JP4451132B2

JP4451132B2 - 新規スピノシン誘導体の製造方法

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Publication number: JP4451132B2
Application number: JP2003515514A
Authority: JP
Inventors: イエシユケー，ペーター; エベルツ，ギユンター; フレデ，リタ; メールレ，フオルカー; フエルテン，ロベルト
Original assignee: バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 2001-07-20
Filing date: 2002-07-08
Publication date: 2010-04-14
Anticipated expiration: 2022-07-08
Also published as: US20060173172A1; CN1556802A; DE50202431D1; EP1412346B1; DE10135550A1; ATE290532T1; JP2005503371A; US7034130B2; WO2003010155A1; US20040242858A1; EP1412346A1; CN1293069C

Description

本発明は、Ｃ−２１位において１−ヒドロキシ−エチル基で置換されている新規スピノシン誘導体の製造方法およびこのタイプの新規スピノシン誘導体それ自体および新規スピノシン誘導体の製造へのそれらの使用に関する。

スピノシンは公知化合物である。スピノシンは、放線菌Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓｐｉｎｏｓａの培養によって産生される発酵産生物である。天然スピノシンは、１２員マクロ環および５，６，５−シス−アンチ−トランス−三環、並びにその上、Ｄ−ホロサミンおよび２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｌ−ラムノース部分を有する四環式ポリケチド主鎖（アグリコン）からなる（Ｋｉｒｓｔら，１９９１，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，３２：４８３９）。２０種類を上回る異なる天然スピノシン、「Ａ８３５４３複合体」が従来記述されている（ＷＯ９７／００２６５、ＷＯ９４／２０５１８およびＷＯ９３／０９１２６を参照）。例えば、ＥＰ−Ａ３７５３１６は、スピノシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＪを記述する。ＷＯ９３／０９１２６は、スピノシンＬ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴを記述する。スピノシンＫ、Ｏ、Ｐ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＹ並びにそれらの誘導体がＷＯ９４／２０５１８において言及されている。これらの化合物は、四環式主鎖の１つ以上のメチル基、Ｄ−ホロサミン糖部分または２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｌ−ラムノース糖部分の置換において異なる。Ｄ−ホロサミン糖部分と反応する１７−シュードアグリコンも同様にＳ．ｓｐｉｎｏｓａ培養ブロスから単離されている。

Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａによって産生されるＡ８３５４３複合体の主成分は変種スピノシンＡおよびスピノシンＤであり、これらは製品スピノサッドの必須成分である（ＰｅｓｔｉｃｉｄｅＭａｎｕａｌ，ＢｒｉｔｉｓｈＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＣｏｕｎｃｉｌ．第１１版，１９９７，ｐａｇｅ１２７２並びにＤｏｗＥｌａｎｃｏＴｒａｄｅＭａｇａｚｉｎｅＤｏｗｎｔｏＥａｒｔｈ，第５２巻，第１号，１９９７およびそこで引用される文献を参照）。

Ｃ−１７位のアミノ糖が存在しない場合、それらの化合物はスピノシンＡ、Ｄ等１７−シュードアグリコンと呼ばれる；Ｃ−９位の中性糖が存在しない場合、それらの化合物はスピノシンＡ、Ｄ等９−シュードアグリコンと呼ばれる。Ｃ−９およびＣ−１７位の２つの糖残基を含まないスピノシンはスピノシンアグリコンと呼ばれる。

スピノシンはクモ類、線虫、外寄生生物（ＷＯ０１／１１９６２、ＷＯ０１／１１９６３、ＷＯ０１／１１９６４を参照）および昆虫、特には、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａおよびＤｉｐｔｅｒａ種の駆除に適する。加えて、スピノシンの技術的適用は環境的に安全であり、さらに、この物質クラスは魅力的な毒物学的プロフィールを有する。

しかしながら、動物害虫、特には外寄生生物、または現在スピノシンを用いて駆除されている植物害虫がこれらの商業的に入手可能な活性物質に対する耐性を生じ得ることを予想することができる。したがって、現在害虫の駆除に用いられているスピノシンに代わる新規の生物学的に活性なスピノシン誘導体を生成することが重要である。

近年、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種（ＬＷ１０７１２９）がスピノシンの特定の天然アグリコン誘導体の生成に用いられており、これらの誘導体はＣ−８位にヒドロキシ基を有し、かつ殺昆虫剤として知られるようになっている（ＷＯ０１／１９８４０を参照）。スピノシンの多くの修飾が行われているが（ＷＯ９７／００２６５を参照）、マクロライド主鎖のＣ−２１位のメチル基およびエチル基の誘導体化は僅かな注意を引くのみである。Ｃ−２１位のアルキル基の官能化は、とりわけ誘導体化反応に、有利ではあるが、置換基がＣ−２１にヒドロキシル基を有するスピノシン誘導体は僅かに知られるのみである。例えば、Ｃ−２１において３−ヒドロキシ−１−ブテニル基で置換され、適切であるならば、上記Ｃ−８位にヒドロキシル基をさらに担持し、かつ殺昆虫活性を有するスピノシン誘導体が記述されるのは近年になってからのみである（ＷＯ０１／１９８４０を参照）。

スピノシン誘導体の化学合成法が記述されてはいるが（Ｍａｒｔｙｎｏｗ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄＫｉｒｓｔ，Ｈ．Ａ．，１９９４，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ，５９：１５４８を参照）、Ｃ−２１位に１−ヒドロキシ−エチル基を有する上記スピノシン誘導体の化学合成に関する知識は現在まで存在していない。

本発明の目的は、Ｃ−２１位に１−ヒドロキシ−エチル基を有する新規スピノシン誘導体の選択的および／または立体特異的製造に用いることができる適切な方法を提供することである。

この目的は、一般式（Ｉ）の化合物

（ここで、
Ａ−Ｂは以下の基のいずれかであり：−ＨＣ＝ＣＨ−、−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−、−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−または−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、
Ｄは基

であり、
Ｒ^１は水素またはアミノ糖であり、および
Ｒ^２は水素または糖である）
の製造方法であって、一般式（ＩＩ）の化合物

（ここで、
Ａ−Ｂ、ＤおよびＲ^１は上に定義される通りである）
を水性栄養培地中、好気性条件下において微生物と接触させるか、またはそれらから調製される酵素抽出物もしくはそれらから単離される１種類以上の酵素と接触させる方法を提供することによって達成された。

したがって、出発化合物は、微生物またはそれらの酵素を用いる生体内変換により、選択的および／または立体特異的に、Ｃ−２１位において１−ヒドロキシ−エチル基によって置換されているスピノシン誘導体に変換される。

「スピノシン誘導体」という用語は、ここで用いられる場合、スピノシンアグリコン化合物、すなわち、スピノシンのマクロライド主鎖は有するものの糖基を持たない化合物をも含む。

ケース（１）において、
Ａ−Ｂが以下の基のいずれかであり：−ＨＣ＝ＣＨ−、−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−、−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−もしくは−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が式１ａ

のアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ａ

の糖であるか、
または、ケース（２）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−または−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素または式２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅもしくは２ｆ

の糖であるか、
または、ケース（３）において、
Ａ−Ｂが以下の基のいずれかであり：−ＨＣ＝ＣＨ−、−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−もしくは−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素もしくは式１ｂ

のアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素もしくは上記式２ａの糖であるか、
または、ケース（４）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｊもしくは２ｋ

の糖であるか、
または、ケース（５）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ｌもしくは２ｍ

の糖であるか、
または、ケース（６）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素または上記式１ｂのアミノ糖もしくは式１ｃ

のアミノ糖であり、および
Ｒ^２が上記式２ｂ、２ｃ、２ｇもしくは２ｈの糖または式２ｎ

の糖であるか、
または、ケース（７）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ｏ

の糖であるか、
または、ケース（８）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ｂのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が上記式２ｄ、２ｉもしくは２ｊの糖または式２ｐ

の糖であるか、
または、ケース（９）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素または上記式１ｃのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が上記式２ｉもしくは２ｐの糖であるか、
または、ケース（１０）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が式１ｄ、１ｅもしくは１ｆ

のアミノ糖であり、および
Ｒ^２が上記式２ａの糖であるか、
または、ケース（１１）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が水素または上記式１ａのアミノ糖である、
式（ＩＩ）の化合物を出発化合物として用いることが好ましい。

ケース（１２）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ａ、２ｇもしくは２ｈの糖であるか、
または、ケース（１３）において
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素または式２ｄ、２ｅ、２ｌ、２ｍもしくは２ｏの糖であるか、
または、ケース（１４）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素または式１ｂのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素または式２ａの糖であるか、
または、Ａ−Ｂ、ＤおよびＲ^１がケース（１１）において定義される通りである、
一般式（ＩＩ）の化合物を出発化合物として用いることが特に好ましい。

ケース（１５）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ａの糖であるか、
または、ケース（１６）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素または式２ｄ、２ｌもしくは２ｍの糖であるか、
または、Ａ−Ｂ、ＤおよびＲ^１がケース（１１）において定義される通りである、
一般式（ＩＩ）の化合物を出発化合物として用いることが極めて好ましい。

ケース（１７）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ａの糖であるか、
または、ケース（１８）において、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素であり、および
Ｒ^２が水素である、
一般式（ＩＩ）の化合物を出発化合物として用いることが最も好ましい。

本発明は、Ａ−Ｂ、ＤおよびＲ^１が上に定義される通りである一般式（Ｉ）の化合物にも関する。

ここで用いられる略語「Ｍｅ」はメチルを表し；略語「Ｅｔ」はエチルを表す。

本発明の方法は、一般式（Ｉ）の化合物の光学的に活性な立体異性体形態の形成に用いることができるが、ジアステレオマー形態の形成にも用いることができる。

本発明の式（Ｉ）の化合物は、像および鏡像として挙動する（鏡像体）か、または像および鏡像として挙動しない（ジアステレオマー）立体異性体形態で存在し得る。本発明は、鏡像体およびジアステレオマーの両者並びにそれらそれぞれの混合物に関する。ジアステレオマーに加えてラセミ形態は公知の方法で立体異性的に均一な化合物に分解することができる。適切であるならば、それ自体公知の方法をそれらの異性体の相互変換に用いることができる。

Ｒ^１が式１ａ−１ｅのアミノ糖である本発明の化合物は塩を形成することができる。塩は、塩を調製するための標準法に従って形成される。例えば、酸付加塩を生成するため、本発明の化合物を適切な酸で中和する。代表的な使用可能酸付加塩は、例えば、他の無機酸、例えば、硫酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、または有機カルボン酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、ギ酸、マレイン酸、ショウノウ酸、フタル酸、グリコール酸、グルタミン酸、ステアリン酸、サリチル酸、ソルビン酸、ケイ皮酸、ピクリン酸、安息香酸、または有機スルホン酸、例えば、メタンスルホン酸およびパラ−トルエンスルホン酸との、または塩基性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン等との反応のために形成される塩である。

本発明の方法に出発化合物として用いることができる一般式（ＩＩ）の化合物は記述されており（ＣｒｅｅｍｅｒＬ．Ｃ．ら，１９９８，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ５１（８）：７９５−８００；ＳｐａｒｋｓＴ．Ｃ．ら，１９９８，Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．９１（６）：１２７７−１２８３；ＳｐａｒｋｓＴ．Ｃ．ら，２０００，Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６７（３）：１８７−１９７；ＰａｑｕｅｔｔｅＬＡ．ら，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０（１１）：２５５３−２５６３；ＥｖａｎｓＤ．Ａ．ら，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５（１１）：４４９７−４５１３；ＣｒｏｕｓｅＧ．Ｄ．ら，２００１，Ｐｅｓｔ．Ｍａｎａｇ．Ｓｃｉ．５７（２）：１７７−１８５；ＣｒｅｅｍｅｒＬ．Ｃ．ら，２０００，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ５３（２）：１７１−１７８；ＳｐａｒｋｓＴ．Ｃ．ら，２０００，Ｐｒｏｃ．−ＢｅｌｔｗｉｄｅＣｏｔｔｏｎＣｏｎｆ．第２巻：１２２５−１２２９を参照）、またはＷＯ０１／１６３０３に記述される方法に従って調製することができる。同様に、本発明の方法に使用可能な出発化合物は適切な天然スピノシンから出発して得ることができる。

例えば、式（ＩＩａ）のスピノシンＡアグリコンを用いるとき、本発明の方法は以下の反応スキーム１によって表すことができる：

微生物またはそれらの酵素を用いる生物変換による天然産生物および合成化合物の選択的および／または立体特異的ヒドロキシル化は文献に記述されている。特には、グラム陽性菌、例えば、ストレプトミセテス、もしくはグラム陰性菌、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、または真菌、例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍの細胞および／または酵素を用いた。適切な酵素クラス、例えば、Ｐ−４５０モノオキシゲナーゼを含む微生物の例を以下の表に列挙する：

本発明および上記反応スキーム１に従い、Ａ−Ｂ、ＤおよびＲ^１が上に定義される通りである一般式（ＩＩ）の化合物を水性栄養培地中、好気性条件下で適切な微生物と接触させ、次いで一般式（Ｉ）の所望の化合物を単離することができる。

前記微生物の代わりに、前記微生物から出発して通常の方法によって得ることができる酵素抽出物および精製酵素を、適切であるならば必要な補因子の添加の後に、またはそれを再生しながら、用いることも可能である。

特には、そのような酵素の生合成を決定し、かつ外来宿主、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）においてそれらを発現する遺伝子をクローン化することも可能である。このタイプの組換え細菌は生物変換に直ちに用いることができる。加えて、そのような組換え細胞の酵素抽出物または精製タンパク質を、適切である場合には必要な補因子の添加の後に、またはそれを再生しながら、生物変換に用いることも可能である。

放線菌群、特には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属からの微生物を本発明の方法に用いることが好ましい。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ属の株を本発明の方法に用いることが特に好ましい。

以下の株の特徴を有する株を本発明の方法に用いることが極めて好ましい：

この表において言及される株は、ブダペスト条約の要求に従い、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｉｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツに再度寄託されている。

これらの株は実施例１６においてより詳細に説明される。寄託された株それ自体だけではなくそれらの突然変異体を用いることも、これらの突然変異体が寄託された株の特徴を有する限り、これらの突然変異体が可能であり、すなわち、これらの突然変異体は依然として本発明の生物変換を実施することが可能でなければならない。

水性栄養培地は、好ましくは、同化可能な炭素源および同化可能な窒素源を含む。

式（Ｉ）の化合物は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓまたはＳ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ種の株を水性栄養培地中、好気性条件下、式（ＩＩ）の化合物の存在下で発酵させるときに生成される。これらの微生物は、典型的には、炭素源および、適切である場合には、タンパク質性物質を含む栄養培地において発酵させる。好ましい炭素源には、グルコース、黒砂糖、スクロース、グリセロール、デンプン、コーンスターチ、ラクトース、デキストリン、糖蜜等が含まれる。好ましい窒素源には、綿実粉、酵母、自己融解パン酵母、固形乳成分、大豆粉、トウモロコシ粉、膵臓もしくはパパインカゼイン加水分解物、固形蒸留成分、動物ペプトンのブロス、肉および骨画分等が含まれる。これらの炭素および窒素源の組合せを用いることが好ましい。トレース元素、例えば、亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄等は、水道水および非精製成分が培地の成分として用いられる限り、添加する必要はない。

一般式（Ｉ）の化合物の産生は、微生物の十分な成長を保証するいかなる温度でも誘導することができる。温度は、好ましくは２１℃から３２℃、特に好ましくは約２８℃である。式（Ｉ）の化合物の最適産生は、通常、式（ＩＩ）の化合物を培養に添加した後２から４日以内に達成される。本発明の化合物は振盪瓶および攪拌発酵器の両者において産生させることができる。

振盪フラスコにおける成長に好ましい成長条件および培地は実施例２から９において説明される。

生物変換産生物としての本発明の化合物は通常の方法によって培養培地から単離することができる。

発酵ブロスから本発明の化合物を単離および精製するために様々な方法、例えば、調製用ゲルクロマトグラフィー、逆相での調製用クロマトグラフィーまたは調製用吸収クロマトグラフィーを適用することができる。検出は、例えば、ＵＶ吸収または質量分析によって行うことができる。

本発明の化合物は生物学的に活性の、特には殺昆虫性および殺クモ性の、スピノシンの調製に用いることができる。マクロライド主鎖のＣ−８位にヒドロキシル基を有するスピノシンの天然アグリコン誘導体の生物学的効力が近年記述されている（ＷＯ０１／１９８４０を参照）。言及することができるさらなる例は、Ｃ−２１位に３−ヒドロキシ−１−ブテニル基を有し、同様に近年記述されているスピノシン誘導体である。適切であるならば、これらのスピノシン誘導体は上記Ｃ−８位のいずれかにヒドロキシル基をさらに有することができ、同様に殺昆虫活性を有する（ＷＯ０１／１９８４０を参照）。

Ｒ^１が水素であり、かつＤが基Ｃ＝ＯまたはＣ−Ｏ−Ｒ^２（ここで、Ｒ^２は水素である）である一般式（Ｉ）の本発明の化合物からさらなるスピノシン誘導体を調製するとき、適切な保護基（ＰＧ）を用いることが有利である。ヒドロキシル基の保護基（ＰＧ）の公知の例は、置換メチルエーテルおよびエーテル、置換エチルエーテル、置換ベンジルエーテル、シリルエーテル、エステル、カーボネートまたはスルホネートである（ＧｒｅｅｎｅＴ．Ｗ．，ＷｕｔｓＰ．Ｇ．Ｗ．ｉｎＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｈｎｓ，Ｉｎｃ．１９９９，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｈｙｄｒｏｘｙｌｇｒｏｕｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１，２− ａｎｄ１，３−ｄｉｏｌｓを参照）。

言及することができるメチルエーテル型の保護基（ＰＧ）の例は：メトキシメチル（ＭＯＭ）エーテル、メチルチオメチル（ＭＴＭ）エーテル、（フェニル−ジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ−ＯＲ）エーテル、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ−ＯＲ）エーテル、パラ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ−ＯＲ）エーテル、パラ−ニトロベンジルオキシ−メチルエーテル、オルト−ニトロベンジルオキシメチル（ＮＢＯＭ−ＯＲ）エーテル、（４−メトキシフェノキシ）−メチル（ｐ−ＡＯＭ−ＯＲ）エーテル、グアイアコールメチル（ＧＵＭ−ＯＲ）エーテル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチルエーテル、４−ペンテニル−オキシメチル（ＰＯＭ−ＯＲ）エーテル、シリルオキシメチルエーテル、２−メトキシエトキシ−メチル（ＭＥＭ−ＯＲ）エーテル、２，２，２−トリクロロエトキシメチルエーテル、ビス（２−クロロエトキシ）−メチルエーテル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ−ＯＲ）エーテル、メトキシ−メチル（ＭＭ−ＯＲ）エーテルである。

言及することができる置換エチルエーテル型の保護基（ＰＧ）の例は：１−エトキシエチル（ＥＥ−ＯＲ）エーテル、１−（２−クロロエトキシ）エチル（Ｃｅｅ−ＯＲ）エーテル、１−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］エチル（ＳＥＥ−ＯＲ）エーテル、１−メチル−１−メトキシエチル（ＭＩＰ−ＯＲ）エーテル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル（ＭＢＥ−ＯＲ）エーテル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロ−エチルエーテル、１−メチル−１−フェノキシ−エチルエーテル、２，２，２−トリクロロエチルエーテル、１，１−ジアニシル−２，２，２−トリクロロエチル（ＤＡＴＥ−ＯＲ）エーテル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−フェニルイソ−プロピル（ＨＩＰ−ＯＲ）エーテル、２−トリメチルシリルエチルエーテル、２−（ベンジルチオ）エチルエーテル、２−（フェニル−セレニル）エチルエーテルである。言及することができるエーテル型の保護基（ＰＧ）のさらなる例は：テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ−ＯＲ）エーテル、３−ブロモ−テトラヒドロピラニル（３−ＢｒＴＨＰ−ＯＲ）エーテル、テトラヒドロチオピラニルエーテル、１−メトキシ−シクロヘキシルエーテル、２−および４−ピコリルエーテル、３−メチル−２−ピコリル−Ｎ−オキシドエーテル、２−キノリニルメチル（Ｑｍ−ＯＲ）エーテル、１−ピレニルメチルエーテル、ジペニルメチル（ＤＰＭ−ＯＲ）エーテル、パラ，パラ’−ジニトロベンズ−ヒドリル（ＲＯ−ＤＮＢ）エーテル、５−ジベンゾスベリルエーテル、トリフェニルエチル（Ｔｒ−ＯＲ）エーテル、α−ナフチルジフェニルメチルエーテル、パラ−メトキシ−フェニルジフェニルメチル（ＭＭＴｒ−ＯＲ）エーテル、ジ（パラ−メトキシ−フェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ−ＯＲ）エーテル、トリ（パラ−メトキシ−フェニル）メチル（ＴＭＴｒ−ＯＲ）エーテル、４−（４’−ブロモ−フェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチルエーテル、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタリミド−フェニル）メチル（ＣＰＴｒ−ＯＲ）エーテル、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシ−フェニル）メチル（ＴＬＴｒ−ＯＲ）エーテル、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）−メチル（ＴＢＴｒ−ＯＲ）エーテル、４，４’−ジメトキシ−３”−［Ｎ−（イミダゾリルメチル）］−トリチル（ＩＤＴｒ−ＯＲ）エーテル、４，４’−ジメトキシ−３”−［Ｎ−（イミダゾリル−エチル）カルバモイル］トリチル（ＩＥＴｒ−ＯＲ）エーテル、１，１−ビス（４−メトキシ−フェニル）−１’−ピレニルメチル（Ｂｍｐｍ−ＯＲ）エーテル、９−アントリルエーテル、９−（９−フェニル）キサンテニル（ピキシル−ＯＲ）エーテル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル（トリチロンエーテル）。４−メトキシ−テトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ−ＯＲ）エーテル、４−メトキシ−テトラヒドロチオ−ピラニルエーテル、４−メトキシ−テトラヒドロチオ−ピラニルエーテルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ−ＯＲ）エーテル、１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシ−ピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ−ＯＲ）エーテル、１，４−ジオキサン−２−イルエーテル、テトラヒドロフラニルエーテル、テトラヒドロチオフラニルエーテル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタンベンゾフラン−２−イル（ＲＯ−ＭＢＦ）エーテル、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アリルエーテル、プロパルギルエーテル、パラ−クロロフェニルエーテル、パラ−メトキシフェニルエーテル、パラ−ニトロフェニルエーテル、２，４−ジニトロ−フェニル（ＲＯ−ＤＮＰ）エーテル、２，３，５，６−テトラフルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニルエーテル、ベンジル（Ｂｎ−ＯＲ）エーテルである。言及することができる置換ベンジルエーテル型の保護基の例は：パラ−メトキシベンジル（ＭＰＭ−ＯＲ）エーテル、３，４−ジメトキシ−ベンジル（ＤＭＰＭ−ＯＲ）エーテル、オルト−ニトロベンジルエーテル、パラ−ニトロベンジルエーテル、パラ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロ−ベンジルエーテル、パラ−シアノベンジルエーテル、パラ−フェニル−ベンジルエーテル、２，６−ジフルオロベンジルエーテル、パラ−アミノアシルベンジル（ＰＡＢ−ＯＲ）エーテル、パラ−アジドベンジル（Ａｚｂ−ＯＲ）エーテル、４−アジド−３−クロロベンジルエーテル、２−トリフルオロメチル−ベンジルエーテル、パラ−（メチルスルフィニル）ベンジルＭｓｉｂ−ＯＲ）エーテルである。言及することができるシリルエーテル型の保護基（ＰＧ）の例は：トリメチルシリル（ＴＭＳ−ＯＲ）エーテル、トリエチルシリル（ＴＥＳ−ＯＲ）エーテル、トリイソ−プロピルシリル（ＴＩＰＳ−ＯＲ）エーテル、ジメチルイソプロピル−シリル（ＩＰＤＭＳ−ＯＲ）エーテル、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ−ＯＲ）エーテル、ジメチルヘキシルシリル（ＴＤＳ−ＯＲ）エーテル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ−ＯＲ）エーテル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ−ＯＲ）エーテル、トリベンジルシリルエーテル、トリ−パラ−キシリルシリルエーテル、トリフェニルシリル（ＴＰＳ−ＯＲ）エーテル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ−ＯＲ）エーテル、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルメチルシリル（ＤＴＢＭＳ−ＯＲ）エーテル、トリス（トリメチルシリル）シリルエーテル（シシルエーテル）、（２−ヒドロキシスチリル）−ジメチルシリル（ＨＳＤＭＳ−ＯＲ）エーテル、（２−ヒドロキシスチリル）ジイソプロピルシリル（ＨＳＤＩＳ−ＯＲ）エーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ−ＯＲ）エーテル、ｔｅｒｔ−ブトキシジフェニルシリル（ＤＰＴＢＯＳ−ＯＲ）エーテルである。言及することができるエステル型の保護基（ＰＧ）の例は：ギ酸エステル、ベンゾイルギ酸エステル、酢酸エステル（ＲＯ−Ａｃ）、クロロ酢酸エステル、ジクロロ酢酸エステル、トリクロロ酢酸エステル、トリフルオロ酢酸エステル（ＲＯ−ＴＦＡ）、メトキシ−酢酸エステル、トリフェニルメトキシ酢酸エステル、フェノキシ酢酸エステル、パラ−クロロフェノキシ−酢酸エステル、フェニル酢酸エステル、ジフェニル酢酸エステル（ＤＰＡ−ＯＲ）、ニコチン酸エステル、３−フェニルプロピオン酸エステル、４−ペンテン酸エステル、４−オキソペンタン酸エステル（レブリネート）（Ｌｅｖ−ＯＲ）、４，４−（エチレンジチオ）−ペンタン酸エステル（ＲＯ−ＬｅｖＳ）、５−［３−ビス（４−メトキシフェニル）ヒドロキシ−メチルフェノキシ］−レブリン酸エステル、ピバリン酸エステル（Ｐｖ−ＯＲ）、１−アダマンタンカルボン酸エステル、クロトン酸エステル、４−メトキシ−クロトン酸エステル、安息香酸エステル（Ｂｚ−ＯＲ）、パラ−フェニル−安息香酸エステル、２，４，６−トリメチル安息香酸エステル（メシトイックエステル（ｍｅｓｉｔｏｉｃｅｓｔｅｒｓ））、４−（メチルチオメトキシ）−酪酸エステル（ＭＴＭＢ−ＯＲ）、２−（メチルチオメトキシメチル）安息香酸エステル（ＭＴＭＴ−ＯＲ）である。言及することができるエステル型の保護基（ＰＧ）の例は：メチルカーボネート、メトキシメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ−ＯＲ）、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ−ＯＲ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロ−エチルカーボネート（ＴＣＢＯＣ−ＯＲ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ−ＯＲ）、２−（フェニルスルホニル）−エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ−ＯＲ）、２−（トリフェニルホスホニオ）−エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ−ＯＲ）、ｔｅｒｔ−ブチルカーボネート（Ｂｏｃ−ＯＲ）、イソブチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネート（Ａｌｌｏｃ−ＯＲ）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、ベンジルカーボネート（Ｚ−ＯＲ）、パラ−メトキシベンジルカーボネート、３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、オルト−ニトロベンジルカーボネート、パラ−ニトロベンジルカーボネート、２−ダンシルエチルカーボネート（Ｄｎｓｅｏｃ−ＯＲ）、２−（４−ニトロフェニル）−エチルカーボネート（Ｎｐｅｏｃ−ＯＲ）、２−（２，４−ジニトロフェニル）エチルカーボネート（Ｄｎｐｅｏｃ−ＯＲ）である。言及することができるスルホネート型の保護基（ＰＧ）の例は：アリルスルホネート（Ａｌｓ−ＯＲ）、メタンスルホネート（Ｍｓ−ＯＲ）、ベンジルスルホネート、トシレート（Ｔｓ−ＯＲ）、２−［（４−ニトロフェニル）エチル］スルホネート（Ｎｐｅｓ−ＯＲ）である。

上記一般式（Ｉ）の化合物からさらなるスピノシン誘導体を調製するとき、最初にＣ−２１位の１−ヒドロキシ−エチル基および、適切であるならば、Ｃ−９位のヒドロキシル基（Ｒ^２＝Ｈである場合）を適切な、例えば上述のもののうちの１つ、保護基（ＰＧ）で遮断することが非常に有利であり得る。ここでは２つの異なる保護基（それぞれ、ＰＧ^１およびＰＧ^２）の使用が推奨され、これらの保護基は適切に適合しなければならず、すなわち、互いに選択的かつ独立に除去可能でなければならない。次に、化学合成または微生物生物変換（ＵＳ５５３９０８９；基ＲまたはＲ’の導入も参照）によるＣ−１７位のヒドロキシル基に対する誘導体化、例えば、グリコシド化を行ない、スピノシン誘導体（Ｉａ−２またはＩｂ−２）を得る（スキーム２および３を参照）。

（ｉ）導入−保護基（ＰＧ^１、ＰＧ^２）
（ｉｉ）誘導体化−例えば、グリコシル化（それぞれ、ＲおよびＲ’）
（ｉｉｉ）脱遮断−保護基（ＰＧ）／または選択的脱遮断−保護基（例えば、ＰＧ^１）

（ｉ）導入−保護基（ＰＧ）
（ｉｉ）誘導体化−例えば、グリコシル化（Ｒ）
（ｉｉｉ）脱遮断−保護基（ＰＧ）
Ｃ−９位および、それぞれ、Ｃ−１７（Ｉａ−４を参照）またはＣ−１７（Ｉｂ−２を参照）の誘導体化が成功した後、残りの保護基（ＰＧ）を除去し、一般式（Ｉ）のスピノシン誘導体を得ることができる。

用いられる株
表：Ｃ−２１位に１−ヒドロキシ−エチル基を有する対応誘導体（化合物（Ｉａ））をもたらす化合物（ＩＩａ）の生物変換が可能な株

Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３を用いる生物変換
化合物（ＩＩａ）から化合物（Ｉａ）を生成するための例示的生物変換プロトコル。

１００ｍｌ三角フラスコ内に２０ｍｌのＲ５Ａ培地（Ｒ５Ａ培地のリットル当たり：１０３ｇのスクロース；０．２５ｇのＫ_２ＳＯ_４；１０．１２ｇのＭｇＣｌ_２；１０ｇのグルコース；５ｇの酵母抽出物；０．１ｇのカザミノ酸、２１ｇのＭＯＰＳバッファｐＨ６．８（ＫＯＨ）、２ｍｌのトレース元素溶液；トレース元素溶液：（リットル当たり）４０ｍｇのＺｎＣｌ_２、２００ｍｇのＦｅＣｌ_３×６Ｈ_２Ｏ、１０ｍｇのＣｕＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、１０ｍｇのＭｎＣｌ_２×４Ｈ_２Ｏ、１０ｍｇのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７×１０Ｈ_２Ｏ、１０ｍｇの（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４×４Ｈ_２Ｏ；（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら，１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：４９２９：Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５，ＧｅｎｅｔｉｃｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．ＴｈｅＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，英国）に、各々の場合において、５０μｌのＳ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３胞子懸濁液を接種することによって産生培養物を調製した。接種に先立ち、培地を１２１℃および１．１の過圧で２０分間滅菌した。これらの培養物を２８℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーションの２４時間および７２時間後、各々の場合において１ｍｇの化合物（ＩＩａ）（メタノール中１０ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液１００μｌ）を添加した。１２０時間後に生物変換を停止させた。それらの培養物を遠心（４０００ｒｐｍ、１０分）によって除去し、上清を同じ容積のメタノールと混合した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓを用いる生物変換
化合物（ＩＩａ）から化合物（Ｉａ）を生成するための例示的生物変換プロトコル。

実施例２の方法を、Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３株の代わりにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ株の胞子懸濁液５０μｌを用いて適用することにより、産生培養物を調製した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓを用いる生物変換
化合物（ＩＩａ）から化合物（Ｉａ）を生成するための例示的生物変換プロトコル。

実施例２の方法を、Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３株の代わりにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓ株の胞子懸濁液５０μｌを用いて適用することにより、産生培養物を調製した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓを用いる生物変換
化合物（ＩＩａ）から化合物（Ｉａ）を生成するための例示的生物変換プロトコル。

実施例２の方法を、Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３株の代わりにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ株の胞子懸濁液５０μｌを用いて適用することにより、産生培養物を調製した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓを用いる生物変換
化合物（ＩＩａ）から化合物（Ｉａ）を生成するための例示的生物変換プロトコル。

実施例２の方法を、Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３株の代わりにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ株の胞子懸濁液５０μｌを用いて適用することにより、産生培養物を調製した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓを用いる生物変換
化合物（ＩＩａ）から化合物（Ｉａ）を生成するための例示的生物変換プロトコル。

実施例２の方法を、Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３株の代わりにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ株の胞子懸濁液５０μｌを用いて適用することにより、産生培養物を調製した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓを用いる生物変換
Ｃ−２１位に１−ヒドロキシ−エチル基を有するスピノシンＡ［Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、およびＤが基−ＣＯ−Ｒ^２（ここで、Ｒ^２は式２ａの糖）である一般式（Ｉ）の化合物］を生成するための例示的生物変換プロトコル。

１００ｍｌ三角フラスコ内に２０ｍｌのＲ５Ａ培地（Ｒ５Ａ培地：実施例２を参照）に、各々の場合において、５０μｌのＳ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３胞子懸濁液を接種することによって産生培養物を調製した。接種に先立ち、培地を１２１℃および１．１の過圧で２０分間滅菌した。これらの培養物を２８℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。４８時間のインキュベーションの後、２ｍｇのスピノシンＡ（メタノール中１０ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液１００μｌ）を添加した。９６時間後に生物変換を停止させた。培養物を遠心（４０００ｒｐｍ、１０分）によって除去し、上清を同じ容積のメタノールと混合した。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓを用いる生物変換
Ｃ−２１位に１−ヒドロキシ−エチル基を有する１７−シュード−スピノシンアグリコンＡ［Ｒ^１が水素であり、Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−または−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、およびＤが基−ＣＯ−Ｒ^２（ここで、Ｒ^２は式２ａの糖である）である一般式（Ｉ）の化合物］を生成するための例示的生物変換プロトコル。

１００ｍｌ三角フラスコ内に２０ｍｌのＲ５Ａ培地（Ｒ５Ａ培地：実施例２を参照）に、各々の場合において、５０μｌのＳ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３胞子懸濁液を接種することによって産生培養物を調製した。接種に先立ち、培地を１２１℃および１．１の過圧で２０分間滅菌した。これらの培養物を２８℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。４８時間のインキュベーションの後、２ｍｇの１７−シュード−スピノシンアグリコンＡ（メタノール中１０ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液１００μｌ）を添加した。９６時間後に生物変換を停止させた。培養物を遠心（４０００ｒｐｍ、１０分）によって除去し、上清を同じ容積のメタノールと混合した。

Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３を用いる生物変換からの化合物（Ｉａ）の単離
培養上清を後処理し、化合物（Ｉａ）を濃縮するための例示的プロトコル。

メタノールが添加されている実施例２の培養上清３５ｍｌを約２０ｍｌに減少させ、１０ｍｌの水を添加した。この後、各々の場合において１０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出し、合わせた有機相を乾燥するまで濃縮して、その残滓を４００μｌのメタノールに再懸濁させた。この溶液のアリコートをＨＰＬＣ／ＭＳによって分析した（実施例１１）。

分析用ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳ
ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳによって処理済培養上清を分析するための例示的プロトコル
Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓを用いた生物変換の処理済培養上清のアリコート（実施例２）を、酢酸アンモニウム（２５ミリモル／ｌ）が添加されている水および酢酸アンモニウム（２５ミリモル／ｌ）が添加されているメタノールの勾配並びに２５０μｌ／分の流速を用いる、逆相ＨＰＬＣカラム（２．１×２５０ｍｍ）でのクロマトグラフィーにかけた。検出はＵＶ（２４５ｎｍ）および四極質量分析器でのエレクトロスプレー（陽）質量分析を用いて行う。

化合物（Ｉａ）は４１８ダルトンの分子量を有し、これらの条件下でｍ／ｚ＝４３６の［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋として検出される。約３２．５分の反応時間は、約３７．５分である化合物（ＩＩａ）よりも短い。

Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３を用いた生物変換の振盪培養物からの、化合物（Ｉａ）の抽出および純粋形態での予備調製
この株（Ｓ．ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓ）の１５の２０ｍｌ培養物を１００ｍｌ三角フラスコにおいて実施例２に説明される方法に従って成長させ、それらの培養上清を合わせて化合物（Ｉａ）の後処理を行った。合わせた培養上清の後処理は実施例１１に説明されるように行った。その残滓を約３ｍｌのメタノールに再懸濁させた。水中に２５ミリモル／ｌの酢酸アンモニウムおよびメタノール中に２５ミリモル／ｌの酢酸アンモニウムの勾配を用いる、分析用逆相ＨＰＬＣカラム（４．６×２５０ｍｍ）でのクロマトグラフィーによって化合物（ＩＩａ）を単離した。各々の稼働に対して１００μｌのアリコートを注入した。２４５ｎｍでＵＶ検出を行った。画分を手動で集めて合わせ、乾燥するまで蒸発させた。収量は約１ｍｇであった。

化合物（Ｉａ）の構造の解明
予備的に単離した化合物（Ｉａ）をＣＤ_３ＯＤに再懸濁させ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって研究した。^１Ｈ−ＮＭＲ、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣスペクトルを記録した。それらの結果が下記表にまとめられている。

ＣＤ_３ＯＤ中での化合物（Ｉａ）のＮＭＲデータ（５００ＭＨｚ）

産生されたヒドロキシル化スピノシンＡの分析的検出
メタノールが添加されている実施例８の生物変換の培養上清２０ｍｌを０．０１ＮＮａＯＨ溶液でｐＨ５に調整して約５ｍｌの水性残滓に濃縮し、次にそれを各々の場合において５ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機相をＮ_２流中で乾燥するまで濃縮し、２００μｌのメタノールに再懸濁させた。この抽出物のアリコートを、エレクトロスプレー陽イオン化を用いるタンデム質量分析器でのＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって研究した。

抽出物のＬＣ／ＭＳクロマトグラムにおいて、４０分で、［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚ＝７４８．５のピークが低密度で現れる。このイオンの娘イオンのスペクトルはｍ／ｚ＝１４２のフラグメントを有し、これはホロサミン単位の除去に特徴的なものである。

産生されたヒドロキシル化１７−シュード−スピノシンアグリコンの分析的検出
メタノールが添加されている実施例９の生物変換の培養上清２０ｍｌを０．０１ＮＮａＯＨ溶液でｐＨ５に調整して約５ｍｌの水性残滓に濃縮し、次にそれを各々の場合において５ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機相をＮ_２流中で乾燥するまで濃縮し、２００μｌのメタノールに再懸濁させた。この抽出物のアリコートを、エレクトロスプレー陽イオン化を用いるタンデム質量分析器でのＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって研究した。

抽出物のＬＣ／ＭＳクロマトグラムにおいて、３８．８分で、［Ｍ＋ＮＨ_４］^＋ｍ／ｚ＝６２４．４のピークが低密度で現れる。これは１７−シュード−スピノシンＡアグリコンのヒドロキシル化生成物に相当する。このイオンの娘イオンのスペクトルはｍ／ｚ＝１８９のフラグメントを有し、これはトリメチルラムノース単位の除去に特徴的なものである。

用いられた株の特徴付け
ａ）ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓＮＲＲＬＢ−１２１０３：
この株はニダマイシン産生体としてＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１８１５Ｎ．ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔｒｅｅｔ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ６１６０４、米国）から受付番号ＮＲＲＬＢ−１２１０３で入手した。この株はＵＳ３６４６１９４に記述されている。その培養物は、ブダペスト条約の要求に従って２００１年６月６日に、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツに寄託番号ＤＳＭ１４３２７で再度寄託された。

ｂ）ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓＤＳＭ４０１９１：
この株は、バンデリンＡ、Ｂ、モルジシジンＡおよびペンタマイシン産生体として、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツ）から受付番号４０１９１で入手した。その培養物は、ブダペスト条約の要求に従って２００１年６月６日に、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツに寄託番号ＤＳＭ１４３３０で再度寄託された。

ｃ）ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓＤＳＭ４００８４：
この株は、カエレスチセチン産生体として、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツ）から受付番号４００８４で入手した。その培養物は、ブダペスト条約の要求に従って２００１年６月６日に、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツに寄託番号ＤＳＭ１４３２８で再度寄託された。

ｄ）ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓＡＴＣＣ１１８９１：
この株は、カエレスチセチン産生体として、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ）から受付番号ＡＴＣＣ１１８９１で入手した。その培養物は、ブダペスト条約の要求に従って２００１年６月６日に、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツに寄託番号ＤＳＭ１４３２９で再度寄託された。

ｅ）ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓＤＳＭ４０９３７：
この株は、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツ）から受付番号４０９３７で入手した。その培養物は、ブダペスト条約の要求に従って２００１年６月６日に、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツに寄託番号ＤＳＭ１４３３１で再度寄託された。

ｆ）ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓＤＳＭ４６４４７：
この株は、テトラサイクリン産生体として、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツ）から受付番号４００８４で入手した。その培養物は、ブダペスト条約の要求に従って２００１年６月６日に、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ドイツに寄託番号ＤＳＭ１４３３２で再度寄託された。

出発化合物の調製
スピノシンＡアグリコン（ＩＩａ）
スピノシンＡアグリコン（ＩＩａ）［Ｒ^１が水素であり、Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、およびＤが基Ｃ−ＯＨである一般式（ＩＩ）の化合物］はＴｒａｃｅｒ（登録商標）からＷＯ０１／１６３０３に記載される通りに調製した。

９−ケト−スピノシンＡアグリコン（ＩＩｂ）
９−ケト−スピノシンＡアグリコン（ＩＩｂ）［Ｒ１が水素であり、Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、およびＤが基Ｃ＝Ｏである一般式（ＩＩ）の化合物］は化合物（ＩＩａ）からピリジニウムジクロメート酸化によって調製した：
４６．５５ｇ（１１５．６ミリモル）のスピノシンＡアグリコン（ＩＩａ）を１１００ｍｌの無水ジクロロメタンに不活性気体の下で溶解し、４３．５１ｇ（１１５．６ミリモル）のピリジニウムジクロメートと混合した。２５℃で４時間攪拌して９００ｍｌのジエチルエーテルを添加した後、沈殿したクロム塩を濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。シリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（溶出液：シクロヘキサン／酢酸エチル１：１、次いで１００％酢酸エチル）で、１１．７４ｇの回収されたスピノシンＡアグリコン（ＩＩａ）に加えて、３．６８ｇの９，１７−ジケトスピノシンアグリコン並びに２３．４０ｇの、スピノシンＡアグリコン（ＩＩａ）および１７−ケト−スピノシンアグリコン（ＩＩｂ）の約９：１混合物が生じた。この混合物のシクロヘキサン／酢酸エチルにおける再結晶化により、９−ケト−スピノシンＡアグリコン（ＩＩｂ）が＞９８％まで濃縮される。２０．７８ｇの９−ケト−スピノシンＡアグリコン（ＩＩｂ）が無色結晶の形態で得られる。

ＴＬＣ：Ｒ_ｆ（ＳｉＯ_２、酢酸エチル＝０．４４−^１Ｈ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３、とりわけ、δ＝６．７７（ｓ、１３−Ｈ）；５．９７（ｄ、６−Ｈ）；５．８８（ｍ、５−Ｈ）；４．７２（ｍ、２１−Ｈ）；３．６９（ｍ、１７−Ｈ）−ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０１（２５％）［Ｍ］^＋、２８９（１００％）。

ジケトスピノシンアグリコン：ＴＬＣ：Ｒ_ｆ（ＳｉＯ_２、酢酸エチル）＝０．６４−^１Ｈ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ_３、とりわけ、δ＝６．９２（ｓ、１３−Ｈ）；５．９７（ｄ、６−Ｈ）；５．８７（ｍ、５−Ｈ）；４．８５（ｍ、２１−Ｈ）；４．２５（ｑ、１６−Ｈ）−ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３９９（１００％）［Ｍ＋Ｈ］^＋。

スピノシンＡ
スピノシンＡの調製は、最初に、ＷＯ０１／１６３０３に記載されるように行った。得られたスピノシンＡ／Ｄ混合物を、調製用逆相カラム（２５０×８ｍｍ）でのクロマトグラフィーによって分画した。用いた溶離液は、２５ミリモル／ｌ酢酸アンモニウムを含有する水（Ａ）および２５ミリモル／ｌ酢酸アンモニウムを含有するメタノール（Ｂ）であった。溶出は３５分で６０％Ｂから１００％Ｂまでの勾配を用いて行った。流速は３ｍｌ／分であった。分離された物質はＵＶ検出器によって２４２ｎｍで検出し、自動的に分画した。スピノシンＡは約３１分、スピノシンＤは約３３分で流出した。数回の注入からのスピノシンＡの合体画分を、減圧下でロータリーエバポレーターにおいて水性残滓に至るまで蒸発させた。その水溶液を凍結乾燥し、スピノシンＡを白色固体として得た。

１７−シュードスピノシンＡ／Ｄアグリコン
１７−シュードスピノシンＡ／ＤアグリコンはＷＯ０１／１６３０３に記載されるように調製した。

Claims

一般式（Ｉ）の化合物。

（ここで、
Ａ−Ｂは以下の基のいずれかであり：−ＨＣ＝ＣＨ−、−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−、−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−または−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、
Ｄは基

であり、
Ｒ^１はアミノ糖であり、および
Ｒ^２は糖である）
ケース（１）においては、
Ａ−Ｂが以下の基のいずれかであり：−ＨＣ＝ＣＨ−、−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−、−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−もしくは−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が式１ａ

のアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ａ

の糖であるか、
または、ケース（２）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ−ＣＨ−または−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素または式２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅもしくは２ｆ

の糖であるか、
または、ケース（３）においては、
Ａ−Ｂが以下の基のいずれかであり：−ＨＣ＝ＣＨ−、−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−もしくは−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素もしくは式１ｂ

のアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素もしくは上記式２ａの糖であるか、
または、ケース（４）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｊもしくは２ｋ

の糖であるか、
または、ケース（５）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−Ｈ_２Ｃ−ＣＨ_２−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ｌもしくは２ｍ

の糖であるか、
または、ケース（６）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素または上記式１ｂのアミノ糖もしくは式１ｃ

のアミノ糖であり、および
Ｒ^２が上記式２ｂ、２ｃ、２ｇもしくは２ｈの糖または式２ｎ

の糖であるか、
または、ケース（７）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ｏ

の糖であるか、
または、ケース（８）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が上記式１ｂのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が上記式２ｄ、２ｉもしくは２ｊの糖または式２ｐ

の糖であるか、
または、ケース（９）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素または上記式１ｃのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が上記式２ｉもしくは２ｐの糖であるか、
または、ケース（１０）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が式１ｄ、１ｅのアミノ糖もしくは１ｆ

のアミノ糖であり、および
Ｒ^２が上記式２ａの糖であるか、
または、ケース（１１）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が水素または上記式１ａのアミノ糖である、
ことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
ケース（１２）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ａ、２ｇもしくは２ｈの糖であるか、
または、ケース（１３）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素または式２ｄ、２ｅ、２ｌ、２ｍもしくは２ｏの糖であるか、
または、ケース（１４）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素または式１ｂのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素または式２ａの糖であるか、
または、Ａ−Ｂ、ＤおよびＲ^１がケース（１１）において定義される通りである、
ことを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
ケース（１５）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ａの糖であるか、
または、ケース（１６）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が水素または式２ｄ、２ｌもしくは２ｍの糖であるか、
または、Ａ−Ｂ、ＤおよびＲ^１がケース（１１）において定義される通りである、
ことを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
ケース（１７）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、および
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ａの糖であるか、
または、ケース（１８）においては、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、および
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素であり、および
Ｒ^２が水素である、
ことを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、
Ｄが基

であり、
Ｒ^１が式１ａのアミノ糖であり、および
Ｒ^２が式２ａの糖であるか、
または、
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−もしくは−ＨＣ＝Ｃ（ＣＨ_３）−であり、
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素であり、および
Ｒ^２が式２ａの糖であるか、
または
Ａ−Ｂが基−ＨＣ＝ＣＨ−であり、
Ｄが上に定義される通りであり、
Ｒ^１が水素であり、および
Ｒ^２が水素である、
ことを特徴とする、請求項２に記載の化合物。