JP4463884B2 - 免疫不全ウイルス−１型増幅用プライマー - Google Patents
免疫不全ウイルス−１型増幅用プライマー Download PDFInfo
- Publication number
- JP4463884B2 JP4463884B2 JP02956596A JP2956596A JP4463884B2 JP 4463884 B2 JP4463884 B2 JP 4463884B2 JP 02956596 A JP02956596 A JP 02956596A JP 2956596 A JP2956596 A JP 2956596A JP 4463884 B2 JP4463884 B2 JP 4463884B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hiv
- seq
- amplification
- primer
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6823—Release of bound markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measurement Of Length, Angles, Or The Like Using Electric Or Magnetic Means (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は分子生物学及び核酸化学の分野に関する。さらに具体的には、本発明はヒト免疫不全ウイルス−１型（ＨＩＶ−１）の検出のための方法及び試薬に関する。従って本発明は、一般に医療、特に医療診断、及び分子生物学の分野に用途を有する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の特定の配列を増幅するための方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、従来検出できない程少量でサンプル中に存在する核酸の迅速な検出を可能にする（米国特許 No.４，６８３，１９５、 No.４，６８３，２０２及び No.４，９６５，１８８を参照のこと）。増幅された核酸を検出するための好ましい方法は配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによる方法である（Saiki ら、1986, Nature 324 ：163-166 を参照のこと) 。
【０００３】
ＨＩＶ−１核酸の増幅及び検出のためのＰＣＲ及びプローブハイブリダイゼーションの使用は、Kwok, 1992, Ann, Med. 24：211-214 、及び Coutleeら、1991, Mol.Cell.Probes ５：241-259 に総説されている。ＰＣＲに基くＨＩＶ−１の検出測定は、例えば、米国特許 No.５，００８，１８２及び No.５，１７６，７７５、 Kellogg及びKwok, 1990, PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innisら編、Academic Press, サン・ジエゴ, カリフォルニア) : 337-347 並びに Jacksonら、 1991, AIDS ５：1463-1467 に記載されている。さらに、ＨＩＶ−１の増幅及び検出のための試薬が商業的に入手可能である。
【０００４】
ＨＩＶ−１は、異なる個体からの分離株間のみならず、同一の個体から時間を異にして得た分離株間でかなりのゲノム配列多様性を示す。ＨＩＶ−１遺伝子ｇａｇ及びｅｎｖの核酸配列の系統発生分析により、考慮されるコード配列に依存して少なくとも５個のサブタイプが同定されている(Myersら、1993, Human Retrovirus and AIDS 1993, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) 。最も分岐したＨＩＶ−１がアフリカで同定されている。
【０００５】
特に、ＡＮＴ７０及びＭＶＰ５１８０と称する、ＨＩＶ−１の２つの分岐した株が東中央アフリカのカメルーン出身の患者から単離された。これらの分離株のゲノム構成は他のＨＩＶ−１サブタイプに類似するが、有意なヌクレオチド配列の分岐が観察された。これらの分離株の核酸配列は、ＡＮＴ−７０についてはアクセス番号Ｌ２０５８７として、そしてＭＶＰ−５１８０についてはアクセス番号Ｌ２０５７１として入手可能である。これらの新しいサブタイプは従来はサブタイプＯと称されていた。
【０００６】
本発明は、サブタイプＯも含めてヒト免疫不全ウイルス−１型（ＨＩＶ−１）のすべての既知のサブタイプからのｐｏｌ遺伝子の１領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を可能にする改良されたオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。本発明はまた、ハイブリダイゼーションによりＨＩＶ−１の核酸の検出を可能にする改良されたオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００７】
本発明のプライマーの重要な利点は、それらが、非標的配列の同時増幅を伴わないで、サブタイプＯも含めてすべてのＨＩＶ−１サブタイプの増幅を可能にすることである。すなわち、このプライマーは、世界のすべての地域由来のサンプルからのＨＩＶ−１のすべてのサブタイプを検出することができるＨＩＶ−１検出測定を可能にする。
特に、本発明は、ＲＡＲ１０３２（配列番号：１）、ＲＡＲ１０３３（配列番号：２）、ＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）から成る群から選択される、ヒト免疫不全ウイルス−１型（ＨＩＶ−１）の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【０００８】
好ましくは、１対のプライマーはＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）から成る。第二の１対のプライマーは、ＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）から成る。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、本発明のプライマーを用いて増幅される領域内に含まれるＨＩＶ−１ゲノムの領域とハイブリダイズする。このプローブは、１セットのハイブリダイゼーション条件下ですべてのサブタイプからのＨＩＶ−１核酸の特異的検出を可能にする。本発明のプライマーを用いて増幅されたＨＩＶ−１核酸を検出するために使用される場合、プローブの特異性はＨＩＶ−１検出の特異性をさらに増加し、それにより偽陽性 (false positive) の可能性を低下せしめる。
【０００９】
１つの態様において、本発明は塩基７〜３５個を含んで成るＲＡＲ１０３４（配列番号：５）のサブ配列もしくは塩基７〜３５個を含んで成るＲＡＲ１０３７（配列番号：６）のサブ配列、又はこれらの相補体から成る、ヒト免疫不全ウイルス核酸の検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
好ましい態様において、このプローブは、ＲＡＲ１０３４（配列番号：５）、ＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）及びこれらの相補体から成る群から選択され、あるいはＲＡＲ１０３７（配列番号：６）、ＲＡＲ１０３７Ｔ（配列番号：８）及びそれらの相補体から成る群から選択される。
【００１０】
本発明の他の観点は、本発明のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含んで成る、すべてのＨＩＶ−１サブタイプからのｐｏｌ遺伝子の領域を増幅する方法に関する。
本発明の他の観点は、本発明のプライマーを用いてＰＣＲを行い、そして増幅されたＤＮＡを本発明のプローブを用いて検出することを含んで成る、ＨＩＶ−１の検出方法に関する。本発明のプライマー及びプローブは、ＨＩＶ−１核酸の特異的検出のための特に簡単で且つ迅速な方法を可能にする。
本発明の他の観点は、本発明の増幅プライマーを含んで成るキットに関する。これらのキットは、本発明のプローブのごとき追加の試薬を含むことができる。キットはまた、１又は複数の増幅試薬、例えばポリメラーゼ、緩衝剤、及びヌクレオチドトリホスフェートを含むことができる。
【００１１】
本発明の理解を助けるため、次に幾つかの用語を定義する。
「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」なる用語はプライマー、プローブ、及び検出されるべきオリゴマー断片に関し、そしてポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、及びプリンもしくはピリミジン塩基又は修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他の任意のポリヌクレオチドに共通である。「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」なる用語の間に意図する区別は存在せず、そしてこれらの用語は、互換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造にのみ関する。従って、これらの用語は、二本鎖及び単鎖ＤＮＡ、二本鎖及び単鎖ＲＮＡ、並びにＲＮＡとＤＮＡとの二本鎖を包含する。
【００１２】
オリゴヌクレオチドの正確なサイズは多くの因子及びオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途に依存する。オリゴヌクレオチドは任意の適当な方法、例えば適当な配列のクローニング及び制限酵素処理、並びに、Narangら、1979, Meth.Enzymol. 68：90-99 のホスホトリエステル法、 Brownら、1979, Meth.Enzymol. 68：109-151 のホスホジエステル法、Beaucageら、1981, Tetrahedron Lett. 22：1859-1862 のジエチルホスホラミダイト法、並びに米国特許 No.４，４５８，０６６の固体支持体法のごとき方法により直接化学合成される。合成法の総説はGoodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry １(3) : 165-187 に記載されている。
【００１３】
「ハイブリダイゼーション」なる用語は、相補的塩基対合による２本の単鎖核酸による二本鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは完全に相補的な核酸鎖の間、又はわずかな領域のミスマッチを含む「実質的に相補的な」核酸鎖の間で生ずる。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件を「ストリンゼント(stringent) ハイブリダイゼーション条件」又は「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と称する。
【００１４】
実質的に相補的な安定な二本鎖は低いストリンゼントハイブリダイゼーション条件下で達成し得る。核酸技術の分野の当業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃度、イオン強度、及びミスマッチ塩基対の頻度等の多くの変化条件を考慮し、当業界に与えられた指標に従って、二本鎖の安定性を経験的に決定することができる (Sambrookら、1985, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, ニューヨークを参照のこと) 。
【００１５】
一般に、ストリンゼント条件は、定義されたイオン強度及びpHにおいて特定の配列についての熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、塩基対の５０％が解離する温度（定義されたイオン強度及びpHのもとで）である。ハイブリダイゼーション条件のストリンゼンシーの緩和は、配列のミスマッチが耐えられることを許容するであろう。耐えられるミスマッチの程度はハイブリダイゼーションの適当な調整により制御することができる。
【００１６】
「プライマー」なる用語は、適切な緩衝液中適切な温度において、４種類の異なるヌクレオチドトリホスフェート及び重合剤（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で、核酸鎖に対して相補的なプライマー延長生成物の合成が誘導される条件下でＤＮＡ合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドであって、天然のものでも合成品でもよい。プライマーは好ましくは、単鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さはプライマーの意図される用途に依存するが、しかし典型的には１５〜３５ヌクレオチドである。短いプライマー分子は一般に、鋳型との十分に安定なハイブリド複合体を形成するためにはより低い温度を必要とする。
【００１７】
プライマーは鋳型核酸の正確な配列を反映する必要はないが、しかし鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。プライマーは、該プライマーの検出又は固定化を可能にする追加の特徴を含むことができるが、しかしＤＮＡ合成の開始点として作用するという、プライマーの基本的な性質を変更しない。例えば、プライマーは、標的核酸にはハイブリダイズしないが増幅された生成物のクローニングを促進する追加の核酸配列を５′−末端に含有することができる。ハイブリダイズするために鋳型に対して十分に相補的であるプライマーの領域は、この明細書において、ハイブリダイジング領域と称する。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「上流」プライマーとは、その延長生成物がコード配列のサブ配列であるプライマーを意味する。「下流」プライマーとは、その延長生成物が相補的非コード配列のサブ配列であるプライマーを意味する。
本明細書で使用する場合、「プローブ」なる用語は、相補的塩基対合のために標的核酸の配列と共に二本鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは標的核酸の検出又は捕捉のために使用される。プローブは好ましくは単鎖オリゴヌクレオチドである。プローブは典型的には、標的配列のある領域に対応する、好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３５ヌクレオチドから成る「ハイブリダイジング領域」から成るか又はそれを含有するであろう。
【００１９】
「対応する」とは、特定の核酸又はその相補体に対して、少なくとも実質的に相補的であることを意味する。プローブは標的核酸の正確な配列を反映する必要はないが、選択されたハイブリダイゼーション条件下で標的とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。プローブオリゴヌクレオチドは、該プローブの検出又は固定化を許容するがしかしハイブリダイジング領域のハイブリダイゼーション特性を有意に変更しない追加の特徴を含有するか又はそれに結合していてもよい。
【００２０】
例えば、プローブは、放射能標識されたヌクレオチドの導入により、又は別の検出可能な成分への結合により標識されるであろう。
【００２１】
本明細書において使用する場合、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドと非標的配列との間に存在するミスマッチの数より少ない場合、オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは標的配列に対して「特異的」である。存在するミスマッチの数がオリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在するミスマッチの数より多くない場合にのみ安定な二本鎖が形成されるようなハイブリダイゼーション条件を選択することができる。このような条件下で、標的特異的オリゴヌクレオチドは標的配列とのみ安定な二本鎖を形成することができる。すなわち、適当にストリンゼントなハイブリダイゼーション条件下での標的特異的プローブの使用が特異的標的配列の検出を可能にする。同様に、適当にストリンゼントな増幅条件下での標的特異的プライマーの使用が、標的プライマー結合部位を含有する標的配列の特異的増幅を可能にする。
【００２２】
「標的領域」及び「標的核酸」なる用語は、増幅、検出又は分析されるべき核酸の領域を意味する。プライマー又はプローブがそれに対してハイブリダイズする配列を「標的配列」と称することができる。
「熱安定性ポリメラーゼ酵素」なる用語は、熱に対して比較的安定であり、且つ標的配列の核酸鎖の１つに対して相補的なプライマー延長生成物を形成するためのヌクレオシドトリホスフェートの重合を触媒する酵素を意味する。この酵素はプライマーの３′末端において合成を開始し、そして鋳型の５′末端の方向に、合成が停止するまで進行する。精製された熱安定性ポリメラーゼ酵素はさらに十分に米国特許 No.４，８８９，８１８に記載されており、そしてパーキン−エルマー社, Norwalk, CTから市販されている。
【００２３】
「増幅反応混合物」及び「ポリメラーゼ連鎖反応混合物」なる用語は、ポリメラーゼ連鎖反応を行うために適当な試薬の組合せを意味する。反応混合物は典型的には、オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオチドトリホスフェート、及びＤＮＡポリメラーゼ（適当な緩衝液中）から成る。好ましい反応混合物は実施例に記載されている。
所与の核酸の「相補体」なる用語は特に、該所与の核酸と同じ長さを有し、且つ完全に相補的である核酸を意味する。従って、核酸の相補体は単一の一義的に定義された配列を意味する。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「サブ配列」なる用語は、第二配列中に含まれる配列を意味する。本明細書において定義されそして使用される場合、サブ配列はその範囲に全長配列を包含するものと意図される。従って、例えば、配列番号：５のサブ配列から成るプローブは、配列番号：５であるプローブを包含する。
当業界の技術レベル内にある分子生物学及び核酸化学の常用技法は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrookら、1985, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, ニューヨーク；Oligonucleotide Synthesis (MJ.Gait編、1984) ; Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及びS.J.Higgis編、1984) ; 並びに一連のMethods in Enzymology(Academic Press, Inc.) を参照のこと。
【００２５】
ＨＩＶ増幅プライマー
ＨＩＶ−１サブタイプ間の高度な配列多様性が、すべてのサブタイプ配列に正確に相補的であるプライマーを使用してのＨＩＶ−１核酸の増幅を妨げる。比較的保存された領域でさえなお、有意な配列多様性を含む。本発明のプライマーは、プライマーハイブリダイジング領域中に存在する配列多様性にも拘らずすべてのＨＩＶ−１サブタイプの増幅を可能にする。
【００２６】
本発明のプライマーは、増幅において順応されなければならない多様性を最小にするｐｏｌ遺伝子中の比較的保存された領域にハイブリダイズする。本発明のプライマーは、ＨＩＶ−１サブタイプのそれぞれと１〜５個ミスマッチを含有する。実施例に記載するように、増幅は５塩基対以下のミスマッチを許容する条件下で行われ、そしてそれ故にすべてのＨＩＶ−１サブタイプの増幅を可能にする。すなわち、本発明のプライマーは既知ＨＩＶ−１サブタイプからのｐｏｌ遺伝子核酸の特異的増幅を可能にする。
【００２７】
一般に、プライマー延長部位であるプライマーの３′末端のミスマッチは、３′末端から離れて存在する塩基対ミスマッチよりも、プライマー延長により大きな影響を与える。しかしながら、塩基対ミスマッチの脱安定化効果は関与する塩基に依存し、チミジンが関与するミスマッチが最も少なく脱安定化する (Kwokら、 1990, Nuc.Acids Res. 18：999-1005を参照のこと) 。プライマーの３′末端における脱安定化効果を最小にするため、各プライマーは３′末端にチミジンを含有する。従って、本発明のプライマーは、プライマーの重大な３′末端塩基において偶然に異なる新しいＨＩＶ−１分離株を増幅する。
【００２８】
脱安定化する塩基対ミスマッチの効果はまた、プライマーの長さに依存する。プライマーが長くなるに従って１個のミスマッチによる影響が少ない。３２〜３３塩基長を有する本発明のプライマーを用いて、新たなＨＩＶ−１分離株中に予想されるわずかな配列多様性に順応することができるが、他の生物由来の相同性の低い配列を増幅しない。
５′から３′の方向に示すプライマーの配列を表１に記載する。
【００２９】
【表１】
【００３０】
上流プライマーＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及び下流プライマーＲＡＲ１０３３（配列番号：２）は、ＨＩＶ−１参照株ＨＸＢ２(GenBankアクセス番号Ｋ０３４５５）の配列のヌクレオチド位置２９５９〜３１２８に対応する１７０塩基対の生成物を増幅する。上流プライマーＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及び下流プライマーＲＡＲ１０３６（配列番号：４）はヌクレオチド位置４７５０−４９９０に対応する２４１塩基対の生成物を増幅する。
【００３１】
プライマーのハイブリダイゼーション特異性は、他のウイルス又はヒトのゲノムＤＮＡからのホモロガス (homologous) な非標的配列の同時的増幅を伴わないで既知のＨＩＶ−１サブタイプの増幅を可能にするプライマーの必須の性質である。プライマーのハイブリダイゼーション特異性はハイブリダイジング領域の正確な長さ及び塩基組成に依存するので、プライマーのハイブリダイジング領域の配列のわずかな修飾がプライマーの有用性に不都合な影響を与える可能性がある。
【００３２】
要するに、プライマーのハイブリダイジング領域は表１に示す配列から成らなければならない。しかしながら、当業者は、ある種の特定のわずかな修飾、例えば５′末端における１個の塩基の除去又は付加は、ハイブリダイゼーション特異性及び有用性に有意な影響を与えることなく可能であろう。このような修飾は典型的には日常的態様でのハイブリダイゼーションの最適化を必要とするであろう。ハイブリダイゼーション特異性を検知できる程変えることなく変更されたプライマーは同等であると考えられる。
【００３３】
増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法は当業界においてよく知られており、そして米国特許 No.４，６８３，１９５及び No.４，６８３，２０２； Saikiら、1988, Science 239 ：487 ; Scharfら、 1988, Hum.Immunol. 22：61；並びにScharfら、 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6215に記載されている。 Perkin Elmer, Norwalk, CTのごとき商業的提供者がＰＣＲ試薬を販売しており、そしてＰＣＲ法を発行している。本発明により提供される利点の理解を容易にするため、ＰＣＲの概要を記載する。
【００３４】
ＰＣＲ増幅の各サイクルにおいて、二本鎖標的配列を変性し、変性された標的の各鎖にプライマーをアニールさせ、そしてプライマーをＤＮＡポリメラーゼの作用によりプライマーを延長せしめる。工程を典型的には２５〜４０回反復する。２つのプライマーは、標的核酸配列の相対する端に、そして各プライマーの延長生成物が標的配列の相補的コピーであり且つその相補体から分離された場合に他方のプライマーとハイブリダイズすることができる配向でアニールされる。各サンプルは、もしそれが１００％有効であれば、存在する標的配列の数の倍化をもたらすであろう。
【００３５】
ＰＣＲのために適当な種々の適当なサンプル調製法は文献に記載されている。使用される特定の方法は本発明の本質的な部分ではない。当業者は既知のサンプル調製法に使用するための反応条件を最適化することができる。ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの検出に使用するための好ましいサンプル調製法は、Casareale ら、1992, PCR Methods and Applications 2：149-153 に記載されている。
【００３６】
本発明の方法は、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ又はＨＩＶ−１ ＲＮＡを検出するために使用することができる。逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いるＲＮＡの増幅はよく知られており、そして米国特許 No.５，３２２，７７０及び No.５，３１０，６５２； Myers及びGelfand, 1991, Biochemistry 30 (31): 7661-7666 ; Youngら、1993, J.Clin.Microbiol. 31 (4)：882-886 ；並びにMulderら、1994, J.Clin.Microbiol. 32 (2)：292-300 に記載されている。
【００３７】
ＰＣＲ法により大きな増幅が可能であるため、ポジティブ対照鋳型である高いＤＮＡレベルを含むサンプルからの、又は予備増幅からの低レベルのＤＮＡの持込みが、目的とする添付された鋳型ＤＮＡの非存在下でもＰＣＲ生成物をもたらす場合がある。可能であれば、すべての反応混合物は、ＰＣＲ生成物の分析及びサンプルの調製とは別の場所で用意する。ＲＮＡ／ＤＮＡの調製、反応混合、及びサンプルの分析のための犠牲にされる又は使捨て容器、溶液及びピペット（好ましくはポジティブ置換ピペット）の使用が汚染を最小にするであろう。さらに、Kwok及びHiguchi, 1989, Nature 339 ：237-238 ；並びにKwok及び Orrago, Innisら編、1990 PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. San Diego, CAを参照のこと。
【００３８】
予備反応からの増幅された核酸によるＰＣＲの汚染の問題を減少させるための酵素的方法は、ＰＣＴ特許出願公開 No.ＷＯ９２／０１８１４（出願番号ＵＳ９１／０５２１０）及び米国特許 No.５，０３５，９９６に記載されている。これらの方法は、予備反応からのすべての増幅されたＤＮＡの酵素的分解を可能にする。ＰＣＲ増幅は、ｄＴＴＰではなくｄＵＴＰの存在下で行われる。ウラシルを含有する得られる二本鎖増幅生成物はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）による分解にかけられ、他方正常のチミジン含有ＤＮＡはＵＮＧにより分解されない。
【００３９】
標的として役立つかも知れないウラシル含有ＤＮＡを分解するために、増幅の前に増幅反応生成物をＵＮＧにより処理する。ウラシル含有ＤＮＡの唯一の源は予備反応の増幅された生成物であるから、この方法は、予備反応からの汚染の問題（持ち込み）を効果的に除去する。ＵＮＧは熱により臨時に不活性化されるので、増幅法における変性段階もＵＮＧの不活性化に役立つ。従って、新しい増幅生成物は、ウラシルを含むが、ＵＮＧが不活性化された環境において生成され、そして分解されない。
【００４０】
増幅反応混合物は、典型的には、プライマーハイブリダイゼーション特異性を確実にするために必要な温度より十分に低い室温において一緒にされる。室温においてはプライマーが非特異的に他の部分的にのみ相補的な核酸配列に結合し、そして不所望の核酸配列の合成を開始するので、非特異的増幅が生ずるであろう。これらの新たに合成された不所望の配列は、増幅反応の間に目的とする標的配列と競争することができ、そして所望の配列の増幅効率を有意に低下せしめるであろう。非特異的増幅は「ホット−スタート」法を用いて減少させることができ、この方法においては、必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するのに十分なだけ温度が上昇するまで、１又は複数の試薬を反応混合物から排除しておく。
【００４１】
非特異的増幅を減少させるための好ましい方法は、ＷＯ９２／０１８１４に記載されている。そこに記載されている方法は、反応混合物が配合された後であるが増幅反応の開始前に新たに合成された核酸を分解することにより、非特異的増幅を減少せしめる。新たに合成されたすべての核酸を分解することにより、高温増幅反応が行われる際、意図しない配列にハイブリダイズしたプライマーから生ずる増幅可能な核酸標的配列は存在しない。新たに合成された核酸の分解は反応混合物にｄＵＴＰ及びＵＮＧを導入し、そして増幅反応を行う前に反応混合物を４５〜６０℃でインキュベートすることにより達成される。
【００４２】
増幅された生成物の分析
増幅に続き、ＨＩＶ−１核酸の存在を、増幅された生成物の検出により決定する。ＰＣＲ増幅された核酸を検出するための方法は当業界においてよく知られている。例えば、増幅された生成物の存在及び量はゲル電気泳動を用いて測定することができる。ゲル電気泳動による増幅生成物の検出は当業界においてよく知られている（例えば、Sambrookら、１９８５、前掲を参照のこと）。
【００４３】
増幅された生成物の検出は好ましくはオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより行われる。表１のプライマーを用いて増幅されたＤＮＡを検出するために使用される本発明のプローブは、下の表２に示す。各プローブの成分は本明細書に記載する方法において有用である。好ましいハイブリダイゼーション条件は実施例に記載する。
【００４４】
【表２】
【００４５】
ＲＡＲ１０３４（配列番号：５）はＨＩＶ−１ゲノムに位置２９９６−３０３０においてハイブリダイズし、そしてプライマーＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）を用いて増幅されたＤＮＡを検出するために使用される。ＲＡＲ１０３７（配列番号：６）はＨＩＶ−１ゲノムに位置４９０８−４９４２においてハイブリダイズし、そしてプライマーＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）を用いて増幅されたＤＮＡを検出するために使用される。
【００４６】
ＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）はＲＡＲ１０３４（配列番号：５）から、５′末端の６塩基が除去されている点において異なる。全長プローブ及び末端が除去されたプローブの両者は下記及び実施例６に記載の５′−ヌクレアーゼ測定においてよく機能するが、ＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）が好ましい。同様に、ＲＡＲ１０３７（配列番号：６）から５′末端の６塩基が除去されている点において異なるＲＡＲ１０３７Ｔ（配列番号：８）は、下記及び実施例６に記載の５′−ヌクレアーゼ測定での使用のために好ましい。
【００４７】
従って、全長プローブＲＡＲ１０３４（配列番号：５）及びＲＡＲ１０３７（配列番号：６）は実施例１〜３に記載のマイクロウエルプレート測定において使用するのに好ましく、そして５′末端において６塩基除去された全長配列ＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）及びＲＡＲ１０３７Ｔ（配列番号：８）から成るプローブは、実施例６に記載の５′ヌクレアーゼ測定における使用のために好ましい。さらに、５′末端において１〜５塩基が除去された全長配列から成るプローブもまた本発明の方法において適当である。従って、本発明のプローブは全長プローブＲＡＲ１０３４（配列番号：５）又はＲＡＲ１０３７（配列番号：６）のサブ配列から成り、ここでサブ配列は前記配列の塩基７〜３５個又はその相補体を含んで成る。プローブの番号は５′末端に関連する。
【００４８】
プライマーと同様に、本発明のプローブはＨＩＶ−１サブタイプのそれぞれにつき少数個のミスマッチ（それぞれ１〜５、及び１〜４）を含有する。実施例に記載するハイブリダイゼーション条件は、他の生物からの相同性の少ない配列とのハイブリダイゼーションを許容することなく、任意のＨＩＶ−１サブタイプへのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。従って、本発明のプローブは、ＨＩＶ−１核酸の特異的検出を可能にする。
サンプル中の標的核酸配列とプローブとの間に形成されたハイブリドを検出するために適当な測定方式は当業界において知られている（Sambrookら、１９８５、前掲を参照のこと）。実施例はドット−ブロット測定方式及び逆ドット−ブロット測定方式を包含する。
【００４９】
ドット−ブロット方式においては、増幅された標的ＤＮＡを固体支持体、例えばナイロン膜に固定化する。膜−標的複合体を適当なハイブリダイゼーション条件下で、ラベルされたプローブと共にインキュベートし、ハイブリダイズしないプローブを適当なストリンゼント条件下で洗浄することにより除去し、そして膜を結合したプローブの存在についてモニターする。
【００５０】
他の方式は「逆」ドット−ブロット方式であり、この方法においては増幅された標的ＤＮＡをラベルし、そしてプローブを固体支持体、例えばナイロン膜に固定化する(Saikiら、 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230、及びＰＣＴ出願 No.ＷＯ８９／１１５４８を参照のこと）。標的ＤＮＡは典型的には増幅の間に、ラベルされたプライマーの導入によりラベルされる。プライマーの一方又は両方をラベルすることができる。膜−プローブ複合体を適当なハイブリダイゼーション条件下で、ラベルされ増幅された標的ＤＮＡと共にインキュベートし、適当なストリンゼント条件下で洗浄することによりハイブリダイズしていない標的ＤＮＡを除去し、そして次にフィルターを、結合した標的ＤＮＡの存在についてモニターする。
【００５１】
あるいは、多数のプローブハイブリダイゼーション部位又はウエルを有する固体支持体を用いて逆ドット−ブロット測定を行うことができる。例えば、本発明の大規模臨床適用においてはマイクロウエルプレートが特に有用である。プローブはマイクロウエルプレートに、受動結合により、あるいはマイクロウエルプレートに付着する蛋白質中間体例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を介して固定化することができる。マイクロウエルプレート中で行われる逆ドット−ブロット法は米国特許 No.５，２３２，８２９、 Loeffelholzら、1992, J.Clin.Microbiol. 30 (11): 2847-2851, Mulderら、1994、前掲、及び Jacksonら、1991, 前掲に記載されている。
【００５２】
検出のためにハイブリダイゼーション二本鎖を固定化するための他の方法においては、ＢＳＡに結合したプローブを磁性微粒子に結合せしめる。結合したプローブを溶液中でラベル化増幅生成物にハイブリダイズせしめる。ハイブリダイゼーションに続き、プローブ−標的二本鎖を溶液から磁気的に除去し、そして次に磁気的に固定化されたハイブリダイゼーション二本鎖を前記の方法のようにして検出する。
【００５３】
５′−ヌクレアーゼ測定法と称する他の適当な測定法は米国特許 No.５，２１０，０１５に記載されており、この方法においては、ラベルされた検出プローブがＰＣＲ増幅工程中に添加される。このプローブは、該プローブがＤＮＡ合成のためのプライマーとして働かないように修飾されている。各合成段階、すなわちプライマー延長の間に標的ＤＮＡにハイブリダイズする任意のプローブが、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性により分解される。次に、プローブからの分解生成物を検出する。従って、プローブ分解生成物の存在が、プローブと標的ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションが生じたこと、及び増幅反応が生じたこと、の両方を示す。米国特許 No.５，２１０，０１５の方法において機能するように修飾された表２のプローブは本発明の範囲内にある。
【００５４】
上記の測定方式は典型的には、ハイブリド二本鎖の検出を促進するためにラベルされたオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段により検出可能なラベルの導入によりラベルすることができる。有用なラベルには32Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡＳにおいて一般に使用される）、ビオチン又はハプテン及び、それに対して抗血清又はモノクローナル抗体が入手可能な蛋白質が含まれる。本発明のラベルされたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成について上に記載した技法を用いて合成し又はラベルすることができる。
【００５５】
本発明の好ましい態様においては、逆ドット−ブロット測定はマイクロウエルプレートを用いて行われ、そしてプライマーはビオチンによりラベルされる (Levenson及びChang, 1989, PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications (Innisら編、Academic Press, サンジエゴ) 99-112頁に記載されているように）。プローブはＢＳＡに結合させ（Tungら、 1991, Bioconjugate Chem. ２：464-465)、そしてマイクロウエルプレートに固定化する。ラベルされたプライマーを用いての増幅及び固定化されたプローブとのハイブリダイゼーションの後、増幅された核酸はまず、ビオチンをアビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ（Ａ−ＨＲＰ）又はストレプトアビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）に結合せしめ、次にこれを反応の実施により検出することにより検出する。この反応においてはＨＲＰが色原体の変色を触媒する(Saikiら、１９８９、前掲を参照のこと）。
【００５６】
反応混合物中の二本鎖ＤＮＡの全量の増加をモニターすることによりＨＩＶ−１核酸の増幅を検出する他の方法は、 Higuchiら、1992 Bio／Technology 10：413-417 ; Higuchiら、 1993, Bio／Technology 11：1023-1030 ；並びにヨーロッパ特許出願公開 No.４８７，２１８及び No.５１２，３３４に記載されている。二本鎖標的ＤＮＡの検出は、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）及び他のＤＮＡ結合ラベルが二本鎖ＤＮＡに結合した際に示す蛍光の増加に頼っている。標的配列の合成から生ずる二本鎖ＤＮＡの増加が蛍光を増加せしめる。本発明のプライマーは、極めて低レベルのバックグラウンド非特異的増幅生成物を伴って増幅を可能にするので、特に有用である。
【００５７】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための有用な構成成分を含んで成るキット、すなわち多容器ユニットに関する。有用なキットはＨＩＶ−１核酸のＰＣＲ増幅のためのプライマーを含むことができる。キットはさらに、増幅されたＨＩＶ−１核酸を検出するための手段、例えばオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。幾つかのケースにおいては、プローブは適当な支持体膜に固定される。キットの他の任意成分には、例えば、プライマー延長生成物の合成を触媒する試薬、基質ヌクレオシドトリホスフェート、ラベルするために使用される手段（例えば、アビジン−酵素結合体及び酵素基質、並びにラベルがビオチンである場合には色原体）、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション反応のための適当な緩衝液、並びに本発明の方法を実施するための指示書を含むことができる。
【００５８】
【実施例】
下記に提示する本発明の実施例は例示のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１．ＨＩＶ−１ ＤＮＡの増幅及び検出
後の実施例に記載するような臨床サンプルからのＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの増幅及び検出のために次の方法を用いた。
【００５９】
サンプルの調製
第一の方法においては、Boyum, 1968, Scan. J.Clin.Lab.Invert. 21 (Suppl.97) : 77、及びFotinoら、1971, Ann.Clin.Lab.Sci. １：131-133 に記載されている標準的Ficoll-Hypaque密度勾配法により末梢血単球を単離した。
第二の方法においては、 Casarealeら、 1992, PCR Methods and Applications ２：149-153 に記載されているようにして直接赤血球溶解により０．５mlの末梢血から白血球細胞を単離した。
細胞の単離に続き、 Casarealeら、1992、前掲；並びに Butcher及び Spadoro, 1992, Clin.Immunol.Newsletter 12：73-76 に記載されているようにしてＤＮＡを抽出した。
【００６０】
増幅
プライマーＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）を用いる増幅を１００μｌの反応体積（サンプルから５０μｌ）中で行った。各反応は次の試薬を含有した。
１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．４）
５０mM ＫＣｌ
２００μＭ 各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ
３．０mM ＭｇＣｌ2
１０％ グリセロール
２．０ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ* 、及び
２．０ユニットのＵＮＧ*
* ホフマン−ラ．ロシュ社により開発及び製造され、そしてパーキン・エルマー, Norwalk, CT, により販売されている。
【００６１】
プライマーＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）を用いる増幅は、反応が２．０mM ＭｇＣｌ2 を含有する点を除き、本質的に同一の条件下で行った。
増幅は、次の温度プロフィールを用いてＴＣ９６００ ＤＮＡ熱サイクラー（パーキン・エルマー, Norwalk, CT）において行われた。
【００６２】
温度サイクルに続き、反応混合物を好ましくはすぐに分析する。分析の前に反応混合物を７２℃にて短時間保持することができる。あるいは、ＰＣＲチューブを−２０℃で貯蔵し、そして開封前に短時間２５℃〜３０℃に加温することができる。
【００６３】
増幅された生成物の検出
Ａ．ゲル電気泳動
増幅された生成物は次のようにしてゲル電気泳動により検出された。反応生成物を、アガロースゲル（１００mlの３％ NuSieve及び０．５％ Seachem) 及び１×ＴＥ（０．０８９Ｍ Ｔｒｉｓ、０．０８９Ｍ硼酸、０．００２５Ｍ ＥＤＴＡ二ナトリウム）ランニング緩衝液を用いて分画した。電気泳動は１００ボルトにて約１時間行った。電気泳動に続き臭化エチジウム（０．５μｇ／ml）を加えて存在するすべてのＤＮＡを染色する。ゲルを水中で短時間脱色し、そして臭化エチジウムで染色したＤＮＡをＵＶ照射により可視化した。
【００６４】
Ｂ．プローブハイブリダイゼーション
増幅された生成物を、マイクロウエルプレートに固定化したプローブを用いる逆ドット−ブロット形式で測定した。この検出方式においては、プローブをマイクロウエルプレートのウエルに固定化し、そして変性した増幅された標的ＤＮＡを結合したプローブにハイブリダイズせしめた。上記の増幅をビオチン化されたプライマーを用いて行い、結合したプローブにハイブリダイズする増幅されたＤＮＡの検出を可能にした。
増幅されたＤＮＡは、各ＰＣＲチューブに同体積の変性溶液（０．４Ｍ ＮａＯＨ、８０mM ＥＤＴＡ及び０．００５％チモールブルー）を添加することにより変性した。
【００６５】
プローブをマイクロウエルプレートに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中間体を介して固定化した。ＢＳＡに結合したプローブを９６ウエルプレート(Corning, コーニング, ニューヨーク）の各ウエルのプラスチック表面に吸着せしめた。プローブは１５ng／ウエルの濃度でマイクロウエルプレート上に固定化した。
あるいは、プローブは次のようにしてマイクロウエルプレートのプラスチック表面上に受動的に固定化することができる。０．１２５ng／μｌの濃度でプローブを含有する１Ｍ ＣＨ3 ＣＯＯＮＨ4 の溶液１００μｌをマイクロウエルプレートの各ウエルに添加する。プレートを３７℃にて１０〜２０時間（一夜）インキュベートし、そして次にＰＢＳ／ＥＤＴＡ（ＰＢＳは２．６８mM ＫＣｌ、１３７mM ＮａＣｌ、１．４７mM ＫＨ2 ＰＯ4 、及び８．０３mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）ですすぐ。
【００６６】
適当な数の８ウエル・マイクロウエルストリップ（最少２ストリップ）を取り出し、そしてマイクロウエルプレートのフレームに入れた。１００μｌのハイブリダイゼーション／中和緩衝液（２．５Ｍ ＮａＳＣＮ、８０mM ＮａＨ2 ＳＯ4 、１０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 及び０．１２５％ Ｔｗｅｅｎ２０；pH５．０±０．２）をマイクロウエルプレートの各ウエルにピペットに加えた。多チャンネルピペッターと共に栓をしたチップを用いて、トレイ中各ＰＣＲチューブからの変性された増幅反応混合物２５μｌをマイクロウエルプレート中の対応するウエル位置にピペットした。プレートをマイクロウエルプレートのふたにより覆い、そして色が青から明黄色に変化するまで約１０〜１５回、側をかるくたたいた。
【００６７】
プレートを６０分間３７℃にてインキュベートしてハイブリダイゼーションさせた。インキュベーションの後、プレートを１×洗浄溶液により５回洗浄した。１０×濃度の洗浄溶液は９．９４ｇ／Ｌリン酸二塩基性ナトリウム、４．４１ｇ／Ｌリン酸ナトリウム（一塩基性）、３．７２２ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、８７．６６ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１３．７ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ２０、及び１０ｇ／Ｌ Pro Clin 300 (Rhom and Haas, フィラデルフィア, PA) を含有する。溶液のpHをリン酸により調整する（pH６．５−７．１が好ましい）。プレートの洗浄は手動で、又はプログラムされた自動化マイクロウエルプレート洗浄機を用いて行うことができる。
【００６８】
手動洗浄のためには、プレートの内容物を空にし、かるくたたいて乾かす。各ウエルを洗浄溶液（４００〜４５０μｌ）で満たし、プレートを３０秒間浸漬し、そしてプレートを再度空にし、そしてかるくたたいて乾かす。この洗浄液をさらに４回反復する。
自動化されたマイクロプレート洗浄機については、次の手順を用いる。ウエルの内容物を吸引除去する。試験すべきプレートの各ウエルに３５０〜４５０μｌの洗浄溶液を加え、３０秒間浸漬し、そして吸引除去するように洗浄機をプログラムする。段階をさらに４回反復する。次にプレートをかるくたたいて乾かす。
【００６９】
１００μｌのアビジン−ＨＲＰ結合体（多くの提供者、例えば Fluka Chemical Corp. Ronkonkoma, ニューヨーク；及び Sigma Chemical Co. セントルイス, MOから得られる）をプレートの各ウエルに加えた。プレートを覆い、そて３７℃にて１５分間インキュベートし、そして上記のようにして再度洗浄した。テトラメチルベンザジン（多くの提供者、例えば Fluka Chemical Corp. Ronkonkoma, ニューヨーク；及び Sigma Chemical Co. セントルイス, MOから入手可能）及びＨ2 Ｏ2 を含有する色原体溶液１００μｌを、プレートの各ウエルに加える。次に、プレートを覆い、そして室温（２０℃〜２５℃）にて１０分間暗所にインキュベートすることにより発色させた。最後に、１００μｌの停止試薬（５％Ｈ2 ＳＯ4 ）を各ウエルに加えた。４５０nMの各ウエルの吸光度を停止試薬を添加して１時間以内に読み取る。
【００７０】
実施例２．臨床サンプル中のＨＩＶ ＤＮＡの検出
この実施例においては、アフリカ象牙海岸からの血清陽性患者から得られた９１サンプルをＨＩＶ ＤＮＡの存在について測定した。比較のため、増幅及び検出も文献に記載されているプライマー及びプローブを用いて行った。
末梢血単球を実施例１に記載したFicoll-Hypaque密度勾配法により単離した。増幅及び検出は、実施例１に記載されているようにして、プライマー対ＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）並びにプローブＲＡＲ１０３４（配列番号：５）を用いて、並びにプライマー対ＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）並びにＲＡＲ１０３７（配列番号：６）を用いて行った。
【００７１】
比較のため、別々の増幅／検出測定を、文献に記載されている２つの追加のプライマー／プローブを用いて行った。プライマーＳＫ４６２及びＳＫ４３１、並びにプローブＳＫ１０２は Jacksonら、前掲、に記載されている。プライマーＳＫ３８及びＳＫ３９、並びにＳＫ１９は Kellogg及びKwok, １９００、前掲、に記載されている。。プライマー対ＳＫ４６２／ＳＫ４３１、及びＳＫ３８／ＳＫ３９を用いる増幅は本質的に実施例１に記載した方法により行ったが、次の条件を用いた。
【００７２】
反応混合物は次の試薬を含有した。
１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．４）
５０mM ＫＣｌ
２００mM 各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ
２５pmole の各ビオチン化プライマー
３．７５mM ＭｇＣｌ2
１０％ グリセロール
２．０ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ* 、及び
２．０ユニットのＵＮＧ*
* ホフマン−ラ ロシュにより開発及び製造され、そしてパーキン・エルマー, Norwalk, CTにより販売されている。
【００７３】
増幅は、次の温度プロフィールを用いてＴＣ９６００ ＤＮＡ熱サイクラー（パーキン・エルマー, Norwalk, CT）において行われた。
プライマー及びプローブのセットを比較した結果を、測定した各サブタイプの合計数に対するＨＩＶ−１が検出されたサンプルの数、及び検出された対応する％を下記の表に示す。
【００７４】
【表３】
【００７５】
本発明の両測定法は、試験したサンプルのほとんどすべてからＨＩＶ−１を検出することができた。これに対して、プライマー対ＳＫ４６２及びＳＫ４３１並びにプローブＳＫ１０２を用いた測定法、並びにプライマー対ＳＫ３８及びＳＫ３９並びにＳＫ１９を用いた測定法は、サンプルの多くからＨＩＶ−１ ＤＮＡを検出しなかった。本発明のプライマー及びプローブを用いて検出できない１個のサンプルはＳＫプライマー及びプローブを用いても検出できなかった。このサンプルからＨＩＶ−１が検出できなかった理由は、低いサンプルの品質又は異常に低いウイルスタイターのためであろう。
【００７６】
実施例３．臨床サンプル中のＨＩＶの検出
この実施例においては、４１個のサンプルをＨＩＶ−１ ＤＮＡの存在について測定した。サンプルはアフリカ象牙海岸の血清陽性患者から得た。
実施例１に記載した直接赤血球溶解法により、０．５mlの末梢血から白血球を単離した。増幅反応及び検出測定は実施例１並びに２に記載したようにして行った。結果を、測定した各サブタイプの合計数に対するＨＩＶ−１が検出されたサンプル数、及び検出された対応する％として下記の表に示す。
【００７７】
【表４】
【００７８】
実施例４．既知のＨＩＶ−１サブタイプの増幅及び検出
既知ＨＩＶ−１サブタイプからの合計１８個のＤＮＡ排出物を、実質的に実施例１〜３に記載したようにして測定した。サブタイプＡ〜ＦからのＤＮＡを臨床サンプルから得た。サブタイプＯからのＤＮＡを感染したセルラインから得た。すべてのＤＮＡサンプルを実質的に Casarealeら、１９９２、前掲、に記載されているようにして、プロテイナーゼＫ溶液を用いて抽出した。
結果を、測定した各サブタイプの合計数に対するＨＩＶ−１が検出された各サブタイプのサンプル数として下記の表に示す。
【００７９】
【表５】
【００８０】
プライマー対ＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）並びににプローブＲＡＲ１０３４（配列番号：５）を用いて測定された１８個のＨＩＶ−１サンプルのすべてからＨＩＶ−１が検出された。これに対して、プライマー対ＳＫ４６２及びＳＫ４３１並びにプローブＳＫ１０２を用いた測定、並びにプライマー対ＳＫ３８及びＳＫ３９並びにプローブＳＫ１９を用いた測定においては、ＨＩＶ−１サブタイプＯのＤＮＡの検出に失敗した。さらに、プライマー対ＳＫ４６２及びＳＫ４３１並びにプローブＳＫ１０２を用いた測定においては、サンプルの１つからのＨＩＶ−１サブタイプＥの検出に失敗した。プライマー対ＳＫ３８及びＳＫ３９並びにプローブＳＫ１９を用いた測定においては、２個のサンプルからのＨＩＶ−１サブタイプＥの検出に失敗し、そしてＨＩＶ−１サブタイプＦの検出に失敗した。
【００８１】
実施例５．ＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出
ＨＩＶ−１ ＲＮＡはGeneAmp(登録商標）ＥＺｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＴキット（パーキン・エルマー社, Norwalk, CT）を用いて増幅することができる。サンプルの調製は、Mulderら、１９９４、前掲、に記載されているようにして行う。増幅された生成物の検出は実施例１に記載したようにして行う。
【００８２】
実施例６．５′−エキソヌクレアーゼ測定法
この実施例は、米国特許 No.５，２１０，０１５に記載の方法における本発明のプライマー及びプローブの使用について記載する。プローブがＤＮＡ合成のためにプライマーとして作用しないように修飾したラベルされたプローブを、ＰＣＲ増幅工程の間に添加した。ＨＩＶ−１ ＤＮＡにハイブリダイズしたすべてのプローブを、増幅の間にｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性により分解した。分解されたプローブの検出がＨＩＶ−１ ＤＮＡの存在を示した。
【００８３】
使用したプローブは、５′末端に結合したＦＡＭラベル（Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) 及びＤＮＡポリメラーゼによる延長をブロックするために３′−ＯＨの代りに３′−ＰＯ4 を有する合成されたＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）の相補体であった。
ＨＩＶ−１ ＤＮＡを含有するサンプルは前記のようにして調製した。反応は、下記の試薬を含有する１００μｌの体積中で行った。
【００８４】
５０mM トリシン（Tricine)（pH８．２）
１１０mM ＫＯＡｃ
３００μＭ 各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ
５００μＭ 各ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰ
５０pmole の各プライマー
１００pmole プローブ
２．４mM Ｍｎ（ＡＯｃ)2
１２％ グリセロール
２ユニットＵＮＧ* 、及び
２０ユニットのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ*
* ホフマン−ラ ロシュ社により開発及び製造され、そしてパーキン・エルマー社, Norwalk, CTにより販売されている。
分解されたプローブの検出は米国特許 No.５，２１０，０１５に記載されている方法を用いて行うことができる。
【００８５】
【配列表】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【発明の属する技術分野】
本発明は分子生物学及び核酸化学の分野に関する。さらに具体的には、本発明はヒト免疫不全ウイルス−１型（ＨＩＶ−１）の検出のための方法及び試薬に関する。従って本発明は、一般に医療、特に医療診断、及び分子生物学の分野に用途を有する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の特定の配列を増幅するための方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、従来検出できない程少量でサンプル中に存在する核酸の迅速な検出を可能にする（米国特許 No.４，６８３，１９５、 No.４，６８３，２０２及び No.４，９６５，１８８を参照のこと）。増幅された核酸を検出するための好ましい方法は配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによる方法である（Saiki ら、1986, Nature 324 ：163-166 を参照のこと) 。
【０００３】
ＨＩＶ−１核酸の増幅及び検出のためのＰＣＲ及びプローブハイブリダイゼーションの使用は、Kwok, 1992, Ann, Med. 24：211-214 、及び Coutleeら、1991, Mol.Cell.Probes ５：241-259 に総説されている。ＰＣＲに基くＨＩＶ−１の検出測定は、例えば、米国特許 No.５，００８，１８２及び No.５，１７６，７７５、 Kellogg及びKwok, 1990, PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innisら編、Academic Press, サン・ジエゴ, カリフォルニア) : 337-347 並びに Jacksonら、 1991, AIDS ５：1463-1467 に記載されている。さらに、ＨＩＶ−１の増幅及び検出のための試薬が商業的に入手可能である。
【０００４】
ＨＩＶ−１は、異なる個体からの分離株間のみならず、同一の個体から時間を異にして得た分離株間でかなりのゲノム配列多様性を示す。ＨＩＶ−１遺伝子ｇａｇ及びｅｎｖの核酸配列の系統発生分析により、考慮されるコード配列に依存して少なくとも５個のサブタイプが同定されている(Myersら、1993, Human Retrovirus and AIDS 1993, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) 。最も分岐したＨＩＶ−１がアフリカで同定されている。
【０００５】
特に、ＡＮＴ７０及びＭＶＰ５１８０と称する、ＨＩＶ−１の２つの分岐した株が東中央アフリカのカメルーン出身の患者から単離された。これらの分離株のゲノム構成は他のＨＩＶ−１サブタイプに類似するが、有意なヌクレオチド配列の分岐が観察された。これらの分離株の核酸配列は、ＡＮＴ−７０についてはアクセス番号Ｌ２０５８７として、そしてＭＶＰ−５１８０についてはアクセス番号Ｌ２０５７１として入手可能である。これらの新しいサブタイプは従来はサブタイプＯと称されていた。
【０００６】
本発明は、サブタイプＯも含めてヒト免疫不全ウイルス−１型（ＨＩＶ−１）のすべての既知のサブタイプからのｐｏｌ遺伝子の１領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を可能にする改良されたオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。本発明はまた、ハイブリダイゼーションによりＨＩＶ−１の核酸の検出を可能にする改良されたオリゴヌクレオチドを提供する。
【０００７】
本発明のプライマーの重要な利点は、それらが、非標的配列の同時増幅を伴わないで、サブタイプＯも含めてすべてのＨＩＶ−１サブタイプの増幅を可能にすることである。すなわち、このプライマーは、世界のすべての地域由来のサンプルからのＨＩＶ−１のすべてのサブタイプを検出することができるＨＩＶ−１検出測定を可能にする。
特に、本発明は、ＲＡＲ１０３２（配列番号：１）、ＲＡＲ１０３３（配列番号：２）、ＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）から成る群から選択される、ヒト免疫不全ウイルス−１型（ＨＩＶ−１）の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【０００８】
好ましくは、１対のプライマーはＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）から成る。第二の１対のプライマーは、ＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）から成る。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、本発明のプライマーを用いて増幅される領域内に含まれるＨＩＶ−１ゲノムの領域とハイブリダイズする。このプローブは、１セットのハイブリダイゼーション条件下ですべてのサブタイプからのＨＩＶ−１核酸の特異的検出を可能にする。本発明のプライマーを用いて増幅されたＨＩＶ−１核酸を検出するために使用される場合、プローブの特異性はＨＩＶ−１検出の特異性をさらに増加し、それにより偽陽性 (false positive) の可能性を低下せしめる。
【０００９】
１つの態様において、本発明は塩基７〜３５個を含んで成るＲＡＲ１０３４（配列番号：５）のサブ配列もしくは塩基７〜３５個を含んで成るＲＡＲ１０３７（配列番号：６）のサブ配列、又はこれらの相補体から成る、ヒト免疫不全ウイルス核酸の検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
好ましい態様において、このプローブは、ＲＡＲ１０３４（配列番号：５）、ＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）及びこれらの相補体から成る群から選択され、あるいはＲＡＲ１０３７（配列番号：６）、ＲＡＲ１０３７Ｔ（配列番号：８）及びそれらの相補体から成る群から選択される。
【００１０】
本発明の他の観点は、本発明のプライマーを用いてＰＣＲを行うことを含んで成る、すべてのＨＩＶ−１サブタイプからのｐｏｌ遺伝子の領域を増幅する方法に関する。
本発明の他の観点は、本発明のプライマーを用いてＰＣＲを行い、そして増幅されたＤＮＡを本発明のプローブを用いて検出することを含んで成る、ＨＩＶ−１の検出方法に関する。本発明のプライマー及びプローブは、ＨＩＶ−１核酸の特異的検出のための特に簡単で且つ迅速な方法を可能にする。
本発明の他の観点は、本発明の増幅プライマーを含んで成るキットに関する。これらのキットは、本発明のプローブのごとき追加の試薬を含むことができる。キットはまた、１又は複数の増幅試薬、例えばポリメラーゼ、緩衝剤、及びヌクレオチドトリホスフェートを含むことができる。
【００１１】
本発明の理解を助けるため、次に幾つかの用語を定義する。
「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」なる用語はプライマー、プローブ、及び検出されるべきオリゴマー断片に関し、そしてポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、及びプリンもしくはピリミジン塩基又は修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他の任意のポリヌクレオチドに共通である。「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」なる用語の間に意図する区別は存在せず、そしてこれらの用語は、互換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造にのみ関する。従って、これらの用語は、二本鎖及び単鎖ＤＮＡ、二本鎖及び単鎖ＲＮＡ、並びにＲＮＡとＤＮＡとの二本鎖を包含する。
【００１２】
オリゴヌクレオチドの正確なサイズは多くの因子及びオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途に依存する。オリゴヌクレオチドは任意の適当な方法、例えば適当な配列のクローニング及び制限酵素処理、並びに、Narangら、1979, Meth.Enzymol. 68：90-99 のホスホトリエステル法、 Brownら、1979, Meth.Enzymol. 68：109-151 のホスホジエステル法、Beaucageら、1981, Tetrahedron Lett. 22：1859-1862 のジエチルホスホラミダイト法、並びに米国特許 No.４，４５８，０６６の固体支持体法のごとき方法により直接化学合成される。合成法の総説はGoodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry １(3) : 165-187 に記載されている。
【００１３】
「ハイブリダイゼーション」なる用語は、相補的塩基対合による２本の単鎖核酸による二本鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは完全に相補的な核酸鎖の間、又はわずかな領域のミスマッチを含む「実質的に相補的な」核酸鎖の間で生ずる。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件を「ストリンゼント(stringent) ハイブリダイゼーション条件」又は「配列特異的ハイブリダイゼーション条件」と称する。
【００１４】
実質的に相補的な安定な二本鎖は低いストリンゼントハイブリダイゼーション条件下で達成し得る。核酸技術の分野の当業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃度、イオン強度、及びミスマッチ塩基対の頻度等の多くの変化条件を考慮し、当業界に与えられた指標に従って、二本鎖の安定性を経験的に決定することができる (Sambrookら、1985, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, ニューヨークを参照のこと) 。
【００１５】
一般に、ストリンゼント条件は、定義されたイオン強度及びpHにおいて特定の配列についての熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、塩基対の５０％が解離する温度（定義されたイオン強度及びpHのもとで）である。ハイブリダイゼーション条件のストリンゼンシーの緩和は、配列のミスマッチが耐えられることを許容するであろう。耐えられるミスマッチの程度はハイブリダイゼーションの適当な調整により制御することができる。
【００１６】
「プライマー」なる用語は、適切な緩衝液中適切な温度において、４種類の異なるヌクレオチドトリホスフェート及び重合剤（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で、核酸鎖に対して相補的なプライマー延長生成物の合成が誘導される条件下でＤＮＡ合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドであって、天然のものでも合成品でもよい。プライマーは好ましくは、単鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さはプライマーの意図される用途に依存するが、しかし典型的には１５〜３５ヌクレオチドである。短いプライマー分子は一般に、鋳型との十分に安定なハイブリド複合体を形成するためにはより低い温度を必要とする。
【００１７】
プライマーは鋳型核酸の正確な配列を反映する必要はないが、しかし鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。プライマーは、該プライマーの検出又は固定化を可能にする追加の特徴を含むことができるが、しかしＤＮＡ合成の開始点として作用するという、プライマーの基本的な性質を変更しない。例えば、プライマーは、標的核酸にはハイブリダイズしないが増幅された生成物のクローニングを促進する追加の核酸配列を５′−末端に含有することができる。ハイブリダイズするために鋳型に対して十分に相補的であるプライマーの領域は、この明細書において、ハイブリダイジング領域と称する。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「上流」プライマーとは、その延長生成物がコード配列のサブ配列であるプライマーを意味する。「下流」プライマーとは、その延長生成物が相補的非コード配列のサブ配列であるプライマーを意味する。
本明細書で使用する場合、「プローブ」なる用語は、相補的塩基対合のために標的核酸の配列と共に二本鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは標的核酸の検出又は捕捉のために使用される。プローブは好ましくは単鎖オリゴヌクレオチドである。プローブは典型的には、標的配列のある領域に対応する、好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３５ヌクレオチドから成る「ハイブリダイジング領域」から成るか又はそれを含有するであろう。
【００１９】
「対応する」とは、特定の核酸又はその相補体に対して、少なくとも実質的に相補的であることを意味する。プローブは標的核酸の正確な配列を反映する必要はないが、選択されたハイブリダイゼーション条件下で標的とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。プローブオリゴヌクレオチドは、該プローブの検出又は固定化を許容するがしかしハイブリダイジング領域のハイブリダイゼーション特性を有意に変更しない追加の特徴を含有するか又はそれに結合していてもよい。
【００２０】
例えば、プローブは、放射能標識されたヌクレオチドの導入により、又は別の検出可能な成分への結合により標識されるであろう。
【００２１】
本明細書において使用する場合、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在するミスマッチの数が、オリゴヌクレオチドと非標的配列との間に存在するミスマッチの数より少ない場合、オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは標的配列に対して「特異的」である。存在するミスマッチの数がオリゴヌクレオチドと標的配列との間に存在するミスマッチの数より多くない場合にのみ安定な二本鎖が形成されるようなハイブリダイゼーション条件を選択することができる。このような条件下で、標的特異的オリゴヌクレオチドは標的配列とのみ安定な二本鎖を形成することができる。すなわち、適当にストリンゼントなハイブリダイゼーション条件下での標的特異的プローブの使用が特異的標的配列の検出を可能にする。同様に、適当にストリンゼントな増幅条件下での標的特異的プライマーの使用が、標的プライマー結合部位を含有する標的配列の特異的増幅を可能にする。
【００２２】
「標的領域」及び「標的核酸」なる用語は、増幅、検出又は分析されるべき核酸の領域を意味する。プライマー又はプローブがそれに対してハイブリダイズする配列を「標的配列」と称することができる。
「熱安定性ポリメラーゼ酵素」なる用語は、熱に対して比較的安定であり、且つ標的配列の核酸鎖の１つに対して相補的なプライマー延長生成物を形成するためのヌクレオシドトリホスフェートの重合を触媒する酵素を意味する。この酵素はプライマーの３′末端において合成を開始し、そして鋳型の５′末端の方向に、合成が停止するまで進行する。精製された熱安定性ポリメラーゼ酵素はさらに十分に米国特許 No.４，８８９，８１８に記載されており、そしてパーキン−エルマー社, Norwalk, CTから市販されている。
【００２３】
「増幅反応混合物」及び「ポリメラーゼ連鎖反応混合物」なる用語は、ポリメラーゼ連鎖反応を行うために適当な試薬の組合せを意味する。反応混合物は典型的には、オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオチドトリホスフェート、及びＤＮＡポリメラーゼ（適当な緩衝液中）から成る。好ましい反応混合物は実施例に記載されている。
所与の核酸の「相補体」なる用語は特に、該所与の核酸と同じ長さを有し、且つ完全に相補的である核酸を意味する。従って、核酸の相補体は単一の一義的に定義された配列を意味する。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「サブ配列」なる用語は、第二配列中に含まれる配列を意味する。本明細書において定義されそして使用される場合、サブ配列はその範囲に全長配列を包含するものと意図される。従って、例えば、配列番号：５のサブ配列から成るプローブは、配列番号：５であるプローブを包含する。
当業界の技術レベル内にある分子生物学及び核酸化学の常用技法は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrookら、1985, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, ニューヨーク；Oligonucleotide Synthesis (MJ.Gait編、1984) ; Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及びS.J.Higgis編、1984) ; 並びに一連のMethods in Enzymology(Academic Press, Inc.) を参照のこと。
【００２５】
ＨＩＶ増幅プライマー
ＨＩＶ−１サブタイプ間の高度な配列多様性が、すべてのサブタイプ配列に正確に相補的であるプライマーを使用してのＨＩＶ−１核酸の増幅を妨げる。比較的保存された領域でさえなお、有意な配列多様性を含む。本発明のプライマーは、プライマーハイブリダイジング領域中に存在する配列多様性にも拘らずすべてのＨＩＶ−１サブタイプの増幅を可能にする。
【００２６】
本発明のプライマーは、増幅において順応されなければならない多様性を最小にするｐｏｌ遺伝子中の比較的保存された領域にハイブリダイズする。本発明のプライマーは、ＨＩＶ−１サブタイプのそれぞれと１〜５個ミスマッチを含有する。実施例に記載するように、増幅は５塩基対以下のミスマッチを許容する条件下で行われ、そしてそれ故にすべてのＨＩＶ−１サブタイプの増幅を可能にする。すなわち、本発明のプライマーは既知ＨＩＶ−１サブタイプからのｐｏｌ遺伝子核酸の特異的増幅を可能にする。
【００２７】
一般に、プライマー延長部位であるプライマーの３′末端のミスマッチは、３′末端から離れて存在する塩基対ミスマッチよりも、プライマー延長により大きな影響を与える。しかしながら、塩基対ミスマッチの脱安定化効果は関与する塩基に依存し、チミジンが関与するミスマッチが最も少なく脱安定化する (Kwokら、 1990, Nuc.Acids Res. 18：999-1005を参照のこと) 。プライマーの３′末端における脱安定化効果を最小にするため、各プライマーは３′末端にチミジンを含有する。従って、本発明のプライマーは、プライマーの重大な３′末端塩基において偶然に異なる新しいＨＩＶ−１分離株を増幅する。
【００２８】
脱安定化する塩基対ミスマッチの効果はまた、プライマーの長さに依存する。プライマーが長くなるに従って１個のミスマッチによる影響が少ない。３２〜３３塩基長を有する本発明のプライマーを用いて、新たなＨＩＶ−１分離株中に予想されるわずかな配列多様性に順応することができるが、他の生物由来の相同性の低い配列を増幅しない。
５′から３′の方向に示すプライマーの配列を表１に記載する。
【００２９】
【表１】
上流プライマーＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及び下流プライマーＲＡＲ１０３３（配列番号：２）は、ＨＩＶ−１参照株ＨＸＢ２(GenBankアクセス番号Ｋ０３４５５）の配列のヌクレオチド位置２９５９〜３１２８に対応する１７０塩基対の生成物を増幅する。上流プライマーＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及び下流プライマーＲＡＲ１０３６（配列番号：４）はヌクレオチド位置４７５０−４９９０に対応する２４１塩基対の生成物を増幅する。
【００３１】
プライマーのハイブリダイゼーション特異性は、他のウイルス又はヒトのゲノムＤＮＡからのホモロガス (homologous) な非標的配列の同時的増幅を伴わないで既知のＨＩＶ−１サブタイプの増幅を可能にするプライマーの必須の性質である。プライマーのハイブリダイゼーション特異性はハイブリダイジング領域の正確な長さ及び塩基組成に依存するので、プライマーのハイブリダイジング領域の配列のわずかな修飾がプライマーの有用性に不都合な影響を与える可能性がある。
【００３２】
要するに、プライマーのハイブリダイジング領域は表１に示す配列から成らなければならない。しかしながら、当業者は、ある種の特定のわずかな修飾、例えば５′末端における１個の塩基の除去又は付加は、ハイブリダイゼーション特異性及び有用性に有意な影響を与えることなく可能であろう。このような修飾は典型的には日常的態様でのハイブリダイゼーションの最適化を必要とするであろう。ハイブリダイゼーション特異性を検知できる程変えることなく変更されたプライマーは同等であると考えられる。
【００３３】
増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法は当業界においてよく知られており、そして米国特許 No.４，６８３，１９５及び No.４，６８３，２０２； Saikiら、1988, Science 239 ：487 ; Scharfら、 1988, Hum.Immunol. 22：61；並びにScharfら、 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6215に記載されている。 Perkin Elmer, Norwalk, CTのごとき商業的提供者がＰＣＲ試薬を販売しており、そしてＰＣＲ法を発行している。本発明により提供される利点の理解を容易にするため、ＰＣＲの概要を記載する。
【００３４】
ＰＣＲ増幅の各サイクルにおいて、二本鎖標的配列を変性し、変性された標的の各鎖にプライマーをアニールさせ、そしてプライマーをＤＮＡポリメラーゼの作用によりプライマーを延長せしめる。工程を典型的には２５〜４０回反復する。２つのプライマーは、標的核酸配列の相対する端に、そして各プライマーの延長生成物が標的配列の相補的コピーであり且つその相補体から分離された場合に他方のプライマーとハイブリダイズすることができる配向でアニールされる。各サンプルは、もしそれが１００％有効であれば、存在する標的配列の数の倍化をもたらすであろう。
【００３５】
ＰＣＲのために適当な種々の適当なサンプル調製法は文献に記載されている。使用される特定の方法は本発明の本質的な部分ではない。当業者は既知のサンプル調製法に使用するための反応条件を最適化することができる。ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの検出に使用するための好ましいサンプル調製法は、Casareale ら、1992, PCR Methods and Applications 2：149-153 に記載されている。
【００３６】
本発明の方法は、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ又はＨＩＶ−１ ＲＮＡを検出するために使用することができる。逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いるＲＮＡの増幅はよく知られており、そして米国特許 No.５，３２２，７７０及び No.５，３１０，６５２； Myers及びGelfand, 1991, Biochemistry 30 (31): 7661-7666 ; Youngら、1993, J.Clin.Microbiol. 31 (4)：882-886 ；並びにMulderら、1994, J.Clin.Microbiol. 32 (2)：292-300 に記載されている。
【００３７】
ＰＣＲ法により大きな増幅が可能であるため、ポジティブ対照鋳型である高いＤＮＡレベルを含むサンプルからの、又は予備増幅からの低レベルのＤＮＡの持込みが、目的とする添付された鋳型ＤＮＡの非存在下でもＰＣＲ生成物をもたらす場合がある。可能であれば、すべての反応混合物は、ＰＣＲ生成物の分析及びサンプルの調製とは別の場所で用意する。ＲＮＡ／ＤＮＡの調製、反応混合、及びサンプルの分析のための犠牲にされる又は使捨て容器、溶液及びピペット（好ましくはポジティブ置換ピペット）の使用が汚染を最小にするであろう。さらに、Kwok及びHiguchi, 1989, Nature 339 ：237-238 ；並びにKwok及び Orrago, Innisら編、1990 PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. San Diego, CAを参照のこと。
【００３８】
予備反応からの増幅された核酸によるＰＣＲの汚染の問題を減少させるための酵素的方法は、ＰＣＴ特許出願公開 No.ＷＯ９２／０１８１４（出願番号ＵＳ９１／０５２１０）及び米国特許 No.５，０３５，９９６に記載されている。これらの方法は、予備反応からのすべての増幅されたＤＮＡの酵素的分解を可能にする。ＰＣＲ増幅は、ｄＴＴＰではなくｄＵＴＰの存在下で行われる。ウラシルを含有する得られる二本鎖増幅生成物はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）による分解にかけられ、他方正常のチミジン含有ＤＮＡはＵＮＧにより分解されない。
【００３９】
標的として役立つかも知れないウラシル含有ＤＮＡを分解するために、増幅の前に増幅反応生成物をＵＮＧにより処理する。ウラシル含有ＤＮＡの唯一の源は予備反応の増幅された生成物であるから、この方法は、予備反応からの汚染の問題（持ち込み）を効果的に除去する。ＵＮＧは熱により臨時に不活性化されるので、増幅法における変性段階もＵＮＧの不活性化に役立つ。従って、新しい増幅生成物は、ウラシルを含むが、ＵＮＧが不活性化された環境において生成され、そして分解されない。
【００４０】
増幅反応混合物は、典型的には、プライマーハイブリダイゼーション特異性を確実にするために必要な温度より十分に低い室温において一緒にされる。室温においてはプライマーが非特異的に他の部分的にのみ相補的な核酸配列に結合し、そして不所望の核酸配列の合成を開始するので、非特異的増幅が生ずるであろう。これらの新たに合成された不所望の配列は、増幅反応の間に目的とする標的配列と競争することができ、そして所望の配列の増幅効率を有意に低下せしめるであろう。非特異的増幅は「ホット−スタート」法を用いて減少させることができ、この方法においては、必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するのに十分なだけ温度が上昇するまで、１又は複数の試薬を反応混合物から排除しておく。
【００４１】
非特異的増幅を減少させるための好ましい方法は、ＷＯ９２／０１８１４に記載されている。そこに記載されている方法は、反応混合物が配合された後であるが増幅反応の開始前に新たに合成された核酸を分解することにより、非特異的増幅を減少せしめる。新たに合成されたすべての核酸を分解することにより、高温増幅反応が行われる際、意図しない配列にハイブリダイズしたプライマーから生ずる増幅可能な核酸標的配列は存在しない。新たに合成された核酸の分解は反応混合物にｄＵＴＰ及びＵＮＧを導入し、そして増幅反応を行う前に反応混合物を４５〜６０℃でインキュベートすることにより達成される。
【００４２】
増幅された生成物の分析
増幅に続き、ＨＩＶ−１核酸の存在を、増幅された生成物の検出により決定する。ＰＣＲ増幅された核酸を検出するための方法は当業界においてよく知られている。例えば、増幅された生成物の存在及び量はゲル電気泳動を用いて測定することができる。ゲル電気泳動による増幅生成物の検出は当業界においてよく知られている（例えば、Sambrookら、１９８５、前掲を参照のこと）。
【００４３】
増幅された生成物の検出は好ましくはオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより行われる。表１のプライマーを用いて増幅されたＤＮＡを検出するために使用される本発明のプローブは、下の表２に示す。各プローブの成分は本明細書に記載する方法において有用である。好ましいハイブリダイゼーション条件は実施例に記載する。
【００４４】
【表２】
ＲＡＲ１０３４（配列番号：５）はＨＩＶ−１ゲノムに位置２９９６−３０３０においてハイブリダイズし、そしてプライマーＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）を用いて増幅されたＤＮＡを検出するために使用される。ＲＡＲ１０３７（配列番号：６）はＨＩＶ−１ゲノムに位置４９０８−４９４２においてハイブリダイズし、そしてプライマーＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）を用いて増幅されたＤＮＡを検出するために使用される。
【００４６】
ＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）はＲＡＲ１０３４（配列番号：５）から、５′末端の６塩基が除去されている点において異なる。全長プローブ及び末端が除去されたプローブの両者は下記及び実施例６に記載の５′−ヌクレアーゼ測定においてよく機能するが、ＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）が好ましい。同様に、ＲＡＲ１０３７（配列番号：６）から５′末端の６塩基が除去されている点において異なるＲＡＲ１０３７Ｔ（配列番号：８）は、下記及び実施例６に記載の５′−ヌクレアーゼ測定での使用のために好ましい。
【００４７】
従って、全長プローブＲＡＲ１０３４（配列番号：５）及びＲＡＲ１０３７（配列番号：６）は実施例１〜３に記載のマイクロウエルプレート測定において使用するのに好ましく、そして５′末端において６塩基除去された全長配列ＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）及びＲＡＲ１０３７Ｔ（配列番号：８）から成るプローブは、実施例６に記載の５′ヌクレアーゼ測定における使用のために好ましい。さらに、５′末端において１〜５塩基が除去された全長配列から成るプローブもまた本発明の方法において適当である。従って、本発明のプローブは全長プローブＲＡＲ１０３４（配列番号：５）又はＲＡＲ１０３７（配列番号：６）のサブ配列から成り、ここでサブ配列は前記配列の塩基７〜３５個又はその相補体を含んで成る。プローブの番号は５′末端に関連する。
【００４８】
プライマーと同様に、本発明のプローブはＨＩＶ−１サブタイプのそれぞれにつき少数個のミスマッチ（それぞれ１〜５、及び１〜４）を含有する。実施例に記載するハイブリダイゼーション条件は、他の生物からの相同性の少ない配列とのハイブリダイゼーションを許容することなく、任意のＨＩＶ−１サブタイプへのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。従って、本発明のプローブは、ＨＩＶ−１核酸の特異的検出を可能にする。
サンプル中の標的核酸配列とプローブとの間に形成されたハイブリドを検出するために適当な測定方式は当業界において知られている（Sambrookら、１９８５、前掲を参照のこと）。実施例はドット−ブロット測定方式及び逆ドット−ブロット測定方式を包含する。
【００４９】
ドット−ブロット方式においては、増幅された標的ＤＮＡを固体支持体、例えばナイロン膜に固定化する。膜−標的複合体を適当なハイブリダイゼーション条件下で、ラベルされたプローブと共にインキュベートし、ハイブリダイズしないプローブを適当なストリンゼント条件下で洗浄することにより除去し、そして膜を結合したプローブの存在についてモニターする。
【００５０】
他の方式は「逆」ドット−ブロット方式であり、この方法においては増幅された標的ＤＮＡをラベルし、そしてプローブを固体支持体、例えばナイロン膜に固定化する(Saikiら、 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230、及びＰＣＴ出願 No.ＷＯ８９／１１５４８を参照のこと）。標的ＤＮＡは典型的には増幅の間に、ラベルされたプライマーの導入によりラベルされる。プライマーの一方又は両方をラベルすることができる。膜−プローブ複合体を適当なハイブリダイゼーション条件下で、ラベルされ増幅された標的ＤＮＡと共にインキュベートし、適当なストリンゼント条件下で洗浄することによりハイブリダイズしていない標的ＤＮＡを除去し、そして次にフィルターを、結合した標的ＤＮＡの存在についてモニターする。
【００５１】
あるいは、多数のプローブハイブリダイゼーション部位又はウエルを有する固体支持体を用いて逆ドット−ブロット測定を行うことができる。例えば、本発明の大規模臨床適用においてはマイクロウエルプレートが特に有用である。プローブはマイクロウエルプレートに、受動結合により、あるいはマイクロウエルプレートに付着する蛋白質中間体例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を介して固定化することができる。マイクロウエルプレート中で行われる逆ドット−ブロット法は米国特許 No.５，２３２，８２９、 Loeffelholzら、1992, J.Clin.Microbiol. 30 (11): 2847-2851, Mulderら、1994、前掲、及び Jacksonら、1991, 前掲に記載されている。
【００５２】
検出のためにハイブリダイゼーション二本鎖を固定化するための他の方法においては、ＢＳＡに結合したプローブを磁性微粒子に結合せしめる。結合したプローブを溶液中でラベル化増幅生成物にハイブリダイズせしめる。ハイブリダイゼーションに続き、プローブ−標的二本鎖を溶液から磁気的に除去し、そして次に磁気的に固定化されたハイブリダイゼーション二本鎖を前記の方法のようにして検出する。
【００５３】
５′−ヌクレアーゼ測定法と称する他の適当な測定法は米国特許 No.５，２１０，０１５に記載されており、この方法においては、ラベルされた検出プローブがＰＣＲ増幅工程中に添加される。このプローブは、該プローブがＤＮＡ合成のためのプライマーとして働かないように修飾されている。各合成段階、すなわちプライマー延長の間に標的ＤＮＡにハイブリダイズする任意のプローブが、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性により分解される。次に、プローブからの分解生成物を検出する。従って、プローブ分解生成物の存在が、プローブと標的ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションが生じたこと、及び増幅反応が生じたこと、の両方を示す。米国特許 No.５，２１０，０１５の方法において機能するように修飾された表２のプローブは本発明の範囲内にある。
【００５４】
上記の測定方式は典型的には、ハイブリド二本鎖の検出を促進するためにラベルされたオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段により検出可能なラベルの導入によりラベルすることができる。有用なラベルには32Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡＳにおいて一般に使用される）、ビオチン又はハプテン及び、それに対して抗血清又はモノクローナル抗体が入手可能な蛋白質が含まれる。本発明のラベルされたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成について上に記載した技法を用いて合成し又はラベルすることができる。
【００５５】
本発明の好ましい態様においては、逆ドット−ブロット測定はマイクロウエルプレートを用いて行われ、そしてプライマーはビオチンによりラベルされる (Levenson及びChang, 1989, PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications (Innisら編、Academic Press, サンジエゴ) 99-112頁に記載されているように）。プローブはＢＳＡに結合させ（Tungら、 1991, Bioconjugate Chem. ２：464-465)、そしてマイクロウエルプレートに固定化する。ラベルされたプライマーを用いての増幅及び固定化されたプローブとのハイブリダイゼーションの後、増幅された核酸はまず、ビオチンをアビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ（Ａ−ＨＲＰ）又はストレプトアビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）に結合せしめ、次にこれを反応の実施により検出することにより検出する。この反応においてはＨＲＰが色原体の変色を触媒する(Saikiら、１９８９、前掲を参照のこと）。
【００５６】
反応混合物中の二本鎖ＤＮＡの全量の増加をモニターすることによりＨＩＶ−１核酸の増幅を検出する他の方法は、 Higuchiら、1992 Bio／Technology 10：413-417 ; Higuchiら、 1993, Bio／Technology 11：1023-1030 ；並びにヨーロッパ特許出願公開 No.４８７，２１８及び No.５１２，３３４に記載されている。二本鎖標的ＤＮＡの検出は、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）及び他のＤＮＡ結合ラベルが二本鎖ＤＮＡに結合した際に示す蛍光の増加に頼っている。標的配列の合成から生ずる二本鎖ＤＮＡの増加が蛍光を増加せしめる。本発明のプライマーは、極めて低レベルのバックグラウンド非特異的増幅生成物を伴って増幅を可能にするので、特に有用である。
【００５７】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための有用な構成成分を含んで成るキット、すなわち多容器ユニットに関する。有用なキットはＨＩＶ−１核酸のＰＣＲ増幅のためのプライマーを含むことができる。キットはさらに、増幅されたＨＩＶ−１核酸を検出するための手段、例えばオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。幾つかのケースにおいては、プローブは適当な支持体膜に固定される。キットの他の任意成分には、例えば、プライマー延長生成物の合成を触媒する試薬、基質ヌクレオシドトリホスフェート、ラベルするために使用される手段（例えば、アビジン−酵素結合体及び酵素基質、並びにラベルがビオチンである場合には色原体）、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション反応のための適当な緩衝液、並びに本発明の方法を実施するための指示書を含むことができる。
【００５８】
【実施例】
下記に提示する本発明の実施例は例示のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１．ＨＩＶ−１ ＤＮＡの増幅及び検出
後の実施例に記載するような臨床サンプルからのＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの増幅及び検出のために次の方法を用いた。
【００５９】
サンプルの調製
第一の方法においては、Boyum, 1968, Scan. J.Clin.Lab.Invert. 21 (Suppl.97) : 77、及びFotinoら、1971, Ann.Clin.Lab.Sci. １：131-133 に記載されている標準的Ficoll-Hypaque密度勾配法により末梢血単球を単離した。
第二の方法においては、 Casarealeら、 1992, PCR Methods and Applications ２：149-153 に記載されているようにして直接赤血球溶解により０．５mlの末梢血から白血球細胞を単離した。
細胞の単離に続き、 Casarealeら、1992、前掲；並びに Butcher及び Spadoro, 1992, Clin.Immunol.Newsletter 12：73-76 に記載されているようにしてＤＮＡを抽出した。
【００６０】
増幅
プライマーＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）を用いる増幅を１００μｌの反応体積（サンプルから５０μｌ）中で行った。各反応は次の試薬を含有した。
１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．４）
５０mM ＫＣｌ
２００μＭ 各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ
３．０mM ＭｇＣｌ2
１０％ グリセロール
２．０ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ* 、及び
２．０ユニットのＵＮＧ*
* ホフマン−ラ．ロシュ社により開発及び製造され、そしてパーキン・エルマー, Norwalk, CT, により販売されている。
【００６１】
プライマーＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）を用いる増幅は、反応が２．０mM ＭｇＣｌ2 を含有する点を除き、本質的に同一の条件下で行った。
増幅は、次の温度プロフィールを用いてＴＣ９６００ ＤＮＡ熱サイクラー（パーキン・エルマー, Norwalk, CT）において行われた。
【００６２】
【００６３】
増幅された生成物の検出
Ａ．ゲル電気泳動
増幅された生成物は次のようにしてゲル電気泳動により検出された。反応生成物を、アガロースゲル（１００mlの３％ NuSieve及び０．５％ Seachem) 及び１×ＴＥ（０．０８９Ｍ Ｔｒｉｓ、０．０８９Ｍ硼酸、０．００２５Ｍ ＥＤＴＡ二ナトリウム）ランニング緩衝液を用いて分画した。電気泳動は１００ボルトにて約１時間行った。電気泳動に続き臭化エチジウム（０．５μｇ／ml）を加えて存在するすべてのＤＮＡを染色する。ゲルを水中で短時間脱色し、そして臭化エチジウムで染色したＤＮＡをＵＶ照射により可視化した。
【００６４】
Ｂ．プローブハイブリダイゼーション
増幅された生成物を、マイクロウエルプレートに固定化したプローブを用いる逆ドット−ブロット形式で測定した。この検出方式においては、プローブをマイクロウエルプレートのウエルに固定化し、そして変性した増幅された標的ＤＮＡを結合したプローブにハイブリダイズせしめた。上記の増幅をビオチン化されたプライマーを用いて行い、結合したプローブにハイブリダイズする増幅されたＤＮＡの検出を可能にした。
増幅されたＤＮＡは、各ＰＣＲチューブに同体積の変性溶液（０．４Ｍ ＮａＯＨ、８０mM ＥＤＴＡ及び０．００５％チモールブルー）を添加することにより変性した。
【００６５】
プローブをマイクロウエルプレートに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中間体を介して固定化した。ＢＳＡに結合したプローブを９６ウエルプレート(Corning, コーニング, ニューヨーク）の各ウエルのプラスチック表面に吸着せしめた。プローブは１５ng／ウエルの濃度でマイクロウエルプレート上に固定化した。
あるいは、プローブは次のようにしてマイクロウエルプレートのプラスチック表面上に受動的に固定化することができる。０．１２５ng／μｌの濃度でプローブを含有する１Ｍ ＣＨ3 ＣＯＯＮＨ4 の溶液１００μｌをマイクロウエルプレートの各ウエルに添加する。プレートを３７℃にて１０〜２０時間（一夜）インキュベートし、そして次にＰＢＳ／ＥＤＴＡ（ＰＢＳは２．６８mM ＫＣｌ、１３７mM ＮａＣｌ、１．４７mM ＫＨ2 ＰＯ4 、及び８．０３mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）ですすぐ。
【００６６】
適当な数の８ウエル・マイクロウエルストリップ（最少２ストリップ）を取り出し、そしてマイクロウエルプレートのフレームに入れた。１００μｌのハイブリダイゼーション／中和緩衝液（２．５Ｍ ＮａＳＣＮ、８０mM ＮａＨ2 ＳＯ4 、１０mM ＮａＨ2 ＰＯ4 及び０．１２５％ Ｔｗｅｅｎ２０；pH５．０±０．２）をマイクロウエルプレートの各ウエルにピペットに加えた。多チャンネルピペッターと共に栓をしたチップを用いて、トレイ中各ＰＣＲチューブからの変性された増幅反応混合物２５μｌをマイクロウエルプレート中の対応するウエル位置にピペットした。プレートをマイクロウエルプレートのふたにより覆い、そして色が青から明黄色に変化するまで約１０〜１５回、側をかるくたたいた。
【００６７】
プレートを６０分間３７℃にてインキュベートしてハイブリダイゼーションさせた。インキュベーションの後、プレートを１×洗浄溶液により５回洗浄した。１０×濃度の洗浄溶液は９．９４ｇ／Ｌリン酸二塩基性ナトリウム、４．４１ｇ／Ｌリン酸ナトリウム（一塩基性）、３．７２２ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、８７．６６ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１３．７ｇ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ２０、及び１０ｇ／Ｌ Pro Clin 300 (Rhom and Haas, フィラデルフィア, PA) を含有する。溶液のpHをリン酸により調整する（pH６．５−７．１が好ましい）。プレートの洗浄は手動で、又はプログラムされた自動化マイクロウエルプレート洗浄機を用いて行うことができる。
【００６８】
手動洗浄のためには、プレートの内容物を空にし、かるくたたいて乾かす。各ウエルを洗浄溶液（４００〜４５０μｌ）で満たし、プレートを３０秒間浸漬し、そしてプレートを再度空にし、そしてかるくたたいて乾かす。この洗浄液をさらに４回反復する。
自動化されたマイクロプレート洗浄機については、次の手順を用いる。ウエルの内容物を吸引除去する。試験すべきプレートの各ウエルに３５０〜４５０μｌの洗浄溶液を加え、３０秒間浸漬し、そして吸引除去するように洗浄機をプログラムする。段階をさらに４回反復する。次にプレートをかるくたたいて乾かす。
【００６９】
１００μｌのアビジン−ＨＲＰ結合体（多くの提供者、例えば Fluka Chemical Corp. Ronkonkoma, ニューヨーク；及び Sigma Chemical Co. セントルイス, MOから得られる）をプレートの各ウエルに加えた。プレートを覆い、そて３７℃にて１５分間インキュベートし、そして上記のようにして再度洗浄した。テトラメチルベンザジン（多くの提供者、例えば Fluka Chemical Corp. Ronkonkoma, ニューヨーク；及び Sigma Chemical Co. セントルイス, MOから入手可能）及びＨ2 Ｏ2 を含有する色原体溶液１００μｌを、プレートの各ウエルに加える。次に、プレートを覆い、そして室温（２０℃〜２５℃）にて１０分間暗所にインキュベートすることにより発色させた。最後に、１００μｌの停止試薬（５％Ｈ2 ＳＯ4 ）を各ウエルに加えた。４５０nMの各ウエルの吸光度を停止試薬を添加して１時間以内に読み取る。
【００７０】
実施例２．臨床サンプル中のＨＩＶ ＤＮＡの検出
この実施例においては、アフリカ象牙海岸からの血清陽性患者から得られた９１サンプルをＨＩＶ ＤＮＡの存在について測定した。比較のため、増幅及び検出も文献に記載されているプライマー及びプローブを用いて行った。
末梢血単球を実施例１に記載したFicoll-Hypaque密度勾配法により単離した。増幅及び検出は、実施例１に記載されているようにして、プライマー対ＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）並びにプローブＲＡＲ１０３４（配列番号：５）を用いて、並びにプライマー対ＲＡＲ１０３５（配列番号：３）及びＲＡＲ１０３６（配列番号：４）並びにＲＡＲ１０３７（配列番号：６）を用いて行った。
【００７１】
比較のため、別々の増幅／検出測定を、文献に記載されている２つの追加のプライマー／プローブを用いて行った。プライマーＳＫ４６２及びＳＫ４３１、並びにプローブＳＫ１０２は Jacksonら、前掲、に記載されている。プライマーＳＫ３８及びＳＫ３９、並びにＳＫ１９は Kellogg及びKwok, １９００、前掲、に記載されている。。プライマー対ＳＫ４６２／ＳＫ４３１、及びＳＫ３８／ＳＫ３９を用いる増幅は本質的に実施例１に記載した方法により行ったが、次の条件を用いた。
【００７２】
反応混合物は次の試薬を含有した。
１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．４）
５０mM ＫＣｌ
２００mM 各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ
２５pmole の各ビオチン化プライマー
３．７５mM ＭｇＣｌ2
１０％ グリセロール
２．０ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ* 、及び
２．０ユニットのＵＮＧ*
* ホフマン−ラ ロシュにより開発及び製造され、そしてパーキン・エルマー, Norwalk, CTにより販売されている。
【００７３】
増幅は、次の温度プロフィールを用いてＴＣ９６００ ＤＮＡ熱サイクラー（パーキン・エルマー, Norwalk, CT）において行われた。
【００７４】
【表３】
本発明の両測定法は、試験したサンプルのほとんどすべてからＨＩＶ−１を検出することができた。これに対して、プライマー対ＳＫ４６２及びＳＫ４３１並びにプローブＳＫ１０２を用いた測定法、並びにプライマー対ＳＫ３８及びＳＫ３９並びにＳＫ１９を用いた測定法は、サンプルの多くからＨＩＶ−１ ＤＮＡを検出しなかった。本発明のプライマー及びプローブを用いて検出できない１個のサンプルはＳＫプライマー及びプローブを用いても検出できなかった。このサンプルからＨＩＶ−１が検出できなかった理由は、低いサンプルの品質又は異常に低いウイルスタイターのためであろう。
【００７６】
実施例３．臨床サンプル中のＨＩＶの検出
この実施例においては、４１個のサンプルをＨＩＶ−１ ＤＮＡの存在について測定した。サンプルはアフリカ象牙海岸の血清陽性患者から得た。
実施例１に記載した直接赤血球溶解法により、０．５mlの末梢血から白血球を単離した。増幅反応及び検出測定は実施例１並びに２に記載したようにして行った。結果を、測定した各サブタイプの合計数に対するＨＩＶ−１が検出されたサンプル数、及び検出された対応する％として下記の表に示す。
【００７７】
【表４】
実施例４．既知のＨＩＶ−１サブタイプの増幅及び検出
既知ＨＩＶ−１サブタイプからの合計１８個のＤＮＡ排出物を、実質的に実施例１〜３に記載したようにして測定した。サブタイプＡ〜ＦからのＤＮＡを臨床サンプルから得た。サブタイプＯからのＤＮＡを感染したセルラインから得た。すべてのＤＮＡサンプルを実質的に Casarealeら、１９９２、前掲、に記載されているようにして、プロテイナーゼＫ溶液を用いて抽出した。
結果を、測定した各サブタイプの合計数に対するＨＩＶ−１が検出された各サブタイプのサンプル数として下記の表に示す。
【００７９】
【表５】
プライマー対ＲＡＲ１０３２（配列番号：１）及びＲＡＲ１０３３（配列番号：２）並びににプローブＲＡＲ１０３４（配列番号：５）を用いて測定された１８個のＨＩＶ−１サンプルのすべてからＨＩＶ−１が検出された。これに対して、プライマー対ＳＫ４６２及びＳＫ４３１並びにプローブＳＫ１０２を用いた測定、並びにプライマー対ＳＫ３８及びＳＫ３９並びにプローブＳＫ１９を用いた測定においては、ＨＩＶ−１サブタイプＯのＤＮＡの検出に失敗した。さらに、プライマー対ＳＫ４６２及びＳＫ４３１並びにプローブＳＫ１０２を用いた測定においては、サンプルの１つからのＨＩＶ−１サブタイプＥの検出に失敗した。プライマー対ＳＫ３８及びＳＫ３９並びにプローブＳＫ１９を用いた測定においては、２個のサンプルからのＨＩＶ−１サブタイプＥの検出に失敗し、そしてＨＩＶ−１サブタイプＦの検出に失敗した。
【００８１】
実施例５．ＨＩＶ−１ ＲＮＡの検出
ＨＩＶ−１ ＲＮＡはGeneAmp(登録商標）ＥＺｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＴキット（パーキン・エルマー社, Norwalk, CT）を用いて増幅することができる。サンプルの調製は、Mulderら、１９９４、前掲、に記載されているようにして行う。増幅された生成物の検出は実施例１に記載したようにして行う。
【００８２】
実施例６．５′−エキソヌクレアーゼ測定法
この実施例は、米国特許 No.５，２１０，０１５に記載の方法における本発明のプライマー及びプローブの使用について記載する。プローブがＤＮＡ合成のためにプライマーとして作用しないように修飾したラベルされたプローブを、ＰＣＲ増幅工程の間に添加した。ＨＩＶ−１ ＤＮＡにハイブリダイズしたすべてのプローブを、増幅の間にｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性により分解した。分解されたプローブの検出がＨＩＶ−１ ＤＮＡの存在を示した。
【００８３】
使用したプローブは、５′末端に結合したＦＡＭラベル（Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) 及びＤＮＡポリメラーゼによる延長をブロックするために３′−ＯＨの代りに３′−ＰＯ4 を有する合成されたＲＡＲ１０３４Ｔ（配列番号：７）の相補体であった。
ＨＩＶ−１ ＤＮＡを含有するサンプルは前記のようにして調製した。反応は、下記の試薬を含有する１００μｌの体積中で行った。
【００８４】
５０mM トリシン（Tricine)（pH８．２）
１１０mM ＫＯＡｃ
３００μＭ 各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ
５００μＭ 各ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰ
５０pmole の各プライマー
１００pmole プローブ
２．４mM Ｍｎ（ＡＯｃ)2
１２％ グリセロール
２ユニットＵＮＧ* 、及び
２０ユニットのｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ*
* ホフマン−ラ ロシュ社により開発及び製造され、そしてパーキン・エルマー社, Norwalk, CTにより販売されている。
分解されたプローブの検出は米国特許 No.５，２１０，０１５に記載されている方法を用いて行うことができる。
【００８５】
【配列表】
Claims (10)
- RAR1032（配列番号：１）及びRAR1033（配列番号：２）から成る、ヒト免疫不全ウイルス−１型（HIV-1）の核酸の増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
- RAR1035（配列番号：３）及びRAR1036（配列番号：４）から成る、ヒト免疫不全ウイルス−１型（HIV-1）の核酸の増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマー。
- RAR1032（配列番号：１）及びRAR1033（配列番号：２）から成る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る、ヒト免疫不全ウイルス−１型（HIV-1）の核酸の増幅のためのキット。
- RAR1035（配列番号：３）及びRAR1036（配列番号：４）から成る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含んで成る、ヒト免疫不全ウイルス−１型（HIV-1）の核酸の増幅のためのキット。
- 塩基15〜35個を含んで成るRAR1034（配列番号：５）のサブ配列又はその相補体から成るオリゴヌクレオチドプローブをさらに含んで成る、請求項３に記載のキット。
- 塩基15〜35個を含んで成るRAR1037（配列番号：６）のサブ配列又はその相補体から成るオリゴヌクレオチドプローブをさらに含んで成る、請求項４に記載のキット。
- ヒト免疫不全ウイルス−１型（HIV-1）の核酸の検出方法であって、
（ａ）RAR1032（配列番号：１）及びRAR1033（配列番号：２）から成る一対のオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、そして
（ｂ）増幅されたHIV-1の核酸を検出する、
ことを含んで成る方法。 - 塩基15〜35個を含んで成るRAR1034（配列番号：５）のサブ配列又はその相補体から成るオリゴヌクレオチドプローブを用いて段階（ｂ）を行う、請求項７に記載の方法。
- ヒト免疫不全ウイルス−１型（HIV-1）の核酸の検出方法であって、
（ａ）RAR1035（配列番号：３）及びRAR1036（配列番号：４）から成る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、そして
（ｂ）増幅されたHIV-1の核酸を検出する、
ことを含んで成る方法。 - 塩基15〜35個を含んで成るRAR1037（配列番号：６）のサブ配列又はその相補体を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブを用いて段階（ｂ）を行う、請求項９に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US390192 | 1995-02-17 | ||
| US08/390,192 US5599662A (en) | 1995-02-17 | 1995-02-17 | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08242898A JPH08242898A (ja) | 1996-09-24 |
| JP4463884B2 true JP4463884B2 (ja) | 2010-05-19 |
Family
ID=23541480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02956596A Expired - Lifetime JP4463884B2 (ja) | 1995-02-17 | 1996-02-16 | 免疫不全ウイルス−１型増幅用プライマー |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5599662A (ja) |
| EP (1) | EP0727497B1 (ja) |
| JP (1) | JP4463884B2 (ja) |
| AT (1) | ATE237698T1 (ja) |
| CA (1) | CA2169315C (ja) |
| DE (1) | DE69627408T2 (ja) |
| ES (1) | ES2196100T3 (ja) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6342349B1 (en) | 1996-07-08 | 2002-01-29 | Burstein Technologies, Inc. | Optical disk-based assay devices and methods |
| US20050214827A1 (en) * | 1996-07-08 | 2005-09-29 | Burstein Technologies, Inc. | Assay device and method |
| US6331275B1 (en) | 1996-07-08 | 2001-12-18 | Burstein Technologies, Inc. | Spatially addressable, cleavable reflective signal elements, assay device and method |
| BR9710702A (pt) | 1996-07-08 | 2000-01-11 | Burstein Lab Inc | Dispositivo de elemento de sinal clivável e método. |
| DE19644248A1 (de) * | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Primer und Probes zum Nachweis von HIV |
| CA2222769C (en) * | 1997-01-17 | 2001-06-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Primers for the detection of hiv-1 |
| EP0866071B1 (en) * | 1997-03-20 | 2004-10-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Modified primers |
| US5962665A (en) * | 1997-06-16 | 1999-10-05 | Abbott Laboratories | Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2 |
| US6001558A (en) * | 1997-06-25 | 1999-12-14 | Ortho Clinical Diagnostics, Inc. | Amplification and detection of HIV-1 and/or HIV 2 |
| US6881537B1 (en) | 1997-08-08 | 2005-04-19 | Biomerieux, B.V. | Nucleic acid sequences that can be used as primers and probes in the amplification and detection of all subtypes of HIV-1 |
| US6846905B2 (en) * | 1997-08-15 | 2005-01-25 | Abbott Laboratories | Antigen constructs useful in the detection and differentiation of antibodies to HIV |
| US6635418B2 (en) * | 1998-02-13 | 2003-10-21 | Igen International, Inc. | Assay methods for nucleic acid in a sample |
| EP1097378A2 (en) * | 1998-07-21 | 2001-05-09 | Burstein Laboratories Inc. | Optical disc-based assay devices and methods |
| US7244570B2 (en) * | 1998-08-04 | 2007-07-17 | Luminex Molecular Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for modulating “marginally indiscriminant” hybridizations |
| DE19850186A1 (de) * | 1998-10-30 | 2000-05-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV |
| US6303293B1 (en) * | 1999-02-02 | 2001-10-16 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Oligonucleotide reverse transcription primers for efficient detection of HIV-1 and HIV-2 and methods of use thereof |
| AU3219400A (en) * | 1999-02-03 | 2000-08-25 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Methods and reagents for molecular detection of hiv-1 groups m, n and |
| ES2269129T3 (es) * | 1999-04-09 | 2007-04-01 | Exact Sciences Corporation | Procedimientos para detectar acidos nucleicos reveladores de cancer. |
| WO2000068436A1 (en) * | 1999-05-07 | 2000-11-16 | Nationales Zentrum Für Retroviren | Detection system for human immunodeficiency virus based on nucleic acid amplification |
| DE60043789D1 (de) * | 1999-07-09 | 2010-03-18 | Gen Probe Inc | HIV-1 Detektion mittels Nukleinsäureamplifizierung |
| US6849403B1 (en) * | 1999-09-08 | 2005-02-01 | Exact Sciences Corporation | Apparatus and method for drug screening |
| US6586177B1 (en) | 1999-09-08 | 2003-07-01 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| CA2391560A1 (en) * | 1999-11-16 | 2001-05-25 | Geneart Gmbh Gessellschaft Fur Angewandte Biotechnologie | The genome of the hiv-1 inter-subtype (c/b') and use thereof |
| WO2001042781A2 (en) * | 1999-12-07 | 2001-06-14 | Exact Sciences Corporation | Supracolonic aerodigestive neoplasm detection |
| US6919174B1 (en) | 1999-12-07 | 2005-07-19 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
| AU2001233513A1 (en) * | 2000-02-04 | 2001-08-14 | K.U. Leuven Research And Development | Hiv-1 resistance assay |
| US6582920B2 (en) | 2000-09-01 | 2003-06-24 | Gen-Probe Incorporated | Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| DE60045932D1 (de) * | 2000-09-01 | 2011-06-16 | Gen Probe Inc | HIV-1-Sequenzverstärkung zur Erkennung von Sequenzen in Zusammenhang mit Wirkstoffresistenz-Mutationen |
| US6770752B2 (en) | 2001-01-09 | 2004-08-03 | Becton, Dickinson And Company | Sequences for detection of HIV-1 |
| WO2002070731A2 (en) | 2001-03-05 | 2002-09-12 | Visible Genetics Inc. | Methods and primers for evaluating hiv-1 mutations |
| AU2003213107A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-09-09 | Exact Sciences Corporation | Methods for analysis of molecular events |
| US20050014249A1 (en) * | 2003-02-21 | 2005-01-20 | Norbert Staimer | Chromatographic analysis on optical bio-discs and methods relating thereto |
| US7820030B2 (en) * | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US20040259101A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Shuber Anthony P. | Methods for disease screening |
| DE602004028862D1 (de) * | 2003-12-19 | 2010-10-07 | Gen Probe Inc | Der nukleinsäuren von hiv-1 und hiv-2 |
| EP2309269B1 (en) * | 2004-09-08 | 2016-10-26 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Compositions and methods for the detection of HIV-1/HIV-2 infection. |
| KR101390072B1 (ko) | 2004-09-14 | 2014-04-30 | 아고스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | 병원체의 균주 독립성 증폭 및 그에 대한 백신 |
| JP2010521156A (ja) * | 2007-03-16 | 2010-06-24 | ４５４ ライフ サイエンシーズ コーポレイション | Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法 |
| DE102008025328B4 (de) | 2008-05-27 | 2013-10-17 | DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH | Zusammensetzungen und Verfahren zur Amplifikation von HI-Viren mittels Multiplex-PCR in multiplen Genombereichen |
| US20100136516A1 (en) * | 2008-12-01 | 2010-06-03 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for detection of HIV integrase variants |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1369427A3 (en) * | 1988-06-09 | 2004-05-12 | Innogenetics N.V. | HIV-3 retrovirus strains and their use |
| AU1741692A (en) * | 1991-03-13 | 1992-10-21 | Regents Of The University Of California, The | Detection of 3'-azido-3'-deoxythymidine resistance |
| CA2039449A1 (en) * | 1991-03-28 | 1992-09-29 | Sharon Cassol | Hiv-1 detection primer and method of detection using the same |
| FR2677039B1 (fr) * | 1991-05-31 | 1994-09-09 | Cis Bio Int | Oligonucleotides, utilisables comme reactifs pour la detection in vitro des infections a retrovirus de type hiv et procede de detection de retrovirus de type hiv. |
| PT726962E (pt) * | 1991-12-23 | 2006-10-31 | Chiron Corp | Sondas para hiv para uso em ensaios de hibridacao em sanduiche em fase de solucao |
| JP3277045B2 (ja) * | 1992-10-06 | 2002-04-22 | デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | Ｈｉｖ−グループのレトロウイルスおよびその使用 |
| WO1994023069A1 (en) * | 1993-03-26 | 1994-10-13 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
-
1995
- 1995-02-17 US US08/390,192 patent/US5599662A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-08 DE DE69627408T patent/DE69627408T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-08 AT AT96101784T patent/ATE237698T1/de active
- 1996-02-08 EP EP96101784A patent/EP0727497B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-08 ES ES96101784T patent/ES2196100T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 CA CA002169315A patent/CA2169315C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-16 JP JP02956596A patent/JP4463884B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5599662A (en) | 1997-02-04 |
| ES2196100T3 (es) | 2003-12-16 |
| EP0727497B1 (en) | 2003-04-16 |
| EP0727497A1 (en) | 1996-08-21 |
| ATE237698T1 (de) | 2003-05-15 |
| JPH08242898A (ja) | 1996-09-24 |
| DE69627408D1 (de) | 2003-05-22 |
| DE69627408T2 (de) | 2004-03-25 |
| CA2169315C (en) | 2009-02-03 |
| CA2169315A1 (en) | 1996-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4463884B2 (ja) | 免疫不全ウイルス−１型増幅用プライマー | |
| JP3814352B2 (ja) | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー | |
| JP2576980B2 (ja) | ウイルス検出用キツト | |
| US5962665A (en) | Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2 | |
| US6303293B1 (en) | Oligonucleotide reverse transcription primers for efficient detection of HIV-1 and HIV-2 and methods of use thereof | |
| US5589333A (en) | In situ polymerase chain reaction | |
| JP2692702B2 (ja) | 単純ヘルペスウイルスの検出方法およびそのための試薬 | |
| AU741141B2 (en) | Specific and sensitive method for detecting nucleic acids | |
| EP2390259A2 (en) | Amplification and detection reagents for HIV-1 | |
| RU2186112C2 (ru) | Олигонуклеотидный праймер, пара праймеров, набор праймеров (варианты), способ их изготовления для амплификации нуклеиновой кислоты вич-1 | |
| JP2022546443A (ja) | ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡを含む、Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの増幅および検出のための組成物および方法 | |
| JPH10117780A (ja) | Ｈｉｖ検出用プライマー及びプローブ | |
| JP2008510467A (ja) | 長さ多型を有する準種において変異を検出するための方法および材料 | |
| Hoad et al. | Virus genome detection by the polymerase chain reaction (PCR) | |
| EP0879894A2 (en) | Sample preparation for nucleic acid based diagnostic tests | |
| CA2236613A1 (en) | Sample preparation for nucleic acid based diagnostic tests | |
| MXPA98000480A (en) | Cebadores for vi detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060530 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20060817 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20060822 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061129 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070123 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070423 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20070703 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20071012 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100218 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130226 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130226 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140226 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |