supply of galactosamine-6-phosphate and other amino sugar phosphate compounds.

上記現状に鑑みて、本発明は、アミノ糖リン酸の異性化酵素を提供することを目的とする。   In view of the above-described present situation, an object of the present invention is to provide an amino sugar phosphate isomerase.

また、本発明は、前記異性化酵素をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された形質転換体、前記形質転換体を培養する異性化酵素の製造方法、前記酵素を作用させるガラクトサミン−６−リン酸の製造方法を提供することを目的とする。   The present invention also provides a DNA encoding the isomerase, an expression vector containing the DNA, a transformant transformed with the expression vector, a method for producing an isomerase for culturing the transformant, the enzyme It is an object of the present invention to provide a method for producing galactosamine-6-phosphate that causes galactosamine to act.

本発明者は、超好熱アーキアのスルフォロバス属（genus Sulfolobus）の菌体抽出物にガラクトサミン−６−リン酸を生成する異性化酵素が存在すること、前記超好熱アーキアの菌体抽出物に含まれる当該酵素を用いて遺伝子工学的手段によりリコンビナントを製造しうること、当該酵素および／またはリコンビナントを使用するとガラクトサミン−６−リン酸を安定的に製造できることを見出し、本発明を完成させた。更に、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）由来の糖リン酸化合物のリン酸基分子内転移酵素が、アミノ糖リン酸化合物において、リン酸基分子内転移活性を有することを見出し、本発明を完成させた。   The inventor of the present invention states that an isomerase producing galactosamine-6-phosphate is present in a cell extract of genus Sulfolobus of hyperthermophilic archaea, the cell extract of hyperthermophilic archaea. The inventors have found that a recombinant can be produced by genetic engineering means using the enzyme contained, and that galactosamine-6-phosphate can be stably produced by using the enzyme and / or the recombinant, thereby completing the present invention. Furthermore, the present inventors have found that a phosphate group intramolecular transferase of a sugar phosphate compound derived from genus Sulfolobus has a phosphate group intramolecular transfer activity in an amino sugar phosphate compound, and completed the present invention. .

すなわち本発明は、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来する、アミノ糖リン酸の異性化酵素を提供するものである。   That is, the present invention provides an amino sugar phosphate isomerase derived from the genus Sulfolobus.

また本発明は、前記異性化酵素が、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうる、前記異性化酵素を提供するものである。   The present invention also provides the isomerase, wherein the isomerase can isomerize glucosamine-6-phosphate to galactosamine-6-phosphate.

また本発明は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または前記配列番号３に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、アミノ糖リン酸の異性化酵素を提供するものである。   Further, the present invention is characterized in that it has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence in which one or more amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted, inserted or added. An amino sugar phosphate isomerase is provided.

また本発明は、前記異性化酵素が、ガラクトサミン−１−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうる、前記異性化酵素を提供するものである。   The present invention also provides the isomerase, wherein the isomerase can isomerize galactosamine-1-phosphate to galactosamine-6-phosphate.

また本発明は、温度２５〜９８℃で酵素活性を発揮する、前記異性化酵素を提供するものである。   Moreover, this invention provides the said isomerase which exhibits enzyme activity at the temperature of 25-98 degreeC.

また本発明は、前記異性化酵素をコードするＤＮＡを提供するものである。   The present invention also provides DNA encoding the isomerase.

また本発明は、配列番号４記載のＤＮＡ、または配列番号４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ糖リン酸異性化活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、ＤＮＡを提供するものである。   Further, the present invention is characterized in that it encodes a protein having the amino sugar phosphate isomerization activity that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 4 or the DNA of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions. It provides DNA.

また本発明は、前記ＤＮＡを発現可能に含む、発現ベクターを提供するものである。   The present invention also provides an expression vector containing the DNA so that it can be expressed.

また本発明は、前記発現ベクターを宿主細胞に導入してなる形質転換体を提供するものである。   The present invention also provides a transformant obtained by introducing the expression vector into a host cell.

また本発明は、前記形質転換体を培地中で培養し、
得られた培養物からアミノ糖リン酸異性化活性を有するタンパク質を分離することを特徴とする、アミノ糖リン酸の異性化酵素の製造方法を提供するものである。 In the present invention, the transformant is cultured in a medium,
The present invention provides a method for producing an amino sugar phosphate isomerase, which comprises separating a protein having amino sugar phosphate isomerization activity from the obtained culture.

また本発明は、グルコサミン−６−リン酸に、前記異性化酵素を作用させることを特徴とする、ガラクトサミン−６−リン酸の製造方法を提供するものである。   The present invention also provides a method for producing galactosamine-6-phosphate, wherein the isomerase is allowed to act on glucosamine-6-phosphate.

また本発明は、ガラクトサミン−１−リン酸に、前記異性化酵素を作用させることを特徴とする、ガラクトサミン−６−リン酸の製造方法を提供するものである。   The present invention also provides a method for producing galactosamine-6-phosphate, wherein the isomerase is allowed to act on galactosamine-1-phosphate.

本発明によれば、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化できるアミノ糖リン酸の異性化酵素等が提供される。   According to the present invention, an amino sugar phosphate isomerase capable of isomerizing glucosamine-6-phosphate to galactosamine-6-phosphate is provided.

また、本発明によれば、ガラクトサミン−１−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸にリン酸基の糖分子内転移できるアミノ糖リン酸のアミノ糖リン酸化合物のリン酸基分子内転移酵素等が提供される。   In addition, according to the present invention, an amino sugar phosphate compound of an amino sugar phosphate capable of transferring galactosamine-1-phosphate to galactosamine-6-phosphate in a sugar molecule of a phosphate group, etc. Is provided.

実施例２の結果を示す図であり、グルコサミン−６−リン酸に実施例１の工程（２）で得た粗抽出液を添加して３０分、６０分、および１２０分反応させた際の反応液のＨＰＬＣによる分析結果を説明する図である。It is a figure which shows the result of Example 2, and when the crude extract obtained at the process (2) of Example 1 was added to glucosamine-6-phosphate, it was made to react for 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes It is a figure explaining the analysis result by HPLC of a reaction liquid. 実施例３および実施例４の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of Example 3 and Example 4. FIG. 実施例３において、本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素によって、グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸が生成する反応を説明する図である。In Example 3, it is a figure explaining the reaction which galactosamine-6-phosphate produces | generates from glucosamine-6-phosphate by the epimerase enzyme of the amino sugar phosphate of this invention. ＳＴ２２４５タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。It is a figure which shows the result of SDS-PAGE of ST2245 protein. ＳＴ２２４５タンパク質と、スルフォロバス・トーコーダイイに含まれるアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素との反応生成物をＨＰＬＣで分析した結果を示す図である。図５Ａは、ＳＴ２２４５タンパク質の結果を示し、図５Ｂは天然タンパク質画分の結果を示し、図５Ｃは、基質（グルコサミン−６−リン酸）のピークを示す。It is a figure which shows the result of having analyzed the reaction product of ST2245 protein and the epimerase enzyme of amino sugar phosphate contained in Sulfolobus tokodaiii by HPLC. FIG. 5A shows the results for the ST2245 protein, FIG. 5B shows the results for the natural protein fraction, and FIG. 5C shows the peak for the substrate (glucosamine-6-phosphate). ＳＴ２２４５タンパク質の反応温度の違いによる活性変化を説明する図である。It is a figure explaining the activity change by the difference in reaction temperature of ST2245 protein. ＳＴ２２４５タンパク質のｐＨの違いによる活性変化を説明する図である。It is a figure explaining the activity change by the difference in pH of ST2245 protein. 本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素によるグルコサミン−６−リン酸とガラクトサミン−６−リン酸との相互異性化反応を説明する図である。It is a figure explaining the mutual isomerization reaction of glucosamine-6-phosphate and galactosamine-6-phosphate by the epimerase enzyme of the amino sugar phosphate of this invention. 本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素によるガラクトサミン−１−リン酸とガラクトサミン−６−リン酸との相互異性化反応を説明する図である。It is a figure explaining the mutual isomerization reaction of galactosamine-1-phosphate and galactosamine-6-phosphate by the phosphate group intramolecular transfer mutase enzyme of the amino sugar phosphate of the present invention. ガラクトサミン−１−リン酸およびグルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸が生成される関係を説明する図である。It is a figure explaining the relationship by which galactosamine-6-phosphate is produced | generated from galactosamine-1-phosphate and glucosamine-6-phosphate.

本発明の第一は、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来する、アミノ糖リン酸の異性化酵素である。以下、本発明を詳細に説明する。   The first of the present invention is an amino sugar phosphate isomerase derived from the genus Sulfolobus. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

（１）スルフォロバス属（genus Sulfolobus）
スルフォロバス属は、好気・好酸・好熱性のアーキアとして知られ、陸上の温泉などに広く生息する。硫黄を好むことから命名された。スルフォロバス属に属する微生物として、スルフォロバス・トーコーダイイ（Sulfolobus tokodaii）、スルフォロバス・アチドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）などがある。本発明では、スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）を好適に使用することができる。スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）は、スルフォロバス属の１種であり、７５〜８０℃で生育しうる。例えば、スルフォロバス・トーコーダイイ ストレイン７（S.tokodaii strain7）は、大分県別府温泉で採取された超好熱のアーキアであり、単独で硫化水素を分解する特徴を有している。生育限界温度は８７℃、ｐＨ２〜３の酸性を好むことが知られている。 (1) Genus Sulfolobus
The Sulfolobus genus is known as an aerobic, acidophilic, and thermophilic archaea. Named for its preference for sulfur. Examples of microorganisms belonging to the genus Sulfolobus include Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus solfataricus and the like. In the present invention, Sulfolobus tokodaii can be preferably used. Sulfolobus tokodaii (S. tokodaii) is a member of the genus Sulfolobus and can grow at 75-80 ° C. For example, Sulfolobus tokodaii strain 7 (S. tokodaii strain 7) is a hyperthermophilic archaea collected at Beppu Onsen, Oita Prefecture, and has the characteristic of decomposing hydrogen sulfide alone. It is known that the growth limit temperature is 87 ° C. and pH 2-3 is preferred.

本発明では、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）として、その菌体抽出物がアミノ糖リン酸の異性化酵素活性を有するものを広く使用することができる。このような活性は、例えば、グルコサミン−６−リン酸を基質として添加した際の反応生成物を分析することで確認することができる。その際、ガラクトサミン−１−リン酸を基質として添加し、ガラクトサミン−６−リン酸を生成するアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移酵素を比較分析することで確認することができる。スルフォロバス属の中でも、スルフォロバス・トーコーダイイを好適に使用することができる。スルフォロバス・トーコーダイイとしては、スルフォロバス・トーコーダイイ ストレイン７ ＪＣＭ登録番号:ＪＣＭ１０５４５（S.tokodaii strain7 JCM10545）がある。なお、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)のゲノムの全塩基配列および遺伝子情報は公知である。   In the present invention, as the genus Sulfolobus, those in which the bacterial cell extract has isomerase activity of amino sugar phosphate can be widely used. Such activity can be confirmed, for example, by analyzing a reaction product when glucosamine-6-phosphate is added as a substrate. In that case, it can confirm by adding galactosamine-1-phosphate as a substrate and comparatively analyzing the phosphate group intramolecular transferase of the amino sugar phosphate which produces | generates galactosamine-6-phosphate. Of the genus Sulfolobus, Sulfolobus tokodaiii can be preferably used. Sulfolobus Tokodaii strain 7 JCM registration number: JCM10545 (S. tokodaii strain7 JCM10545) is available as Sulfolobus Tokodaii strain. The complete nucleotide sequence and gene information of Sulfolobus tokodaiii (JCM10545) genome are known.

（２）アミノ糖リン酸の異性化酵素
本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素は、スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来する。本発明において、「スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来」とは、スルフォロバス属のいずれかの種の培養物から抽出した異性化酵素と、この異性化酵素の遺伝子配列に基づき、必要に応じて改変を加え、遺伝子工学的に製造されたリコンビナントタンパク質とを含むことを意味する。なお、リコンビナントタンパク質では、このタンパク質をコードするＤＮＡが、少なくとも、スルフォロバス属のいずれかの種に含まれるアミノ糖リン酸の異性化酵素をコードするＤＮＡと２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するものである。 (2) Amino sugar phosphate isomerase The amino sugar phosphate isomerase of the present invention is derived from the genus Sulfolobus. In the present invention, “derived from genus Sulfolobus” refers to an isomerase extracted from a culture of any species of the genus Sulfolobus and a gene sequence of the isomerase, and modified as necessary. And a recombinant protein produced by genetic engineering. In the recombinant protein, the DNA encoding this protein is at least 20%, preferably 30% or more of the DNA encoding the amino sugar phosphate isomerase contained in any species of the genus sulfolobas. It preferably has 50% or more, more preferably 70% or more, particularly preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more.

本発明において、アミノ糖リン酸の異性化酵素とは、基質であるアミノ糖リン酸化合物を糖部分が異なるアミノ糖化合物に変換するエピメラーゼと、基質であるアミノ糖リン酸化合物のリン酸基を分子内転移により変換するムターゼとを含む。前者をアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素とし、後者をアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素とする。本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素は、１種の異性化酵素が、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性とアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ活性との双方を有するものであってもよい。   In the present invention, the amino sugar phosphate isomerase refers to an epimerase that converts an amino sugar phosphate compound as a substrate into an amino sugar compound having a different sugar moiety, and a phosphate group of the amino sugar phosphate compound as a substrate. And mutase that converts by intramolecular transfer. The former is an amino sugar phosphate epimerase enzyme, and the latter is an amino sugar phosphate intramolecular transmutase enzyme. In the amino sugar phosphate isomerase of the present invention, one type of isomerase has both the epimerase activity of amino sugar phosphate and the phosphate group intramolecular transfer mutase activity of amino sugar phosphate. May be.

（３）アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素
本発明では、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を天然に含むスルフォロバス属由来生物として、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)がある。スルフォロバス属の生物に、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素が存在することは知られていない。また、スルフォロバス属以外の生物においても、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素が存在することは知られていない。このため、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)の全ゲノム遺伝子情報を検索して、本発明のエピメラーゼ酵素を検出することはできない。遺伝子情報に基づく検索では、相同性を評価することが基準であるが、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素は従前存在しないからである。しかしながら、スルフォロバス・トーコーダイイの菌体抽出物に、グルコサミン−１−リン酸とグルコサミン−６−リン酸とを添加して反応させたところ、グルコサミン−６−リン酸を添加した場合のみ、未知のアミノ糖リン酸化合物を生成することが確認された。以下、便宜のため、スルフォロバス属としてスルフォロバス・トーコーダイイを使用する場合で説明する。 (3) Episaccharide enzyme of amino sugar phosphate In the present invention, Sulfolobus tokodaiii (JCM10545) is an organism derived from the genus Sulfolobus that naturally contains an epimerase enzyme of amino sugar phosphate. It is not known that the amino sugar phosphate epimerase enzyme exists in the organism of the genus Sulfolobus. In addition, it is not known that an epimerase enzyme of amino sugar phosphate exists in organisms other than the genus Sulfolobus. Therefore, it is not possible to detect the epimerase enzyme of the present invention by searching the entire genome gene information of Sulfolobus tokodaiii (JCM10545). In the search based on genetic information, the standard is to evaluate homology, but the epimerase enzyme of amino sugar phosphate has not existed before. However, when glucosamine-1-phosphate and glucosamine-6-phosphate were added to the cell extract of Sulfolobus tokodaiii and reacted, an unknown amino acid was added only when glucosamine-6-phosphate was added. It was confirmed to produce sugar phosphate compounds. Hereinafter, for the sake of convenience, the description will be made on the case of using the Sulfolobus tokodaii as the Sulfolobus genus.

本発明のエピメラーゼ酵素は、スルフォロバス・トーコーダイイの培養物から分離することができる。異性化しうるアミノ糖リン酸としてはアミノ糖６リン酸があり、例えば、グルコサミン−６−リン酸、ガラクトサミン−６−リン酸などがある。異性化反応により、ガラクトサミン−６−リン酸、グルコサミン−６−リン酸などを製造することができる。より好ましくは、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化するエピメラーゼ酵素である。   The epimerase enzyme of the present invention can be isolated from a culture of Sulfolobus tokodaiii. Examples of amino sugar phosphates that can be isomerized include amino sugar hexaphosphates such as glucosamine-6-phosphate and galactosamine-6-phosphate. Galactosamine-6-phosphate, glucosamine-6-phosphate, and the like can be produced by an isomerization reaction. More preferably, it is an epimerase enzyme that isomerizes glucosamine-6-phosphate to galactosamine-6-phosphate.

本発明のエピメラーゼ酵素の至適温度は、２５〜９８℃であり、好ましくは３５〜９８℃であり、より好ましくは６０〜９５℃である。至適温度が５０℃以上であれば、他の酵素反応の影響を受けず、本発明のエピメラーゼ酵素の分離精製が容易であり、かつ本エピメラーゼ酵素を使用し、効率的に目的のアミノ糖リン酸、例えばアミノ糖６リン酸を製造することができる。   The optimum temperature of the epimerase enzyme of the present invention is 25 to 98 ° C, preferably 35 to 98 ° C, more preferably 60 to 95 ° C. When the optimum temperature is 50 ° C. or higher, the epimerase enzyme of the present invention is easily separated and purified without being affected by other enzyme reactions, and the target amino sugar phosphorus is efficiently used by using the epimerase enzyme. Acids such as amino sugar hexaphosphate can be prepared.

前記したように、本発明のエピメラーゼ酵素は、スルフォロバス・トーコーダイイの培養物から抽出したエピメラーゼ酵素に基づき、遺伝子工学的に製造されたリコンビナントタンパク質であってもよい。このようなリコンビナントタンパク質は、スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）から分離したアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素の遺伝子を用い、遺伝子工学的手法により調製することができる。具体的には、スルフォロバス・トーコーダイイの培養物から、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を指標に複数段階で精製してエピメラーゼ酵素を分離する。次いで、例えばＮ末端アミノ酸配列を解析し、これをスルフォロバス・トーコーダイイの全ゲノム情報と比較し、これによりエピメラーゼ酵素の遺伝子領域を特定する。このようなエピメラーゼ酵素のアミノ酸配列として配列番号３がある。本酵素遺伝子領域をＰＣＲ反応で増幅・抽出し、タンパク質発現プラスミドに挿入して発現ベクターを調製し、発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を得て、これを培養すれば、リコンビナントタンパク質を得ることができる。このような遺伝子領域としてＳＴ２２４５がある。ＳＴ２２４５遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号４に示す。後記する実施例に示すように、得られたリコンビナントタンパク質を加熱処理およびカラムクロマトグラムで単離精製すると、少なくともグルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化するエピメラーゼ活性を有することが判明した。   As described above, the epimerase enzyme of the present invention may be a recombinant protein produced by genetic engineering based on an epimerase enzyme extracted from a culture of Sulfolobus tokodaiii. Such a recombinant protein can be prepared by a genetic engineering technique using an epimerase enzyme gene of amino sugar phosphate isolated from Sulfurovo tokodaii. Specifically, the epimerase enzyme is separated from a culture of Sulfolobus tokodaiii by purifying in multiple stages using the epimerase activity of amino sugar phosphate as an index. Next, for example, the N-terminal amino acid sequence is analyzed, and this is compared with the entire genome information of Sulfolobus tokodaii, thereby identifying the gene region of the epimerase enzyme. There is SEQ ID NO: 3 as an amino acid sequence of such an epimerase enzyme. This enzyme gene region is amplified and extracted by a PCR reaction, inserted into a protein expression plasmid to prepare an expression vector, an expression vector is introduced into a host to obtain a transformant, and this is cultured. Can be obtained. There is ST2245 as such a gene region. The DNA sequence of the ST2245 gene is shown in SEQ ID NO: 4. As shown in the examples described later, when the obtained recombinant protein is isolated by heat treatment and column chromatogram, it has an epimerase activity that isomerizes at least glucosamine-6-phosphate to galactosamine-6-phosphate. There was found.

従って、本発明のエピメラーゼ酵素は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうることを条件に、前記配列番号３に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは、１以上２００以下、より好ましくは１以上１００以下、特に好ましくは１以上５０以下である。また、配列番号４に示すＤＮＡを用いて遺伝子工学的に製造されたリコンビナントタンパク質であってもよい。いずれも、アミノ糖リン酸の異性化活性を有するからである。   Therefore, the epimerase enzyme of the present invention is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or the amino acid shown in SEQ ID NO: 3 on the condition that glucosamine-6-phosphate can be isomerized to galactosamine-6-phosphate. It may have an amino acid sequence in which one or more amino acid residues of the sequence are deleted, substituted, inserted or added. The number of amino acids deleted, substituted, inserted or added is preferably 1 or more and 200 or less, more preferably 1 or more and 100 or less, and particularly preferably 1 or more and 50 or less. Moreover, the recombinant protein manufactured by genetic engineering using DNA shown to sequence number 4 may be sufficient. This is because both have isomerization activity of amino sugar phosphate.

なお、本発明のエピメラーゼ酵素は、カルボキシ末端タグ、Ｈｉｓタグ、多重荷電ペプチド、抗体のＦc部分、免疫グロブリン結合ドメイン、プロテインＡ若しくはプロテインＧ若しくはこれらの一部、レシチン、核酸結合部位、ヘパリン結合部位、特異性リガンド、特異性受容体、インテグリンなどをＮ末端あるいはＣ末端側にさらに結合したものであってもよい。   The epimerase enzyme of the present invention includes a carboxy terminal tag, a His tag, a multiply charged peptide, an antibody Fc portion, an immunoglobulin binding domain, protein A or protein G or a part thereof, lecithin, a nucleic acid binding site, a heparin binding site. , Specific ligands, specific receptors, integrins and the like may be further bound to the N-terminal or C-terminal side.

（４）アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素
本発明の、スルフォロバスに由来するアミノ糖リン酸の異性化酵素を用いたアミノ糖リン酸の製造は、アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ活性を利用するものであってもよい。本発明のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素によって反応しうるアミノ糖リン酸としては、グルコサミン−１−リン酸、ガラクトサミン−１−リン酸、グルコサミン−６−リン酸、ガラクトサミン−６−リン酸などがある。リン酸基分子内転移反応により１位または６位に結合したリン酸基が、６位または１位に分子内転移する。これにより、例えば、ガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。 (4) Phosphoryl group intramolecular mutase enzyme of amino sugar phosphate Production of amino sugar phosphate using the isomerase of amino sugar phosphate derived from sulfolobus of the present invention is performed by phosphorylation of amino sugar phosphate. It may utilize a group intramolecular transfer mutase activity. Examples of the amino sugar phosphate that can be reacted by the phosphate group intramolecular transfer mutase enzyme of the present invention include glucosamine-1-phosphate, galactosamine-1-phosphate, glucosamine-6-phosphate, galactosamine-6-phosphate, and the like. There is. The phosphate group bonded to the 1-position or 6-position by the phosphoric acid group intramolecular transfer reaction undergoes intramolecular transfer to the 6-position or 1-position. Thereby, for example, galactosamine-6-phosphate can be produced from galactosamine-1-phosphate.

本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素は、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)から抽出されたタンパク質である。特許文献１には、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)に由来する糖リン酸化合物のリン酸基分子内転移酵素が記載され、ＳＴ０２４２タンパク質と称されている。しかしながら、ＳＴ０２４２タンパク質にアミノ糖リン酸化合物を基質として用いたところ、アミノ糖リン酸化合物においても、リン酸基分子内転移ムターゼ活性を有することが判明したのである。本発明は、このＳＴ０２４２タンパク質を、アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素として使用するものである。なお、酵素は基質を厳格に特定するため、糖リン酸化合物に加えてアミノ糖リン酸においてリン酸基の分子内転移活性があることは推定することができなかった。ＳＴ０２４２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示し、このタンパク質をコードするＤＮＡ配列を配列番号６に示す。本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素は、特許文献１記載の手法に従い、スルフォロバス・トーコーダイイ(JCM10545)から抽出されたものであってもよく、前記配列番号６に示すＤＮＡ配列に基づき、遺伝子工学的手法により製造したリコンビナントタンパク質であってもよい。   The phosphoryl group intramolecular transfer mutase enzyme of amino sugar phosphate of the present invention is a protein extracted from Sulfolobus tokodaiii (JCM10545). Patent Document 1 describes a phosphate group intramolecular transferase of a sugar phosphate compound derived from Sulfolobus tokodaiii (JCM10545), and is referred to as ST0242 protein. However, when an amino sugar phosphate compound was used as a substrate for ST0242 protein, the amino sugar phosphate compound was also found to have phosphate group intramolecular transfer mutase activity. In the present invention, this ST0242 protein is used as a phosphate group intramolecular transfer mutase enzyme of amino sugar phosphate. In addition, since the enzyme strictly specifies the substrate, it could not be estimated that the amino sugar phosphate has intramolecular transfer activity of the phosphate group in addition to the sugar phosphate compound. The amino acid sequence of the ST0242 protein is shown in SEQ ID NO: 5, and the DNA sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 6. The phosphate group intramolecular mutase enzyme of amino sugar phosphate of the present invention may be extracted from Sulfolobus tokodaiii (JCM10545) according to the method described in Patent Document 1, and the DNA shown in SEQ ID NO: 6 It may be a recombinant protein produced by genetic engineering techniques based on the sequence.

本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素の至適温度は、２５〜９８℃であり、好ましくは３５〜９８℃であり、より好ましくは６０〜９５℃である。至適温度が５０℃以上であれば、他の酵素反応の影響を受けず、本発明のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素の分離精製が容易であり、かつ本リン酸基分子内転移ムターゼ酵素を使用し、効率的に目的のアミノ糖リン酸、例えばアミノ糖６リン酸を製造することができる。   The optimum temperature of the phosphate group intramolecular mutase enzyme of the amino sugar phosphate of the present invention is 25 to 98 ° C, preferably 35 to 98 ° C, more preferably 60 to 95 ° C. When the optimum temperature is 50 ° C. or higher, the phosphate group intramolecular transfer mutase enzyme of the present invention can be easily separated and purified without being affected by other enzyme reactions, and the present phosphate group intramolecular transfer mutase enzyme. Can be used to efficiently produce the desired amino sugar phosphate, for example, amino sugar hexaphosphate.

なお、本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素は、カルボキシ末端タグ、Ｈｉｓタグ、多重荷電ペプチド、抗体のＦc部分、免疫グロブリン結合ドメイン、プロテインＡ若しくはプロテインＧ若しくはこれらの一部、レシチン、核酸結合部位、ヘパリン結合部位、特異性リガンド、特異性受容体、インテグリンなどをＮ末端あるいはＣ末端側にさらに結合したものであってもよい。   In addition, the phosphate group intramolecular mutase enzyme of amino sugar phosphate of the present invention includes a carboxy terminal tag, a His tag, a multiply charged peptide, an Fc part of an antibody, an immunoglobulin binding domain, protein A or protein G, or one of these. Or a lecithin, a nucleic acid binding site, a heparin binding site, a specific ligand, a specific receptor, an integrin, etc. may be further bound to the N-terminal or C-terminal side.

（５）ＤＮＡ
本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素に関するＤＮＡは、配列番号４記載のＤＮＡ、または配列番号４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、ＤＮＡである。なお、ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション溶液１リットル中に５２．５９ｇのＮａＣｌ、２６．４６ｇのクエン酸ナトリウム、１ｇのフィコール（Ｔｙｐｅ ４００）、１ｇのポリビニルピロリドン、１ｇのウシ血清アルブミン、５ｇのＳＤＳ、１ｇの断片化鮭精子ＤＮＡ、５００ｍｌのホルムアミドを含み、温度４２℃で行う。その後の洗浄は、洗浄用溶液１リットル中に１７．５３ｇのＮａＣｌ、８．８２ｇのクエン酸ナトリウム、５ｇのＳＤＳを含み、温度６８℃で行う条件である。本発明のＤＮＡを使用すれば、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を遺伝子工学的に製造することができる。 (5) DNA
The DNA relating to the epimerase enzyme of amino sugar phosphate of the present invention is a protein that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 4 or the DNA of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions and has an epimerase activity of amino sugar phosphate It is DNA characterized by encoding. The stringent conditions include 52.59 g NaCl, 26.46 g sodium citrate, 1 g Ficoll (Type 400), 1 g polyvinylpyrrolidone, 1 g bovine serum albumin, 5 g in 1 liter of hybridization solution. Of SDS, 1 g of fragmented sperm DNA, 500 ml of formamide at a temperature of 42 ° C. Subsequent washing is carried out at a temperature of 68 ° C. containing 17.53 g NaCl, 8.82 g sodium citrate, 5 g SDS in 1 liter of the washing solution. If the DNA of the present invention is used, an epimerase enzyme of amino sugar phosphate can be produced by genetic engineering.

（６）アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素の製造方法
本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を得るには、スルフォロバス・トーコーダイイを培養し、培養物からアミノ糖リン酸の異性化活性を指標に、ＤＥＡＥ、ＨｉＴｒａｐＱ、ＨｉＴｒａｐＰなどを用いたイオン交換クロマト、ＨｉＴｒａｐ−Ｐｈｅｎｙｌカラム、ＨｉＴｒａｐ−Ｂｕｔｈｙｌカラムなどを用いた疎水性クロマト、ＢＥＨ Ａｍｉｄｅカラムを用いた親水性クロマト、デキストラン担体を用いたゲルろ過、その他の公知の方法を組み合わせて分離精製することができる。 (6) Method for Producing Amino Sugar Phosphate Epimerase Enzyme To obtain the amino sugar phosphate epimerase enzyme of the present invention, cultivating Sulfolobus tokodaiii, using the isomerization activity of amino sugar phosphate from the culture as an index, Ion exchange chromatography using DEAE, HiTrapQ, HiTrapP, etc., hydrophobic chromatography using HiTrap-Phenyl column, HiTrap-Butyl column, etc., hydrophilic chromatography using BEH Amide column, gel filtration using dextran carrier, etc. Separation and purification can be performed by combining known methods.

一方、前記ＤＮＡを用いて、通常の遺伝子工学的手法を適用して製造することもできる。たとえば、前記したＤＮＡから発現ベクターを調製し、この発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換して、エピメラーゼ活性を有する形質転換体を得てこれを培養し、培養物に含まれるエピメラーゼ酵素を分離回収してもよい。発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ２１ｂ、ｐＨＹ４８１等のタンパク質発現プラスミドベクターを好適に使用することができる。また、発現ベクターを導入する宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌などの微生物、酵母、ラン藻、放線菌などの従来公知の種々の宿主を使用することができる。得られた形質転換体の培養は、宿主細胞の培養条件に準じて行うことができる。   On the other hand, it can also be produced by applying the usual genetic engineering technique using the DNA. For example, an expression vector is prepared from the DNA described above, a host cell is transformed using this expression vector, a transformant having epimerase activity is obtained and cultured, and the epimerase enzyme contained in the culture is separated. It may be recovered. As an expression vector, for example, a protein expression plasmid vector such as pET21b or pHY481 can be preferably used. As host cells into which expression vectors are introduced, various conventionally known hosts such as microorganisms such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeasts, cyanobacteria and actinomycetes can be used. The obtained transformant can be cultured according to the culture conditions of the host cell.

形質転換体から本発明のエピメラーゼ酵素を分離するには、アミノ糖リン酸の異性化活性を指標に、公知の方法を組み合わせて分離精製すればよい。その際、大腸菌等の非分泌型細胞を用いる場合は本発明のエピメラーゼ酵素は菌体内に生成されるので、培養液や菌体破砕物等の培養処理物から、エピメラーゼ酵素を分離精製する。一方、宿主として枯草菌等分泌型の系を用いる場合には、培養液中に本エピメラーゼ酵素が生成蓄積される。したがって、菌体を破砕することなく培養液を分離精製し、本発明のエピメラーゼ酵素を製造することができる。
なお、分離精製に際し、本発明のエピメラーゼ酵素の至適温度が５０℃以上であれば、培養液を加熱処理し、およびカラムクロマトグラムをおこなえば、効率的に単離精製することができる。 In order to separate the epimerase enzyme of the present invention from the transformant, separation and purification may be performed by combining known methods using the isomerization activity of amino sugar phosphate as an index. At that time, when non-secretory cells such as Escherichia coli are used, the epimerase enzyme of the present invention is produced in the microbial cells. Therefore, the epimerase enzyme is separated and purified from a culture treated product such as a culture solution or a crushed bacterial cell. On the other hand, when a secretory system such as Bacillus subtilis is used as the host, the epimerase enzyme is produced and accumulated in the culture solution. Therefore, the culture solution can be separated and purified without disrupting the cells, and the epimerase enzyme of the present invention can be produced.
In the separation and purification, if the optimum temperature of the epimerase enzyme of the present invention is 50 ° C. or higher, the culture solution can be heat-treated and subjected to column chromatogram, so that it can be isolated and purified efficiently.

（７）グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を製造する方法
本発明の製造方法では、グルコサミン−６−リン酸に前記アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を作用させる。予め、本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素の至適温度や指摘ｐＨ等を測定し、好適な培養条件で培養することが望ましい。これにより、効率的にガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。より好ましくは、反応温度６０〜９５℃で保温・反応させる。なお、グルコサミン−６−リン酸とガラクトサミン−６−リン酸との相互異性化反応を図８に示す。 (7) Method for producing galactosamine-6-phosphate from glucosamine-6-phosphate In the production method of the present invention, the epimerase enzyme of the amino sugar phosphate is allowed to act on glucosamine-6-phosphate. It is desirable to measure in advance the optimum temperature, indicated pH, etc. of the epimerase enzyme of amino sugar phosphate of the present invention, and culture under suitable culture conditions. Thereby, galactosamine-6-phosphate can be produced efficiently. More preferably, the temperature is kept and reacted at a reaction temperature of 60 to 95 ° C. In addition, the mutual isomerization reaction of glucosamine-6-phosphate and galactosamine-6-phosphate is shown in FIG.

なお、本発明のアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を使用する場合に限定されず、例えば、前記形質転換体の培養液や菌体抽出液、その他の粗酵素を使用してもよい。前記したように、形質転換体の宿主が枯草菌等分泌型細胞であれば、培養液中に本酵素が生成蓄積されるため、この培養液にグルコサミン−６−リン酸を添加して反応させ、ガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。特に、本発明のエピメラーゼ酵素の至適温度が５０℃以上の場合には、他の酵素の影響を受けることなく異性化反応のみが進行するため、効率的である。   The amino sugar phosphate epimerase enzyme of the present invention is not limited to the above, and for example, a culture solution or a bacterial cell extract of the transformant or other crude enzyme may be used. As described above, if the host of the transformant is a secretory cell such as Bacillus subtilis, the enzyme is produced and accumulated in the culture solution. Therefore, glucosamine-6-phosphate is added to the culture solution and reacted. Galactosamine-6-phosphate can be produced. In particular, when the optimal temperature of the epimerase enzyme of the present invention is 50 ° C. or higher, only the isomerization reaction proceeds without being affected by other enzymes, which is efficient.

（８）ガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を製造する方法
本発明の製造方法は、ガラクトサミン−１−リン酸に前記アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素を作用させる。予め、本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素の至適温度や指摘ｐＨ等を測定し、好適な条件で反応させることが望ましい。これにより、効率的にガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。より好ましくは、反応温度６０〜９５℃で保温・反応させる。なお、ガラクトサミン−１−リン酸とガラクトサミン−６−リン酸との相互異性化反応を図９に示す。 (8) Method for Producing Galactosamine-6-Phosphate from Galactosamine-1-Phosphate The production method of the present invention acts on the galactosamine-1-phosphate using the phosphate group intramolecular transfer mutase enzyme of the amino sugar phosphate. Let It is desirable to measure in advance the optimum temperature, indicated pH, etc. of the phosphate group intramolecular mutase enzyme of the amino sugar phosphate of the present invention, and to react under suitable conditions. Thereby, galactosamine-6-phosphate can be produced efficiently. More preferably, the temperature is kept and reacted at a reaction temperature of 60 to 95 ° C. In addition, the mutual isomerization reaction of galactosamine-1-phosphate and galactosamine-6-phosphate is shown in FIG.

なお、本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素を使用すれば、グルコサミン−６−リン酸にアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を作用させてガラクトサミン−６−リン酸を製造し、およびガラクトサミン−１−リン酸に本発明のアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素を作用させてガラクトサミン−６−リン酸を製造することができる。これら３者の関係を図１０に示す。図１０において、（１）の反応はアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素により、（２）の反応はアミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ酵素により触媒される。本発明の酵素による反応により、アミノ糖リン酸化合物を１段階で製造することができる。   When the amino sugar phosphate isomerase of the present invention is used, galactosamine-6-phosphate is produced by allowing the amino sugar phosphate epimerase enzyme to act on glucosamine-6-phosphate, and galactosamine-1 -Galactosamine-6-phosphate can be produced by allowing the phosphate group intramolecular transfer mutase enzyme of the amino sugar phosphate of the present invention to act on phosphate. These three relationships are shown in FIG. In FIG. 10, the reaction (1) is catalyzed by an amino sugar phosphate epimerase enzyme, and the reaction (2) is catalyzed by an amino sugar phosphate intramolecular transfer mutase enzyme. By the reaction with the enzyme of the present invention, an amino sugar phosphate compound can be produced in one step.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these.

（実施例１）
以下により、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素を製造した。
（１）菌の培養
次の方法で、スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）（ＪＣＭ１０５４５）を培養した。
１．３ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２８ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１．８ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、４．５ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．２２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０３ｍｇのＶＯＳＯ４・ｘＨ２Ｏ、０．０１ｍｇのＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇの酵母エキスを１Ｌの蒸留水に溶かし、１０規定Ｈ２ＳＯ４溶液を用いてｐＨを３．５に調整した。この溶液を加圧殺菌した後、ＪＣＭ１０５４５を植菌した。この培養液２．５Ｌを８０℃で４日間培養した。 Example 1
The amino sugar phosphate epimerase enzyme was produced as follows.
(1) Cultivation of bacteria Sulfolobos tokodaii (JCM10545) was cultured by the following method.
1.3 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.28 g KH 2 PO 4 , 0.25 g MgSO 4 .7H 2 O, 0.07 g CaCl 2 .2H 2 O, 0.02 g FeCl 3. 6H 2 O, MnCl of 1.8mg 2 · 4H 2 O, Na of 4.5mg 2 B 4 O 7 · 10H 2 O, ZnSO of 0.22mg 4 · 7H 2 O, 0.05mg of CuCl 2 · 2H 2 O, 0.03 mg Na 2 MoO 4 · 2H 2 O, 0.03 mg VOSO 4 · xH 2 O, 0.01 mg CoSO 4 · 7H 2 O, 1.0 g yeast extract are dissolved in 1 L distilled water. The pH was adjusted to 3.5 using a 10 N H 2 SO 4 solution. After sterilizing this solution under pressure, JCM10545 was inoculated. 2.5 L of this culture solution was cultured at 80 ° C. for 4 days.

（２）粗抽出液の調製
ＪＣＭ１０５４５の培養終了後、６，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって菌体を集菌した。蒸留水で２回洗浄した後、超音波処理（氷中、２０秒破砕・４０秒休止×２０回）により菌体を破砕し、破砕物を１００００ｒｐｍ、２０分で遠心分離した。上清をろ過し、これをスルフォロバス・トーコーダイイ菌体の粗抽出液とした。 (2) Preparation of crude extract After completion of the cultivation of JCM10545, the cells were collected by centrifugation at 6,000 rpm for 15 minutes. After washing twice with distilled water, the microbial cells were crushed by ultrasonication (in ice, 20 seconds crushing / 40 seconds rest × 20 times), and the crushed material was centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes. The supernatant was filtered and used as a crude extract of Sulfolobus tokodaiii cells.

（３）アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を有するタンパク質の精製
上記（２）で得た粗抽出液の硫酸アンモニウム飽和濃度３０−６０％で沈殿する画分を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に溶解し、次いでＴｏｙｏＰｅａｒｌ-ＤＥＡＥカラムに吸着させた。溶離液として、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）→２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）−０．５ＭＮａＣｌを使用し、１２０分掛けて溶出した。次いで、最終画分を分離し透析した。透析後の画分をＨｉＴｒａｐＱカラムに吸着させ、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）→２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）−１ＭＮａＣｌで１２０分かけて溶出した。各０．８ｍＬを分画し、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性が検出された画分（第２０〜３０番目）を集め透析した。透析後の画分をＨｉＴｒａｐ−Ｐｈｅｎｙｌカラムに吸着させ２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）→２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）−２０％エタノールで溶出した。次いで、最終画分を透析し、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を確認しつつ精製し、アミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を有するタンパク質を含む画分を得た。 (3) Purification of protein having epimerase activity of amino sugar phosphate Dissolve the fraction precipitated in the crude extract obtained in (2) above at a saturated ammonium sulfate concentration of 30-60% in 20 mM Tris (pH 8.0). It was then adsorbed on a ToyoPearl-DEAE column. As an eluent, 20 mM Tris (pH 8.0) → 20 mM Tris (pH 8.0) -0.5 M NaCl was used and eluted for 120 minutes. The final fraction was then separated and dialyzed. The fraction after dialysis was adsorbed on a HiTrapQ column and eluted with 20 mM Tris (pH 8.0) → 20 mM Tris (pH 8.0) -1M NaCl over 120 minutes. Each 0.8 mL was fractionated, and fractions (20th to 30th) in which the epimerase activity of amino sugar phosphate was detected were collected and dialyzed. The fraction after dialysis was adsorbed on a HiTrap-Phenyl column and eluted with 20 mM Tris (pH 8.0) → 20 mM Tris (pH 8.0) -20% ethanol. Next, the final fraction was dialyzed and purified while confirming the epimerase activity of amino sugar phosphate to obtain a fraction containing a protein having the epimerase activity of amino sugar phosphate.

（４）目的遺伝子の同定
上記（３）で得た画分のタンパク質のＮ末端配列を解析した。この解析結果とスルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）のゲノム全遺伝子情報とを比較した。この結果、上記（３）で得たタンパク質をコードしている遺伝子を、スルフォロバス・トーコーダイイのＳＴ２２４５遺伝子（以下、単にＳＴ２２４５遺伝子と称する。）と同定した。なお、以下、ＳＴ２２４５遺伝子で発現されるリコンビナントタンパク質を、ＳＴ２２４５タンパク質と称する。 (4) Identification of target gene The protein N-terminal sequence of the fraction obtained in (3) above was analyzed. The results of this analysis were compared with information on the entire genome of S. tokodaii. As a result, the gene encoding the protein obtained in the above (3) was identified as ST2245 gene of Sulfolobus tokodaiii (hereinafter simply referred to as ST2245 gene). Hereinafter, the recombinant protein expressed in the ST2245 gene is referred to as ST2245 protein.

（５）ＳＴ２２４５遺伝子を導入した発現プラスミドの構築
ＳＴ２２４５遺伝子領域の前後に制限酵素（ＮｃｏＩとＸｈｏＩ）サイトを構築する目的でＤＮＡプライマーを合成し、遺伝子の前後に制限酵素サイトが導入されたＤＮＡをＰＣＲで増幅した。なお、合成されるＳＴ２２４５タンパク質のＣ末端にヒスチジン残基をタグとして結合するように、プライマーを設計した。 (5) Construction of expression plasmid introduced with ST2245 gene DNA primers were synthesized for the purpose of constructing restriction enzyme (NcoI and XhoI) sites before and after the ST2245 gene region, and DNA with restriction enzyme sites introduced before and after the gene was synthesized. Amplified by PCR. The primer was designed so that a histidine residue was bound as a tag to the C-terminus of the synthesized ST2245 protein.

ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、以下の通りである。センスプライマーの下線部はＮｃｏＩサイトを示し、アンチセンスプライマーの下線部は、ＸｈｏＩサイトを示す。
センスプライマー：5'- CATGCCATGGATAATCCATATGAGAATTGG -3'（配列番号１）
アンチセンスプライマー：5'- CCGCTCGAGTAAATTCTGATCTGCATTAAT-3'（配列番号２） The primers used for PCR amplification are as follows. The underlined part of the sense primer indicates the NcoI site, and the underlined part of the antisense primer indicates the XhoI site.
Sense primer: 5'-CATG CCATGG ATAATCCATATGAGAATTGG-3 '(SEQ ID NO: 1)
Antisense primer: 5'- CCG CTCGAG TAAATTCTGATCTGCATTAAT-3 '(SEQ ID NO : 2)

ＰＣＲ反応の後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩとを用いて３７℃、２時間反応させ分解した。次いで、その構造遺伝子領域断片を精製した。得られた断片と同一制限酵素で切断したｐＥＴ２８ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とを、Ｔ４リガーゼ存在下に１６℃、２時間反応させて連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入して形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドを得てこれを精製した。塩基配列を確認し、これを発現プラスミドｐＥＴ２８ｂ／ＳＴ２２４５とした。発現プラスミドｐＥＴ２８ｂ／ＳＴ２２４５を用いると、ＳＴ２２４５タンパク質のＣ末端にヒスチジンタグが付加された融合タンパク質が生産される。   After the PCR reaction, the reaction was digested with restriction enzymes NcoI and XhoI at 37 ° C. for 2 hours for degradation. Subsequently, the structural gene region fragment was purified. The obtained fragment and pET28b (manufactured by Novagen) cleaved with the same restriction enzyme were ligated by reacting at 16 ° C. for 2 hours in the presence of T4 ligase. A part of the ligated DNA was introduced into competent cells of E. coli DH5α to obtain transformant colonies. A plasmid was obtained from the obtained colony and purified. The base sequence was confirmed and designated as expression plasmid pET28b / ST2245. When the expression plasmid pET28b / ST2245 is used, a fusion protein in which a histidine tag is added to the C-terminus of the ST2245 protein is produced.

（６）組換え遺伝子の発現
大腸菌（Ｎｏｖａｇｅｎ社製、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ ＲＩＬ）のコンピテントセルを融解し、これに上記発現プラスミド１０ｎｇを含む溶液を加え氷中に３０分間放置し、次いで４２℃に３０秒間加熱してヒートショックを与えた。その後、ＳＯＣ培地０．９ｍｌを加え、３７℃で１時間振とう培養した。培養後に、適量をカナマイシン含有ＬＢ寒天プレートにまき、３７℃で１晩培養して形質転換体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ ＲＩＬ／ｐＥＴ２８ｂ／ＳＴ２２４５を得た。 (6) Recombinant gene expression A competent cell of E. coli (Novagen, E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIL) was thawed, and a solution containing 10 ng of the above expression plasmid was added thereto and left on ice for 30 minutes. Then, heat shock was applied by heating to 42 ° C. for 30 seconds. Thereafter, 0.9 ml of SOC medium was added and cultured with shaking at 37 ° C. for 1 hour. After culturing, an appropriate amount was plated on a kanamycin-containing LB agar plate and cultured at 37 ° C. overnight to obtain transformant E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIL / pET28b / ST2245.

この形質転換体を、２リットルのカナマイシン含有ＬＢ培地中で３７℃、一晩培養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）を１ｍＭになるように加え、さらに３０℃で５時間培養した。培養後遠心分離（６，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）により集菌した。   This transformant was cultured in 2 liters of kanamycin-containing LB medium at 37 ° C. overnight, and then IPTG (Isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside) was added to 1 mM, followed by further culturing at 30 ° C. for 5 hours. After culture, the cells were collected by centrifugation (6,000 rpm, 20 min).

（７）ＳＴ２２４５タンパク質の分離
２リットル培養液から集菌した菌体に２倍量の４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、プロテアーゼ阻害剤（Roche社製、Complete EDTA-free）１錠、０．５ｍｇのＤＮａｓｅ ＲＱ１（プロメガ社製）を加え懸濁液を得た。得られた懸濁液を超音波破砕（氷中、２０秒破砕・４０秒休止×４０回）し、７５℃で１０分保温した後、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、２０分）により上清液を得た。この上清液を用いＮｉ−カラム（Novagen社製,His・Bind metal chelation resin & His・Bind buffer kitを使用）による親和性クロマトグラムを行った。ここで得られた０．５Ｍイミダゾール溶出画分（２０ｍｌ）を、再度７５℃で１０分加熱処理し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、２０分）により得た上清液を、セントリプレップＹＭ−５０（ミリポア社）で２ｍｌまで濃縮し、これを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌで透析し、ＳＴ２２４５タンパク質を得た。 (7) Separation of ST2245 protein Two cells of 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), protease inhibitor (Roche, Complete EDTA-free), 1 tablet, collected from 2 liter culture solution 0.5 mg DNase RQ1 (Promega) was added to obtain a suspension. The obtained suspension was subjected to ultrasonic disruption (in ice, 20 seconds disruption / 40 seconds pause × 40 times), kept at 75 ° C. for 10 minutes, and then centrifuged (11,000 rpm, 20 minutes) to obtain a supernatant. Got. Affinity chromatogram using a Ni-column (using Novagen, His • Bind metal chelation resin & His • Bind buffer kit) was performed using this supernatant. The 0.5 M imidazole elution fraction (20 ml) obtained here was again heat-treated at 75 ° C. for 10 minutes, and the supernatant obtained by centrifugation (11,000 rpm, 20 minutes) was sent to Centriprep YM-50. (Millipore) concentrated to 2 ml and dialyzed against 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 100 mM NaCl to obtain ST2245 protein.

（実施例２）
グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を合成した。
実施例１の工程（２）で得たスルフォロバス・トーコーダイイ菌体の粗抽出液を使用し、グルコサミン−６−リン酸を異性化した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのグルコサミン−６−リン酸を含む溶液１３５μｌに、実施例１の（２）で得た粗抽出液１５μｌ（０．０１３５ｍｇ）を加えた。この酵素反応液を８０℃で保温し反応させた。反応３０分、６０分、および１２０分後に、反応チューブを氷上に移して反応を停止させ、その一部を保存した。
反応液を、電気化学検出器（Ｔｈｅｒｍｏ社製、イオンクロマトグラフィー）を装着したＨＰＬＣを用いて分析した。Ａ溶媒として１００ｍＭのＮａＯＨを、Ｂ溶液として１００ｍＭＮａＯＨ-１Ｍの酢酸Ｎａを使用した。Ａ：Ｂ＝９：１でカラムを飽和し、その後２０分かけて、流速１ｍｌ／ｍｉｎで混合比をＡ：Ｂ＝８：２まで変化させて。その後３０分かけてＡ：Ｂ＝５：５の混合比となる液を溶離液として使用した。なお、検出器は、電気化学検出器（金電極、パルストアンベロメトリー）である。結果を図１に示す。反応３０分の反応液には、基質（グルコサミン−６−リン酸）と、反応生成物（ガラクトサミン−６−リン酸）とが含まれるが、反応時間に対応してグルコサミン−６−リン酸が低減し、ガラクトサミン−６−リン酸量が増加した。このため、反応１２０分の反応液には基質は存在せず、反応生成物（ガラクトサミン−６−リン酸）のみが存在する結果となった。 (Example 2)
Galactosamine-6-phosphate was synthesized from glucosamine-6-phosphate.
Glucosamine-6-phosphate was isomerized using the crude extract of Sulfolobus tokodaiii cells obtained in step (2) of Example 1. 15 μl (0.0135 mg) of the crude extract obtained in (2) of Example 1 was added to 135 μl of a solution containing 50 mM Tris buffer (pH 8.0), 1 mM MgCl 2 , and 1 mM glucosamine-6-phosphate. It was. This enzyme reaction solution was incubated at 80 ° C. for reaction. After 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes of reaction, the reaction tube was transferred onto ice to stop the reaction, and a part of it was stored.
The reaction solution was analyzed using HPLC equipped with an electrochemical detector (Thermo, ion chromatography). 100 mM NaOH was used as the A solvent, and 100 mM NaOH-1M Na acetate was used as the B solution. Saturate the column at A: B = 9: 1, then change the mixing ratio to A: B = 8: 2 at a flow rate of 1 ml / min over 20 minutes. Thereafter, a liquid having a mixing ratio of A: B = 5: 5 over 30 minutes was used as an eluent. The detector is an electrochemical detector (gold electrode, pulsed amberometry). The results are shown in FIG. The reaction solution for 30 minutes contains a substrate (glucosamine-6-phosphate) and a reaction product (galactosamine-6-phosphate), but glucosamine-6-phosphate is added corresponding to the reaction time. The amount of galactosamine-6-phosphate was decreased. For this reason, the substrate was not present in the reaction solution for 120 minutes, and only the reaction product (galactosamine-6-phosphate) was present.

（実施例３）
ＳＴ２２４５タンパク質の酵素反応をＨＰＬＣにより確認した。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのグルコサミン−６−リン酸を含む溶液１３５μｌに、実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質を２μｇ加えた。この酵素反応液を８０℃で保温し反応させた。反応３０分後に、反応チューブを氷上に移して反応を停止させた。この反応液について、実施例２と同様に分析した。結果を図２の（２）に示す。なお、図２において、（５）は、ガラクトサミン−１−リン酸基質のピークを示し、（４）はグルコサミン−６−リン酸基質のピークを示し、（３）はガラクトサミン−１−リン酸に実施例４で得たＳＴ０２４２タンパク質を作用させた反応液のチャートを示し、（２）はグルコサミン−６−リン酸にＳＴ２２４５タンパク質を作用させた反応液のチャートを示し、（１）は上記（２）と（３）との混合液のチャートである。後記するように、実施例４で得たＳＴ０２４２タンパク質は、アミノ糖リン酸のリン酸基分子内転移ムターゼ活性を有し、ガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を生成する。図２に示すように、（１）、（２）、（３）は、いずれもガラクトサミン−６−リン酸のピークを有する。反応生成物、基質および触媒反応との関係から推定し、前記ＳＴ２２４５タンパク質は、グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を生成するエピメラーゼ酵素と同定される。なお、グルコサミン−６−リン酸からガラクトサミン６−リン酸が生成する反応を図３に示す。 (Example 3)
Enzymatic reaction of ST2245 protein was confirmed by HPLC.
2 μg of ST2245 protein obtained in step (7) of Example 1 was added to 135 μl of a solution containing 50 mM Tris buffer (pH 8.0), 1 mM MgCl 2 , and 1 mM glucosamine-6-phosphate. This enzyme reaction solution was incubated at 80 ° C. for reaction. After 30 minutes of reaction, the reaction tube was transferred onto ice to stop the reaction. This reaction solution was analyzed in the same manner as in Example 2. The results are shown in (2) of FIG. In FIG. 2, (5) shows the peak of galactosamine-1-phosphate substrate, (4) shows the peak of glucosamine-6-phosphate substrate, and (3) shows galactosamine-1-phosphate. The chart of the reaction liquid in which ST0242 protein obtained in Example 4 was allowed to act is shown, (2) is the chart of the reaction liquid in which ST2245 protein is allowed to act on glucosamine-6-phosphate, and (1) is the above (2 It is a chart of the liquid mixture of (3). As will be described later, the ST0242 protein obtained in Example 4 has a phosphate group intramolecular transfer mutase activity of amino sugar phosphate, and generates galactosamine-6-phosphate from galactosamine-1-phosphate. As shown in FIG. 2, (1), (2), and (3) all have a galactosamine-6-phosphate peak. Estimated from the relationship between reaction products, substrates and catalytic reaction, the ST2245 protein is identified as an epimerase enzyme that produces galactosamine-6-phosphate from glucosamine-6-phosphate. In addition, reaction which galactosamine 6-phosphate produces | generates from glucosamine-6-phosphate is shown in FIG.

(実施例４）
特許文献１の実施例１に従い、スルフォロバス・トーコーダイイ（S.tokodaii）由来の遺伝子（ＳＴ０２４２）を特定し、およびＳＴ０２４２遺伝子を用いてリコンビナントタンパク質を製造した。これをＳＴ０２４２タンパク質と称する。
５０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．６）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０μＭグルコース１，６ビスリン酸、０．４ｍＭガラクトサミン−１−リン酸を含む溶液０．２ｍｌに、ＳＴ０２４２タンパク質２μｇを添加し、温度６５〜８０℃で２０分反応させた。反応液を実施例３と同様にして分析した。結果を、図２に併せて記載する。図２の（１）、（２）、（３）には、いずれもガラクトサミン−６−リン酸のピークが含まれる。反応生成物、基質および触媒反応との関係から推定し、前記ＳＴ０２４２タンパク質は、ガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸を生成するリン酸基分子内転移ムターゼ酵素と同定される。なお、グルコサミン−６−リン酸およびガラクトサミン−１−リン酸からガラクトサミン−６−リン酸が生成される反応は図１０に示されている。図１０における反応（１）は、実施例３のＳＴ２２４５タンパク質によって触媒され、同（２）はＳＴ０２４２タンパク質によって触媒される。 Example 4
According to Example 1 of Patent Document 1, a gene derived from S. tokodaii (ST0242) was identified, and a recombinant protein was produced using the ST0242 gene. This is referred to as ST0242 protein.
2 μg of ST0242 protein was added to 0.2 ml of a solution containing 50 mM MOPS (pH 7.6), 2 mM MgSO 4 , 10 μM glucose 1,6 bisphosphate, 0.4 mM galactosamine-1-phosphate, and the temperature was adjusted to 65-80 ° C. It was made to react for minutes. The reaction solution was analyzed in the same manner as in Example 3. The results are also shown in FIG. Each of (1), (2), and (3) in FIG. 2 includes a galactosamine-6-phosphate peak. Estimated from the relationship between the reaction product, substrate and catalytic reaction, the ST0242 protein is identified as a phosphate group intramolecular mutase enzyme that produces galactosamine-6-phosphate from galactosamine-1-phosphate. The reaction in which galactosamine-6-phosphate is produced from glucosamine-6-phosphate and galactosamine-1-phosphate is shown in FIG. Reaction (1) in FIG. 10 is catalyzed by ST2245 protein of Example 3, and (2) is catalyzed by ST0242 protein.

（実施例５）
以下により、ＳＴ２２４５タンパク質の分子量、天然物との反応同一性、温度依存性、ｐＨ依存性等を評価した。
（１）分子量
実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。結果を図４に示す。図４の左カラムは、ＳＴ２２４５タンパク質の単一バンドを示し、右カラムは分子量マーカーである。図４から、ＳＴ２２４５タンパク質の分子量は、約３５ｋＤａと推定された。なお、ＳＴ２２４５タンパク質は配列番号３に示すように３１１アミノ酸残基より構成され、そのアミノ酸配列から予測される分子量は約３５，０００Ｄａである。 (Example 5)
The molecular weight of ST2245 protein, reaction identity with natural products, temperature dependency, pH dependency and the like were evaluated as follows.
(1) Molecular weight The molecular weight of ST2245 protein obtained in the step (7) of Example 1 was evaluated by SDS-PAGE. The results are shown in FIG. The left column of FIG. 4 shows a single band of ST2245 protein, and the right column is a molecular weight marker. From FIG. 4, the molecular weight of ST2245 protein was estimated to be about 35 kDa. The ST2245 protein is composed of 311 amino acid residues as shown in SEQ ID NO: 3, and the molecular weight predicted from the amino acid sequence is about 35,000 Da.

（２）リコンビナントと天然酵素との反応同一性
実施例１の工程（３）で得たアミノ糖リン酸のエピメラーゼ活性を有するスルフォロバス・トーコーダイイ抽出タンパク質を含む画分（以下、天然タンパク質画分と称する。）と、実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質を用い、それぞれグルコサミン−６−リン酸を基質とした反応を行い、得られた反応生成物を分析した。分析は、実施例２と同様に、電気化学検出器を装着したＨＰＬＣで行った。結果を図５に示す。図５Ａは、ＳＴ２２４５タンパク質の結果を示し、図５Ｂは天然タンパク質画分の結果を示し、図５Ｃは、基質（グルコサミン−６−リン酸）のピークを示す。図５に示すように、ＳＴ２２４５タンパク質と天然タンパク質画分とによる反応生成物は、同一の位置に反応生成物のピークが検出された。このことから、ＳＴ２２４５タンパク質は、菌体内に存在するアミノ糖リン酸のエピメラーゼ酵素の活性と同一のものであることが示された。 (2) Reaction identity between recombinant and natural enzyme Fraction containing sulfobasus tokodaii extracted protein having epimerase activity of amino sugar phosphate obtained in step (3) of Example 1 (hereinafter referred to as natural protein fraction) ) And ST2245 protein obtained in step (7) of Example 1, each using glucosamine-6-phosphate as a substrate, and the obtained reaction product was analyzed. The analysis was performed by HPLC equipped with an electrochemical detector as in Example 2. The results are shown in FIG. FIG. 5A shows the results for the ST2245 protein, FIG. 5B shows the results for the natural protein fraction, and FIG. 5C shows the peak for the substrate (glucosamine-6-phosphate). As shown in FIG. 5, the reaction product peaks of the ST2245 protein and the natural protein fraction were detected at the same position. From this, it was shown that ST2245 protein has the same activity as that of the amino sugar phosphate epimerase enzyme present in the microbial cells.

（実施例６）
実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質の温度依存性を評価した。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭグルコサミン−６−リン酸、２μｇのＳＴ２２４５タンパク質からなる酵素反応液１５０μｌを、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５℃で保温し、反応液の酵素活性を評価した。結果を図６に示す。ＳＴ２２４５タンパク質は、８０〜９５℃で非常に高い反応を示した。 (Example 6)
The temperature dependence of the ST2245 protein obtained in step (7) of Example 1 was evaluated.
150 μl of an enzyme reaction solution consisting of 50 mM Tris buffer (pH 7.5), 1 mM MgCl 2 , 1 mM glucosamine-6-phosphate, 2 μg ST2245 protein was added to 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, The temperature was kept at 65, 70, 75, 80, 85, 90 or 95 ° C., and the enzyme activity of the reaction solution was evaluated. The results are shown in FIG. The ST2245 protein showed very high response at 80-95 ° C.

（実施例７）
実施例１の工程（７）で得たＳＴ２２４５タンパク質のｐＨ依存性を評価した。
５０ｍＭ緩衝液、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭグルコサミン−６−リン酸、２μｇのＳＴ２２４５タンパク質からなる酵素反応液１５０μｌを、前記緩衝液としてリン酸バッファーを用いてｐＨ６．０、ｐＨ６．４、ｐＨ６．８、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０に調整し、またはＴｒｉｓ緩衝液を用いてｐＨ６．８、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０に調整し、反応活性を評価した。結果を図７に示す。その結果、図７に示すようにｐＨ７．０からｐＨ８．０程度のｐＨが本酵素の反応を進めるのに最適であることが示された。 (Example 7)
The pH dependence of the ST2245 protein obtained in step (7) of Example 1 was evaluated.
150 μl of an enzyme reaction solution consisting of 50 mM buffer solution, 1 mM MgCl 2 , 1 mM glucosamine-6-phosphate, 2 μg of ST2245 protein was used for the pH 6.0, pH 6.4, pH 6.8, using phosphate buffer as the buffer solution. The reaction activity was adjusted by adjusting pH 7.0, pH 7.5, pH 8.0, or using Tris buffer to pH 6.8, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9.0. . The results are shown in FIG. As a result, as shown in FIG. 7, it was shown that a pH of about 7.0 to pH 8.0 is optimal for proceeding the reaction of this enzyme.

（結果）
本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素によれば、従来生産が困難であったガラクトサミン−６−リン酸を、グルコサミン−６−リン酸からエピメラーゼ活性により、または、ガラクトサミン−１−リン酸からリン酸基分子内転移ムターゼ活性により合成することが可能となった。また、本発明のアミノ糖リン酸の異性化酵素は耐熱性に優れるため、本酵素の至適温度条件では他の酵素が失活する。このため、選択的な酵素反応を行うことができる。 (result)
According to the isomerase of amino sugar phosphate of the present invention, galactosamine-6-phosphate, which has been difficult to produce conventionally, is converted from glucosamine-6-phosphate by epimerase activity or from galactosamine-1-phosphate. It became possible to synthesize by phosphate group intramolecular transfer mutase activity. In addition, since the amino sugar phosphate isomerase of the present invention is excellent in heat resistance, other enzymes are inactivated under the optimum temperature conditions of the enzyme. For this reason, a selective enzyme reaction can be performed.

Claims (12)

スルフォロバス属（genus Sulfolobus）に由来する、アミノ糖リン酸の異性化酵素。   An amino sugar phosphate isomerase derived from the genus Sulfolobus. 前記異性化酵素は、グルコサミン−６−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうる、請求項１記載の異性化酵素。   The isomerase according to claim 1, wherein the isomerase can isomerize glucosamine-6-phosphate to galactosamine-6-phosphate. 配列番号３に記載のアミノ酸配列、または前記配列番号３に記載のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、アミノ糖リン酸の異性化酵素。   An amino sugar phosphorus comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence in which one or more amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted, inserted or added Acid isomerase. 前記異性化酵素は、ガラクトサミン−１−リン酸をガラクトサミン−６−リン酸に異性化しうる、請求項１記載の異性化酵素。   The isomerase according to claim 1, wherein the isomerase can isomerize galactosamine-1-phosphate to galactosamine-6-phosphate. 温度２５〜９８℃で酵素活性を発揮する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の異性化酵素。   The isomerase according to any one of claims 1 to 4, which exhibits enzyme activity at a temperature of 25 to 98 ° C. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の異性化酵素をコードするＤＮＡ。   DNA encoding the isomerase according to any one of claims 1 to 3. 配列番号４記載のＤＮＡ、または配列番号４記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノ糖リン酸異性化活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、ＤＮＡ。   DNA which is hybridized under stringent conditions with DNA of SEQ ID NO: 4 or DNA of SEQ ID NO: 4 and which encodes a protein having amino sugar phosphate isomerization activity. 請求項６または７記載のＤＮＡを発現可能に含む、発現ベクター。   An expression vector comprising the DNA according to claim 6 or 7 in an expressible manner. 請求項８に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入してなる形質転換体。   A transformant obtained by introducing the expression vector according to claim 8 into a host cell. 請求項９に記載の形質転換体を培地中で培養し、
得られた培養物からアミノ糖リン酸異性化活性を有するタンパク質を分離することを特徴とする、アミノ糖リン酸の異性化酵素の製造方法。 Culturing the transformant according to claim 9 in a medium;
A method for producing an amino sugar phosphate isomerase, comprising separating a protein having amino sugar phosphate isomerization activity from the obtained culture. グルコサミン−６−リン酸に、請求項１〜３のいずれか１項、または請求項５に記載の異性化酵素を作用させることを特徴とする、ガラクトサミン−６−リン酸の製造方法。   A method for producing galactosamine-6-phosphate, wherein the isomerase according to any one of claims 1 to 3 or claim 5 is allowed to act on glucosamine-6-phosphate. ガラクトサミン−１−リン酸に、請求項１、４または５に記載の異性化酵素を作用させることを特徴とする、ガラクトサミン−６−リン酸の製造方法。   A method for producing galactosamine-6-phosphate, wherein the isomerase according to claim 1, 4 or 5 is allowed to act on galactosamine-1-phosphate.
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