JP4447796B2 - 前立腺癌と良性前立腺肥大とを識別する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、概して前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に関し、具体的には様々な型のＰＳＡならびにそれらと前立腺癌および良性前立腺疾患との関連に関する。
【０００２】
（従来技術の説明）
本明細書では様々な文献をカッコ内に挙げる。これら刊行物の開示内容は、本願が属する技術分野の到達水準をより詳しく記載するために、参照をもってそれぞれ完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。本願の末尾、図面の詳細な説明の前に、これらの文献に関する詳細な書誌事項を記載する。
【０００３】
血清ＰＳＡの測定はヒト前立腺癌の早期発見に広く使用されているマーカーである（１〜３）。血中ＰＳＡレベルの上昇は、主に良性前立腺肥大（ＢＰＨ）または前立腺癌（ＰＣａ）として現れる前立腺疾患の徴候である。しかし、ＰＳＡが血清１ｍｌあたり４〜１０ｎｇの範囲にある場合は、直腸内触診および前立腺針生検などの追加検査を行なわなければ、ＢＰＨとＰＣａとを識別することは困難である。
【０００４】
最近、遊離ＰＳＡまたは非複合体型ＰＳＡの血清レベルによって、ＰＣａとＢＰＨの弁別が改良され得ることが実証された（４〜６）。高い遊離ＰＳＡ対総ＰＳＡの比はＢＰＨとより高い相関関係にある。したがって血清に遊離ＰＳＡが存在する理由は徹底的な研究の対象になっている。
【０００５】
血清中の遊離ＰＳＡが酵素的に不活性であることは一般に受け入れられている。ＰＳＡは血清プロテアーゼ阻害剤と複合体を形成する能力を持つセリンプロテアーゼである。ヒト血清は高レベルのα₁アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）およびα₂マクログロブリンを含有しており、これらはどちらもＰＳＡと複合体を形成することが明らかにされている（７）。イムノアッセイで検出できる血清中のＰＳＡの大部分はＡＣＴと複合体を形成している（４、６）。血清中のＰＳＡの７０〜９５％がＡＣＴと複合体を形成している。精漿から精製されたＰＳＡを使った研究では、そのＰＳＡの約３０％がＡＣＴと複合体を形成していないことがわかっている。ＰＳＡのこの画分はＬｙｓ１４５に内部ペプチド結合切断を含有し、それがこの画分を不活性にしている（４、６、７）。この精漿由来の不活性型ＰＳＡをさらに詳しく特徴づけたところ、切断されていないがＡＣＴとは複合体を形成しないＰＳＡの画分と共に、Ｌｙｓ１４５とＡｒｇ８５の両方で切断されたＰＳＡが明らかになった（８）。
【０００６】
精漿以外の供給源に由来するＰＳＡの分析はさらに限られている。ＢＰＨ結節からＰＳＡが単離されたが（９）、これは酵素的に不活性なＰＳＡを精漿ＰＳＡより多く含有し、Ｉｌｅ１、Ｈｉｓ５４、Ｐｈｅ５７およびＬｙｓ１４６の後ろにさらに新たな切断点を含有することがわかった。ＰＣａ患者の血清にはプロ酵素型のＰＳＡ（ｐＰＳＡ）も報告されている（１０）。したがって切断型ＰＳＡもプロ酵素型ＰＳＡも共に前立腺疾患患者の血清成分でありうる。
【０００７】
しかし血清中の様々な型のＰＳＡの供給源に関する研究は誰も行なっていない。切断型ＰＳＡおよびプロ酵素型ＰＳＡと様々な前立腺疾患との関連はわかっていない。したがって様々な型のＰＳＡならびにそれらと様々な前立腺組織および前立腺疾患との関連を研究する必要がある。またＢＰＨとＰＣａとを識別する方法を開発する必要もある。
【０００８】
（発明の概要）
血清中の様々な型のＰＳＡの供給源を決定することが本発明の目的である。様々な型のＰＳＡと様々な前立腺組織または前立腺疾患との関連を研究することも本発明の目的である。ＢＰＨと前立腺癌とを識別するための高感度な方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【０００９】
これらの目的および利点ならびに他の目的および利点は血清中の様々な型のＰＳＡの供給源としての前立腺組織に研究を集中させることによって達成される。なぜなら、ＰＳＡは前立腺から血清へのＰＳＡの逆行的放出に起因すると考えられるからである（１１）。どんな分子型のＰＳＡが前立腺中に存在するかを決定するために、本発明は３つの異なる型の前立腺組織、すなわち１）非癌性辺縁領域組織（ＰＺ−Ｎ）、２）少なくとも８０％腫瘍を含有する癌性辺縁領域組織（ＰＺ−Ｃ）、および３）非癌性移行領域組織（ＴＺ）を調べた。ＢＰＨ患者で過形成性になるのはＴＺである。これに対し、ほとんどの癌は辺縁領域（ＰＺ）に見出される。
【００１０】
これらの研究から本発明は前立腺ＴＺおよびＰＺ中で差次的に上昇する遊離ＰＳＡの２つの部分集合を同定した。これら遊離型ＰＳＡの測定は前立腺疾患を持つ患者におけるＢＰＨとＰＣａの識別に役立ちうると考えられる。
【００１１】
したがって本発明は、その一側面として、試料中に含まれる異なる型の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を決定する方法であって、
（ａ）試料に含まれているプロＰＳＡの量を決定すること、
（ｂ）試料中のＢＰＳＡの量を決定すること、および
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）の結果を数学的に組み合わせること、
を含んでなる方法を提供する。
【００１２】
本発明は、もう一つの側面として、試料中のＢＰＨまたは前立腺癌の存在を決定するための診断方法であって、
（ａ）プロＰＳＡに特異的に結合する第１薬剤を用意する工程、
（ｂ）ＢＰＳＡに特異的に結合する第２薬剤を用意する工程、
（ｃ）該第１薬剤および第２薬剤を、第１薬剤およびプロＰＳＡを含んでなる第１二元複合体ならびに第２薬剤およびＢＰＳＡを含んでなる第２二元複合体の形成が可能な条件下で、試料と接触させる工程、
（ｄ）該第１複合体および第２複合体の存在または量を検出または決定する工程、
（ｅ）第１複合体および第２複合体の量またはプロＰＳＡの量およびＢＰＳＡの量を数学的に組み合わせる工程、および
（ｆ）その組み合わせを試料中のＢＰＨまたは前立腺癌の存在と関連付ける工程、
を含んでなる方法を提供する。
【００１３】
本発明は、さらにもう一つの側面として、試料中のＢＰＨまたは前立腺癌の存在を決定するための診断キットであって、
（ａ）プロＰＳＡに特異的結合する既知量の第１薬剤、および
（ｂ）ＢＰＳＡに特異的に結合する既知量の第２薬剤、
を含んでなり、第１薬剤および第２薬剤がそれぞれに検出可能な標識を含んでなるか、または検出可能な標識に結合するキット。
【００１４】
本願特許請求の範囲には本発明を最も広義に定義し、その好ましい実施態様について以下に説明する。
【００１５】
上述した本発明の特徴および本発明の他の特徴ならびにそれらを獲得する方法は、以下の説明を添付の図面と共に参照することによって、より明白になり、最もよく理解されるだろう。添付の図面は本発明の典型的実施態様を図示しているに過ぎず、したがって本発明の範囲を限定するものではない。添付の図面は具体性と詳細を付け加える役割を果たす。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、異なる型のＰＳＡが異なる前立腺組織または異なる前立腺疾患と関連しているという予想外の発見に基づいている。
【００１７】
前立腺は３つの領域、すなわち中心領域、辺縁領域（ＰＺ）および移行領域（ＴＺ）から構成される。ＰＺは正常前立腺の体積の約７０％を構成し、中心領域とＴＺはそれぞれ約２５％および５％である。当技術分野ではこれらは３つの領域は全て明確に定義されている（例えば米国チャップマン・アンド・ホール（ニューヨーク州１０００３ニューヨーク・フィフスアベニュー１１５）発行のデービッド・ジー・ボストウィックおよびポール・エイ・ダンドア著「前立腺の生検病理学」を参照されたい）。簡単に述べると、ＴＺが緻密な支質に埋まった小さく単純な腺を特徴とするのに対し、ＰＺは目の粗い支質に埋まった小さい腺を特徴とする。ＴＺ組織はＰＺと明確に識別できる境界を形成する。ＰＺとＴＺは最も関心が持たれる領域である。なぜなら、癌が主としてＰＺに局在するのに対し、ＢＰＨはＴＺの組織肥大の結果だからである。多数のＢＰＨでは、ＴＺが他の前立腺領域の体積の数倍に肥大する。ＴＺ組織は近位前立腺尿道を取り囲んでおり、そのことが、制限された尿流量がＢＰＨに起因する肥大ＴＺの症状である理由になっている。
【００１８】
プロＰＳＡがＰＺ中に高いレベルで存在することは、本発明の発見である。また、ＢＰＳＡがＴＺ中に高いレベルで存在することも、本発明の発見である。癌は主にＰＺに局在し、ＢＰＨはＴＺの組織肥大の結果であることから、本発明は、プロＰＳＡとＢＰＳＡの比をＢＰＨと前立腺癌組織とを識別するためのマーカーとして使用できることを発見した。
【００１９】
したがって本発明は、その一側面として、試料中の異なる型の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の比を決定する方法を提供する。この方法には、
（ａ）試料に含まれているプロＰＳＡの量を決定すること、
（ｂ）試料中のＢＰＳＡの量を決定すること、および
（ｃ）プロＰＳＡの量とＢＰＳＡの量を数学的に組み合わせること、
が含まれる。
【００２０】
本明細書で使用する「プロＰＳＡ」または「ｐＰＳＡ」という用語は前駆体型ＰＳＡを指す。完全長前駆体型ＰＳＡは７アミノ酸のプロペプチドＡＰＬＩＬＳＲを含み、その後ろに２３７アミノ酸の成熟ＰＳＡタンパク質が続いている。プロＰＳＡの完全長アミノ酸配列は当技術分野既知であって、文献（１５）に完全に記載されており、この文献の該当する内容は参照をもって本明細書に組み込まれるものとする。本明細書ではプロペプチド配列の最後のアミノ酸「Ｒ」を［−１］アミノ酸とカウントする。例えば［−７］プロＰＳＡとはその末端がプロペプチドの−７アミノ酸（ａａ）から始まっているプロＰＳＡである。これは完全長プロＰＳＡを含有する。また、例えば［−５］プロＰＳＡは、プロＰＳＡの末端がプロペプチドの−５アミノ酸から始まることを示し、これはプロＰＳＡのプロペプチド配列の最後の５アミノ酸を含有する。本発明では、プロＰＳＡのプロペプチドのいずれかのアミノ酸で始まる末端を持つ、完全長型プロＰＳＡと切断型プロＰＳＡとの両方が、本発明のプロＰＳＡに包含されるものとする。本発明プロＰＳＡの例には［−１］ｐＰＳＡ、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡ、［−５］ｐＰＳＡおよび［−７］ｐＰＳＡなどがあるが、これらに限るわけではない。
【００２１】
本発明のプロＰＳＡ、特に［−２］ｐＰＳＡおよび［−４］ｐＰＳＡは、前立腺組織の移行領域と比較して、辺縁領域により高いレベルで存在する。本発明では、総ＰＳＡと比較したプロＰＳＡの百分率が前立腺組織の移行領域中に存在するプロＰＳＡの百分率より高い場合に、プロＰＳＡのレベルが高いという。本発明の一実施態様では、前立腺組織から抽出されたプロＰＳＡが最大３５％の本発明プロＰＳＡを含有する。プロＰＳＡは移行領域では低レベルであるか、または存在しない。前立腺癌は主にＰＺに局在し、腫瘍性損傷による血清へのＰＳＡ漏出はＰＺ中のＰＳＡの集団を含有すると予想されるので、プロＰＳＡは前立腺癌に関連するマーカーとして使用できると考えられる。
【００２２】
プロＰＳＡは不活性である。すなわちプロＰＳＡはキモトリプシン様の酵素活性を欠く。したがってプロＰＳＡは血清中にＰＳＡアンチキモトリプシン複合体としてではなく遊離ＰＳＡとして存在する。本発明では、遊離ＰＳＡとは、アンチキモトリプシン複合体の一部として複合体を形成していないＰＳＡをいう。
【００２３】
本発明のプロＰＳＡは、当技術分野において、例えばタンパク質精製技術、組換えタンパク質技術およびタンパク質合成技術など（ただし、これらに限定されない）の分野で広く知られている方法によって製造できる。本発明のプロＰＳＡの製造および検出に関する詳細は、米国特許出願第０８／８４６，４０８号の一部継続出願であって本願と同時出願される「前立腺特異抗原の型およびそれらの検出方法」と題する同時係属中の米国特許出願に記載されており、同特許出願の該当する内容は参照をもって完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。
【００２４】
本明細書で使用する「ＢＰＳＡ」という用語は、少なくとも１つの切断を成熟型ＰＳＡのアミノ酸配列のＬｙｓ１８２に含む型のＰＳＡを指す。成熟型ＰＳＡは２８，４００Ｄの分子量を持つ２３７アミノ酸残基からなり（１３）、そのアミノ酸配列は文献（１４）に完全に記載されている。成熟型ＰＳＡの配列を図６に示す。本発明のＢＰＳＡは少なくとも１つの切断を成熟型ＰＳＡのアミノ酸配列のリジン１８２に持つ。言い換えると本発明のＢＰＳＡは、本発明のＰＳＡのポリペプチド鎖が残基１８２と残基１８３の間で加水分解されている点を除いて、成熟型ＰＳＡと同じアミノ酸配列を持っている。本発明の諸実施態様として、本発明のＢＰＳＡは成熟ＰＳＡのアミノ酸配列のＩｌｅ１、Ｌｙｓ１４５およびＬｙｓ１４６にさらに１つまたは複数の切断を含みうる。本発明の一実施態様では、本発明のＢＰＳＡがＬｙｓ１４５とＬｙｓ１８２に２つの切断からなる。
【００２５】
本発明のＢＰＳＡは、辺縁領域癌性および非癌性前立腺組織と比較して、ＢＰＨ組織の移行領域に高レベルに存在する。本発明では、総ＰＳＡと比較したＢＰＳＡの百分率が辺縁領域癌性および非癌性前立腺組織中に存在するＢＰＳＡの百分率より高い場合に、ＢＰＳＡのレベルが高いという。本発明の一実施態様では、ＢＰＨ組織から抽出したＰＳＡが５〜３０％の本発明ＢＰＳＡを含有する。ＢＰＳＡは辺縁領域癌性および非癌性前立腺組織では低レベルであるかまたは存在しない。ＢＰＨを持つ患者で過形成性になるのはＴＺであるので、本発明のＢＰＳＡはＢＰＨに特異的であると考えられる。
【００２６】
ＢＰＳＡは不活性である。すなわちＢＰＳＡはキモトリプシン様の酵素活性を欠く。したがってＢＰＳＡは血清中にＰＳＡアンチキモトリプシン複合体としてではなく遊離ＰＳＡとして存在する。本発明では、遊離ＰＳＡとは、アンチキモトリプシン複合体の一部として複合体を形成していないＰＳＡをいう。
【００２７】
本発明のＢＰＳＡは、本明細書に記載の方法または当技術分野で知られる他の方法により、組織または精漿から単離するか、またはインビトロトリプシン処理によって調製できる。本発明のＢＰＳＡは、当技術分野で周知のＨＩＣ−ＨＰＬＣ技術によって他の型のＰＳＡから分離できる。本発明のＢＰＳＡはＨＩＣ−ＨＰＬＣで主要ピークを形成する。ＢＰＳＡの単離または調製法に関する詳細は、本願と同時出願される「良性前立腺肥大（ＢＰＨ）に特異的な新しい型の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその使用法」と題する同時係属中の米国特許出願に記載されており、同特許出願の該当する内容は参照をもって完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。
【００２８】
本発明のプロＰＳＡおよびＢＰＳＡを特徴づけて、それらを抗体開発に使用することができる。係属中の米国特許出願第０８／８４６，４０８号にはそれらの抗体および抗体（特に本発明のプロＰＳＡに対するモノクローナル抗体）の開発法が詳述されており、同特許出願の該当する内容は参照をもって完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。本願と同時出願される「良性前立腺肥大（ＢＰＨ）に特異的な新しい型の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその使用法」と題する同時係属中の米国特許出願には、それらの抗体および抗体（特に本発明のＢＰＳＡに対するモノクローナル抗体）の作成方法が詳述されており、同特許出願の該当する内容は参照をもって完全な形で本明細書に組み込まれるものとする。
【００２９】
簡単に述べると、本質的にさまざまなエピトープ特異性を持つモノクローナル抗体が集まってなる抗体および明確なモノクローナル調製物を提供する。モノクローナル抗体は、本発明の新しい型のＰＳＡまたはその断片を含有する抗原から当技術分野で周知の方法によって製造される（イー・ハーロウら著「抗体：実験マニュアル」コールドスプリングハーバー研究所、１９８８年）。一般にこの方法では、例えば適合する骨髄腫細胞の継代細胞株と融合した初代脾細胞から抗体産生融合細胞株が調製され、その融合細胞を大量培養によって成長させるか、または使用した骨髄腫細胞株が由来するまたは適合する動物種の体内で成長させる。かかる抗体は、特異性および感度が高く免疫学的「純度」が比較的高いため、動物への接種によって産生される抗体と比較して多くの利点を持っている。ｆ（ａｂ）断片などの免疫学的に活性な抗体断片および部分的にヒト化されたモノクローナル抗体も、本発明の範囲に包含される。
【００３０】
所望であれば、ポリクローナル抗体は、その抗体を産生させたポリペプチドまたはペプチドを結合したマトリックスに結合しそこから溶出することによって、さらに精製することができる。当業者には、免疫学分野で一般的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の様々な精製および／または濃縮法が知られているだろう。（例えば参照をもって本明細書に組み込まれるコリガンら著「免疫学の最新プロトコール」（ワイリー・インターサイエンス、１９９１年）のユニット９を参照されたい。）
【００３１】
本発明で使用する「抗体」という用語は完全な抗体ならびにエピトープ決定基を結合する能力を持つその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦｖなどを包含する。これらの抗体断片はそれぞれの抗原またはレセプターと選択的に結合する能力をいくらか保持している。
【００３２】
したがって本発明は、その一側面として、本発明のプロＰＳＡまたはＢＰＳＡと特異的に免疫反応し、それらに結合する抗体を提供する。本明細書で使用する「特異的に免疫反応しまたは特異的に結合する」という用語は、本発明の抗体がプロＰＳＡまたはＢＰＳＡを他の型のＰＳＡ（例えば他の切断または非切断成熟型ＰＳＡ）より選択的に認識し結合することを示す。本明細書で使用する「選択的に認識し結合する」という用語は、本発明の抗体が本発明のプロＰＳＡまたはＢＰＳＡを同じ条件下に他の型のＰＳＡへの結合より高い程度に結合することを意味する。プロＰＳＡに選択的に結合するモノクローナル抗体の例には、例えばＰＳ１Ｚ１３４、ＰＳ１Ｚ１２０、ＰＳ１Ｚ１２５およびＰＳ１Ｚ８０などがあるが、これらに限らない。ＢＰＳＡに選択的に結合するモノクローナル抗体の例には、例えばＰＳ２Ｃ１０９、ＰＳ２Ｃ５０１、ＰＳ２Ｃ６３４、ＰＳ２Ｃ８０７およびＰＳ２Ｃ８３７などがあるが、これらに限らない。
【００３３】
本発明の抗体は、試料中のプロＰＳＡまたはＢＰＳＡの存在および量を検出および決定するために使用できる。本発明によれば、プロＰＳＡおよびＢＰＳＡを免疫組織化学的方法によって患者組織試料中に、そして／またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）イムノアッセイ法によって患者液体試料中に検出できる。
【００３４】
患者組織検体中の抗原を検出するための免疫組織化学的方法は当技術分野では周知であり、本明細書に詳述する必要はない。例えば抗原の免疫組織化学的検出法はテーラー、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１０２：１１３（１９７８）に概説されている。本発明との関連で簡単に述べると、前立腺関連の問題を持つと疑われる患者から採取した組織検体を、プロＰＳＡまたはＢＰＳＡを認識する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）と接触させる。次に、標準的な免疫組織化学的方法による組織検体の選択的染色によって、抗体が結合する部位を決定する。ＢＰＳＡまたはプロＰＳＡを認識する別の抗体を使って同じ方法を同じ試料で繰り返すことができる。もう一つの選択肢として、プロＰＳＡに対する抗体とＢＰＳＡに対する抗体が異なる方法で標識されているか、異なる標識に結合できるのであれば、試料をそれら２つの抗体と同時に接触させてもよい。本発明の一実施態様では、組織検体が患者の前立腺から採取される組織検体である。その前立腺組織は正常前立腺組織、癌前立腺組織または良性前立腺肥大組織であることができる。
【００３５】
同様に、患者液体試料中の抗原物質をイムノアッセイ法によりインビトロで検出するための一般的方法も当技術分野ではよく知られており、ここに繰り返す必要はない。例えばイムノアッセイ法は、パターソンら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．３７：６５９（１９８６）およびバーチェルら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．３４：７６３（１９８４）に概説されている。本発明の一実施態様によれば、生物学的試料中のプロＰＳＡおよびＢＰＳＡを検出するためのイムノアッセイは、（ａ）プロＰＳＡに特異的に結合するある量の第１薬剤を、第１薬剤およびプロＰＳＡを含んでなる二元複合体の形成が可能な条件下に、試料と接触させる工程および（ｂ）プロＰＳＡの量の尺度として複合体の存在または量を検出または決定する工程からなるか、または（ａ）ＢＰＳＡに特異的に結合するある量の第２薬剤を、第２薬剤およびＢＰＳＡを含んでなる二元複合体の形成が可能な条件下に、試料と接触させる工程および（ｂ）試料中に含まれるＢＰＳＡの量の尺度として複合体の存在または量を検出または決定する工程を含んでなる。もう一つの選択肢として、第１薬剤と第２薬剤が異なる方法で標識されているかまたは異なる標識に結合する能力を持つ場合は、試料を第１薬剤および第２薬剤と同時に接触させてもよい。
【００３６】
本発明の目的にとって生物学的試料は、本発明のプロＰＳＡまたはＢＰＳＡを含有するヒトの生理学的液体の試料のいずれでもよい。ヒトの生理学的液体試料の例には、血清、精漿、尿および血漿などがあるが、これらに限らない。
【００３７】
本発明では、本発明によって提供される抗原に対して必要な特異性を有する抗体である限り、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方を使用できるものとする。好ましくはモノクローナル抗体を使用する。
【００３８】
モノクローナル抗体は液相で使用するか、固相担体に結合して使用することができる。モノクローナル抗体は多くの異なる担体に結合でき、本発明の新しい型のＰＳＡを決定するために使用できる。周知の担体の例にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース、修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱などがある。本発明において、担体の性質は可溶性であることも不溶性であることもできるものとする。不溶性担体の例には、ビーズおよびマイクロタイタープレートなどがあるが、これらに限らない。当業者は、モノクローナル抗体を結合するのに適した他の担体を知っているか、日常的な実験下でそれらを確かめることができるだろう。
【００３９】
また、これらのイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は、様々な方法で検出可能に標識できる。例えば本発明のモノクローナル抗体は、低分子量ハプテンに結合することができる。次にこれらのハプテンを第２の反応を使って特異的に検出することができる。例えばアビジンと反応するビオチンを使用するか、または特異的抗ハプテン抗体と反応できるジニトロフェニル、ピリドキサルおよびフルオレセインなどのハプテンを使用することが一般的である。また、本発明のモノクローナル抗体に、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、蛍光金属、化学発光化合物または生物発光化合物などの検出可能な標識を結合することもできる。さらにまた、これらの標識は、当業者によく知られている標準的技術を使って所望の分子に結合することができる。
【００４０】
抗体を検出可能に標識する方法の１つは、それを酵素に結合することである。その場合、この酵素は、後にその基質にさらされた時に、例えば分光光度法的手段または蛍光測定法的手段によって検出できる化学部分を生成するような形で、その基質と反応するだろう（ＥＬＩＳＡシステム）。検出可能な標識として使用できる酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼである。
【００４１】
ＥＬＩＳＡシステムの感度を向上させるために、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体と反応するビオチン化抗体を使って、上記の方法を改変することができる。
【００４２】
抗原の量は放射性同位体で抗体を標識することによって決定することもできる。その場合、放射性同位体の存在は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用などの手段で決定されるだろう。とりわけ有用な同位体は³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹²³Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、⁵¹Ｃｒ、³⁶Ｃｌ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁷⁵Ｓｅ、¹¹¹Ｎ、⁹⁹ｍＴｃ、⁶⁷Ｇａおよび⁹⁰Ｙである。
【００４３】
抗原の決定は、蛍光化合物で抗体を標識することによっても可能である。蛍光標識分子を適切な波長の光にさらすと、色素の蛍光によってその存在を検出できる。最も重要な蛍光標識化合物としてはフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンが挙げられる。
【００４４】
Ｅｕ（ユーロピウム）および他のランタニドなどの蛍光放出金属原子も使用できる。これらはＤＴＰＡまたはＥＤＴＡなどの金属キレート基を使って所望の分子に結合させることができる。
【００４５】
抗体を検出可能に標識するもう一つの方法は、それを化学発光化合物に結合することである。その場合、化学発光基標識免疫グロブリンの存在は、化学反応の過程で生じるルミネセンスの存在を検出することによって決定される。とりわけ有用な化学発光標識化合物の例はルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００４６】
同様に生物発光化合物も標識として使用できる。生物発光は生物系に見出される特殊なタイプの化学発光であり、生物発光では触媒タンパク質が化学発光の効率を増大させる。生物発光分子の存在は発行（ルミネッセンス）の存在を検出することによって検出される。重要な標識用生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００４７】
試料中の本発明のプロＰＳＡおよびＢＰＳＡの定性的および／または定量的決定は、直接型または間接型の競合または非競合イムノアッセイ法によって達成できる。かかるイムノアッセイ（免疫検定）の例はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ；放射線免疫検定）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原の検出は、フォワード形式、リバース形式または同時形式で行なわれるイムノアッセイ（生理学的試料に対する免疫組織化学的アッセイを含む）を使って行なうことができる。当業者は他のイムノアッセイ形式を知っているか、甚だしい実験を行なわずに他のイムノアッセイ形式を容易に認識することができる。
【００４８】
「イムノメトリックアッセイ」または「サンドイッチイムノアッセイ」という用語は、同時サンドイッチイムノアッセイ、フォワードサンドイッチイムノアッセイおよびリバースサンドイッチイムノアッセイを包含する。これらの用語は当業者にはよく知られている。当業者には、本発明の抗体が現在知られているまたは将来開発されるかもしれない他の変形または形態のアッセイに有用であることも理解されるだろう。これらは本発明の範囲に包含されるものとする。
【００４９】
ＢＰＳＡはＴＺ中で選択的に高く、ｐＰＳＡはＰＺ中で高いので、遊離ＰＳＡのこれら２つの亜型を組み合わせると、ＢＰＨとＰＣａとをより良く弁別できる。ＢＰＨを持つ患者で過形成性になるのはＴＺであり、一方、ほとんどの癌はＰＺに見出される。したがって、プロＰＳＡおよびＢＰＳＡの量の数学的組み合わせは、ＢＰＨと前立腺癌とを識別するのに役立つ血清マーカーとしてまたは免疫学的組織学的マーカーとして使用できる。ただしプロＰＳＡとＢＰＳＡは、ＢＰＨと前立腺癌とを識別するための血清マーカーとして、または免疫組織学的マーカーとして、単独でも使用できることに注意すべきである。本明細書で使用する「数学的組み合わせ」という用語は、プロＰＳＡおよびＢＰＳＡの量の任意の数学的計算を指す。一実施態様として数学的組み合わせは比である。試料中のプロＰＳＡとＢＰＳＡの比は、試料中のプロＰＳＡまたはプロＰＳＡ複合体の量をＢＰＳＡまたはＢＰＳＡ複合体の量と比較することによって決定できる。
【００５０】
したがって本発明のもう一つの側面は、試料中のＢＰＨまたは前立腺癌の存在を決定するための診断方法であって、
（ａ）プロＰＳＡに特異的に結合する第１薬剤を用意する工程、
（ｂ）ＢＰＳＡに特異的に結合する第２薬剤を用意する工程、
（ｃ）上記第１薬剤および第２薬剤を、第１薬剤およびプロＰＳＡを含んでなる第１二元複合体ならびに第２薬剤およびＢＰＳＡを含んでなる第２二元複合体の形成が可能な条件下で、試料と接触させる工程、
（ｄ）上記第１複合体および第２複合体の存在または量を検出または決定する工程、
（ｅ）第１複合体および第２複合体の量またはプロＰＳＡの量およびＢＰＳＡの量を数学的に組み合わせる工程、および
（ｆ）その組み合わせを試料中のＢＰＨまたは前立腺癌の存在と関連付ける工程、
を含んでなる方法を提供する。
【００５１】
本発明の諸実施態様では、薬剤が抗体、特に本発明のモノクローナル抗体を含んでなる。好ましくは、試料を第１薬剤および第２薬剤と接触させる場合、第１薬剤および第２薬剤は異なる方法で標識されているか、または異なる標識に結合して個別に検出できるそれぞれの複合体を形成することができる。もう一つの選択肢として、プロＰＳＡまたはＢＰＳＡがまず検出されるように試料を一方の薬剤とまず接触させ、次にもう一つの型のＰＳＡを検出するために同じ試料をもう一つの薬剤と接触させてもよい。
【００５２】
本発明の一実施態様として、試料は、例えば血清、精漿、尿および血漿など（ただしこれらに限らない）といったヒトの生理学的液体の試料であってよい。本発明のもう一つの実施態様として、試料は患者の前立腺から採取した組織検体であってもよい。本発明では、上記薬剤は抗体、特に本発明のモノクローナル抗体でありうる。本発明の一実施態様では、数学的組み合わせが比である。
【００５３】
本発明はもう一つの側面として、試料中のＢＰＨまたは前立腺癌の存在を決定するための診断キットを提供する。本キットは、
（ａ）プロＰＳＡに特異的に結合する既知量の第１薬剤、
（ｂ）ＢＰＳＡに特異的に結合する既知量の第２薬剤、
を含んでなり、第１薬剤と第２薬剤はそれぞれに検出可能な標識を含んでなるか、検出可能な標識に結合する。
【００５４】
本発明の目的には、試料は、例えば血清、精漿、尿または血漿など（ただしこれらに限らない）といったヒトの生理学的液体の試料でありうる。試料は患者の前立腺から採取した組織検体であってもよい。薬剤は抗体、特に本発明のモノクローナル抗体であることができる。好ましくは第１薬剤と第２薬剤がそれぞれに異なる検出可能標識を含んでなるか、異なる検出可能標識に結合する。
【００５５】
プロＰＳＡまたはＢＰＳＡはＢＰＨと前立腺癌とを識別するための血清マーカーとして、または免疫組織学的マーカーとして、単独で使用できるので、本発明は、試料中のプロＰＳＡまたはＢＰＳＡの量を検出または決定することによってＢＰＨと前立腺癌とを識別するための診断方法も提供する。患者組織試料中のプロＰＳＡまたはＢＰＳＡの量は免疫組織化学的方法によって、そして／または患者液体試料中のプロＰＳＡまたはＢＰＳＡの量は本明細書に記載のインビトロイムノアッセイ法によって決定できる。
【００５６】
以下の実施例は本発明の範囲を例示するものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。これらの実施例は使用されるであろう方法の典型であるが、当業者に知られる他の方法も以下の実施例に代えて使用できる。事実、当業者は本明細書の教示内容に基づいて甚だしい実験を行なうことなく、さらなる実施態様を容易に構想し、作り出すことができる。
【００５７】
実施例
材料と方法
前立腺組織からのＰＳＡの単離
前立腺組織を液体窒素で凍結し、液体窒素中に維持した金属製組織粉砕機で微粉末に粉砕した。１００〜３００ｍｇの範囲のＰＺ−Ｎ、ＰＺ−ＣおよびＴＺ組織試料については、プロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリート（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）、ベーリンガー・マンハイム）を含有する３ｍｌのＰＢＳ中で、ガラス製組織ホモジナイザーを使って凍結組織をホモジナイズした。次に試料を遠心分離して細胞片を除去し、上清を０．２μｍ膜を通してろ過した。より大量の組織は、ポリトロン組織ホモジナイザーを使って５０ｍｌチューブ中で組織をホモジナイズした点を除いて、上と同様に抽出した。
【００５８】
樹脂１ｍｌにつき５ｍｇの抗ＰＳＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＰＳＭ７７３が結合しているイムノアフィニティーカラムに通すことにより、ろ過した上清からＰＳＡを精製した。０．１％還元型トリトン−Ｘ１００を含有する４０体積のＰＢＳでカラムを洗浄し、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）でＰＳＡを溶出させた。溶出液は１０％（ｖ／ｖ）１Ｍトリス（ｐＨ８．０）で直ちに中和した。
【００５９】
インビトロでのＢＰＳＡの調製
加工しろ過した精漿をＰＢＳに１：１０希釈し、抗ＰＳＡモノクローナル抗体ＰＳＭ７７３を結合したイムノアフィニティーカラムに通した。０．１％還元型トリトンＸ１００を含有する２０体積のＰＢＳでカラムを洗浄し、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）でＰＳＡを溶出させた。精製ＰＳＡを後述するＨＩＣ−ＨＰＬＣにかけ、８分のＢＰＳＡピークおよび１０分のＰＳＡピークを別々に集めた。１０分ピークから得たＰＳＡを１００ｍＭトリス（ｐＨ８）に透析し、１％（ｗ／ｗ）トリプシンと共に３７℃で３０分間インキュベートした。添加したトリプシンの二倍に相当する量のアプロチニンを添加することにより、混合物中のトリプシンを不活化した。そのインキュベーション混合物をＨＩＣ−ＨＰＬＣにかけ、得られた切断型ＰＳＡピークを分析のために集めた。
【００６０】
ＰＳＡのＨＩＣ−ＨＰＬＣ
高性能疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）は、ポリプロピルアスパルトアミドカラム（ポリＬＣ、ウェスタン・アナリティカル（カリフォルニア州テメキュラ）が販売）を使って行なった。カラムは４．６×２５０ｍｍ（長さ）で孔径１０００Åだった。試料は１．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液として充填し、勾配によって溶出させた。緩衝液Ａ：１．２Ｍ硫酸ナトリウム、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．３。緩衝液Ｂ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、５％（ｖ／ｖ）２−プロパノール。勾配は０〜３５％Ｂが１分、３０〜８０％Ｂが２分、８０％Ｂの定組成で２分の後、緩衝液Ａで平衡化した。高感度ピーク検出は、バリアンモデル９０７０走査型蛍光検出器を使用し励起波長２３２ｎｍおよび放射波長３３４ｎｍでタンパク質のトリプトファン残基を検出することによって達成した。
【００６１】
ＰＳＡのアミノ酸配列決定
試料のＮ末端配列解析はＰＥ−アプライドバイオシステムズモデル４９２アミノ酸シークエンサー（パーキンエルマー、アプライドバイオシステムズ部門、カリフォルニア州フォスターシティー）で行なった。精製ＰＳＡおよびＨＩＣ−ＨＰＬＣによって集めたピークをプロソーブ（Ｐｒｏｓｏｒｂ）カートリッジ（パーキンエルマー、アプライドバイオシステムズ部門、カリフォルニア州フォスターシティー）に直接かけ、０．１ｍＬの０．０１％トリフルオロ酢酸で３回洗浄し、モデル４９２シークエンサーにかけた。
【００６２】
ｐＰＳＡに対するモノクローナル抗体の作製
抗ＰＳＡ抗体ＰＳＭ７７３を使ったイムノアフィニティークロマトグラフィーを利用して、ＡＶ１２の培地からプロＰＳＡを精製した。プロＰＳＡを発現するＡＶ１２細胞は、係属中の米国特許出願第０８／８４６，４０８号に記載されているように作製した。マウスをＣＦＡ中の保護免疫原５０μｇで１回およびＩＦＡ中の保護免疫原２５μｇで２回免疫した。ハイブリドーマは公表された方法に従って作製した（１６）。ｐＰＳＡに対する反応性に関して培地上清をスクリーニングした。
【００６３】
別法として、マウスをＣＦＡ中の突然変異型プロＰＳＡ２１７ｓｅｒ−ｇｌｙ免疫原５０μｇで１回およびＩＦＡ中の同免疫原２５μｇで２回免疫した。
【００６４】
ハイブリドーマスクリーニングアッセイ
５０μｌの培養上清をストレプトアビジンマイクロプレート（ワラック、フィンランド・トゥルク）のウェルに加え、１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ｐＰＳＡ ５０μｌも加えた。１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／０．１％ツイーン２０で洗浄し、次いでＰＢＳ／１％ＢＳＡおよび０．１％ツイーン２０に希釈（１：１０，０００）したヤギ抗マウスＩｇセイヨウワサビペルオキシダーゼ５０μｌ／ウェルと共にインキュベートした。１時間のインキュベーション後に、プレートを洗浄し、ＯＰＤ基質で発色させた。モノクローナル抗体の特異性を決定するために、１００ｎｇ／ｍｌのｐＰＳＡおよび１００ｎｇ／ｍｌの無傷ＰＳＡの反応性を比較した。
【００６５】
結果
ＨＩＣ−ＨＰＬＣによる前立腺組織中のＢＰＳＡ
抗ＰＳＡモノクローナル抗体ＰＳＭ７７３を使って組織抽出物からＰＳＡをイムノアフィニティー精製した後、高性能疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によってさらに分割した。いくつかの試料に、主要ＰＳＡピークより速く溶出するもう一つの小さいＰＳＡピークが観察された。この変種型ＰＳＡのレベルは主にＰＺ組織よりＴＺ組織の方が高いことが確認された。図１はマッチド前立腺組織領域から精製されたＰＳＡのＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルを比較した図である。同じ前立腺から得た３つのマッチド組織、すなわち移行領域（ＴＺ）、８０〜１００％腫瘍を含有する辺縁領域（ＰＺ−Ｃ）および癌を含まない辺縁領域（ＰＺ−Ｎ）を分析した。通常、ＰＳＡはこれらのクロマトグラフィー条件で１０分に溶出する。この例では、８分に溶出するＰＳＡピークはＴＺ抽出物中の総ＰＳＡの２８％を含有するのに対し、ＰＺ−ＣおよびＰＺ−Ｎ組織中ではそれぞれ３％および８％に過ぎない。
【００６６】
本発明では８分に溶出するＰＳＡをＢＰＳＡと命名した。異なるＴＺ患者試料間ではＢＰＳＡの絶対値が５％〜３０％の間で変動することがわかったので、本発明ではＴＵＲＰ組織も調べた。ＴＵＲＰ術はＢＰＨを持つ患者に施される。ＴＵＲＰ術では移行領域が切除されるので、単一の患者から得たＴＵＲＰ抽出物のＰＳＡ分析によりＴＺ全体にわたるＢＰＳＡの平均レベルが得られる。図２はＴＵＲＰ組織から精製したＰＳＡのＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルである。ＢＰＳＡはこの試料中の総ＰＳＡの２２％を占めた。試験した８つの異なるＴＵＲＰ試料のうち６つのＴＺ組織は、総ＰＳＡの平均２０％±３％という高いＢＰＳＡレベルを含有していた。ＴＵＲＰ試料のうち２つはＢＰＳＡレベルが低く、平均３．２％±０．５％だった。
【００６７】
抽出物の分画を取り出し、３７℃で１時間インキュベートして追加の内部切断が起こるかどうかを決定する対照実験を組織抽出物で行なった。ＨＩＣ−ＨＰＬＣとそれに続く精製ＰＳＡのＮ末端配列決定によれば、追加の内部切断部位は得られなかった（非掲載データ）。これは、抽出およびＰＳＡ精製作業中に有意なインビトロタンパク質分解切断が起こらないこと、および観察されたＰＳＡ切断がいずれも精製および分析に先立ち、ＰＳＡにとって内因的に起こることを示している。
【００６８】
前立腺組織由来のＢＰＳＡの特徴づけ
さらなる分析に十分な量を得るために前立腺切除術で得た前立腺組織約５０ｇ（ｎ＞４０）を抽出した。これらの組織はＴＺまたはＰＺに由来したものとはしなかった。図３Ａに、約１５％のＢＰＳＡを含有するこの組織から精製したＰＳＡのＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。８分のＢＰＳＡピークと１０分のＰＳＡピークを個別に収集し、Ｎ末端配列決定によって分析した。図３ＢはＨＩＣ−ＨＰＬＣ精製したＢＰＳＡおよびＰＳＡが互いにきれいに分割されていることを示す。
【００６９】
表１は各型のＰＳＡ中に存在する内部切断の百分率を表す。５つの主要な切断部位、すなわちＩｌｅ１、Ａｒｇ８５、Ｌｙｓ１４５、Ｌｙｓ１４６およびＬｙｓ１８２が検出された。これらの２つのピークの配列を比較すると、次の２つの特徴があった。１）８分ピークはＬｙｓ１８２の特徴的な切断を含めて内部切断率が高い。２）１０分に溶出するＰＳＡの大半は低レベルの内部切断しか含有していない。
【００７０】
【表１】

【００７１】
Ｌｙｓ１８２の切断は８分ＢＰＳＡピークの最も弁別的な特徴であり、１０分から８分へのシフトの原因であると思われる。ＢＰＳＡ中ではＮ末端バリンから始まるＰＳＡを生成するＩｌｅ１での切断のレベルも高い。Ｉｌｅ１切断はＬｙｓ１４６切断と共に、ＢＰＨ結節から得られるＰＳＡに報告されている（９）。Ｌｙｓ１４５での切断は精漿から精製されるＰＳＡ中の主要な内部切断部位である。Ｌｙｓ１４５だけが切断されたＰＳＡは１０分に溶出しつづける（非掲載データ）。したがってＢＰＳＡは精漿から特徴づけられているものとは異なる型の不活性ＰＳＡに相当する。
【００７２】
組織中のＢＰＳＡの分布
１８組のマッチド前立腺組織（１０組は大体積前立腺（＞５０ｇ）および８組は小体積前立腺（＜２０ｇ））から得られるＰＳＡを調べた。ＢＰＳＡとして存在する総ＰＳＡの百分率を表２に示す。大半の試料では、ＴＺがマッチドＰＺ組織と比較して高レベルのＢＰＳＡを含有している。大体積前立腺と小体積前立腺の間に明らかな相違はない。
【００７３】
【表２】

【００７４】
前立腺組織中のｐＰＳＡの測定
組織抽出物中の不活性型ＰＳＡには、ＢＰＳＡの他に、［−１］ｐＰＳＡ、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡ、［＋５］ＰＳＡ、Ｌｙｓ１４５で切断されたＰＳＡおよび成熟不活性ＰＳＡがある。これらの不活性型はＰＳＡをＡＣＴと共にインキュベートした後、ＡＣＴと複合体を形成しないＰＳＡのＮ末端配列分析を行なうことによって明らかになった。図４はＡＣＴと共にインキュベートしたＰＺ−Ｎ ＰＳＡのＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイルを表す。このＰＺ−Ｎ試料の元のプロファイルは図１に示すものである。図４のピーク１はＰＳＡとのインキュベーション後に形成された不活性切断ＡＣＴである（７）。ピーク２はインキュベーション後に残った残留過剰活性ＡＣＴである。ピーク３はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体であり、ピーク４はＡＣＴと複合体を形成しなかった不活性ＰＳＡである。不活性ＰＳＡであるピーク４のＮ末端配列決定をパネルＢに示す。この不活性ＰＳＡピークの前半分は主に成熟ＰＳＡ、Ｌｙｓ１４５で切断されたＰＳＡおよびＧｌｙ４の後ろで切断されたＰＳＡを含有する。この不活性ＰＳＡピークの後ろ半分は［−２］ｐＰＳＡの大半を含有する。［−２］ｐＰＳＡは７アミノ酸プロリーダーペプチドの最後の２アミノ酸を含有する切断型ｐＰＳＡである。ＰＰＳＡはＡＰＬＩＬＳＲからなるヘプタペプチドプロリーダー配列を伴なって発現される。したがって［−２］ｐＰＳＡは成熟ＰＳＡのＮ末端イソロイシン上にセリン−アルギニンジペプチドを含有している。１２分に溶出する小ピークは［−４］ｐＰＳＡを含有する。［−４］ｐＰＳＡの保持時間は先に報告されている（１０）。［−２］ｐＰＳＡはこの試料中の不活性ＰＳＡの６５％を構成し、［−４］ｐＰＳＡは６％だった。
【００７５】
組織試料のバルクで形成されるｐＰＳＡの百分率は、ＡＣＴインキュベーション後の不活性ＰＳＡを配列決定するのではなく、イムノアフィニティー精製したＰＳＡ全体を直接Ｎ末端配列決定することによって決定した。表３はこれらの試料中に見出される［−２］ｐＰＳＡの百分率を表す。数個のサンプルでは極低レベルの他のプロ型が全ＰＳＡ中に検出されたが、［−２］ｐＰＳＡが主要なプロ型だった。表３はｐＰＳＡが主としてＰＺ（癌性および非癌性の両方）に見出されることを示している。これに対し、測定可能なｐＰＳＡを示すＴＺ試料は４つだけだった。プロＰＳＡは表３のＴＺ試料の大半で検出できなかった。プロＰＳＡはＴＵＲＰ組織にも検出されなかった。
【００７６】
【表３】

【００７７】
前立腺組織におけるプロＰＳＡ対ＢＰＳＡの比
ＢＰＳＡのレベルはＴＺで選択的に高く、ｐＰＳＡのレベルはＰＺで高いので、これら２つの遊離ＳＰＡの亜型を組み合わせると、ＢＰＨとＰＣａとをより良く弁別できるようになる。ＢＰＨを持つ患者で過形成性になるのはＴＺであり、ほとんどの癌はＰＺに見出される。図５は１８のマッチド組織試料に関する％ＢＰＳＡ、％ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡ／ｐＰＳＡの比のドットプロットである。図５はＴＺ組織とＰＺ組織との有意な弁別を示している。
【００７８】
考察
ＴＺ組織ではＢＰＳＡと名付けたＰＳＡの特定アイソフォームのレベルが高くなっていたことが、本発明の発見である。ＢＰＳＡはＨＩＣ−ＨＰＬＣで弁別的なクロマトグラフィープロファイルを持ち、Ｌｙｓ１８２にある少なくとも１つの切断を特徴とする（表１）。ＢＰＳＡレベルが癌性前立腺のＴＺ中および非癌性前立腺から採取したＴＵＲＰ組織中で選択的に高いという知見は、この型のＰＳＡがＴＺ由来のＰＳＡに関する一般的マーカーになりうることを示唆している。
【００７９】
同じマッチド組織を調べたところ、ＰＺ組織中の高い［−２］ｐＰＳＡレベルとの相補的相関関係が明らかになった。ＰＰＳＡはＴＺにはほとんど存在しなかった。ＰＺと関連するｐＰＳＡ、したがって前立腺癌とより高度に相関するｐＰＳＡの発見は、本発明者らが先に報告したＰＣａ患者血清中のｐＰＳＡと一致する。
【００８０】
したがってＴＺ関連ＢＰＳＡとＰＺ関連ｐＰＳＡの両方を検出する能力を組み合わせたアッセイはＢＰＨとＰＣａとの弁別の特異性を有意に向上させるだろう。図５に、本発明者らの組織試料から得たＢＰＳＡ／ｐＰＳＡの比をプロットした。これらのプロットはＴＺとＰＺとの明らかな弁別を示している。
【００８１】
本発明によれば、組織中のＰＳＡの型は精漿で報告されているものとは異なる（７、８）。表１は組織から抽出されたＰＳＡの大半が低レベルの切断を含有しているのに対し、ＢＰＳＡは著しく切断されていることを示している。２つの型のＰＳＡ間の切断の層化により、ＢＰＳＡはより高度にタンパク質分解的な環境に由来する区画化されたＰＳＡであることが、さらに示唆される。
【００８２】
プール精漿由来のＰＳＡは５〜１０％の範囲の低レベルのＢＰＳＡを含有したが、ＨＩＣ−ＨＰＬＣで１０分に溶出するＰＳＡの主要画分は約３０％がＬｙｓ１４５で切断されていた（非掲載データ）。精漿由来ＰＳＡを精製し特徴づけるために行なわれた最初期の研究の一つにより、Ａｒｇ８５、Ｌｙｓ１４８およびＬｙｓ１８５に内部切断が存在することが報告された（１２）。（今考えると、この文献の配列は３アミノ酸分ずれていると思われる。したがってＬｙｓ１４８はＬｙｓ１４５であり、Ｌｙｓ１８５はＬｙｓ１８２であるべきと思われる。）不活性ＰＳＡのその後の研究は、ほとんどＬｙｓ１４５での切断だけに集中してきた。なぜなら、これが主な切断であり、これがＰＳＡを実際に不活性にするからである。
【００８３】
個々のドナーから得た精漿中のＢＰＳＡレベルを調べると、前立腺疾患状態におけるＢＰＳＡの変動への洞察をさらに得ることができる。本発明によれば、個々の癌患者は調べていないが、プール精漿からは不活性ＰＳＡ中にｐＰＳＡは検出されない。
【００８４】
本発明はＢＰＳＡおよびｐＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体も提供する。血清遊離ＰＳＡレベルが前立腺組織疾患状態で存在するＰＳＡの集団を反映するなら、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡを測定するイムノアッセイにより、ＢＰＨと前立腺癌とがより良く弁別できるようになるだろう。
【００８５】
本発明はその本質的特徴から逸脱することなく他の具体的実施態様で実施することができる。上述した実施態様はあらゆる面で単なる例示に過ぎず、限定ではないとみなすべきである。したがって本発明の範囲は上述の説明よりもむしろ特許請求の範囲によって示される。したがって本願請求項と等価な意味および範囲に含まれる全ての変更は、本願請求項の範囲に包含されるものとする。
【００８６】
文献目録
１．カタロナ，ダブリュ・ジェイ、スミス，ディ・エス、ラトリフ，ティ・エル、ドッツ，ケイ・エム、コプレン，ディ・イー、ユアン，ジェイ・ジェイ、テトロス，ジェイ・エイおよびアンドリオール，ジー・エル「前立腺癌のスクリーニング検査としての血清中の前立腺特異抗原の測定」Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２４：１１５６−１１６１，１９９１。
【００８７】
２．エスタリング，ジェイ・イー「前立腺特異抗原：前立腺腺癌の最も有用な腫瘍マーカーの批判的評価」Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１４５：９０７−９２３，１９９１。
【００８８】
３．ラブリー，エフ、デュポン，エイ、スブル，アール、キュサン，エル、トレンブレイ，エム、ゴメス，ジェイ・エルおよびエモンド，ジェイ「前立腺癌のプレスクリーニング検査としての血清前立腺特異抗原」［コメント参照］Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１４７：８４６−８５１，１９９２。
【００８９】
４．ステンマン，ユー・エイチ、レイノネン，ジェイ、アルフザン，エイチ、ラニッコ，エス、ツカネン，ケイおよびアルフザン，オー「前立腺特異抗原とα₁−アンチキモトリプシンの複合体は前立腺癌を持つ患者の血清中の前立腺特異抗原の主要な形態である：この複合体のアッセイにより癌に関する臨床的感度が向上する」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：２２２−２２６，１９９１。
【００９０】
５．カタロナ，ダブリュ・ジェイ「遊離および総前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の臨床的有用性：総説」Ｐｒｏｓｔａｔｅ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ７：６４−６９，１９９６。
【００９１】
６．リルハ，エイチ、クリステンソン，エイ、ダーレン，ユー、マチカイネン，エム・ティー、ニルソン，オー、ペターソン，ケイおよびロブグレン，ティ「血清中の前立腺特異抗原は主にα₁−アンチキモトリプシンとの複合体として存在する」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３７：１６１８−１６２５，１９９１。
【００９２】
７．クリステンソン，エイ、ローレル、シー・ビーおよびリルハ，エイチ「前立腺特異抗原の酵素活性および細胞外セリンプロテイナーゼ阻害剤との反応」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９４：７５５−７６３，１９９０。
【００９３】
８．ジャン，ダブリュ・エム、レイノネン，ジェイ、カルッキネン，エヌ、ダウエル，ビーおよびステンマン，ユー・エイチ「ヒト精液中の異なる分子型の前立腺特異抗原の精製および特徴づけ」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４１：１５６７−１５７３，１９９５。
【００９４】
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【００９５】
１０．ミコワイチク，エス・ディ、グラウエル，エル・エス、ミラー，エル・エス、ヒル，ティ・エム、クマール，エイ、リッテンハウス、エイチ・ジー、ウルファート，アール・エルおよびセージ，エム・エス「ＰＳＡの前駆体（ｐＰＳＡ）は前立腺癌血清中の遊離ＰＳＡの一成分である」Ｕｒｏｌｏｇｙ ５０：７１０−７１４，１９９７。
【００９６】
１１．リッテンハウス，エイチ・ジー、フィンレー，ジェイ・エイ、ミコワイチク，エス・ディーおよびパーティン，エイ・ダブリュ「ヒトカリクレイン２（ｈＫ２）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）：近い類縁関係にあるが相異なる前立腺中の２つのカリクレイン」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，３５：２７５−３６８，１９９８。
【００９７】
１２．ワット，ケイ・ダブリュ・ケイ、リー，ピィ・ジェイ、マクティムクル、ティ、チャン，ダブリュ・ピィおよびロール，アール「ヒト前立腺特異抗原：セリンプロテアーゼとの構造的および機能的類似性」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：３１６６−３１７０，１９８６。
【００９８】
１３．ベランガー，エイ、ファンハルビーク，エイチ、グレーブズ，エイチ・シー・ビー、グランボア，ケイ、ステイミー，ティ、フアン，エル・エイチ、ポッペ，アイおよびラブリー，エフ「前立腺特異抗原の分子量および糖質構造：国際的ＰＳＡ標品を確立するための研究」Ｐｒｏｓｔａｔｅ，２７：１８７−１９７，１９９５。
【００９９】
１４．リッテンハウス，エイチ・ジー、フィンレー，ジェイ・エイ、ミコワイチク，エス・ディおよびパーティン，エイ・ダブリュ「ヒトカリクレイン２（ｈＫ２）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）：近い類縁関係にあるが相異なる前立腺中の２つのカリクレイン」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，３５：２７５−３６８，１９９８。
【０１００】
１５．クマー，エイ、ミコワイチク，エス・ディ、グレル，エイ・エス、ミラー，エル・エス、セージ，エム・エス「哺乳類細胞によるプロ型前立腺特異抗原の発現およびその成熟活性型ヒトカリクレイン２への変換」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７，３１１１−３１１４，１９９７。
【０１０１】
１６．ノット，シー・エル、クス−ライヘル，ケイ、リュー，アール・エス、ウルファート，アール・エル「診断アッセイ用抗体の開発」、「イムノアッセイの原理と実際」（プリンス，シー・ピー、ニューマン，ディ・ジェイ編、ストックトン・プレス、ニューヨーク、１９７７）の３７〜６４頁。
【図面の簡単な説明】
【図１】 前立腺組織から単離されたイムノアフィニティー精製ＰＳＡの高性能疎水相互作用クロマトグラフィープロファイル。同じ前立腺から得た３つのマッチド組織、すなわち移行領域（ＴＺ）、８０〜１００％腫瘍を含有する辺縁領域（ＰＺ−Ｃ）、および癌を含有しない辺縁領域（ＰＺ−Ｎ）を分析した。
【図２】 ＴＵＲＰ前立腺組織から精製したＰＳＡのＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイル。ＢＰＳＡ（２２％）は８分に溶出し、他の型のＰＳＡは１０分に溶出する。
【図３Ａ】 前立腺組織から精製したＰＳＡのＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイル。図３ＡはＢＰＳＡ（１５％）が８分に溶出し、他の型のＰＳＡが１０分に溶出することを示している。図３ＢはＨＩＣ−ＨＰＬＣ精製したＢＰＳＡおよびＰＳＡを表す。
【図３Ｂ】 前立腺組織から精製したＰＳＡのＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイル。図３ＡはＢＰＳＡ（１５％）が８分に溶出し、他の型のＰＳＡが１０分に溶出することを示している。図３ＢはＨＩＣ−ＨＰＬＣ精製したＢＰＳＡおよびＰＳＡを表す。
【図４Ａ】 過剰のＡＣＴと共にインキュベートしたＰＺ−Ｎ ＰＳＡの反応混合物のＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイル。ピーク１はＰＳＡで切断されている不活性ＡＣＴである。ピーク２は残存している過剰な活性ＡＣＴである。ピーク３は共有結合したＰＳＡ−ＡＣＴ複合体である。ピーク４はＡＣＴと反応しなかった不活性ＰＳＡである。３ＢはＰＳＡ−ＡＣＴピークおよび不活性ＰＳＡピークを示す３Ａの拡大図である。矢印で示すように、不活性ＰＳＡピークの様々な画分を集めて、Ｎ−末端配列決定によって分析した。
【図４Ｂ】 過剰のＡＣＴと共にインキュベートしたＰＺ−Ｎ ＰＳＡの反応混合物のＨＩＣ−ＨＰＬＣプロファイル。ピーク１はＰＳＡで切断されている不活性ＡＣＴである。ピーク２は残存している過剰な活性ＡＣＴである。ピーク３は共有結合したＰＳＡ−ＡＣＴ複合体である。ピーク４はＡＣＴと反応しなかった不活性ＰＳＡである。３ＢはＰＳＡ−ＡＣＴピークおよび不活性ＰＳＡピークを示す３Ａの拡大図である。矢印で示すように、不活性ＰＳＡピークの様々な画分を集めて、Ｎ−末端配列決定によって分析した。
【図５】 １８組のマッチド前立腺組織中のＢＰＳＡおよびｐＰＳＡのドットプロット。下部のパネルはＢＰＳＡ／ｐＰＳＡの比を表す。ＴＺは移行領域、ＰＺ−Ｎは辺縁領域−非癌、ＰＺ−Ｃは辺縁領域−癌を表す。
【図６】 ＰＳＡのアミノ酸の一次配列。矢印は本文中に説明する内部ペプチド結合切断部位を表す。

Claims (43)

1. 試料中に含まれる異なる型の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を使って前立腺癌と良性前立腺肥大とを識別する方法であって、（ａ）試料に含まれているプロＰＳＡの量を決定すること、（ｂ）試料中のＢＰＳＡの量を決定すること、および（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）の結果を数学的に組み合わせること、を含んでなる方法。
2. 該工程（ｃ）の数学的組み合わせがプロＰＳＡとＢＰＳＡの比であることを特徴とする請求項１の方法。
3. 該プロＰＳＡが［−１］ｐＰＳＡ、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡ、［−５］ｐＰＳＡおよび［−７］ｐＰＳＡからなる群より選択されることを特徴とする請求項１の方法。
4. 該プロＰＳＡが［−２］ｐＰＳＡまたは［−４］ｐＰＳＡであることを特徴とする請求項３の方法。
5. 該ＢＰＳＡが成熟型ＰＳＡのアミノ酸配列のＬｙｓ１８２に１つの切断を含み、Ｉｌｅ１、Ｌｙｓ１４５およびＬｙｓ１４６からなる群より選択される位置に０〜１以上の追加の切断を含んでなることを特徴とする請求項１の方法。
6. 該試料が哺乳動物組織試料であることを特徴とする請求項１の方法。
7. 該試料がヒトの生理学的液体の試料であることを特徴とする請求項１の方法。
8. 該ヒトの生理学的液体が血清、精漿、尿または血漿であることを特徴とする請求項７の方法。
9. 工程（ａ）が、さらに（ａ）プロＰＳＡに特異的に結合するある量の薬剤を、その薬剤およびプロＰＳＡを含んでなる二元複合体の形成が可能な条件下で、試料と接触させる工程、および（ｂ）該複合体の存在または量を検出または決定する工程、を含んでなることを特徴とする請求項１の方法。
10. 該薬剤がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含んでなることを特徴とする請求項９の方法。
11. 該薬剤がＰＳ１Ｚ１３４、ＰＳ１Ｚ１２０、ＰＳ１Ｚ１２５およびＰＳ１Ｚ８０からなる群より選択されるモノクローナル抗体を含んでなることを特徴とする請求項９の方法。
12. 請求項９の工程（ｂ）において、該抗体が検出可能な標識を含んでなるか、検出可能な標識に結合して検出可能な三元複合体を形成することを特徴とする請求項１０の方法。
13. 工程（ｂ）が、さらに（ａ）ＢＰＳＡに特異的に結合するある量の薬剤を、その薬剤およびＢＰＳＡを含んでなる二元複合体の形成が可能な条件下で、試料と接触させる工程、および（ｂ）該複合体の存在または量を検出または決定する工程、を含んでなる請求項１の方法。
14. 該薬剤がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含んでなることを特徴とする請求項１３の方法。
15. 該薬剤がＰＳ２Ｃ１０９、ＰＳ２Ｃ５０１、ＰＳ２Ｃ６３４、ＰＳ２Ｃ８０７およびＰＳ２Ｃ８３７からなる群より選択されるモノクローナル抗体を含んでなることを特徴とする請求項１４の方法。
16. 請求項１３の工程（ｂ）において、該抗体が検出可能な標識を含んでなるか、検出可能な標識に結合して検出可能な三元複合体を形成することを特徴とする請求項１４の方法。
17. 工程（ｃ）の数学的組み合わせをＢＰＨまたは前立腺癌の存在に関連付ける工程をさらに含んでなることを特徴とする請求項１の方法。
18. 試料中に含まれる異なる型の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を試料中のＢＰＨまたは前立腺癌の存在と関連付ける方法であって、（ａ）プロＰＳＡに特異的に結合する第１薬剤を用意する工程、（ｂ）ＢＰＳＡに特異的に結合する第２薬剤を用意する工程、（ｃ）該第１薬剤および第２薬剤を、第１薬剤およびプロＰＳＡを含んでなる第１二元複合体ならびに第２薬剤およびＢＰＳＡを含んでなる第２二元複合体の形成が可能な条件下で、試料と接触させる工程、（ｄ）該第１複合体および第２複合体の存在または量を検出または決定する工程、（ｅ）工程（ｄ）の結果を数学的に組み合わせる工程、および（ｆ）工程（ｅ）の数学的組み合わせを試料中のＢＰＨまたは前立腺癌の存在と関連付ける工程、を含んでなる方法。
19. 工程（ｅ）の数学的組み合わせがプロＰＳＡとＢＰＳＡの比であることを特徴とする請求項１８の方法。
20. 工程（ｃ）が、さらに（ａ）第１薬剤を、第１薬剤およびプロＰＳＡを含んでなる第１二元複合体の形成が可能な条件下で、試料と接触させる工程、および（ｂ）第２薬剤を、第２薬剤およびＢＰＳＡを含んでなる第２二元複合体の形成が可能な条件下で、試料と接触させる工程、を含んでなることを特徴とする請求項１８の方法。
21. 工程（ｄ）が、さらに（ａ）第１複合体の存在または量を検出または決定する工程、（ｂ）第２複合体の存在または量を検出または決定する工程、を含んでなることを特徴とする請求項１８の方法。
22. 該第１薬剤および該第２薬剤がそれぞれに検出可能な標識を含んでなるか、検出可能な標識に結合してそれぞれ検出可能な三元複合体を形成することを特徴とする請求項２１の方法。
23. 該第１薬剤および該第２薬剤がそれぞれに異なる検出可能標識を含んでなるか、異なる検出可能標識に結合してそれぞれ検出可能な三元複合体を形成することを特徴とする請求項２２の方法。
24. 該試料が哺乳動物組織試料であることを特徴とする請求項１８の方法。
25. 該試料がヒトの生理学的液体の試料であることを特徴とする請求項１８の方法。
26. 該ヒトの生理学的液体が血清、精漿、尿または血漿であることを特徴とする請求項２５の方法。
27. 該第１薬剤がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含んでなることを特徴とする請求項１８の方法。
28. 該第１薬剤がＰＳ１Ｚ１３４、ＰＳ１Ｚ１２０、ＰＳ１Ｚ１２５およびＰＳ１Ｚ８０からなる群より選択されるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２７の方法。
29. 該第２薬剤がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１８の方法。
30. 該第２薬剤がＰＳ２Ｃ１０９、ＰＳ２Ｃ５０１、ＰＳ２Ｃ６３４、ＰＳ２Ｃ８０７およびＰＳ２Ｃ８３７からなる群より選択されるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２９の方法。
31. 該プロＰＳＡが［−２］、［−４］、［−５］および［−７］プロＰＳＡからなる群より選択されることを特徴とする請求項１８の方法。
32. 該ＢＰＳＡがＬｙｓ１８２に１つの切断を含み、Ｉｌｅ１、Ｌｙｓ１４５およびＬｙｓ１４６からなる群より選択される位置に０〜１以上の切断を含んでなることを特徴とする請求項１８の方法。
33. （ａ）プロＰＳＡに特異的に結合する既知量の第１薬剤、および（ｂ）ＢＰＳＡに特異的に結合する既知量の第２薬剤、を含んでなり、第１薬剤および第２薬剤がそれぞれに検出可能な標識を含んでなるか、検出可能な標識に結合することを特徴とする試料中のＢＰＨまたは前立腺癌の存在を決定するためのキット。
34. 該第１薬剤および該第２薬剤がそれぞれ異なる検出可能標識を含んでなるか、異なる検出可能標識に結合して検出可能なそれぞれ三元複合体を形成することを特徴とする請求項３３のキット。
35. 該試料が哺乳動物組織試料であることを特徴とする請求項３３のキット。
36. 該試料がヒトの生理学的液体の試料であることを特徴とする請求項３３のキット。
37. ヒトの生理学的液体が血清、精漿、尿または血漿であることを特徴とする請求項３６のキット。
38. 該第１薬剤がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含んでなることを特徴とする請求項３３のキット。
39. 該第１薬剤がＰＳＭ７７３、ＰＳ１Ｚ１３４、ＰＳ１Ｚ１２０、ＰＳ１Ｚ１２５およびＰＳ１Ｚ８０からなる群より選択されるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３８のキット。
40. 該第２薬剤がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３１のキット。
41. 該第２薬剤がＰＳ２Ｃ１０９、ＰＳ２Ｃ５０１、ＰＳ２Ｃ６３４、ＰＳ２Ｃ８０７およびＰＳ２Ｃ８３７からなる群より選択されるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４０のキット。
42. 該プロＰＳＡが［−２］、［−４］、［−５］および［−７］プロＰＳＡからなる群より選択されることを特徴とする請求項３３のキット。
43. 該ＢＰＳＡがＬｙｓ１８２に１つの切断を含み、Ｉｌｅ１、Ｌｙｓ１４５およびＬｙｓ１４６からなる群より選択される位置に０〜１以上の切断を含むことを特徴とする請求項３３のキット。

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