JP4434643B2 - ２０ｓおよび２６ｓプロテアソームの阻害剤を識別する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、殺菌・殺カビ剤（ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ）およびまた２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ）の阻害剤を識別する方法、２０Ｓプロテアソームを単離する方法、２０Ｓプロテアソームを殺菌・殺カビ剤の識別で用いることそして２６Ｓおよび／または２０Ｓプロテアソームの阻害剤を殺菌・殺カビ剤として用いることに関する。
【０００２】
農業分野でかなりの損害を毎年もたらす望まれない菌・カビの増殖は例えば殺菌・殺カビ剤の使用などで防除可能である。殺菌・殺カビ剤が示す作用、これらのコストそしてとりわけこれらが生態学的に健全であることに関連して殺菌・殺カビ剤の需要が絶えず増大して来ている。従って、効力があって生態学的に健全な新規な殺菌・殺カビ剤になり得る新規な物質または新規な種類の物質の要求が存在する。一般的には、そのような新規な先導的構造物の探求は温室試験で行われるのが通常である。しかしながら、そのような試験は労力集約的で高価である。従って、温室で試験可能な物質の数は制限される。そのような試験の代替法は、「高処理選別（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」（ＨＴＳ）方法を用いることにある。これは、多数の個々の物質をこれらが細胞、個々の遺伝子産物または遺伝子（ｇｅｎｅ）に対して示す効果に関して自動化した方法で試験することを伴う。特定の物質がある効果を示すことを確認した時点で、それらを通常の選別方法で試験してもよくそして適宜更に進展させてもよい。
【０００３】
理想的な殺菌・殺カビ剤は、例えば、菌・カビが示す病原性（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の発現で決定的な役割を果たす遺伝子産物を阻害する物質である。そのような殺菌・殺カビ剤の一例は、菌・カビのメラニン生合成を抑制することでアプレソリア（ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉａ）（接着器官）が完全な状態で形成されることがないようにする活性のある化合物であるカルプロパミド（ｃａｒｐｒｏｐａｍｉｄ）である。しかしながら、菌・カビの中でそのような役割を果たすことが知られている遺伝子産物の数は非常に僅かのみである。加うるに、対応する生合成経路を抑制する結果として病原性を失わせることにより標的細胞の栄養素要求（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｓｍ）をもたらす殺菌・殺カビ剤も知られている。
【０００４】
他の重要な出発点は、必須細胞過程（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）または必須蛋白質活性で中心的な役割を果たすポリペプチドもしくはポリペプチド複合体である。ここでは、酵素反応の抑制を強調するが、しかしながら、蛋白質の相互作用または複雑な蛋白質機構の機能的相互作用を抑制することも可能である。
【０００５】
細胞過程の中心にあるそのような複雑な「蛋白質機構（ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）」の一例は２６Ｓプロテアソームである。２６Ｓプロテアソームの生物学的機能には複数の機能が含まれ、とりわけ、折り畳み不良（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）および組み立て不良（ｍｉｓａｓｓｅｍｂｌｅｄ）蛋白質およびペプチドの分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）、応力反応の調節（例えば転写因子の分解などによる）、またはシクリン（ｃｙｃｌｉｎｓ）の分解による細胞サイクル制御が含まれる。細胞の免疫反応（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）では、ペプチドが処理をそれらが次にＭＨＣＩ複合体によって他の表面に提示され得るような様式で受ける。２６Ｓプロテアソームの触媒作用中心が２０Ｓプロテアソームである。この２０Ｓプロテアソーム自身はいろいろなペプチダーゼ活性を示し、このようなペプチダーゼ活性が２０Ｓプロテアソームが示す酵素活性の基になっており、その結果として、２０Ｓプロテアソームは前記酵素活性に影響を与える物質の特に興味の持たれる標的になる。
【０００６】
プロテアソームがインビボで蛋白質分解活性を示すには標的の蛋白質がユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）を受ける必要があり、それによってＡＴＰが消費される。これに関連して、ユビキチンが標的蛋白質に伝達されることによって標的蛋白質が分解を受ける。次に、そのユビキチネン化された（ｕｂｉｑｕｉｎａｔｅｄ）蛋白質がプロテアソームの所に移送され、そこでそれが分解を受けそしてユビキチンが再利用される。
【０００７】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に含まれるそれを除いて、２０Ｓプロテアソームが有する蛋白質の全部が細胞増殖に必要であることが知られている。そのような複合体は複数の異なる蛋白質分解活性（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）、例えばペプチジル−グルタミルペプチド加水分解（ＰＧＰＨ）活性、トリプシン（ｔｒｙｐｔｉｃ）活性およびキモトリプシン（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ）活性などを含んで成る。変異分析（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ）により、キモトリプシン活性がそのような複合体の最も重要な活性であることが分かっている。２０Ｓプロテアソームを非相同的に発現させるのは以前には不可能であったが、活性のある２０Ｓプロテアソームを酵母から変性なしに精製したことは既に記述されている。
【０００８】
２０Ｓまたは２６Ｓプロテアソームの用語「酵素活性」を本明細書で用いる場合、これは、２０Ｓまたは２６Ｓプロテアソームが示すいろいろな酵素活性の中の少なくとも１つを指す。従って、「酵素活性」を示す２０Ｓまたは２６Ｓプロテアソームは、それでも、天然に存在する酵素反応の中の少なくとも１つを実行し得る。
【０００９】
【従来の技術】
真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）の２６Ｓプロテアソームは各場合とも１種類の蛋白質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）と２種類の調節複合体（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）で構成されている。２０Ｓプロテアソームは、異なる７種類のαサブユニットと異なる７種類のβサブユニットで構成されており、これらのサブユニットは既にいろいろな有機体からクローン化されかつ配列決定されている。パン屋の酵母（Ｓ．セレビシエ）に由来する２０Ｓプロテアソームの分子量は約７００ｋＤである。真核生物に由来するプロテアソームの精製も同様にいろいろな出版物に既に記述されている（例えば特許文献１；特許文献２）。最後に、また、プロテアソームを可能な最も最良の様式で精製しようとする努力によって、Ｓ．セレビシエに由来する２０Ｓプロテアソームの構造の解像ももたらされた（特許文献１、非特許文献１）。
【００１０】
２０Ｓプロテアソームが好ましい（ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ）分枝アミノ酸鎖および小型の中性アミノ酸としてキモトリプシン様、トリプシン様、ＰＧＰＨそして複数の蛋白質分解活性を示すことが非特許文献２に記述されている。そのような蛋白質分解活性はいろいろな誘導条件（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）によって向上し得る。それらには、例えばプロテアソームを５５℃に加熱すること、またはＳＤＳを添加することが含まれる。その上、２０Ｓプロテアソームが示す蛋白質分解活性を検出する時に用いるに適したいろいろな物質、例えばＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣおよびＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−２ＮＡ［ここで、ＳｕｃはＮ−スクシニルであり、ＡＭＣは７−アミノメチルクマリンであり、Ｚはカルボベンジルオキシでありそして２ＮＡは２−ナフチルアミンである］なども非特許文献３に記述されている。
【００１１】
公に入手することができるデータベース、例えばＭＩＰＳ（「Ｍｕｎｉｃｈ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（蛋白質配列に関するＭｕｎｉｃｈ情報センター）」）またはＳＧＤ（「ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ（サッカロミセスゲノムデータベース）」）に、いくつかの例外を伴って本質的に２６Ｓプロテアソームのあらゆるサブユニットが記述されている。
【００１２】
また、プロテアソームの酵素活性をインビトロで可逆的もしくは非可逆的に抑制するいろいろな阻害剤が存在することも公知である。このようにプロテアソーム阻害剤であるカルパイン阻害剤１（ｃａｌｐａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １）がβ−アミロイドペプチドの分泌に対して示す作用も試験された（非特許文献４を参照）。
【００１３】
ラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）がストレプトミセス属の代謝物（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）として非特許文献５に記述されており、それは、マウスの神経芽腫細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）において細胞サイクル阻害剤（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として働くことでニューライト増殖（ｎｅｕｒｉｔｅ ｇｒｏｗｔｈ）の導入をもたらす。このような阻害剤の細胞標的が２０Ｓプロテアソームである。
【００１４】
菌・カビの代謝物であるエピポリチオジオキソピペラジン（グリオトキシン）が非特許文献６に記述されており、それはとりわけ哺乳動物細胞における抗原処理を抑制する。その著者が示すことができたように、グリオトキシンは２０Ｓプロテアソームをインビトロで阻害する非競合阻害剤である。
【００１５】
いろいろなペプチジル化合物がヒト２０Ｓプロテアソームに対して示す阻害作用が非特許文献７に記述されている。この出版物には、更に、前記物質が２００μＭの濃度の時には菌・カビ細胞（Ｓ．セレビシエ）の増殖に全く効果を示さないことも記述されている。薬理学的に高い効力を示すプロテアソーム阻害剤、例えばＭＧ−１３２（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）などが酵母細胞の増殖速度に対して３０℃で示す効果はあるとしても僅かのみであることが非特許文献８に示されており、それは非特許文献８と一致している。
【００１６】
プロテアソームの阻害剤を識別する細胞検定システムが非特許文献９に記述されており、そこには、そのような阻害剤をアルツハイマー病またはパーキンソン病の治療で用いることができることが示されている。その場合、標識を付けた蛋白質が不安定になるような様式でユビキチンに修飾を遺伝的に受けさせると蛋白質の半減期が短くなる。レポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）を基にしてある阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔ）が蛋白質の分解を防止するか否かを測定することができる。
【００１７】
プロテアソーム阻害剤を人のいろいろな障害を治療する目的で用いることが特許文献３に記述されている。前記阻害剤が示す作用の出発点は２６Ｓプロテアソームが示す免疫調節（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）活性であることがそこに述べられている。
【００１８】
このように、プロテアソームは、今までは、ヒト有機体のいろいろな障害を治療するための標的蛋白質として記述されてきた。また、活性化合物用のプロテアソームを菌・カビから入手することができるか否かそして活性化合物を用いてプロテアソームを阻害または修飾することができるか否かそしてまたそのような活性化合物をインビボで用いることができるか否か、即ち殺菌・殺カビ剤として用いることができるか否かは、いずれも今までは研究されておらずかつ詳述されていなかった。ヒトプロテアソームの阻害剤を示した文献は非特許文献７のみであるが、そこに記述された阻害剤は濃度が２００μＭの時には酵母細胞に対して全く阻害作用を示さない。その上、薬理学的に高い効果を示すプロテアソーム阻害剤が酵母細胞の増殖速度に対して効果を示すとしても僅かのみであることも非特許文献８に示されている。
【００１９】
従って、従来技術で明らかになった事項は、ヒトプロテアソームの阻害剤が存在するとしてもそのような阻害剤は菌・カビに対しては全く作用を示さないことのみである。このように、菌・カビのプロテアソームはそのような化合物による阻害作用を受けないと思われている。それにも拘らず、例えば作用部位が異なることで公知の殺菌・殺カビ剤に対する耐性の発生が防止されるように作用部位および機構が新しい新規な殺菌・殺カビ剤を提供しかつより有効またはより特異的な殺菌・殺カビ剤、従ってまた環境により適合し得る殺菌・殺カビ剤を開発することができれば、これは望ましいことである。
【００２０】
【特許文献１】
ＷＯ ９８／４２８２９ Ａ１。
【００２１】
【特許文献２】
ＥＰ ０ ３４５ ７５０ Ａ２。
【００２２】
【特許文献３】
ＷＯ ００／３３６５４ Ａ１。
【００２３】
【非特許文献１】
Ｇｒｏｌｌ他（１９９７）、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ２０Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ａｔ ２．４Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ ３８６、４６３−４７１。
【００２４】
【非特許文献２】
Ｃｏｕｘ他（１９９８）、「Ｅｎｚｙｍｅｓ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐ１０５ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａＢ１」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１５）、８８２０−８８２８。
【００２５】
【非特許文献３】
ＭｃＣｏｒｍａｃｋ他（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、７７９２−７８００。
【００２６】
【非特許文献４】
Ｋｌａｆｋｙ他（１９９５）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１、２９−３２。
【００２７】
【非特許文献５】
Ｆｅｎｔｅａｎｙ他（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８、７２６−７３１。
【００２８】
【非特許文献６】
Ｋｒｏｌｌ他（１９９９）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６、８８９−６９８。
【００２９】
【非特許文献７】
Ｍｅｌｌｇｒｅｎ（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４７）、２９８９９−２９９０３。
【００３０】
【非特許文献８】
ＬｅｅおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９９８）、「Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｉｈｉｂｉｔｏｒｓ ｃａｕｓｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ，ｗｈｉｃｈ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｃｏｎｆｅｒ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８、３０−３８。
【００３１】
【非特許文献９】
Ｓｔａｃｋ他（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８、１２９８−１３０２。
【００３２】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、菌・カビから得られて殺菌・殺カビ剤を識別する時に用いるに適した新規な標的（ｔａｒｇｅｔ）を提供することにあった。
【００３３】
驚くべきことに、Ｍｅｌｌｇｒｅｎが見いだした事項（１９９７）そしてＬｅｅおよびＧｏｌｄｂｅｒｇが見いだした事項（１９９８）が存在するにも拘らず、本発明の範囲内で、今までは新規な殺菌・殺カビ剤の開発に関して不適切であることが知られていた菌・カビの２６Ｓもしくは２０Ｓプロテアソームが特異的阻害剤の有効な標的蛋白質であることをここに見いだした。その上、そのような阻害剤を適切な方法で識別することができそして前記方法で見いだした阻害剤をまた驚くべきことに殺菌・殺カビ剤として用いることができることも見いだした。また、人もしくは動物のプロテアソームの阻害剤であることが既に知られている阻害剤も殺菌・殺カビ剤として使用可能であるか或は人または動物における菌・カビ感染を治療するための薬剤を調製する時に使用可能であることも見いだした。
【００３４】
従って、本発明の範囲内で、活性化合物が菌・カビの２６Ｓもしくは２０Ｓプロテアソームをインビトロで阻害し得ることとそのような活性化合物を用いた処理によって前記活性化合物による処理を受けた菌・カビ有機体が損傷を受けて死滅し得ることを見いだした。従って、菌・カビの２６Ｓ／２０Ｓプロテアソームの阻害剤を植物保護で抗真菌剤（ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ）、特にまた殺菌・殺カビ剤として用いることができる。本発明では、例えば、Ｓ．セレビシエの２０Ｓプロテアソームの阻害（実施例１）をＵ．メイジス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）およびＢ．シネレ（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）（これらは両方とも植物病原性菌・カビである）の２０Ｓプロテアソームの阻害（実施例２）と同様に有効であるとして示す。本発明に従う検定方法で識別した物質そして公知のプロテアソーム阻害剤を用いて合成媒体（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｄｉａ）および植物に存在するそのような菌・カビを処理すると結果として前記菌・カビの死亡がもたらされる。
【００３５】
従って、本発明は、２６Ｓおよび／または２０Ｓプロテアソーム、好適には菌・カビの２０Ｓプロテアソームを殺菌・殺カビ剤の識別で用いることに関する。
【００３６】
用語「殺菌・殺カビ剤１種または２種以上」を本明細書の以下で用いる場合、これに、植物の病原になる菌・カビの防除（作物保護用途）で用いられる物質および人もしくは動物の病原になる菌・カビの防除（抗真菌剤）で用いられる物質の両方を包含させる。
【００３７】
「阻害剤」は、２０Ｓまたはより大型の２６Ｓポリペプチド複合体に結合するか或はそれらの活性に影響を与える小型の有機化学的分子、ペプチドまたは抗体であってもよい。その上、阻害剤は、ある分子（これは本発明のポリペプチドと結合することでそれの生物学的活性に影響を与える）と結合している小型の有機化学的分子、ペプチドまたは抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。阻害剤は天然の基質および配位子またはそれらの構造的もしくは機能的類似物であってもよい。しかしながら、好適には、本明細書で用いる如き用語「阻害剤」は、天然の基質も配位子も構成しない分子も包含する。本明細書で用いる如き用語「２６Ｓおよび／または２０Ｓプロテアソームの阻害剤」は、当該プロテアソームが有する１種以上の酵素活性を特異的に抑制し得る阻害剤を指す。
【００３８】
いろいろな菌・カビ種、例えば以下に挙げる菌・カビ種などに由来する２０Ｓプロテアソームを用いて殺菌・殺カビ剤を識別することができる。従って、例えば、殺菌・殺カビ剤を識別する本発明の検定方法（実施例１、図１）でＳ．セレビシエの２０Ｓプロテアソームを用いることができるばかりでなく植物病原性菌・カビであるＵ．メイジス（実施例２、図２）およびＢ．シネレ（図３）に由来する２０Ｓプロテアソームを用いることも可能である。
【００３９】
２６Ｓ／２０Ｓプロテアソームの阻害剤の識別で用いるに適した方法を用いて識別した化合物は、多種多様な菌・カビ、例えば人病原性菌・カビまたは植物病原性菌・カビなどに作用する。それらには、例えば、植物に損傷を与える下記の菌・カビの範囲に入る菌・カビが含まれるが、しかしながら、このリストは必ずしも完全ではない：
プラスモジオフォロミセテス（Plasmodiophoromycetes）、卵菌類（Oomycetes）、キトリジオミセテス（Chytridiomycetes）、接合菌類（Zygomycetes）、子のう菌類（Ascomycetes）、担子菌類（Basidiomycetes）および不完全菌類（Deuteromycetes）、例えば
ピチウム（Pythium）種、例えば苗立ち枯れ病（Pythium ultimum）など、フイトフトラ（Phytophthora）種、例えば疫病（Phytophthora infestans）など、プソイドペロノスポラ（Pseudoperonospora）種、例えばべと病（Pseudoperonospora humuliまたはPseudoperonospora cubensis）など、プラスモパラ（Plasmopara）種、例えばべと病（Plasmopara viticola）など、ブレミア（Bremia）種、例えばブレミア・ラクツカエ（Bremia lactucae）など、ツユカビ（Peronospora）種、例えばべと病（Peronospora pisiまたはP. brassicae）など、エリシフエ（Erysiphe）種、例えばうどんこ病（Erysiphe graminis）など、スファエロテカ（Sphaerotheca）種、例えばうどんこ病（Sphaerotheca fuliginea）など、ポドスフエラ（Podosphaera）種、例えばうどんこ病（Podosphaera leucotricha）など、ベンチユリア（Venturia）種、例えば黒星病（Venturia inaequalis）など、ピレノホラ（Pyrenophora）種、例えば網斑病（Pyrenophora teresまたはP. graminea）；（分生胞子器型： Drechslera、同義： Helminthosporium）など、コクリオボルス（Cochliobolus）種、例えば斑点病（Cochliobolus sativus）；（分生胞子器型： Drechslera、同義： Helminthosporium）など、ウロミセス（Uromyces）種、例えばウロミセス・アペンジクラツス（Uromyces appendiculatus）など、プシニア（Puccinia）種、例えば赤さび病（Puccinia recondita）など、スクレロチニア（Sclerotinia）種、例えばスクレロチニア・スクレロチオルム（Sclerotinia sclerotiorum）など、ふすべ菌属（Tilletia）種、例えば網なまぐさ黒穂病（Tilletia caries）など、黒穂病（Ustilago）種、例えば裸黒穂病（Ustilago nudaまたはUstilago avenae）など、ペリキユラリア（Pellicularia）種、例えば紋枯病（Pellicularia sasakii）など、ピリキユラリア（Pyricularia）種、例えばいもち病（Pyricularia oryzae)など、フーザリウム（Fusarium）種、例えばフーザリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）など、灰色かび属（Botrytis）種、セプトリア（Septoria）種、例えばふ枯病（Septoria nodorum）など、レプトスフエリア（Leptosphaeria）種、例えばレプトスフエリア・ノドルム（Leptosphaeria nodorum）など、セルコスポラ（Cercospora）種、例えばセルコスポラ・カネセンス（Cercospora canescens）など、アルテルナリア（Alternaria）種、例えば黒斑病（Alternaria brassicae）など、またはプソイドセルコスポレラ（Pseudocercosporella）種、例えばプソイドセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Pseudocercosporella herpotrichoides）など。
【００４０】
特に興味の持たれる他の菌・カビは、例えばＢ．シネレ、マグノポルテ・グリセ（Magnoporthe grisea）、コクリオブルス・ヘテロストロフス（Cochliobulus heterostrophus）、ネクトリア・ヘマトコッカス（Nectria hematococcus）およびフイトフトラ種、プラスモジオフォロミセテス、卵菌類、キトリジオミセテス、接合菌類、子のう菌類、担子菌類および不完全菌類である。
【００４１】
菌・カビの２０Ｓプロテアソームの阻害剤は、また、人もしくは動物の病原になる菌・カビに対しても使用可能であり、その例を完全ではないが以下に挙げる：
皮膚糸状菌、例えば白癬菌種、小胞子菌種、有毛表皮糸状菌またはケラトミセス・アジェロイ（Keratomyces ajelloi）など［これらは例えばＡｔｈｌｅｔｅ’ｓ ｆｏｏｔ（足白癬）の原因になる］、
酵母、例えばカンジダ・アルビカンス［これはカンジダルオエソファギチス（ｃａｎｄｉｄａｌ ｏｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ）および皮膚炎の原因になる］、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）またはクリプトコックス・ネオフォルマンスなど［これらは例えば肺性クリプトコックス症およびまたトルロシス（ｔｏｒｕｌｏｓｉｓ）の原因になり得る］、
糸状菌、例えばアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）、黄色アスペルギルス、黒色アスペルギルス［これらは例えば気管支肺アスペルギルス症または菌・カビ敗血症の原因になる］、ケカビ種、アブシジア種またはクモノスカビ種［これらは例えばジゴミコセス（脈管内真菌症）の原因になる］、リノスポリジウム・シーベリ（Rhinosporidium seeberi）［これは例えば慢性肉芽腫性咽頭炎および気管支炎の原因になる］、マズレラ・ミゼトマチス（Madurella myzetomatis）［これは例えば皮下ミゼトマス（ｍｙｚｅｔｏｍａｓ）の原因になる］、ヒストプラスマ・カプスラツム［これは例えば網内細胞の細胞真菌症（ｃｙｔｏｍｙｃｏｓｉｓ）およびダーリング病の原因になる］、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）［これは例えば肺性コクシジオイデス症および敗血症の原因になる］、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）［これは南アメリカブラストミセス症の原因になる］、ブラストミセス・デルマティティディス［これは例えばギルトクリス病および北アメリカブラストミセス症の原因になる］、ロボ真菌［これは例えばケロイドブラストミセス症およびロボ病の原因になる］、そしてスポロトリックス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）［これは例えばスポロトリックス症（肉芽腫性皮膚真菌症）の原因になる］など。
【００４２】
このように、例えばＳ．セレビシエまたはＵ．メイジスなどに由来する菌・カビの２０Ｓプロテアソームを用いて確認した殺菌・殺カビ剤活性化合物は、また、他のいろいろな菌・カビ種とも相互作用する可能性があり、そのような菌・カビに存在するいろいろな２６Ｓまたは２０Ｓプロテアソームに対して示す相互作用の強さは必ずしも常に等しいとは限らない。このことは、とりわけ、そのようなポリペプチド複合体に作用する物質が示す選択性を観察することで説明される。
【００４３】
プロテアソームの活性を検定する方法は既にいろいろ知られており、そしてまたある程度ではあるが商業的に入手可能（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから「２０Ｓ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＳＤＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ」）であり、これは、少量のプロテアソームの活性を試験する目的で使用可能であるが、これは相対的に時間を消費する、即ちピペットで移す工程を数回用いる必要がある。そのような公知の活性検定方法を用いて例えば本発明の殺菌・殺カビ剤を識別してもよい。しかしながら、２６Ｓおよび／または２０Ｓプロテアソームの阻害剤の識別を可能にするＨＴＳ可能方法はまだ知られていない。個々の化合物の検定またはそれらが示す阻害作用の検定で使用可能な小規模の公知方法は、それらの複雑さが理由で、ＨＴＳまたはＵＨＴＳシステムで物質のライブラリー全体を系統的に充分な信頼性を伴わせて試験しようとする時には適切でない。しかしながら、そのようなシステムは他の方法に比べて特に魅力的である、と言うのは、非常に多数の潜在的阻害剤を短時間に良好な再現性を伴わせて試験することができるからである。
【００４４】
これは特に２０Ｓプロテアソームの場合に興味が持たれる、と言うのは、その場合には１つの酵素が複数の酵素活性を組み合わせて持つが潜在的阻害剤による阻害をまた各場合とも具体的に観察することができるからである。ＨＴＳまたはＵＨＴＳシステムを用いるとそれに要する時間を顕著に短縮することができかつ望ましい特性を有する阻害剤を識別する確率が顕著に高くなり得る。そのような種々の酵素活性を分析することができかつそのような個々の活性に特異的な基質を基にしてそれらを互いから区別することができ［ＭｃＣｏｒｍａｃｋ他（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、７７９２−７８００］、このことは、阻害剤の特異性および作用に影響を与えようとする時に特に重要であり、従って、また、菌・カビまたは個々の菌・カビ属または種に損傷を与えるが他の有機体、例えば植物、昆虫または哺乳動物などには損傷を与えない阻害剤または殺菌・殺カビ剤を見つけだそうとする時にも特に重要である。ヒト（ヒトプロテアソーム）に関しては既にいろいろな特異的阻害剤が知られている。しかしながら、また、複数のプロテアソーム活性に影響を与える阻害剤も存在する。
【００４５】
従って、本発明の目的は、また、プロテアソームの特異的阻害剤を適宜大規模に識別することを可能にしかつ適宜後でポリペプチド複合体の個々の酵素活性に分類分けすることを可能にするＨＴＳおよびＵＨＴＳ方法になり易いインビトロ方法を提供することにあった。このようにして、適切な蛋白質分解活性を抑制することによって例えば高等真核生物に対する毒性を低くすることが可能になる。加うるに、個々の生物学的活性を分別することが可能になり、それに相応してそれらを具体的に修飾することが可能になる。このことは、例えば、治療の目標でない活性を抑制することなく細胞毒性効果を低くする薬剤にとって重要である。
【００４６】
【課題を解決するための手段】
我々は、ここに、ＨＴＳ可能インビトロ検定（ＨＴＳ−ｃａｐａｂｌｅ ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ）を基にして検定を受けさせた多数の化合物、即ち「候補化合物」の中から菌・カビのプロテアソームの阻害剤を選び出し（ｆｉｌｔｅｒ）そして適宜それらを２０Ｓプロテアソームの特異的蛋白質分解活性に関連付けることを可能にする方法を見いだした。
【００４７】
これに関連して、本発明の方法は、この方法全体の中の２つの改良が基になっている。１番目として、本発明を用いると、プロテアソーム抽出物の調製を効率良く行うことが可能になると同時にかなり迅速かつ簡潔に行うことが可能になり、そして２番目として、検定用成分の安定性が向上し、その結果として、活性検定の実施に要する工程の数もまた少なくなった。このような迅速かつ効率良いプロテアソーム精製は、高温のインキュベーション工程を導入したことが基になっており、これを以下により詳細に記述する。ＤＭＳＯの濃度を非常に高い値にまで高くすると、驚くべきことに、背景に対するシグナルの比率が極めて高くなり、それと同時に活性検定で用いる必要がある工程の数を少なくすることができ、それによって、反応成分の安定性を向上させることが可能になった。要するＤＭＳＯの最適な濃度を測定した。
【００４８】
この上に述べた活性のある２０Ｓプロテアソーム抽出物を調製する方法は以前には記述されていなかった。２６Ｓ／２０Ｓプロテアソーム、特に菌・カビのプロテアソームの阻害剤を識別する前記ＨＴＳ可能方法も同様に以前には記述されていなかった。
【００４９】
従って、本発明は、また、２０Ｓプロテアソームを真核生物細胞から単離／精製、特に２０Ｓプロテアソームを菌・カビ細胞から単離／精製する方法にも関し、この方法は特に酵母細胞またはＵ．メイジスまたはＢ．シネレの細胞からの単離／精製で用いるに適する。
【００５０】
本発明は、更に、特別に適合させた阻害検定法を用いて２６Ｓ／２０Ｓプロテアソーム、例えば哺乳動物、特に人の２６Ｓ／２０Ｓプロテアソーム、そして特に菌・カビの２６Ｓ／２０Ｓプロテアソームなどの阻害剤を識別するＨＴＳ／ＵＨＴＳ可能方法にも関する。菌・カビの２６Ｓ／２０Ｓプロテアソームの阻害剤を識別する方法そして殺菌・殺カビ剤を識別する方法の使用が特に好適である。
【００５１】
当該阻害剤がまた殺菌・殺カビ剤としても使用可能であるには、その識別した化合物がプロテアソームをインビトロで阻害することに加えてまたインビボでも活性を示す、即ち例えば農業などで殺菌・殺カビ剤として実際に用いることができることが重要である。インビトロ検定で数多くの阻害剤を見つけだしたとしても、いろいろな理由で、それ自身が必ずしも目標有機体に損傷を与えることができるとは限らない。このように、この上に記述した如く、従来の技術では、ヒトプロテアソームの公知阻害剤は菌・カビでは作用を示さないと認められていた。
【００５２】
従って、本発明の目的は、また、菌・カビの２０Ｓプロテアソームの阻害剤を殺菌・殺カビ剤として用いることを可能にすることにあった。
【００５３】
本発明の範囲内で、例えば、以下に記述する本発明の方法を基にして識別したプロテアソーム阻害剤ばかりでなくまた例えば既に知られているヒトプロテアソーム阻害剤が予測に反して有効な殺菌・殺カビ剤、即ち阻害活性をインビトロで示すばかりでなくまたインビボでも菌・カビのプロテアソームの機能を妨害しかつ当該菌・カビを害するか或は死亡させる目的でも使用可能な物質であることを立証する。
【００５４】
これに関連して、菌・カビの２０Ｓプロテアソームの阻害剤を識別する時、以下に記述する本発明の方法を必ずしも用いる必要はない。むしろ、候補化合物が菌・カビの２０Ｓプロテアソームに対して示す阻害作用を評価することができる限り２０Ｓプロテアソームの活性を測定する目的で用いられるあらゆる公知方法が使用可能である。
【００５５】
従って、本発明は、また、２０Ｓプロテアソーム、好適には菌・カビの２０Ｓプロテアソームを候補化合物に接触させそして次に２０Ｓプロテアソームの酵素活性を抑制する化合物１種または２種以上を選択することによって殺菌・殺カビ剤を識別する方法にも関する。２０Ｓプロテアソームの酵素活性を候補分子の存在有り無しで測定し、プロテアソームの酵素活性を候補化合物存在なしの対照に比較して低くする候補化合物、即ちプロテアソーム阻害剤である化合物を選択するような様式で本方法を実施するのが好適である。
【００５６】
用語「プロテアソーム阻害剤」を本明細書で用いる場合、これは、上述した酵素活性の中の少なくとも１つまたは適宜複数を直接もしくは間接的に抑制する物質を指す。そのような阻害剤は好適には特異的である、即ちそれはプロテアソームの阻害に関連しない異なる作用を引き起こすに要する阻害剤濃度より低い濃度でプロテアソームの活性を抑制する。そのような濃度は、好適には、指定外の作用を引き起こすに要する化合物濃度に比べて２倍低い、特に好適には５倍低い、非常に特に好適には少なくとも１０倍または２０倍低い濃度である。
【００５７】
用語「プロテアソーム活性」を本明細書で用いる場合、上述した２０Ｓもしくは２６Ｓプロテアソームの酵素活性の中の１つ以上を指す。
【００５８】
本発明の範囲内で、２６Ｓおよび／または２０Ｓプロテアソームの阻害剤を識別する目的で、Ｓ．セレビシエ、Ｕ．メイジスおよびＢ．シネレのそれぞれに由来する２０Ｓプロテアソームを例として用いる。しかしながら、また、Ｓ．セレビシエ、Ｕ．メイジスおよびＢ．シネレに由来する２０Ｓプロテアソームの代わりに、他の菌・カビまたは菌・カビでない他の有機体に由来する２０Ｓプロテアソームを用いて阻害剤を識別することも可能である。このことはヒトプロテアソームの阻害剤がまた殺菌・殺カビ剤としても働き得ることから明らかである。
【００５９】
本分野の技術者に公知のいろいろな技術を用いて細胞を破裂させ（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）てもよい。また、公知方法［例えばＧｒｏｌｌ他（１９９７）、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ２０Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ａｔ ２．４Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ ３８６、４６３−４７１；ＥＰ ３４５ ７５０ Ａ２；ＷＯ ９８／４２８２９；ＪＰ ０５２９２９６４ Ａ； ＪＰ ０６０２２７５９ Ａ］を用いて、その後のプロテアソーム精製／単離を達成することも同様に可能である。用語「単離」、「濃縮」または「精製」を本明細書で用いる場合、これは、２０Ｓプロテアソームを細胞または組織の他の蛋白質もしくは他の巨大分子からそれらが示す酵素活性またはそれの抑制を具体的に測定することが可能な度合で取り出すことを意味する。２０Ｓプロテアソーム含有組成物は、プロテアソームの含有量に関して、宿主細胞から調製した調製物に比較して好適には少なくとも１０倍、特に好適には少なくとも１００倍濃縮されている組成物である。公知の方法は相対的に複雑であり、数多くの工程を含んで成る（例えばＷＯ ９８／４２８２９を参照）。特に本発明の方法でプロテアソームを用いる場合、２０Ｓプロテアソームの酵素活性およびそれの抑制の測定を可能にする従来技術の複雑な方法を用いて調製された２０Ｓプロテアソームが示す活性と少なくとも同じ活性を示す２０Ｓプロテアソームを短時間に回収するのが望ましい。
【００６０】
本発明の本方法では、本分野の技術者に公知の方法を用いて、酵母の細胞を後で用いる検定用緩衝液（例えば５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＥＤＴＡ）の中で好適には機械的に破裂させる（例えばＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓまたは高圧ホモジェナイザーを用いて）。本発明の方法で用いるに適した酵母の例にはまたベーキングで用いられる如き商業的に入手可能な酵母（パン屋の酵母）も含まれる。次に、そのプロテアソームを可溶画分の状態にして、それを不溶成分および細胞の屑から遠心分離で分離してもよいが、本発明の方法の実施ではそのような工程を必ずしも実施する必要はない。次に、その懸濁液または可溶画分を約５０℃から７０℃、好適には５５℃から６５℃で約２０から７５分間インキュベートする。特に約６０℃で約６０分間のインキュベーションが適切である。ここでは、そのような温度にすると当該蛋白質がまだ存在する他の蛋白質とは対照的に安定であることを見いだしたことを利用する。従って、温度に不安定な蛋白質が本発明のそのような精製工程中に沈澱を起こし、そしてそれらを温度に安定な２０Ｓ複合体から遠心分離で除去することができる。従って、細胞の成分がもはや変性を受けなくなりかつ沈澱した時点でインキュベーションを止めてもよい。プロテアソームを他の成分から分離する目的で加熱工程を用いることは従来技術には記述されていない。しかしながら、それによって、プロテアソームの精製をほんの一次段階で迅速かつ簡潔に非常に効率良く行うことが可能になり、そして沈澱した細胞成分を除去した後、そのような方法で精製を受けさせたプロテアソームを活性もしくは阻害検定で直接用いることができる。その後、微生物の増殖が起こらないように例えばアジ化ナトリウムをその上澄み液に添加してもよい。その上、本発明の方法を用いると、完全な２６Ｓプロテアソームに含まれる蛋白分解活性領域は利用不能であることから阻害剤の識別で用いるにはあまり適さない２６Ｓプロテアソームではなく２０Ｓプロテアソームを好適に得ることが確保される。阻害剤を識別するＨＴＳ可能方法で用いるに充分な量のプロテアソームをそのような簡潔な様式で３０ｇ（湿った状態の重量）の酵母から得ることができる。
【００６１】
従って、本発明は２０Ｓプロテアソーム、好適には菌・カビの２０Ｓプロテアソームを真核生物の細胞から精製する方法に関し、この方法は、
ａ）普通の方法を用いて細胞、好適には菌・カビの細胞を破裂させ、
ｂ）生じた細胞懸濁液を５０℃−７０℃に温度に敏感な成分が沈澱するまで加熱し、そして
ｃ）不溶成分を遠心分離で除去することでプロテアソームを回収する、
ことを特徴とする。
【００６２】
この２０Ｓプロテアソームを精製する方法はいろいろな有機体で使用可能である。このように、本発明の範囲内で、本発明の方法を用いて例えばＳ．セレビシエ、Ｕ．メイジスおよびＢ．シネレなどの２０Ｓプロテアソームを高い活性を伴わせて得ることができることを立証する。本方法を他の真核生物、特に菌・カビの細胞で用いることも同様に可能である。
【００６３】
２０Ｓプロテアソームが示す酵素活性を検定する方法そしてそれの活性の抑制を検定する方法は文献から公知である。そのような検定システムでは、例えば酵素による分解によって結果として蛍光測定または比色測定で測定可能な基の遊離をもたらす個々のプロテアソーム用基質を用いる。その用いる方法は、個々の成分（例えば反応用緩衝液、活性化用緩衝液、２０Ｓプロテアソーム、基質溶液、阻害剤）を段階的に添加した後に蛍光の変化または吸光度の変化を測定することが基になっている［例えば「２０Ｓ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，ＳＤＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ」、Ｃａｔ．Ｎｏ．５３９１５８を参照］。これに関連して、そのような基質は実験条件下で安定性が低いことを考慮に入れる必要がある。ペプチド基質、例えばＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣなどは溶解度が低くかつ安定性が低いことから相対的に不安定であり、従って、例えば測定する時に導入して測定する必要があるサンプルの数が極めて多いＨＴＳ／ＵＨＴＳシステムなどでは不可避な如く測定が数時間継続する場合にはほとんど適さない。従って、そのような基質またはこれらが基になった活性検定で用いるペプチド基質が無傷なままであることを確保しようとすると、今までのところ、それに適するとしても短時間の単一実験を行う場合のみであった。従って、基質であるＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣは溶解度が低く（ＤＭＳＯ１ｍｌ当たり５０ｍｇ）かつ光に敏感であると記述される。典型的な実験アプローチ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍの「２０Ｓ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ＡｓｓａｙＫｉｔ，ＳＤＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ」）は下記の基本的工程の実施が基になっている：最初に反応用緩衝液を導入し、２番目の工程でピペットを用いて活性化用緩衝液（例えばＳＤＳを含有する）を添加して両方の成分を混ぜ合わせる。３番目の工程で前記溶液に２０Ｓプロテアソームを加える。４番目の工程で、当該基質を添加して反応を開始させる。５番目の工程で阻害剤を添加するが、この最後の２工程を場合によりまた逆の順で実施することも可能である。
【００６４】
そのような種類の活性検定がＨＴＳ／ＵＨＴＳ方法として使用可能であるには、ピペットで移す数多くの工程を少なくする必要があるであろう。この目的で、サンプルの調製そして数多くの候補化合物の測定に要する時間が通常は長いことを考慮に入れて、その場合にピペットで移した個々の成分の混合物が比較的長時間に渡って安定なままである必要があるであろう。これに関連して、その必要な背景に対するシグナルの比率を維持するには、プロテアソームの酵素活性ばかりでなく基質のそれも悪化することがないようにすべきである。従って、本発明の目的は、公知の検定システムを更に進展させてそれをＨＴＳ／ＵＨＴＳ方法として用いることができるようにすることにあった。
【００６５】
このような問題の解決法は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）を反応混合物に入れて用いるか或は反応混合物に入れるＤＭＳＯの濃度を高くすることを基にした解決法である。例えば、ＤＭＳＯの濃度を高くするにつれてプロテアソームが示すキモトリプシン活性（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が低下する［図５（Ｂ）］が、ＤＭＳＯの濃度を高くすると基質の安定性が向上することを見いだした。最後に、ＤＭＳＯの濃度を２から１０％（体積／体積）にすると最適なキモトリプシン活性を維持しながら基質の最適な安定性が得られ、特に３から７％の濃度にするのが望ましい。特に、ＤＭＳＯの濃度を４．５から６％にするのが適切である［図５（Ａ）および（Ｂ）］。ＤＭＳＯの濃度を５％にすると、プロテアソームの活性は７２時間に渡っても安定なままであるが、従来技術に記述されているようにするとほんの１時間のみである（図６）。
【００６６】
その結果として、本発明の方法を用いるとプロテアソームの活性が悪化することなく基質の安定性が顕著に向上する。本発明に従うと、活性検定もしくは阻害検定の実施で利用出来る時間が顕著に長くなることに加えて、また、必要な溶液を前以て既に一緒にしておいてそれらを比較的長時間に渡って貯蔵することも可能になり（図６）、それによって、ピペットで移す必要がある段階の数を公知方法のピペットで移す工程が５工程（この上を参照）ではなく３工程にまで少なくすることが可能になる。例えば、候補化合物を最初に適切な緩衝液の中に入れ、そして２番目の工程で、ＤＭＳＯを適切な量で入れておきかつ可能ならばまた活性化剤であるＳＤＳも既に入れておいた基質溶液を加える。３番目の工程で、２０Ｓプロテアソームの溶液を添加して反応を開始させる。また、個々の成分を添加する順を変えることも可能である。
【００６７】
本発明の方法で用いる温度は非常に幅広い範囲に渡って多様であり得る。１５℃から８０℃、特に２５℃から５０℃の温度、または単に室温を用いてもよい。特に３７℃の温度の使用が好適である。
【００６８】
本発明の方法では、また、２０Ｓプロテアソームの活性化剤を用いることも可能であり、それを反応混合物に入れておく。好適な活性化剤は、Ｃｏｕｘ他（１９９５）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５、８０１−８４７に記述されている活性化剤であり、特に活性化剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）およびＰＡ２８α［Ｋｎｏｗｌｔｏｎ他（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３９０、６３９−６４３］を強調する。
【００６９】
従って、本発明は、また、２０Ｓプロテアソーム阻害検定で候補化合物の検定を２から１０％（体積／体積）のＤＭＳＯの存在下で行うことで２０Ｓプロテアソーム、特に菌・カビの２０Ｓプロテアソームの阻害剤を識別する方法にも関する。蛍光または吸光度を候補化合物の存在有り無しで比較することで候補化合物が２０Ｓプロテアソームの酵素活性を抑制する度合を監視してもよい。
【００７０】
本発明は、また、この上に記述しかつ以下に記述するように殺菌・殺カビ剤を識別した後に殺菌・殺カビ活性を測定するインビボ検定を行ってもよい方法にも関する。このような検定は、好適には、見つけだした阻害剤を少なくとも１種の菌・カビ種に接触させた後に前記菌・カビの損傷を試験することを含んで成る。
【００７１】
これに関連して、用語「２０Ｓプロテアソーム阻害検定」を本明細書で用いる場合、これは、特に、２０Ｓプロテアソームの基質から発蛍光基または比色測定可能基が遊離して来る結果として蛍光もしくは吸光が起こることまたは前記遊離を当該活性の阻害剤が抑制することを基にして２０Ｓプロテアソームの酵素活性を測定することを指す。特に、阻害検定が不安定な基質が基になっていて、それがＤＭＳＯによって安定になり得る場合に、本発明の方法を適用すべきである。
【００７２】
自然な文脈において、２０Ｓプロテアソームは保護されていないペプチドに加水分解を起こさせることから、本発明の方法でまた保護されていない基質を用いることも可能である。しかしながら、保護されている基質に比べて安定性が更に低い可能性があることを考慮に入れる必要がある。蛍光団であるＡＭＣに加えて、また、他の蛍光団または発色団、例えば蛍光団である２−ナフチルアミド（２ＮＡ）、４−メトキシ−２−ナフチルアミドまたは６−アミノキノリンなどを用いることも可能である。比色測定可能基の例はｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）、ｐ−フェニルアゾアニリドまたは３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリドである。プロテアソームが有するいろいろな酵素活性のための公知基質は、とりわけ、蛍光測定または比色測定で監視可能な分解を起こす下記のペプチド基質である。そのような基質の例は、キモトリプシン活性測定用のＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＡＭＣ（Ｚ−ＬＬＬ−ＡＭＣ）、ペプチジル−グルタミルペプチド加水分解活性測定用のＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＡＭＣ（Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ）、キモトリプシン活性測定用のＺ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−ＡＭＣ（Ｚ−ＶＫＭ−ＡＭＣ）、キモトリプシン活性測定用のＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（Ｓｕｃ−ＬＹ−ＡＭＣ）、ＰＧＰＨもしくはキモトリプシン様活性測定用のＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−２ＮＡ（Ｎ−（Ｎ−カルボベンジルオキシカルボニル−ロイシル−ロイシル−アルギニル）−２−ナフチルアミン）もしくはＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ）であり、これらは全部商業的に入手可能である（またＷＯ ００／２３６１４を参照）。使用可能な基質は、また、いろいろな保護基を持たせた前記基質、特にＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣである。頻繁に用いられる保護基の例はベンジルオキシカルボニル（また「Ｚ」とも呼ぶ、この上を参照）およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−ｂｏｃ）である。
【００７３】
従って、本発明は、特に、上述した群の基質から選択した少なくとも１種の基質を用いる方法にも関し、下記の群の基質：Ｚ−ＬＬＬ−ＡＭＣ、Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ、Ｚ−ＶＫＭ−ＡＭＣ、Ｓｕｃ−ＬＹ−ＡＭＣおよび特にＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣから選択した基質の使用が好適である。
【００７４】
加うるに、競合する共有阻害剤（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、例えばクラスト−ラクタシスチンβ−ラクトン、エポキソマイシン（プロテアソームのキモトリプシン様、トリプシン様およびペプチジルグルタミルペプチド加水分解活性を抑制）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂ（ＯＨ）₂、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（ＭＧ−１３２、ユビキチン経路による分解を抑制）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−ＣＨＯ（ＭＧ−１１５、カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ノルバリナール、特にプロテアソームのキモトリプシン様活性を抑制）、Ｚ−ｌｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ（キモトリプシン様活性を抑制）、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ（ＭＧ−１０１、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシナール、キモトリプシン様およびペプチターゼ活性を抑制）またはＡｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ（ペプチダーゼ活性を抑制）なども公知であり、それらも全部同様に商業的に入手可能である［また、Ｍｅｌｌｇｒｅｎ（１９９７）：「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ μ−Ｃａｌｐａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ２０Ｓ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２９８９９−２９９０３；Ｂｏｇｙｏ他（１９９８）：「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｂｅｓ」、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５、３０７−３２０も参照］。このように、本発明の方法の検定でまたそのような公知の阻害剤を用いることも可能である（実施例３を参照）。菌・カビの細胞を基にしたさらなる検定において、驚くべきことに、そのような公知の阻害剤もまた殺菌・殺カビ活性を示すことを見いだし、従って、それらもまた殺菌・殺カビ剤として使用可能であるか或は菌・カビによる感染を処置する薬剤を調製する時に使用可能である。
【００７５】
原則として、上述した公知の基質またはこれらの開裂生成物を基にしてプロテアソームが示す個々の酵素活性または複数の活性を蛍光測定もしくは比色測定で測定することができ、そしてその活性の阻害を上述した公知阻害剤のいずれかを用いて試験することができる。この目的で、目標活性に応じて相当する基質および適宜阻害剤を選択することができる。その後、本発明の方法を用いて見つけだした阻害剤または特定の基質を１種以上の特定の活性を示す阻害剤として直接識別することができる。
【００７６】
しかしながら、そのような基質の選択は測定結果の評価を可能にする選択でなければならない、即ち阻害を明瞭に検出することができるべきである。使用可能な統計学的パラメーターの一例は背景に対するシグナルの比率である。また、選別方法または阻害検定の品質を決定する適切なパラメーターはｚファクター（ｚｆａｃｔｏｒ）である。ｚファクターの計算には、シグナルと背景の間の差に加えて、また、あらゆるデータの散乱も含まれる。このｚファクターの計算を下記の如く行う：ｚファクター＝１−［（３ｘ標準偏差ｐｏｓｃｏ＋３ｘ標準偏差ｎｅｇｃｏ）／（平均ｐｏｓｃｏ−平均ｎｅｇｃｏ）］［ここで、「ｐｏｓｃｏ」は正の対照でありそして「ｎｅｇｃｏ」は負の対照である［Ｚｈａｎｇ他（１９９９）：「Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．４（２）：６７−７３］。
【００７７】
ｚファクターが０．７より大きい時には優れていると見なし、ｚファクターが０．１５から０．７の時には良好であると見なし、ｚファクターが０から０．１５の時にはそれでも充分であると見なしそしてｚファクターが０未満の時にはもはや評価不能であると見なす。
【００７８】
本発明の方法を用いると、ｚファクターが約３０分後に０．７を超える。
【００７９】
従って、本発明は、また、２６Ｓおよび２０Ｓプロテアソームの阻害剤であって好適には０．７を超えるｚファクターを示す阻害剤を識別する方法にも関する。
【００８０】
本方法の原理を示す目的で本発明の方法の可能な態様を公知の阻害剤であるＭＧ−１３２を例として用いて以下に示す。
【００８１】
試験を受けさせるべきプロテアソームの酵素活性またはそれの阻害を、本実施例に示すように、公知ペプチド基質であるＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ［Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ；Ｓｔｅｉｎ他（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５、３８９９］から遊離して来るＡＭＣの蛍光の増加を通して以下のスキームに示すように検出することができる：
２０Ｓプロテアソーム
ペプチド基質（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ） → ＡＭＣ＋ペプチド残基
Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣは、２０Ｓプロテアソームが示すキモトリプシン様活性を測定するための発蛍光基質である。開裂によって取り除かれたＡＭＣ（７−アミノ−４−メトキシクマリン）は３８０ｎｍの波長の所に励起最大値を示しかつ４６０ｎｍの所に発光最大値を示す。この阻害剤のＫ_iは５ｎＭである。
【００８２】
しかしながら、原則として、また、ここに例として挙げた基質であるＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣに加えてプロテアソームの他の基質、例えばこの上に示した公知基質を用いることも可能である。
【００８３】
そのようにして測定可能な蛋白質分解活性は阻害剤、例えばＭＧ−１３２などによる影響を受け、その結果として、観察される相対的蛍光がより低くなり得る（図１および２）。ＭＧ−１３２は、細胞壁を透過し得る公知の可逆的プロテアソーム阻害剤である［Ｌｅｅ，Ｄ．Ｈ．、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．（１９８９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１、２７２８０］。前記公知阻害剤を用いてプロテアソームの活性を抑制すると相対的蛍光が顕著に低くなる。負の対照として、前記反応をプロテアソームなしに実施する。前記反応を本発明の方法に従って起こさせると、プロテアソーム活性の阻害を全く問題なく識別することが可能になり、従って、プロテアソームの阻害剤を識別することが可能になる。
【００８４】
また、本方法の試験で他の阻害剤、例えばプロテアソームの活性を抑制する上述した公知阻害剤などを用いることも可能である。
【００８５】
プロテアソームの阻害剤を識別する方法またはポリペプチド複合体の活性を測定する方法に最適な条件を決定しようとする時には、用いる基質が示す個々のＫ_M値を測定するのが有利である。この値は好適に用いる基質１種または２種以上の濃度を示す値である。例として、用いる基質であるＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣが示した測定Ｋ_M値は５μＭであった（図４参照）。
【００８６】
本発明の方法を用いてまた他の有機体に由来する２６Ｓ／２６Ｓプロテアソーム例えば人または動物の２６Ｓ／２０Ｓプロテアソームの阻害剤、即ち例えば細胞の活性化、細胞サイクルの制御、細胞の分化および成熟または人における細胞消滅の誘発などで用いられる化合物を識別することも可能である。このことは、病気、例えば癌、ＨＩＶ、アレルギー、自己免疫病、感染病、発作、炎症過程および移植用薬（これに関してはＷＯ ００／３３６５４参照）などに関して重要であり、その場合には、プロテアソームが有する個々の酵素活性が決定的な役割を果たす。このように、本方法を菌・カビのプロテアソームの阻害剤を識別することに限定するものでなく、原則として、本方法は多種多様な有機体に由来するそのようなポリペプチド複合体の阻害剤を探求する時にも使用可能である。
【００８７】
菌・カビの２０Ｓプロテアソームの阻害剤および殺菌・殺カビ剤を識別する本発明に従う特に好適な前記方法に加えて、また、本分野の技術者に公知の通常の方法の全部、例えばＷＯ ００／２３６１４、Ｇｒｏｌｌ他（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３８６、４６３、Ｍｅｌｌｇｒｅｎ（１９９７）：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２９８９９、Ｍｅｎｇ他（１９９９）、ＰＮＡＳ ９６、１０４０３、ＭｃＣｏｒｍａｃｋ他（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、７７９２、Ｄｒｉｓｃｏｌｌ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、４７８９またはＯｒｌｏｗｓｋｉ他（９９３）：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２、１５６３に記述されている方法または商業的に利用可能な方法（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍの）などを用いることも可能であることは明らかである。ここで用いるプロテアソームの基質の例は、この上に既に記述した基質以外に、また、リゾチーム、アルファ−ラクトアルブミン、ベータ−ラクトグロブリン、β−インシュリンおよびオルニチンデカルボキシラーゼである。２６Ｓプロテアソーム全体が示す活性を測定することを意図する場合には、そのような基質に好適にはユビキチネーションを受けさせるか、或は反応混合物に追加的にユビキチンとユビキチネーション用酵素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）を含有させる。
【００８８】
この上に例として記述した方法を用いて、２０Ｓプロテアソームをインビトロで抑制することに加えてインビボで殺菌・殺カビ作用を示す化合物を識別することができた。
【００８９】
表Ｉに、例として、本発明の方法で阻害作用を示した化合物そしてその後のインビボ試験、例えばここではいろいろな菌・カビに対する「寒天拡散検定（ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）」などで殺菌・殺カビ作用を示した化合物を示す。これに関連して、下記の菌・カビを例として用いた：ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）シネレ（ＢＯＴＲＣＩ）、トウモロコシ黒穂菌（Ustilago maydis）（ＵＳＴＩＭＡ）、ピリクラリア・オリカエ（ＰＹＲＩＯＲ）、フーザリウム・クルモルム（ＦＵＳＡＣＵ）、リゾクトニア・ソラニ（ＲＨＩＺＳＯ）、プソイドセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（ＰＳＤＣＨＷ）。「ＭＩＣ」値は「最小阻害濃度」を記述する値である。これは、活性化合物が菌・カビの増殖を防止する最低濃度（ｐｐｍ）に相当する。このように、検定を受けさせた基質が示す効力はＭＩＣ値が低ければ低いほど高い。
【００９０】
【表１】

【００９１】
これは、本発明の方法を用いて識別した２６Ｓ／２０Ｓプロテアソームの阻害剤およびまたヒト２６Ｓ／２０Ｓプロテアソームの公知阻害剤が菌・カビの損傷または死滅で用いるに適することを立証している。
【００９２】
寒天拡散検定は、微生物が抗菌活性化合物に対して示す感受性を測定する簡潔な方法である［例えばＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＣａｒｔｅｒ（２０００）：「Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｔｉｍｏｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆＣｌｏｒｏｘ^TM ｕｓｉｎｇ ａｎ ａｇａｒａ−ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ：ａｎｅｗ ｔｗｉｓｔ ｏｎ ａｎ ｏｌｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ」、Ｂｉｏｓｃｅｎｅ ２６（３）、９−１３を参照］。この検定では、微生物、即ちこのケースでは個々の菌・カビを接種しておいた寒天板を用い、そしてその寒天培地の中に活性化合物をゆっくりと拡散させてもよい。例えば、前記活性化合物を染み込ませておいた小型の丸いフィルターを単に例えば寒天板の上に置くことで寒天に接触させることなどでそれを実施する。その菌・カビを接種しておいた培地の中を拡散する活性化合物の濃度は、それが渡る距離の平方の関数として徐々に低くなる。その活性化合物は、これが個々の距離に渡って拡散した後にもはや菌・カビに対して全く作用を示さないくらいまで希釈される。増殖が抑制されるゾーンが発生することを利用して個々の物質が示す効力を示す。そのようなゾーンは、活性化合物を寒天培地の中に染み込ませたことで生じた斑点の回りに透明な領域が生じることで観察可能である。そのようなゾーン、即ち環の直径を測定することで、それを当該物質が示す効力の尺度として用いることができる。
【００９３】
２６Ｓ／２０Ｓプロテアソーム阻害剤がインビボで示す殺菌・殺カビ効力を評価する時、前記検定方法に加えて、また、本分野の技術者に公知の他の方法も使用可能であるが、但し、検定を受けさせる化合物が示す殺菌・殺カビ作用または静菌・カビ（ｆｕｎｇｉ−ｓｔａｔｉｃ）作用を評価することができることを条件とする。
【００９４】
従って、本発明は、また、２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームの阻害剤、特に菌・カビの２０Ｓもしくは２６Ｓプロテアソームの阻害剤、および２０Ｓおよび２６Ｓプロテアソームの阻害剤を識別する本発明の方法を用いて見つけだした殺菌・殺カビ剤にも関する。
【００９５】
本発明は、同様に、２６Ｓ／２０Ｓプロテアソーム、特に菌・カビの２６Ｓ／２０Ｓプロテアソームの阻害剤を殺菌・殺カビ剤として用いることにも関する。それらには、また、他の有機体に由来する２６Ｓ／２０Ｓプロテアソームの既に公知のあらゆる阻害剤、例えばこの上に述べた阻害剤などの全部が含まれる。本発明に従う様式で使用可能、従って、全部が本発明の主題事項に明らかに含まれるさらなる阻害剤は、例えばＷＯ ００／４３０００、ＷＯ ９５／２４９１４およびＷＯ ９１／１３９０４に挙げられているプロテアソーム阻害剤である。
【００９６】
本化合物は、これを植物保護で用いる目的で、これが示す個々の物理的および／または化学的特性に応じて、通常の調剤、例えば液剤、乳剤、懸濁剤、粉剤、発泡剤、ペースト、顆粒剤、エーロゾル、重合体物質に微細カプセル封じされた状態、そして種子用の被覆組成物、およびＵＬＶ冷および温霧調剤に変換可能である。
【００９７】
このような調剤の調製を、公知様式、例えば本活性化合物と増量剤、即ち液状溶媒、加圧下で液化するガスおよび／または固体の担体を適宜界面活性剤、即ち乳化剤および／または分散剤および／または泡形成剤（ｆｏａｍ ｆｏｒｍｅｒｓ）を用いて混合することで行う。用いる増量剤が水の場合、例えば有機溶媒を補助溶媒として使用することも可能である。適切な液状溶媒は本質的に下記である：芳香族、例えばキシレン、トルエンまたはアルキルナフタレン類など、塩素置換芳香族または塩素置換脂肪族炭化水素、例えばクロロベンゼン類、クロロエチレン類または塩化メチレンなど、脂肪族炭化水素、例えばシクロヘキサンまたはパラフィン類、例えば石油留分など、アルコール類、例えばブタノールまたはグリコールなど、そしてそれらのエーテル類およびエステル類、ケトン類、例えばアセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンまたはシクロヘキサノンなど、強極性溶媒、例えばジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキサイドなど、および水。液化した気体状の増量剤または担体は大気圧下の標準的な温度で気体状になる液体を意味し、例えばエーロゾル噴射剤、例えばハロゲン置換炭化水素、およびまたブタン、プロパン、窒素および二酸化炭素などである。適切な固体状担体は、例えば粉砕した天然鉱物、例えばカオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モントモリロナイトまたはケイソウ土など、および粉砕した合成鉱物、例えば微細シリカ、アルミナおよびケイ酸塩などである。粒剤用の適切な固体状担体は、例えば破砕し分級した天然石、例えば方解石、大理石、軽石、海泡石、ドロマイトなど、およびまた無機および有機粉末の合成粒体および有機材料の粒体、例えばのこくず、やし殻、とうもろこしの穂軸およびタバコの茎などである。適切な乳化剤および／または泡形成剤は、例えば非イオンおよび陰イオン乳化剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル類、例えばアルキルアリールポリグリコールエーテル類、アルキルスルホネート類、アルキルスルフェート類、アリールスルホネート類、および蛋白質加水分解生成物などである、適切な分散剤は、例えばリグノスルファイト廃液およびメチルセルロースである。
【００９８】
粘着付与剤、例えばカルボキシメチルセルロース、および粉末、粒体またはラテックス形態の天然および合成重合体、例えばアラビアゴム、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニルなど、および天然の燐脂質類、例えばセファリン類およびレシチン類など、および合成燐脂質などが前記調剤で使用可能である。他の可能な添加剤は鉱油および植物油である。
【００９９】
着色剤、例えば無機顔料、例えば酸化鉄、酸化チタン、プルシアンブルーなど、および有機染料、例えばアリザリン染料、アゾ染料および金属フタロシアニン染料など、そして微量栄養素、例えば鉄、マンガン、ホウ素、銅、コバルト、モリブデンおよび亜鉛の塩類などを使用することも可能である。
【０１００】
前記調剤に含有させる本活性化合物の量は一般に０．１から９５重量パーセント、好適には０．５から９０重量％である。
【０１０１】
本活性化合物またはこれらの調剤を防除すべき菌・カビに直接接触させるか或はそれらの生息地に接触させてもよい。
【０１０２】
【実施例】
実施例１
Ｓ．セレビシエ細胞からプロテアソーム抽出物を調製
小型の発酵装置の酵母１５０ｍｌを２５０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＭのＥＤＴＡ）と一緒にして再懸濁させることで酵母懸濁液を４００ｍｌ得た。この細胞を高圧ホモジェナイザーに入れて１８００ｐｓｉの圧力下２７℃で３回破裂させた。細胞を破裂させた後、０．１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを７．５に調整した。その後直ちにインキュベーションを６０℃で６０分間実施した。次に、この懸濁液をＪＡ２０ローターを用いた遠心分離に４℃において１３０００ｒｐｍで３回かけることで沈澱した成分を除去した。次に、プロテアソームが入っている残存上澄み液の１：１００希釈液を直ちに阻害剤識別検定で用いることができた。
【０１０３】
その活性は細胞の発酵状態に応じて多様であり得ることから、適切な希釈率を選択することができるようにプロテアソームの活性を前以て測定しておくことを推奨する。
【０１０４】
実施例２
Ｕ．メイジス細胞からプロテアソーム抽出物を調製
Ｓｃｈｕｌｚ他［Ｓｃｈｕｌｚ他（１９９０）、「Ｔｈｅ ｂ ａｌｌｅｌｅｓ ｏｆ Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ，Ｗｈｏｓｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｔｉｆ」、Ｃｅｌｌ ６０、２９５−３０６］に従い、５０ｍｌのＵ．メイジス培養物からプロトプラストを調製した。その後、そのプロトプラストを２０００ｒｐｍで５分間かけて薄片状にした。その後、緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＭのＥＤＴＡ）を５０μｌ添加すると、浸透条件が変わることから前記プロトプラストが破裂を起こす。それを遠心分離に１３０００ｒｐｍで５分間かけることで細胞の屑を薄片状にした。その上澄み液を再び６０℃で１時間インキュベートした後、変性した蛋白質を１３０００ｒｐｍで５分間かけて薄片状にした。次に、その得たＵ．メイジスプロテアソームが示す活性を試験することで次の検定で用いる希釈率を決定する。
【０１０５】
実施例３
公知阻害剤であるＭＧ−１３２を用いた検定システムチェック（活性検定）
本発明の方法の有効性を検査することを意図してＣａｌｂｉｏｃｈｅｍの公知阻害剤であるＭＧ−１３２を用いた活性および阻害検定を３８４個のウエルが備わっているＭＴＰ（ウエルが３８４個備わっているミクロタイタープレート）を用いて実施した。全容積が５０μｌのウエルの各々にプロテアソーム（２．８ｇ）を入れておいた酵素用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ）を２５μｌ、基質を入れておいた基質用溶液（１３μＭのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、０．０６％のＳＤＳ、１０％のＤＭＳＯ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；２ｍＭのＥＤＴＡ）を２０μｌおよび試験物質（５％のＤＭＳＯに１６０ｎＮのＭＧ−１３２）を５μｌ入れた。予備測定（蛍光）を３６０／４６５ｎｍ（３５ｎｍの帯幅）で実施した。インキュベーションを２５℃で４０分間実施した。蛍光を再び３６０／４６５ｎｍ（３５ｎｍの帯幅）で測定した。
【０１０６】
実施例４
プロテアソームの阻害剤の識別（選別）
ＵＨＴＳ（選別）におけるプロテアソーム阻害検定で３８４個のウエルが備わっているＭＴＰ（Ｇｒｅｉｎｅｒの）を用いた。最初に５μｌの試験物質用溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＭのＥＤＴＡ）に試験物質を阻害検定における試験物質の最終濃度が２μＭになるように入れた。前記板に備わっている追加的ウエルに負の対照（１６０ｎＭのＭＧ−１３２；５％のＤＭＳＯ）を５μｌ加えかつ正の対照（５％のＤＭＳＯ）を５μｌ加えた。その試験物質溶液に基質溶液（１３μＭのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、０．０６％のＳＤＳ、１０％（体積／体積）のＤＭＳＯ；１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；２ｍＭのＥＤＴＡ）を２０μｌ加えた。その後、酵素溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；２ｍＭのＥＤＴＡ；ウエル１個当たり２８０ｎｇのプロテアソーム）を２５μｌ加えそして相対的蛍光を測定した［３６０／４６５ｎｍ（２５ｎｍの帯幅）で予備測定］。インキュベーションを２５℃で４０分間行った後、相対的蛍光を再び３６０／４６５ｎｍ（２５ｎｍの帯幅）で測定した。
【０１０７】
実施例５
プロテアソームの阻害剤の識別（選別）
ＵＨＴＳ（選別）におけるプロテアソーム阻害検定で３８４個のウエルが備わっているＭＴＰ（Ｇｒｅｉｎｅｒの）を用いた。最初に３５２個のウエルに入れた５μｌの試験物質用溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＭのＥＤＴＡ）に試験物質を阻害検定における試験物質の最終濃度が２μＭになるように入れた。負の対照（３２個のウエル）および正の対照（３２個のウエル）の目的で各場合とも前記板に備わっている追加的ウエルに５％のＤＭＳＯを５μｌ加えた。その試験物質溶液に基質溶液（１３μＭのＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、０．０６％のＳＤＳ、１０％（体積／体積）のＤＭＳＯ；１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；２ｍＭのＥＤＴＡ）を２０μｌ加えた。その後、酵素溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；２ｍＭのＥＤＴＡ；１：１００のプロテアソーム抽出物、これはウエル１個当たり２８０ｎｇに相当）を２５μｌ加えたが、負の対照には酵素なしに緩衝液のみを加えた。その後、最初に、３６０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長を用いた予備測定で蛍光を測定した［３６０／４６５ｎｍ（２５ｎｍの帯幅）で予備測定］。次に、ＭＴＰを３７℃で少なくとも４０分間インキュベートした後、蛍光をこの上に記述した如く測定した。
【０１０８】
【参考資料】
１． Ｂｏｇｙｏ，Ｍ．、Ｓｈｉｎ，Ｓ．、ＭｃＭａｓｔｅｒ，Ｊ．Ｓ．およびＰｌｏｅｇｈ，Ｈ．Ｌ．（１９９８）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５、３０７−３２０。
２． Ｃｏｕｘ他（１９９５）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５、８０１−８４７。
３． Ｃｏｕｘ他（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１５）８８２０−８８２８。
４． ＣｒｉｓｃｏｌｌおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、４７８９。
５． ＥＰ ０ ３４５ ７５０。
６． Ｆｅｎｔｅａｎｙ他（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８、７２６−７３１。
７． Ｇｒｏｌｌ他（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３８６、４６３−４７１。
８． ＪＰ ０５２９２９６４。
９． ＪＰ ０６０２２７５９。
１０． Ｋｌａｆｋｙ他（１９９５）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１、２９−３２。
１１． Ｋｎｏｗｌｔｏｎ他（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ ３９０、６３９−６４３。
１２． Ｋｒｏｌｌ他（１９９９）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６、８８９−６９８。
１３． ＬｅｅおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９８９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、２７２８０。
１４． ＬｅｅおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９９８）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８、３０−３８。
１５． ＭｃＣｏｒｍａｃｋ他（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、７７９２−７８００。
１６． Ｍｅｌｌｇｒｅｎ（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４７）、２９８９９−２９９０３。
１７． Ｍｅｎｇ他（１９９９）、ＰＮＳＡ ９６、１０４０３。
１８． ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＣａｒｔｅｒ（２０００）、Ｂｉｏｓｃｅｎｅ２６（３）、９−１３。
１９． Ｏｒｌｏｗｓｋｉ他（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２、１５６３。
２０． Ｓｃｈｕｌｚ他（１９９０）、Ｃｅｌｌ ６０、２９５−３０６。
２１． Ｓｔａｃｋ他（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８、１２９８−１３０２。
２２． Ｓｔｅｉｎ他（１９９６）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５、３８９９。
２３． ＷＯ ００／２３６１４。
２４． ＷＯ ００／３３６５４。
２５． ＷＯ ００／４３０００。
２６． ＷＯ ９１／１３９０４。
２７． ＷＯ ９５／２４９１４。
２８． ＷＯ ９８／４２８２９。
２９． Ｚｈａｎｇ他（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．４（２）：６７−７３。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵母に由来する２０Ｓプロテアソームの活性検定。キモトリプシン活性で用いた基質はＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣであった。ＡＭＣの遊離を時間の関数として蛍光測定で測定した。酵母抽出物の１：１００希釈液中で４０ｎＭのＭＧ１３２の存在下およびＭＧ−１３２の存在なしでプロテアソーム活性を測定した。負の対照として、酵素なしに反応を実施した（緩衝液）。
【図２】トウモロコシ黒穂菌に由来する２０Ｓプロテアソームの活性検定。キモトリプシン活性で用いた基質はＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣであった。ＡＭＣの遊離を時間の関数として蛍光測定で測定した。トウモロコシ黒穂菌（Ｕ．メイジス）調合物の１：１００希釈液および１：２０希釈液中でプロテアソーム活性を測定した。その上、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ−１３２を４０ｎＭの濃度から最大のプロテアソーム濃度で加えた。
【図３】ボトリチス・シレネに由来する２０Ｓプロテアソームの活性検定。菌・カビの細胞からプロトプラストを調製することを通して、Ｂ．シレネに由来する２０Ｓプロテアソーム（Ｂ．ｃ．プロテアソーム）を単離した。Ｕ．メイジスから２０Ｓプロテアソームを単離するプロトコル（実施例２を参照）に従って前記プロトプラストにさらなる処理を受けさせた。Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣの変換を基にしてＢ．ｃ．プロテアソームのキモトリプシン活性を測定した（実施例３を参照）。（ｘ）＝Ｂ．シレネに由来する２０Ｓプロテアソーム（１：１００に希釈）、（□）＝Ｓ．セレビシエに由来する２０Ｓプロテアソーム（１：１００に希釈）、（▲）＝Ｂ．シレネに由来する２０Ｓプロテアソーム（１：５００に希釈）、（◇）＝プロテアソームなしの反応。
【図４】ペプチド基質であるＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣが示すＫ_Mを測定。一定量（反応当たり約７０ｎｇ）のプロテアソームを基質と一緒に基質の量を多くしながらインキュベートした後、蛍光の量が多くなる度合を５分間に渡って測定した。傾向線（ｔｒｅｎｄ ｌｉｎｅｓ）を計算することで曲線（破線）の傾きを測定した。Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣが示したＫ_MをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅに従って計算することで５μＭの値を得た。
【図５】反応がＤＭＳＯの使用量に依存。時間の関数としてのＡＭＣ遊離を基にして酵母に由来する２０Ｓプロテアソームが示す活性を測定した。この反応に添加するＤＭＳＯの量を多くして行った。図Ａで用いた蛋白質の量は図Ｂに比べて半分であった。この反応では特に５％のＤＭＳＯが適切である。
【図６】図５に記述するようにして反応がＤＭＳＯの使用量に依存することを測定した。しかしながら、図５（Ｂ）では反応成分を４℃で７２時間貯蔵した。ＤＭＳＯを５％存在させると反応が７２時間後でも安定である。ＤＭＳＯの量をより高くすると活性の損失がもたらされる。
【図７】３８４個のウエルが備わっているＭＴＰを用いて２０Ｓプロテアソームが示す活性を検出。各場合とも１９２個のウエルを用いてＡＭＣの蛍光を４０分後、５０分後および６０分後に測定した。「ｐｏｓｃｏ」は酵素を用いた反応に相当し、「ｎｅｇｃｏ」は酵素を用いない反応に相当し、「デルタ」はその２つの間の値の差である。４０分後であっても＞０．７のｚファクターが達成された。このｚファクターは、記録されたデータの均一性を計算するための数学的パラメーターであり、従って、物質を選択する検定の利用性を評価することを可能にするものである。ｚファクターを下記の如く計算する：ｚファクター＝１−［（３ｘ標準偏差ｐｏｓｃｏ＋３ｘ標準偏差ｎｅｇｃｏ）／（平均ｐｏｓｃｏ−平均ｎｅｇｃｏ）］［Ｚｈａｎｇ他（１９９９）：「Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．４（２）：６７−７３］。

Claims (2)

1. ２０Ｓプロテアソーム阻害検定で候補化合物を検定することにより殺菌・殺カビ剤を識別する方法であって、
   ａ）候補化合物と菌・カビの２０Ｓプロテアソームを基質の存在下および２から１０％（体積／体積）のジメチルスルホキサイドの存在下で接触させ、そして
   ｂ）前記２０Ｓプロテアソームの酵素作用による前記基質の変換を特異的に抑制する候補化合物を選択し、そして
   ｃ）選択した候補化合物が菌・カビに対して示す作用を後でインビボ検定で検査することを特徴とする方法。
2. 前記基質が前記２０Ｓプロテアソームの酵素活性によって遊離して来る基を含んで成っていて前記遊離を蛍光測定または比色測定で検出することができることを特徴とする請求項１記載の方法。

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