ES2275044T3

ES2275044T3 - Procedimiento para el aislamiento de proteasoma 20s, y procedimiento para la identificacion de inhibidores del proteasoma 20s y 26s.

Info

Publication number: ES2275044T3
Application number: ES03015260T
Authority: ES
Inventors: Christian Dr. Aichinger; Peter Prof.Dr. Schreier; Roland Dr. Ebbert; Robert Prof.Dr. Huber; Michael Dr. Groll
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Bayer CropScience AG
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Bayer CropScience AG
Priority date: 2002-07-19
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2007-06-01
Anticipated expiration: 2023-07-07
Also published as: JP2004049236A; US7601512B2; EP1382691A3; EP1382691A2; DE10232902A1; JP4434643B2; DE50305399D1; DK1382691T3; US20040053312A1; ATE343002T1; EP1382691B1

Abstract

Procedimiento para identificar fungicidas sometiendo a prueba un compuesto candidato a una prueba de inhibición de los proteasomas 20S.

Description

Procedimiento para el aislamiento del proteasoma 20S, y procedimiento para la identificación de inhibidores del proteasoma 20S y 26S.

La presente invención se refiere a procedimientos para identificar fungicidas.

El crecimiento indeseado de hongos, que por ejemplo conduce cada año a daños considerables en la agricultura, puede controlarse mediante el uso de fungicidas. A este respecto las exigencias sobre los fungicidas han aumentado constantemente con respecto a su eficacia, costes y sobre todo su tolerabilidad para el medio ambiente. Por tanto existe una necesidad de sustancias o clases de sustancias nuevas, que pueden desarrollarse para dar nuevos fungicidas eficaces y tolerables para el medio ambiente. En general es habitual, buscar nuevas estructuras líder en ensayos en invernadero. Sin embargo los ensayos de este tipo son muy intensos de trabajo y caros. El número de sustancias, que pueden someterse a ensayo en invernadero, está correspondientemente limitado. Una alternativa para tales ensayos es el uso de los denominados procedimientos de alto rendimiento (HTS = high throughput screening). A este respecto se someten a prueba en un procedimiento automatizado un gran número de sustancias individuales con respecto a su efecto sobre células, genes o productos génicos individuales. Si se detecta una acción para determinadas sustancias, entonces pueden examinarse éstas en procedimientos de detección habituales y dado el caso desarrollarse adicionalmente.

Fungicidas ideales son por ejemplo aquellas sustancias, que inhiben productos génicos, que tienen un significado decisivo en la manifestación de la patogenicidad de un hongo. Un ejemplo de un fungicida tal es el principio activo carpropamida, que inhibe la biosíntesis de melanina del hongo y de este modo impide la manifestación de apresorios (órganos de adhesión) intactos. Sin embargo sólo hay muy pocos productos génicos conocidos, que desempeñan un papel de este tipo para los hongos. Además se conocen fungicidas, que mediante la inhibición de las rutas biosintéticas correspondientes conducen a la auxotrofia de las células diana y como consecuencia a la pérdida de la patogenicidad.

Otro punto de partida importante son los polipéptidos o complejos de polipéptidos, que desempeñan un papel central en procesos celulares esenciales o actividades proteicas esenciales. Sin embargo en primer plano se encuentra la inhibición de reacciones enzimáticas, pero también puede inhibirse la interacción de proteínas o la interacción funcional de maquinarias proteicas complejas.

Un ejemplo de una "maquinaria proteica" compleja de este tipo, que se encuentra en el centro de ciclos celulares, es el proteasoma 26S. A este respecto la función biológica del proteasoma 26S comprende un gran número de tareas, entre otras la degradación de proteínas y péptidos ensamblados incorrectamente o plegados de manera incorrecta, la regulación de la respuesta al estrés mediante por ejemplo la degradación de factores de transcripción o el control del ciclo celular mediante la degradación de ciclinas. Para la respuesta inmune de la célula se procesan los péptidos de tal manera, que pueden presentarse posteriormente por el complejo MHC I en la superficie externa. La parte esencial catalítica del proteasoma 26S es el proteasoma 20S. El propio proteasoma 20S tiene diversas de las actividades peptídicas en las que se basa la actividad enzimática del proteasoma 26S, por lo cual es especialmente de interés el proteasoma 20S como sitio diana para sustancias, que influyen en estas actividades enzimáticas.

La actividad proteolítica del proteasoma in vivo necesita la ubiquitinación de las proteínas diana y consume ATP. A este respecto, para la degradación de las proteínas diana se transfiere la ubiquitina a la proteína diana. Entonces se lleva la proteína ubiquitinada al proteasoma, en el que se degrada y se somete la ubiquitina a una recirculación.

Se sabe, que todas las proteínas del proteasoma 20S excepto una en S. cerevisiae son necesarias para el crecimiento de la célula. El complejo tiene varias actividades proteolíticas diferentes, de este modo por ejemplo una actividad hidrolítica de péptidos peptidilglutamil, una actividad tríptica y una quimotríptica. Análisis de mutación han dado como resultado, que la actividad quimotríptica es la más importante en el complejo. Hasta el momento no puede expresarse de manera heteróloga el proteasoma 20S, pero ya se ha descrito la purificación natural de proteasomas 20S activos de levadura.

El término "actividad enzimática" del proteasoma 20S o 26S, tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a al menos unas de las diversas actividades enzimáticas del proteasoma 20S o 26S. Según esto un proteasoma 20S o 26S "enzimáticamente activo" todavía puede realizar al menos una de las reacciones enzimáticas existentes de manera natural.

El proteasoma 26S eucariota se compone en cada caso de un complejo proteolítico y dos reguladores. El proteasoma 20S se compone de 7 subunidades \alpha diferentes y siete \beta diferentes, que ya se clonaron y secuenciaron a partir de organismos diferentes. El proteasoma 20S de la levadura de panadería (S. cerevisiae) tiene un peso molecular de aproximadamente 700 kD. La purificación de proteasomas de eucariotas también se ha descrito ya en diferentes documentos (por ejemplo los documentos WO 98/42829 A1; EP 0 345 750 A2). Los esfuerzos de purificar lo mejor posible los proteasomas dan como resultado finalmente también la aclaración de la estructura para los proteasomas 20S de S. cerevisiae (WO 98/42829 A 1; Groll et al. (1997), Structure of the 20S Proteasom from yeast at 2.4 \ring{A} resolution, Nature 386, 463-471).

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En Coux et al. (1998), (Enzymes catalyzing ubiquitination and proteolytic processing of the p105 precursor of nuclear factor kappaB1. J. Biol. Chem. 273(15), 8820-8828), se describen principalmente las múltiples actividades proteolíticas del proteasoma 20S como cadenas de aminoácidos ramificadas, PGPH, de tipo tripsina, de tipo quimotripsina y pequeños aminoácidos neutros. La actividad proteolítica puede reforzarse mediante diferentes condiciones de inducción. Para eso se cuenta por ejemplo con el calentamiento del proteasoma hasta 55ºC o la adición de SDS. Se conocen además por McCormack et al. (1998), Biochemistry 37, 7792-7800, diferentes sustratos para la detección de la actividad proteolítica del proteasoma 20S, tales como por ejemplo Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC, Z-Leu-Leu-Arg-AMC y Z-Leu-Leu-Glu-2NA, representando Suc N-succinilo, representando AMC 7-aminometilcumarina, representando Z carbobenciloxilo y representando 2NA 2-naftilamina.

En bancos de datos de acceso público, tales como MIPS ("Munich Information Center for Protein Sequences", Centro de Información para Secuencias Proteicas de Munich) o SGD ("Saccharomyces Genome Database", Base de Datos del Genoma de Saccharomyces) se describen excepto pocas excepciones todas las subunidades del proteasoma 26S como esenciales.

Se conoce también la existencia de diferentes inhibidores reversibles e irreversibles para la actividad enzimática de los proteasomas in vitro. De este modo han estudiado Klafky et al. (1995), Neuroscience Letters 201, 29-32, la acción del inhibidor de proteasomas, inhibidor de calpaína 1 en la secreción del péptido \beta-amiloide.

En Fenteany et al. (1995), Science, 268, 726-731, se describe la lactacistina como metabolito de estreptomicetos, que actúa como inhibidor del ciclo celular y que conduce en células de neuroblastoma de ratón a la inducción del crecimiento neurítico. La diana celular para este inhibidor es el proteasoma 20S.

En Kroll et al. (1999) Chem. Biol. 6, 889-698, se describe un metabolito fúngico, la epipolitiodioxopiperazina (gliotoxina), que entre otros suprime el procesamiento antigénico en células de mamíferos. Tal como pudieron demostrar los autores, la gliotoxina es un inhibidor no competitivo del proteasoma 20S in vitro.

Mellgren (1997) J. Biol. Chem. 272(47), 29899-29903, describe la acción inhibidora de diferentes compuestos de peptidilo sobre el proteasoma 20S humano. En esta publicación se describe además, que estas sustancias en concentraciones de 200 \muM no tienen ninguna acción sobre el crecimiento de células fúngicas (S. cerevisiae). Lee y Goldberg (1998), (Proteasome inhibitors cause induction of Heat shock proteins and trehalose, which together confer thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae, Molecular and Cellular Biology 18, 30-38), muestran de acuerdo con ello, que los inhibidores de proteasomas farmacológicamente muy eficaces tales como MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-CHO) no tienen ningún efecto o sólo un efecto mínimo sobre la tasa de crecimiento de células de levadura a 30°C.

En Stack et al. (2000), Nature Biotechnology 18, 1298-1302, se describe un sistema de ensayo celular para la identificación de inhibidores del proteasoma y se remite al posible uso de estos inhibidores en el tratamiento de enfermedades de Alzheimer o Parkinson. A este respecto se reduce el tiempo de semivida de las proteínas, modificando mediante ingeniería genética la ubiquitina de tal manera, que las proteínas marcadas con la misma se desestabilizan. Si un inhibidor impide la degradación de proteínas, entonces puede determinarse esto mediante un gen indicador.

En el documento WO 00/33654 A1 se describe el uso de inhibidores del proteasoma para el tratamiento de diferentes enfermedades humanas. Como punto de partida para la acción de los inhibidores se menciona en este caso la actividad inmunomoduladora del proteasoma 26S.

O sea que el proteasoma se describe hasta el momento como proteína diana (blanco) para el tratamiento de diferentes enfermedades del cuerpo humano. Si el proteasoma de hongos es accesible para principios activos y si puede inhibirse o modularse mediante éstos, y si tales principios activos también se utilizan in vivo, es decir pueden usarse como fungicidas, ni se ha estudiado a fondo ni se ha descrito hasta el momento. De Mellgren (1997), J. Biol. Chem. 272(47), 29899-29903, puede deducirse que los inhibidores allí descritos del proteasoma humano en una concentración de 200 \muM no muestran ninguna acción inhibitoria frente a células de levadura. Lee y Goldberg (1998) muestran además, que los inhibidores de proteasomas farmacológicamente muy eficaces no tienen ningún efecto o sólo un efecto mínimo sobre la tasa de crecimiento de las células de levadura.

Con ello sólo puede deducirse del estado de la técnica, que si bien existen inhibidores del proteosoma humano, sin embargo éstos no muestran ninguna acción sobre hongos. O sea que la acción inhibitoria de los compuestos parece no poder acceder al proteasoma fúngico. No obstante sería deseable, proporcionar nuevos fungicidas, que tienen nuevos mecanismos y sitios de acción, para evitar con ello por ejemplo una formación de resistencia frente a los fungicidas conocidos con otros sitios de acción, y para desarrollar fungicidas más eficaces y más específicos, y por consiguiente también más tolerables para el medio ambiente.

Por tanto era objetivo de la presente invención, proporcionar un nuevo blanco a partir de hongos para la identificación de fungicidas.

En el contexto de la presente invención se encontró ahora sorprendentemente, que el proteasoma 26S o 20S fúngico conocido hasta ahora como inadecuado en relación con el desarrollo de nuevos fungicidas, a pesar de los conocimientos de Mellgren (1997) y Lee y Goldberg (1998) representa una proteína diana eficaz para inhibidores específicos. Se encontró además, que los inhibidores de este tipo pueden identificarse en procedimientos adecuados y que los inhibidores encontrados con estos procedimientos sorprendentemente también pueden utilizarse como fungicidas. A este respecto se determinó también, que también los inhibidores ya conocidos del proteasoma humano o animal pueden utilizarse como fungicidas o para la producción de un fármaco para el tratamiento antifúngico en seres humanos o animales.

Por consiguiente en el contexto de la presente invención se encontró, que los proteasomas 26S o 20S fúngicos pueden inhibirse in vitro mediante principios activos, y que un organismo fúngico tratado con estos principios activos puede dañarse o destruirse mediante el tratamiento con estos principios activos. Por tanto, los inhibidores de los proteasomas 26S/20S de hongos pueden utilizarse como antimicóticos y especialmente también como fungicidas en la protección de las plantas. En la presente invención se muestra por ejemplo, que la inhibición de los proteasomas 20S de S. cerevisiae (ejemplo 1) se consigue igualmente que la inhibición de los proteasomas 20S de U. maydis y B. cinerea, ambos hongos fitopatógenos (ejemplo 2). El tratamiento de estos hongos con las sustancias identificadas en el procedimiento de prueba según la invención así como con inhibidores de proteasomas conocidos conduce a la destrucción de los hongos en medios sintéticos o en la planta.

Por tanto pueden utilizarse proteasomas 20S de hongos para identificar fungicidas.

El término "fungicida(s)", tal como se utiliza a continuación en el presente documento, comprende tanto sustancias utilizadas en la protección de las plantas, que se utilizan para la lucha contra hongos fitopatógenos, como sustancias, que se utilizan para la lucha contra hongos patógenos para los seres humanos o los animales (antimicóticos).

"Inhibidores" pueden ser anticuerpos, péptidos o moléculas organoquímicas pequeñas, que se unen a los complejos polipeptídicos 20S o a los mayores 26S o que influyen si actividad. Además los inhibidores pueden ser anticuerpos, péptidos o moléculas organoquímicas pequeñas, que se unen a una molécula, que a su vez se une a los polipéptidos según la invención, y mediante esto influye en su actividad biológica. Los inhibidores pueden representar ligandos y sustratos naturales o miméticos estructurales o funcionales de los mismos. Preferiblemente se trata sin embargo en el caso de la expresión "inhibidor", tal como se utiliza en el presente documento, de aquellas moléculas, que no representan ligandos o sustratos naturales. El término "inhibidores del proteasoma 26S y/o 20S" tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a inhibidores, que pueden inhibir de manera específica una o varias actividades enzimáticas del proteasoma.

Es posible para la identificación de fungicidas utilizar proteasomas 20S de diferentes especies de hongos, tal como se mencionan por ejemplo en la enumeración siguiente. De este modo pueden utilizarse por ejemplo proteasomas 20S de S. cerevisiae en un procedimiento de prueba según la invención para la identificación de fungicidas (ejemplo 1, figura 1) al igual que proteasomas 20S de los hongos fitopatógenos U. maydis (ejemplo 2, figura 2) y B. cinerea (figura 3).

Los compuestos identificados con ayuda de procedimientos adecuados para la identificación de inhibidores del proteasoma 26S/20S actúan contra los hongos más diversos, tales como por ejemplo hongos patógenos para los seres humanos u hongos fitopatógenos. A éstos pertenecen por ejemplo los hongos siguientes del ámbito de los hongos fitotóxicos, no siendo sin embargo la enumeración definitiva:

Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes,

especies de Pythium, tal como por ejemplo Pythium ultimum, especies de Phytophthora, tal como por ejemplo Phytophthora infestans, especies de Pseudoperonospora, tales como por ejemplo Pseudoperonospora humuli o Pseudoperonospora cubensis, especies de Plasmopara, tal como por ejemplo Plasmopara viticola, especies de Bremia, tal como por ejemplo Bremia lactucae, especies de Peronospora, tales como por ejemplo Peronospora pisi o P. brassicae, especies de Erysiphe, tal como por ejemplo Erysiphe graminis, especies de Sphaerotheca, tal como por ejemplo Sphaerotheca fuliginea, especies de Podosphaera, tal como por ejemplo Podosphaera leucotricha, especies de Venturia, tal como por ejemplo Venturia inaequalis, especies de Pyrenophora, tales como por ejemplo Pyrenophora teres o P. graminea (forma de conidio: Drechslera, Syn: Helminthosporium), especies de Cochliobolus, tal como por ejemplo Cochliobolus sativus (forma de conidio: Drechslera, Syn: Helminthosporium), especies de Uromyces, tal como por ejemplo Uromyces appendiculatus, especies de Puccinia, tal como por ejemplo Puccinia recondita, especies de Sclerotinia, tal como por ejemplo Sclerotinia sclerotiorum, especies de Tilletia, tal como por ejemplo Tilletia caries; especies de Ustilago, tales como por ejemplo Ustilago nuda o Ustilago avenae, especies de Pellicularia, tal como por ejemplo Pellicularia sasakii, especies de Pyricularia, tal como por ejemplo Pyricularia oryzae, especies de Fusarium, tal como por ejemplo Fusarium culmorum, especies de Botrytis, especies de Septoria, tal como por ejemplo Septoria nodorum, especies de Leptosphaeria, tal como por ejemplo Leptosphaeria nodorum, especies de Cercospora, tal como por ejemplo Cercospora canescens, especies de Alternaria, tal como por ejemplo Alternaria brassicae o especies de Pseudocercosporella, tal como por ejemplo Pseudocercosporella herpotrichoides.

Son de interés especial por ejemplo también B. cinerea, Magnaporthe grisea, Cochliobulus heterostrophus, Nectria hematococcus y especies de Phytophtora, Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes.

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Los inhibidores del proteasoma 20S fúngico también pueden utilizarse contra los hongos patógenos para los seres humanos o animales mencionados a continuación a modo de ejemplo y no de manera definitiva:

dermatofitos, tales como por ejemplo Trichophyton spec., Microsporum spec., Epidermophyton floccosum o Keratomyces ajelloi, que producen por ejemplo pie de atleta (Tinea pedis),

levaduras, tales como por ejemplo Candida albicans, que produce esofagitis candidiásica y dermatitis, Candida glabrata, Candida krusei o Cryptococcus neoformans, que pueden producir por ejemplo criptococosis pulmonar y también torulosis,

mohos, tales como por ejemplo Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, que producen por ejemplo aspergilosis broncopulmonar o sepsis fúngica, Mucor spec., Absidia spec., o Rhizopus spec., que producen por ejemplo zigomicosis (micosis intranasales), Rhinosporidium seeberi, que produce por ejemplo traqueítis y faringitis granulomatosa crónica, Madurella myzetomatis, que produce por ejemplo micetomas subcutáneos, Histoplasma capsulatum, que produce por ejemplo citomicosis reticuloendotelial y enfermedad de M. Darling, Coccidioides immitis, que produce por ejemplo coccidiomicosis pulmonar y sepsis, Paracoccidioides brasiliensis, que produce por ejemplo blastomicosis brasileña, Blastomyces dermatitidis, que produce por ejemplo la enfermedad de Gilchrist y blastomicosis norteamericana, Loboa loboi, que produce por ejemplo blastomicosis queloide y la enfermedad de Lobo, y Sporothrix schenckii, que produce por ejemplo esporotricosis (micosis cutánea granulomatosa).

Los principios activos fungicidas, que con ayuda del proteasoma 20S fúngico se encuentran a partir de por ejemplo S. cerevisiae o U. maydis, pueden por tanto interaccionar también con muchas otras especies de hongos, no teniendo que ser siempre igual de intensa la interacción con los diferentes proteasomas 26S o 20S que aparecen en estos hongos. Esto explica entre otras cosas la selectividad observada de las sustancias eficaces en este complejo polipeptídico.

Ya se ha dado a conocer una serie de pruebas de actividad para el proteasoma y en parte también pueden adquirirse comercialmente (por ejemplo "Kit de ensayo del proteasoma 20S, activado con SDS" de Calbiochem), a las que se puede recurrir para someter a prueba la actividad del proteasoma en pequeñas cantidades y con un esfuerzo temporal relativamente grande, es decir con varias etapas de pipeteo. Estas pruebas de actividad conocidas pueden aprovecharse, por ejemplo, para identificar los fungicidas según la invención. Sin embargo no se conoce hasta el momento un procedimiento susceptible de HTS, que permite la identificación de inhibidores del proteasoma 26S y/o del 20S. Procedimientos conocidos que a pequeña escala pueden servir para someter a prueba compuestos individuales o su acción inhibitoria, son inadecuados debido a su complejidad, para someter a prueba de manera sistemática bibliotecas de sustancias completas y con una fiabilidad suficiente en un sistema HTS o UHTS. Sin embargo estos sistemas son especialmente atractivos frente a otros procedimientos, dado que puede someterse a prueba un gran número de inhibidores potenciales en poco tiempo y con una buena reproductibilidad.

Esto es de interés especialmente para el proteasoma 20S, dado que en este caso se combinan varias actividades enzimáticas en una enzima, cuya inhibición puede observarse también de manera específica mediante un inhibidor potencial. El esfuerzo temporal asociado a esto puede reducirse claramente mediante el aprovechamiento de un sistema HTS o UHTS y puede aumentarse claramente la probabilidad de identificar las propiedades deseables de un inhibidor. Estas diferentes actividades enzimáticas pueden analizarse mediante sustratos específicos para estas actividades individuales y separarse entre sí (McCormack et al. (1998), Biochemistry 37, 7792-7800), lo que es especialmente importante para influir en la especificidad y la acción de los inhibidores y por consiguiente para encontrar también inhibidores o fungicidas, que son dañinos para los hongos o para determinados géneros o especies de hongos, pero no para otros organismos tales como por ejemplo plantas, insectos o mamíferos. Ya se han dado a conocer en el ámbito humano (proteasoma humano) diferentes inhibidores específicos. Sin embargo hay también inhibidores, que influyen en varias actividades del proteasoma.

Por tanto también era objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento in vitro accesible para procedimientos HTS así como UHTS, que posibilita la identificación de dado el caso inhibidores específicos del proteasoma a escala industrial, y dado el caso permite una asignación posterior a determinadas actividades enzimáticas del complejo polipeptídico. Mediante la inhibición de actividades proteolíticas adecuadas puede reducirse de este modo por ejemplo la toxicidad de eucariotas superiores. Además pueden separarse y modularse específicamente de manera correspondiente las actividades biológicas individuales. En medicina esto es importante, para reducir por ejemplo los efectos citotóxicos, no inhibiendo las actividades que no son diana del tratamiento.

Se ha encontrado ahora un procedimiento, en el que se posibilita mediante pruebas in vitro aptas para HTS, filtrar inhibidores del proteasoma fúngico de un gran número de compuestos que han de someterse a prueba, los denominados compuestos candidatos, y dado el caso asignarles una actividad proteolítica especifica del proteasoma 20S.

A este respecto el procedimiento según la invención se basa en dos mejoras del procedimiento total. Por un lado se posibilita con la presente invención una producción eficaz, a la vez que claramente más rápida y sencilla de extractos de proteasoma, y por otro lado se consiguió un aumento de la estabilidad de los componentes de prueba, mediante lo cual también se consiguió una reducción de las etapas necesarias para la realización de una prueba de actividad. A este respecto la rápida y eficaz purificación de los proteasomas se basa en la introducción de una etapa de incubación a temperatura elevada, que se describe posteriormente con más detalles. El aumento de la estabilidad de los componentes de reacción al alcanzar una razón señal-fondo excelente y la reducción simultánea de las etapas necesarias en la prueba de actividad se posibilitó sorprendentemente mediante un aumento de la concentración de DMSO hasta valores inusualmente elevados. A este respecto se determinó un óptimo para la concentración de DMSO necesaria.

El procedimiento mencionado anteriormente para la producción de un extracto de proteasoma 20S no se ha descrito hasta el momento. Los procedimientos aptos para HTS mencionados para identificar inhibidores de proteasomas 26S/20S, especialmente de proteasomas de hongos, tampoco se han descrito hasta el momento.

Es objeto de la presente invención un procedimiento para identificar fungicidas sometiendo a prueba un compuesto candidato en una prueba de inhibición de los proteasomas 20S. De manera especialmente preferible se utiliza el procedimiento para la identificación de inhibidores del proteasoma 20S fúngico, es decir para la identificación de fungicidas.

Además de la inhibición del proteasoma in vitro es decisivo (para poder utilizar los inhibidores en cuestión también como fungicidas), que los compuestos identificados también sean eficaces in vivo, o sea que realmente puedan utilizarse como fungicidas, por ejemplo en la agricultura. Muchos inhibidores, que se encuentran en pruebas in vitro, no pueden por diversos motivos dañar el propio organismo diana. De este modo, tal como se describió anteriormente, no se encontró en el estado de la técnica ninguna acción de inhibidores conocidos del proteasoma humano en hongos.

En el contexto de la presente invención se muestra, que los inhibidores del proteasoma identificados por ejemplo mediante el procedimiento según la invención descrito a continuación, sin embargo también inhibidores ya conocidos por ejemplo del proteasoma humano, en contra de lo esperado son fungicidas eficaces, o sea sustancias, que muestran una acción inhibidora no sólo in vitro, sino que también pueden utilizarse in vivo, para alterar la función del proteasoma fúngico y dañar o destruir el hongo en cuestión.

Para la identificación de los inhibidores del proteasoma 20S fúngico no tiene que utilizarse a este respecto el procedimiento según la invención descrito a continuación. Más bien puede recurrirse a todos los procedimientos conocidos para la determinación de la actividad del proteasoma 20S, siempre que permitan la valoración de la acción inhibidora de un compuesto candidato sobre el proteasoma 20S fúngico.

Por tanto también es objeto de la presente invención un procedimiento para identificar fungicidas poniendo en contacto proteasomas 20S, preferiblemente proteasomas 20S de hongos, con un compuesto candidato en presencia de un sustrato y en presencia de desde el 2 hasta el 10% (v/v) de dimetilsulfóxido y una selección posterior del (de los) compuesto(s), que inhiben la actividad enzimática del proteasoma 20S. Preferiblemente el procedimiento tiene lugar de tal modo, que la medición de la actividad enzimática del proteasoma 20S tiene lugar en presencia y ausencia de una molécula candidata, seleccionándose aquellos compuestos candidatos, que reducen la actividad enzimática del proteasoma en comparación con el control en ausencia de un compuesto candidato, o sea que son inhibidores de proteasomas.

El término "inhibidor de proteasomas", tal como se utiliza en el presente documento, denomina una sustancia, que inhibe directa o indirectamente una, pero dado el caso también varias de las actividades enzimáticas mencionadas anteriormente. Un inhibidor de este tipo es preferiblemente específico, es decir inhibe la actividad de proteasomas a una concentración que es inferior a la concentración de un inhibidor, que se necesita, para producir otro efecto no relacionado con éste. Preferiblemente la concentración es dos veces inferior, especialmente preferible cinco veces inferior y muy especialmente preferible al menos diez veces o 20 veces inferior a la concentración de un compuesto, que se necesita para producir un efecto no específico.

El término "actividad de proteasomas", tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a una o varias de las actividades enzimáticas mencionadas anteriormente del proteasoma 20S o 26S.

En el contexto de la presente invención se utilizaron a modo de ejemplo en cada caso proteasomas 20S de S. cerevisiae, U. maydis y B. cinerea, para identificar inhibidores del proteasoma 26S y/o 20S. Sin embargo, también es posible utilizar en lugar del proteasoma 20S de S. cerevisiae, U. maydis o B. cinerea proteasomas 20S de otros hongos o de otros organismos no fúngicos, para identificar inhibidores. Esto se hace evidente porque los inhibidores del proteasoma humano también pueden actuar como fungicidas.

La rotura de las células puede tener lugar mediante diferentes técnicas conocidas por el experto. La posterior purificación/aislamiento de los proteasomas puede conseguirse también con procedimientos conocidos (por ejemplo Groll et al. (1997), Structure of the 20S Proteasom from yeast at 2.4 \ring{A} resolution, Nature 386, 463-471; documentos EP 345 750 A2; WO 98/42829; JP 05292964 A; JP 06022759 A). Las expresiones "aislamiento", "enriquecimiento" o "purificación", tal como se utilizan en el presente documento, significan que los proteasomas 20S se separan tanto de otras proteínas u otras macromoléculas de la célula o del tejido, que puede tener lugar una medición específica de su actividad enzimática o de su inhibición. Preferiblemente una composición que contiene los proteasomas 20S con respecto al contenido en proteasomas frente a una preparación de las células huésped está enriquecida al menos 10 veces y especialmente preferible al menos 100 veces. Los procedimientos conocidos son relativamente complejos y comprenden una serie de etapas (véase por ejemplo el documento WO 98/42829). Precisamente para el uso de proteasomas en procedimientos según la invención es deseable, obtener proteasomas 20S en poco tiempo, que al menos son tan activos, como los proteasomas 20S producidos con los métodos costosos del estado de la técnica, y que permiten una medición de su actividad enzimática y de su inhibición.

En el presente procedimiento según la invención se rompen las células de levadura según procedimientos conocidos por el experto, preferiblemente de manera mecánica (por ejemplo usando una prensa francesa o un homogeneizador de alta presión) en el tampón de prueba que se utiliza posteriormente (por ejemplo Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 10 nM). Para el procedimiento según la invención son adecuadas por ejemplo también levaduras comerciales (levadura de panadería), tal como se utilizan para la cocción en horno. Los proteasomas se encuentran entonces en la fracción soluble y pueden separarse mediante centrifugación de los componentes insolubles y los restos celulares, no teniendo que realizarse obligatoriamente sin embargo esta etapa según el procedimiento según la invención. La suspensión o fracción soluble se incuba entonces durante aproximadamente de 20 a 75 minutos a aproximadamente de 50ºC a 70ºC, preferiblemente a de 55ºC a 65ºC. Es especialmente adecuada una incubación a aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 60 minutos. A este respecto se aprovecha el conocimiento de que la proteína en contraposición con las otras proteínas aún presentes es estable a esta temperatura. Por tanto en esta etapa de purificación según la invención precipitan las proteínas inestables térmicamente y pueden separarse del complejo 20S estable térmicamente mediante centrifugación. Tras esto puede interrumpirse la incubación, si ya no se desnaturaliza ni precipita ningún componente celular. El uso de una etapa de calentamiento para la separación del proteasoma de otros componentes de la célula no se describe en el estado de la técnica. Sin embargo permite una purificación rápida, sencilla y muy eficaz de proteasomas en sólo una etapa, pudiendo utilizarse los proteasomas así purificados tras la separación de los componentes celulares precipitados directamente en pruebas de actividad o de inhibición. Al residuo se le puede añadir entonces por ejemplo azida de sodio, para evitar el crecimiento de microorganismos. Mediante el procedimiento según la invención se garantiza además, que preferiblemente se obtienen proteasomas 20S, no proteasomas 26S, que para la identificación de inhibidores son más bien inadecuados, porque no puede accederse a regiones activas proteolíticamente en proteasomas 26S completos. A partir de 30 g de levadura (peso húmedo) pueden obtenerse de esta manera sencilla proteasomas suficientes para su uso en un procedimiento apto para HTS para la identificación de inhibidores.

Preferiblemente los proteasomas 20S utilizados en el procedimiento según la invención se purifican mediante un procedimiento a partir de células eucariotas, preferiblemente de hongos, que se caracteriza porque

a): se rompen células, preferiblemente células fúngicas, con procedimientos habituales,

b): se calienta la suspensión celular resultante hasta de 50ºC a 70ºC, hasta que hayan precipitado los componentes sensibles a la temperatura, y

c): se obtienen los proteasomas mediante la separación por centrifugación de los componentes insolubles.

El procedimiento para la purificación de proteasomas 20S puede utilizarse en diferentes organismos. De este modo se demuestra en el contexto de la presente invención, que con ayuda del procedimiento según la invención pueden obtenerse los proteasomas 20S con una actividad elevada a partir de S. cerevisiae, U. maydis y B. cinerea. De idéntica manera puede aprovecharse el procedimiento también en otras células eucariotas, especialmente fúngicas.

A partir de la bibliografía se conocen procedimientos para someter a prueba la actividad enzimática de proteasomas 20S y para someter a prueba la reducción o inhibición de esta actividad. Estos sistemas de prueba aprovechan por ejemplo determinados sustratos del proteasoma, cuya degradación enzimática conduce a la liberación de un grupo que puede detectarse fluorométrica o colorimétricamente. A este respecto los procedimientos utilizados se basan en la adición por etapas de los componentes individuales (por ejemplo tampón de reacción, tampón de activación, proteasomas 20S, solución de sustrato, inhibidor) y en una posterior medición de la fluorescencia o absorción que se modifica (véase por ejemplo el "Kit de ensayo de proteasoma 20S, activado con SDS" de Calbiochem, nº cat. 539158). A este respecto debe tenerse en cuenta, que la estabilidad del sustrato es reducida en condiciones de ensayo. Los sustratos peptídicos, tales como por ejemplo Suc-LLVY-AMC, son relativamente inestables debido a su reducida solubilidad y por tanto son poco adecuados para mediciones con un periodo de tiempo elevado de varias horas, tal como es imprescindible por ejemplo en sistemas HTS/UHTS en el caso de la medición de un número de muestras extremadamente grande, que han de colocarse previamente y medirse. Los sustratos o las pruebas de actividad que se basan en los mismos son por tanto hasta el momento sólo adecuados para experimentos individuales con un esfuerzo temporal reducido, que garantizan que el sustrato peptídico que se usa está aún intacto. De este modo se describe el sustrato Suc-LLVY-AMC como muy poco soluble (50 mg/ml en DMSO) y fotosensible. Una mezcla básica normal ("Kit de ensayo de proteasoma 20S, activado con SDS" de Calbiochem) se basa en la realización de las etapas básicas siguientes: se coloca previamente un tampón de reacción, en una segunda etapa se la añade con pipeta tampón de activación (que contiene por ejemplo SDS) y se mezclan ambos componentes. A esta solución se le añaden en una tercera etapa proteasomas 20S. En una cuarta etapa se añade el sustrato, mediante lo cual se inicia la reacción. En una quinta etapa se añade el inhibidor, pudiendo tener lugar las dos últimas etapas opcionalmente también en una secuencia inversa.

Para poder utilizar una prueba de actividad de este tipo para procedimientos HTS/UHTS, debía reducirse el gran número de etapas de pipeteo. Para ello a su vez debían permanecer estables las mezclas de los componentes pipeteados individualmente en este caso durante un periodo de tiempo más largo, para hacer frente a la necesidad de tiempo por regla general elevada para la preparación de las muestras y la medición de numerosos compuestos candidatos. A este respecto la actividad enzimática del proteasoma no puede perjudicarse lo más mínimo al igual que la del sustrato, para obtener la razón señal-fondo necesaria. Por tanto el objetivo de la presente invención era desarrollar los sistemas de prueba conocidos de tal manera, que se posibilita su uso en procedimientos HTS/UHTS.

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La solución del problema se basa en utilizar en la mezcla básica de reacción DMSO (dimetilsulfóxido) o aumentar la concentración de DMSO en la mezcla básica de reacción. Se encontró, que por ejemplo la actividad quimotríptica del proteasoma disminuye a concentraciones de DMSO más elevadas (figura 5(B)), mientras que la estabilidad del sustrato aumenta a concentraciones de DMSO más elevadas. Un óptimo para la estabilidad del sustrato con una obtención óptima de la actividad quimotrópica se produjo finalmente para una concentración de DMSO de desde el 2 hasta el 10% de DMSO (v/v), siendo especialmente deseable una concentración de desde el 3 hasta el 7%. Especialmente adecuada es una concentración de DMSO de desde el 4,5 hasta el 6% (figuras 5(A) y (B)). A una concentración del 5% de DMSO la actividad de proteasomas permanece estable incluso durante 72 h, y no sólo durante aproximadamente 1 h tal como se describe en el estado de la técnica (figura 6).

Con ello se aumenta claramente en el procedimiento según la invención la estabilidad del sustrato, sin perjudicar la actividad del proteasoma. Además de un claro aumento de un margen de tiempo, que puede aprovecharse para la realización de la prueba de actividad o de inhibición, pueden combinarse según la presente invención las soluciones necesarias también incluso previamente y almacenarse durante un periodo de tiempo más largo (figura 6), y con ello puede reducirse el número de las etapas de pipeteo necesarias a tres etapas de pipeteo en lugar de hasta cinco etapas en los procedimientos conocidos (véase anteriormente). A este respecto se coloca previamente por ejemplo el compuesto candidato en un tampón adecuado, y se añade en una segunda etapa a la solución de sustrato que contiene una cantidad adecuada de DMSO, que entonces puede contener ya el activador SDS. En una tercera etapa se añade la solución de proteasomas 20S y con ello se inicia la reacción. A este respecto la secuencia de la adición de los componentes individuales también puede variarse.

Las temperaturas utilizadas en el procedimiento según la invención pueden configurarse de manera muy variable. Pueden utilizarse temperaturas de desde 15ºC hasta 80ºC, especialmente de desde 25ºC hasta 50ºC o simplemente la temperatura ambiente. De manera especialmente preferible se utiliza una temperatura de 37ºC.

En el procedimiento según la invención pueden utilizarse también activadores del proteasoma 20S, que están contenidos en la mezcla básica de reacción. Activadores preferidos son los activadores descritos en Coux et al. (1995), Ann. Rev. Biochem. 65, 801-847, destacándose especialmente los actividadores de SDS (dodecilsulfato de sodio) y PA28\alpha (Knowlton et al. (1997), Nature 390, 639-643).

La inhibición de la actividad enzimática del proteasoma 20S mediante el compuesto candidato puede seguirse mediante una comparación de la fluorescencia o de la absorción en presencia y ausencia del compuesto candidato.

También es objeto de la presente invención un procedimiento para identificar fungicidas tal como se describe anteriormente y a continuación, al que puede seguir una prueba in vivo para la determinación de la actividad fungicida. Preferiblemente esta prueba comprende la puesta en contacto del inhibidor encontrado con al menos una especie de hongo y someter a prueba posteriormente para determinar el daño del hongo.

El término "prueba de inhibición del proteasoma 20S" tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a este respecto especialmente a la medición de la actividad enzimática de proteasomas 20S mediante la absorción o fluorescencia que resulta de la liberación de un grupo que puede determinarse fluorógena o colorimétricamente de un sustrato del proteasoma 20S, o de la inhibición de esta liberación mediante un inhibidor de la actividad en cuestión. Especialmente debe aplicarse el procedimiento según la invención, cuando la prueba de inhibición se basa en el uso de un sustrato lábil, que puede estabilizarse mediante DMSO.

En el contexto natural el proteasoma 20S hidroliza los péptido desprotegidos, de modo que también pueden utilizarse sustratos desprotegidos en el procedimiento según la invención. Sin embargo debe tenerse en cuenta, que la estabilidad frente a los sustratos protegidos puede reducirse adicionalmente. Además del fluoróforo AMC pueden utilizarse también otros fluoróforos o también cromóforos, así por ejemplo los fluoróforos 2-naftilamida (2NA), 4-metoxi-2- naftilamida o 6-aminoquinolina. Grupos que pueden determinarse colorimétricamente son por ejemplo p-nitroanilida (pNA), p-fenilazoanilida o 3,5-dibromo-4-hidroxi-anilida. Para las diversas actividades enzimáticas del proteasoma se conocen entre otros los sustratos peptídicos mencionados a continuación, cuya degradación puede seguirse fluorimétrica o colorimétricamente. Tales sustratos son por ejemplo Z-Leu-Leu-Leu-AMC (Z-LLL-AMC) para la medición de la actividad quimotríptica, Z-Leu-Leu-Glu-AMC (Z-LLE-AMC) para la medición de la actividad hidrolítica de péptidos peptidilglutamil, Z-Val- Lys-Met-AMC (Z-VKM-AMC) para la medición de la actividad quimotríptica, Suc-Leu-Tyr-AMC (Suc-LY-AMC) para la medición de la actividad quimotríptica, Z-Leu-Leu-Glu-2NA (N-(N-carbobenciloxicarbonil-leucil-leucil-arginil)-2-naftilamina) o Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Suc-LLVY-AMC) para la medición de la actividad de tipo quimotríptica o PGPH, que pueden adquirirse todos comercialmente (véase también el documento WO 00/23614). Como sustrato pueden utilizarse también los sustratos mencionados anteriormente, especialmente la Suc-LLVY-AMC, que portan otros grupos protectores. Grupos protectores utilizados con frecuencia son por ejemplo benziloxicarbonilo (también denominado "Z", véase anteriormente) o N-terc-butoxicarbonilo (t-boc).

Para el procedimiento según la invención puede seleccionarse al menos un sustrato del grupo de sustratos mencionado anteriormente, utilizándose preferiblemente un sustrato seleccionado del grupo siguiente de sustratos: Z-LLL-AMC, Z-LLE-AMC, Z-VKM-AMC, Suc-LY-AMC, y especialmente Suc-LLVY-AMC.

Además se conocen inhibidores covalentes y competitivos, así por ejemplo clasto-lactacistina \beta-lactona, epoxomicina (que inhibe la actividad hidrolítica de péptidos peptidilglutamil, de tipo tríptica y de tipo quimotríptica del proteasoma), Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)_{2}, Z-Leu-Leu-Leu-CHO (MG-132, que inhibe la degradación a través de la ruta de ubiquitina), Z-Leu-Leu-Nva-CHO (MG-115, carbobenzoxi-L-leucil-L-leucil-L-norvalinal, que inhibe específicamente la actividad de tipo quimotríptica del proteasoma), Z-Leu-Glu(OtBu)Ala-Leu-CHO, Z-Leu-Leu-Phe-CHO (que inhibe la actividad de tipo quimotríptica), Ac-Leu-Leu-Nle-CHO (MG-101, Ac-Leu-Leu-norleucinal, que inhibe la actividad peptidasa y de tipo quimotríptica) o Ac-Leu-Leu-Met-CHO (que inhibe la actividad peptidasa), que también pueden adquirirse todos comercialmente (véase también Mellgren (1997): Specificities of Cell Permeant Peptidyl Inhibitors for Proteinase Activities of \mu-Calpain and the 20S Proteasome. J. Biol. Chem. 272, 29899-29903; Bogyo et al. (1998): Substrate binding and sequence preference of the proteasome revealed by active-site-directed affinity probes. Chem. Biol. 5, 307-320). De este modo puede recurrirse también a tales inhibidores conocidos para la comprobación del procedimiento según la invención (véase el ejemplo 3). En pruebas adicionales a células fúngicas se detectó, que estos inhibidores conocidos sorprendentemente también presentan una acción fungicida y por tanto también pueden utilizarse como fungicidas o para la producción de un medicamento para el tratamiento
antifúngico.

La actividad enzimática respectiva o también varias actividades del proteasoma pueden someterse a prueba básicamente basándose en los sustratos conocidos mencionados anteriormente o sus productos de desdoblamiento medidos fluorimétrica o colorimétricamente, y la inhibición de esta actividad con ayuda de uno de los inhibidores conocidos mencionados anteriormente. Para ello pueden seleccionarse según la actividad diana los sustratos adecuados y dado el caso inhibidores. Los inhibidores encontrados con un procedimiento según la invención o un sustrato específico pueden reconocerse entonces directamente como inhibidores de una o varias actividades específicas.

Sin embargo la selección del sustrato debe posibilitar la valoración de los resultados de medición, es decir una inhibición debe ser reconocible fácilmente. Como parámetro estadístico puede recurrirse por ejemplo a la razón señal-fondo. Una variable adecuada para la determinación de la calidad de un procedimiento de detección o de una prueba de inhibición es también el factor z. En el factor z se incluyen además de la diferencia entre señal y fondo también la varianza de todos los valores de medición en el cálculo. El factor z se calcula tal como sigue: factor z = 1-((3 x desviación estándar posKo + 3 x desviación estándar negKo)/(valor promedio posKo - valor promedio negKo)), representando "posKo" el control positivo y representando "negKo" el control negativo (Zhang et al. (1999): A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4(2):67-73).

Un factor z superior a 0,7 se considera excelente, un factor z de desde 0,15 hasta 0,7 bueno, un factor z de desde 0 hasta 0,15 todavía suficiente y un factor z inferior a 0 no puede evaluarse.

El factor z en el procedimiento según la invención se encuentra tras aproximadamente 30 minutos por encima de 0,7.

A continuación se muestra a modo de ejemplo una configuración posible de un procedimiento según la invención, utilizándose un inhibidor conocido, MG-132, para demostrar el principio del procedimiento.

La actividad enzimática del proteasoma que ha de someterse a prueba o su inhibición puede demostrarse tal como en el presente ejemplo mediante el aumento de la fluorescencia de la AMC liberada del sustrato peptídico conocido Suc-LLVY-AMC (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC; Stein et al. (1996) Biochemistry 35, 3899) tal como se representa esquemáticamente a continuación:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ Proteasoma  20S\+\cr  Sustrato peptídico
(Suc-LLVY-AMC) \+  \rightarrow  \+ 
AMC + resto
peptídico\cr}

Suc-LLVY-AMC es un sustrato fluorógeno para la medición de la actividad de tipo quimotríptica del proteasoma 20S. La AMC (7-amino-4-metoxicumarina) desdoblada presenta un máximo de excitación a una longitud de onda de 380 nm y un máximo de emisión a 460 nm. La K_{i} para el inhibidor se encuentra a 5 nM.

Sin embargo básicamente pueden utilizarse además del sustrato Suc-LLVY-AMC mencionado en este caso a modo de ejemplo también otros sustratos del proteasoma, por ejemplo los sustratos conocidos indicados anterior-
mente.

La actividad proteolítica medible de esta manera puede influirse mediante un inhibidor tal como por ejemplo MG-132, lo que se hace perceptible en una fluorescencia relativa más reducida (figuras 1 y 2). MG-132 es un inhibidor de proteasomas reversible conocido, que pueden atravesar las paredes celulares (Lee, D.H., Goldberg A. (1989) J. Biol. Chem. 271, 27280). La inhibición de la actividad de proteasomas mediante el inhibidor conocido reduce claramente la fluorescencia relativa. Como control negativo se realizó la reacción sin proteasomas. La reacción realizada según el procedimiento según la invención permite sin problemas el reconocimiento de una inhibición de la actividad de proteasomas y con ello la identificación de inhibidores del proteasoma.

También pueden utilizarse otros inhibidores para someter a prueba el procedimiento, así por ejemplo los inhibidores de la actividad de proteasomas conocidos indicados anteriormente.

Para establecer condiciones óptimas para un procedimiento para identificar inhibidores de proteasomas o para la determinación de la actividad de los complejos polipeptídicos, es ventajoso determinar el valor K_{M} respectivo del sustrato utilizado. Éste da una explicación sobre la concentración que ha de utilizarse preferiblemente del o de los sustratos. Para el sustrato Suc-LLVY-AMC utilizado a modo de ejemplo pudo determinarse una K_{M} de 5 \muM (véase la figura 4).

Se entiende por sí mismo, que además de los procedimientos según la invención especialmente preferidos descritos anteriormente para identificar inhibidores de proteasomas 20S fúngicos o de fungicidas pueden utilizarse también todos los procedimientos convencionales conocidos por el experto, que se describen por ejemplo en el documento WO 00/23614, Groll et al. (1997), Nature 386, 463, Mellgren (1997): J. Biol. Chem. 272, 29899, Meng et al. (1999), PNAS 96, 10403, McCormack et al. (1998), Biochemistry 37, 7792, Driscoll y Goldberg (1990), J. Biol. Chem. 265, 4789 u Orlowski et al. (1993): Biochemistry 32, 1563, o que pueden adquirirse comercialmente (por ejemplo de Calbiochem). A este respecto sustratos del proteasoma utilizados además de los ya descritos anteriormente son también por ejemplo lisozima, alfa-lactalbúmina, beta-lactoglobulina, \beta-insulina o ornitina descarboxilasa. Cuando se pretende medir la actividad de todo el proteasoma 26S, el sustrato está preferiblemente ubiquitinado, o la mezcla básica de reacción contienen adicionalmente ubiquitina y enzimas de ubiquitinación.

Con ayuda del procedimiento descrito anteriormente a modo de ejemplo pueden identificarse compuestos, que además de la inhibición in vitro de los proteasomas 20S muestran una acción fungicida in vivo.

En la tabla I se muestran a modo de ejemplo compuestos, que presentan en el procedimiento según la invención una acción inhibidora y en las pruebas in vivo posteriores, en este caso por ejemplo la denominada prueba de difusión en agar, un efecto fungicida frente a diferentes hongos. A este respecto se utilizaron a modo de ejemplo los hongos siguientes: Botrytis cinerea (BOTRCI), Ustilago maydis (USTIMA), Pyricularia orycae (PYRIOR), Fusarium culmorum (FUSACU), Rhizoctonia solana (RHIZSO), Pseudo-cercosporella herpotrichoides (PSDCHW). El valor "MHK" describe la "concentración de inhibición mínima". Reproduce la concentración mínima (en ppm), a la que un principio activo impide el crecimiento del hongo. O sea cuanto menor sea el valor MHK, mayor será la eficacia de la sustancia sometida a prueba.

TABLA I

Ejemplo	Compuesto	Organismo	MHK
1	Carbobenzoxi-L-leucil-	BOTRCI	58,6
	L-leucil-L-norvalinal	FUSACU	> 1000
	(MG-115)	PSDCHR	> 1000
		PYRIOR	2,0
		RHIZSO	> 1000
		USTIMA	750
2	Aprotinina	BOTRCI	339,6
		FUSACU	> 1000
		PSDCHR	> 1000
		PYRIOR	18,0
		RHIZSO	> 1000
		USTIMA	750

Con esto puede demostrarse, que los inhibidores de los proteasomas 26S/20S identificados con ayuda de un procedimiento según la invención así como inhibidores conocidos del proteasoma 26S/20S humano son adecuados, para dañar o destruir hongos.

La prueba de difusión en agar es una manera sencilla para la determinación de la sensibilidad de los microorganismos frente a principios activos antimicrobianos (véase por ejemplo Mitchell y Carter (2000): Modeling antimocrobial activity of Clorox™ using an agardiffusion test: a new twist on an old experiment. Bioscene 26(3), 9-13). A este respecto se utiliza una placa de agar inoculada con el microorganismo, o sea en este caso con el hongo respectivo, y se permite que el principio activo difunda lentamente en el medio de agar. Esto tiene lugar por ejemplo poniendo en contacto con el agar un filtro redondo pequeño impregnado con el principio activo, colocándolo por ejemplo simplemente sobre la placa. Al difundir el principio activo a través del medio inoculado con el hongo disminuye cuadráticamente la concentración con el trayecto recorrido. Tras un trayecto de difusión determinado el principio activo está tan diluido, que ya no muestra ninguna acción más frente al hongo. La eficacia de una sustancia determinada se muestra en la formación de zonas, en las que se inhibe el crecimiento. Estas zonas pueden reconocerse como región clara alrededor de punto, desde el cual ha penetrado el principio activo en el medio de agar. El diámetro de estas zonas o anillos puede medirse y recurrirse al mismo como medida para la eficacia de la sustancia.

Además de la prueba mencionada para la evaluación de la eficacia fungicida de los inhibidores de los proteasomas 26S/20S in vivo, pueden utilizarse también otros procedimientos conocidos por el experto, siempre que posibiliten la evaluación de un efecto fungicida o fungistático de los compuestos sometidos a prueba.

Los compuestos identificados mediante el procedimiento según la invención pueden transformarse para su uso en la protección de las plantas en función de sus propiedades químicas y/o físicas respectivas en las formulaciones habituales, tales como soluciones, emulsiones, suspensiones, polvos, espumas, pastas, productos granulados, aerosoles, encapsulaciones finísimas en sustancias poliméricas y en masas de cubierta para semillas, así como formulaciones de niebla caliente y de niebla fría ULV.

Estas formulaciones se producen de manera conocida, por ejemplo mediante el mezclado de los principios activos con adelgazadores, o sea con disolventes líquidos, gases licuados que se encuentran a presión y/o sustancias de soporte sólidas, dado el caso utilizando agentes tensioactivos, o sea agentes emulsionantes y/o agentes dispersantes y/o agentes de formación de espuma. En caso de utilizar agua como agente adelgazante pueden utilizarse por ejemplo también disolventes orgánicos como disolventes auxiliares. Como disolventes líquidos se tienen en cuenta esencialmente: compuestos aromáticos, tales como xileno, tolueno o alquilnaftalinas, compuestos aromáticos clorados o hidrocarburos alifáticos clorados, tales como clorobencenos, cloroetilenos o cloruro de metileno, hidrocarburos alifáticos, tales como ciclohexano o parafinas, por ejemplo fracciones de petróleo, alcoholes, tales como butanol o glicol así como sus éteres y ésteres, cetonas, tales como acetona, metiletilcetona, metilisobutilcetona o ciclohexanona, disolventes muy polares, tales como dimetilformamida y dimetilsulfóxido, así como agua. Con sustancias de soporte o adelgazantes gaseosos licuados se hace referencia a aquellos líquidos, que a temperatura normal y a presión normal son líquidos, por ejemplos gases impulsores de aerosoles, tales como hidrocarburos halogenados así como butano, propano, dióxido de carbono y nitrógeno. Como sustancias de soporte sólidas se tienen en cuenta: por ejemplo harinas minerales naturales, tales como caolinas, arcillas, talco, creta, cuarzo, atapulgita, montmorillonita o tierras de diatomeas y harinas minerales sintéticas, tales como ácido silícico altamente disperso, óxido de aluminio y silicatos. Como sustancias de soporte sólidas para productos granulados se tienen en cuenta: por ejemplo rocas naturales rotas o fraccionadas tales como calcita, mármol, piedra pómez, sepiolita, dolomita, así como productos granulados sintéticos a partir de harinas inorgánicas u orgánicas así como productos granulados de material orgánico tales como serrín, cáscaras de coco, mazorcas de maíz y tallos de tabaco. Como agentes emulsionantes y/o de formación de espuma se tienen en cuenta: por ejemplo emulsionantes no ionógenos y aniónicos, tales como ésteres de ácidos grasos de polioxietileno, éteres de alcoholes grasos de polioxietileno, por ejemplo alquilarilpoliglicoléter, sulfonatos de alquilo, sulfatos de alquilo, sulfonatos de arilo así como hidrolizados de proteína. Como agentes dispersantes se tienen en cuenta: por ejemplo lejías residuales de sulfito-lignina y metilcelulosa.

En las formulaciones pueden utilizarse agentes adherentes tales como carboximetilcelulosa, polímeros en forma de látex o granulados, pulverulentos naturales o sintéticos, tales como goma arábiga, poli(alcohol vinílico), poli(acetato de vinilo), así como fosfolípidos naturales, tales como cefalinas y lecitinas, y fosfolípidos sintéticos. Otros aditivos pueden ser aceites minerales o vegetales.

Pueden utilizarse colorantes tales como pigmentos inorgánicos, por ejemplo óxido de hierro, óxido de titanio, azul ferrociano y colorantes orgánicos, tales como colorantes de alizarina, azoicos y de ftalocianina metálica y oligonutrientes, tales como sales de hierro, de manganeso, de boro, de cobre, de cobalto, de molibdeno y de zinc.

Las formulaciones contienen en general entre el 0,1 y el 95 por ciento en peso de principio activo, preferiblemente entre el 0,5 y el 90%.

Los principios activos o sus formulaciones pueden ponerse en contacto directamente con los hongos contra los que hay que luchar o su hábitat.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción del extracto de proteasomas a partir de células de S. cerevisiae

Se resuspendieron 150 ml de una levadura de fermentación resistente al punzonado con 250 ml de tampón (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; EDTA 10 mM) para dar 400 ml de una suspensión de levadura. Se rompieron las células en un homogeneizador de alta presión a una presión de 1800 psi y 27ºC en tres pasos. Tras la rotura de las células se ajustó el valor de pH con NaOH 0,1 M a 7,5. Directamente a continuación de esto tuvo lugar la incubación a 60ºC durante 60 minutos. Después de esto se centrifugó la suspensión tres veces a 13000 rpm en un rotor JA20 a 4ºC, para eliminar los componentes precipitados. El residuo restante, en el que se encuentran los proteasomas, pudo utilizarse en una dilución de 1:1000 directamente en el ensayo para la identificación de inhibidores.

Dado que la actividad puede variar según la fase de la fermentación de las células, es recomendable determinar previamente la actividad de los proteasomas, para poder seleccionar la dilución adecuada.

Ejemplo 2 Producción del extracto de proteasomas a partir de células de U. maydis

Se sometieron 50 ml de un cultivo de U. maydis a la obtención de protoplastos según Schulz et al. (Schulz et al. (1990), The b alleles of Ustilago maydis, whose combinations program pathogenic development, code for polypeptides containing a homeo-domain-related motif. Cell 60, 295-306). Le siguió la sedimentación de los protoplastos durante 5 min. a 2000 rpm. Posteriormente se hicieron reventar los protoplastos mediante la adición de 50 \mul de tampón (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; EDTA 10 mM) mediante condiciones osmóticas modificadas. Se sedimentaron los restos celulares mediante centrifugación durante 5 min. a 13000 rpm. Se incubó de nuevo el residuo durante 1 h a 60ºC, seguido de la sedimentación de las proteínas desnaturalizadas durante 5 min. a 13000 rpm. La prueba de actividad siguiente de los proteasomas de U. maydis obtenidos determina la dilución que ha de utilizarse para el ensayo posterior.

Ejemplo 3 Control del sistema de prueba con el inhibidor conocido MG-132 (prueba de actividad)

Se realizó la prueba de actividad y de inhibición utilizando el inhibidor conocido MG-132 de Calbiochem, que debe servir para el control de la aplicabilidad del procedimiento según la invención, en placas MTP de 384 (placa de microtitulación con 384 pocillos). Un volumen total de 50 \mul por pocillo contenía 25 \mul de tampón enzimático (Tris-HCl 10 mM, EDTA 2 mM) que contiene los proteasomas (2,8 mg), 20 \mul de solución de sustrato (Suc-LLVY-AMC 13 \muM, SDS al 0,06%, DMSO al 10%, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 2mM) que contiene el sustrato y 5 \mul de la sustancia sometida a prueba (MG-132 160 nN en DMSO al 5%). La medición previa (fluorescencia) tuvo lugar a 360/465 nm (ancho de banda de 35 nm). Se realizó la incubación durante 40 minutos a 25ºC. La medición de la fluorescencia tuvo lugar de nuevo a 360/465 nm (ancho de banda de 35 nm).

Ejemplo 4 Identificación de inhibidores del proteasoma (detección)

Para la prueba de inhibición de los proteasomas en el UHTS (detección) se utilizaron placas MTP de 384 de Greiner. Se colocaron previamente las sustancias sometidas a prueba en 5 \mul de solución de sustancia sometida a prueba (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; EDTA 10 mM), de modo que en la prueba de inhibición la concentración final de las sustancias sometidas a prueba ascendía a 2 \muM. Sobre la placa se aplicaron en pocillos adicionales un control negativo de 5 \mul (MG-132 160 nM; DMSO al 5%) así como un control positivo de 5 \mul (DMSO al 5%). A la solución de sustancia sometida a prueba se le añadieron 20 \mul de la solución de sustrato (Suc-LLVY-AMC 13 \muM; SDS al 0,06%, DMSO al 10% (v/v); Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 2 mM). Posteriormente se añadieron 25 \mul de solución enzimática (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 2 mM; 280 ng de proteasomas por pocillo) y se determinó la fluorescencia relativa (medición previa a 360/465 nm, ancho de banda de 25 nm). Se incubó durante 40 min. a 25ºC. La medición de la fluorescencia relativa tuvo lugar de nuevo a 360/465 nm, ancho de banda de 25 nm.

Ejemplo 5 Identificación de inhibidores del proteasoma (detección)

Para la prueba de inhibición de los proteasomas en el UHTS (detección) se utilizaron placas MTP de 384 de Greiner. Se colocaron previamente las sustancias sometidas a prueba en 5 \mul de solución de sustancia sometida a prueba (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; EDTA 10 mM) en 352 pocillos, de modo que en la prueba de inhibición la concentración final de las sustancias sometidas a prueba ascendía a 2 \muM. Sobre la placa se aplicaron en pocillos adicionales para un control negativo (32 pocillos) así como un control positivo (32 pocillos) en cada caso 5 \mul de DMSO al 5%. A la solución de sustancia sometida a prueba se le añadieron 20 \mul de la solución de sustrato (Suc-LLVY-AMC 13 \muM; SDS al 0,06%, DMSO al 10% (v/v); Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 2 mM). Posteriormente se añadieron 25 \mul de solución enzimática (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 2 mM; extracto de proteasomas 1:100 correspondiente a 280 ng/pocillo), añadiéndose al control negativo sólo tampón sin enzima. Posteriormente se determinó en primer lugar en una medición previa la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 360 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm (medición previa a 360/465 nm, ancho de banda de 25 nm). Entonces se incubaron las placas MTP a 37ºC durante al menos 40 min. y posteriormente se determinó la fluorescencia tal como se describió anteriormente.

Descripción de las figuras

Figura 1

Prueba de actividad para el proteasoma 20S de levadura. Como sustrato para la actividad quimotríptica se utilizó Suc-LLVY-AMC. Se determinó la liberación de AMC fluorimétricamente a lo largo del tiempo. Se determinó la actividad de proteasomas en una dilución 1:100 de una rotura de levadura en presencia de MG132 40 nM y en ausencia de MG-132. Como control negativo se realizó la reacción sin enzima (tampón).

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Figura 2

Prueba de actividad para el proteasoma 20S de Ustilago maydis. Como sustrato para la actividad quimotríptica se utilizó Suc-LLVY-AMC. Se determinó la liberación de AMC fluorimétricamente a lo largo del tiempo. Se determinó la actividad de proteasomas en una dilución 1:100 y 1:20 de una preparación de U. maydis. Además se le añadió a la mayor concentración de proteasomas el inhibidor de los proteasomas MG-132 en una concentración de 40 nM.

Figura 3

Prueba de actividad para el proteasoma 20S de Botrytis cinerea. Para el aislamiento del proteasoma 20S de B. cinerea (proteasoma B.c.) se obtuvieron protoplastos de células fúngicas. Se trataron adicionalmente los protoplastos de manera análoga al protocolo para el aislamiento del proteasoma 20S de U. maydis (véase el ejemplo 2). Se determinó la actividad quimotríptica del proteasoma B.c. mediante la reacción de Suc-LLVY-AMC (véase el ejemplo 3). (x) = proteasoma 20S de B. cinerea, diluido en 1:100. (\boxempty) = proteasoma 20S de S. cerevisiae, diluido a 1:100. (\ding{115}) = proteasoma 20S de B. cinerea, diluido a 1:500. (\lozenge) = reacción sin proteasomas.

Figura 4

Determinación del valor K_{M} para el sustrato peptídico Suc-LLVY-AMC. Se incubó una cantidad constante de proteasomas (aproximadamente 70 ng por reacción) con cantidades crecientes de sustrato y posteriormente se determinó el aumento de la fluorescencia a lo largo de un periodo de tiempo de 5 minutos. Se determinaron los aumentos de la curva (línea de puntos) mediante el cálculo de líneas de tendencia. El cálculo del valor K_{M} para Suc-LLVY-AMC según Lineweaver-Burke dio un valor de 5 \muM.

Figura 5

Dependencia de la reacción de la cantidad de DMSO utilizada. Se determinó la actividad del proteasoma 20S de levadura mediante la liberación de AMC a lo largo del tiempo. A la reacción se le añadieron cantidades crecientes de DMSO. En la figura A se utilizó la mitad de la cantidad de proteína en comparación con la figura B. El DMSO al 5% es especialmente favorable para la reacción.

Figura 6

Se determinó la dependencia de la reacción de la cantidad de DMSO utilizada tal como se describió para la figura 5. Sin embargo se almacenaron los componentes de la reacción en la figura 5(B) durante 72 h a 4ºC. En presencia de DMSO al 5% la reacción también es estable tras 72 horas. Cantidades mayores de DMSO conducen a la pérdida de la actividad.

Figura 7

Comprobación de la actividad del proteasoma 20S en placas MTP de 384 pocillos. Tras 40, 50 y 60 minutos se determinó la fluorescencia de la AMC en 192 pocillos en cada caso. "PosKo" corresponde a la reacción con enzima, "negKo" corresponde a la reacción sin enzima, "delta" es la diferencia de ambos valores. Ya tras 40 min. se consiguió un factor z > 0,7. El factor z es una variable matemática para la valoración de la uniformidad de los datos que se hacen constar y permite con ello una valoración de la aplicabilidad de un ensayo para una detección de sustancias. Se calcula el factor z tal como sigue: factor z = 1-((3 x desviación estándar posKo + 3 x desviación estándar negKo)/(valor promedio posKo - valor promedio negKo)), (Zhang et al. (1999): A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4(2):67-73).

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Claims

1. Procedimiento para identificar fungicidas sometiendo a prueba un compuesto candidato a una prueba de inhibición de los proteasomas 20S.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan proteasomas 20S de hongos.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque se comprueba la actividad de los compuestos candidatos seleccionados frente a hongos incluyendo una prueba in vivo.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque

a): se ponen en contacto un compuesto candidato con proteasomas 20S en presencia de un sustrato y en presencia de desde el 2 hasta el 10% (v/v) de dimetilsulfóxido, y

b): se seleccionan aquellos compuestos candidatos, que inhiben de manera específica la transformación enzimática del sustrato mediante los proteasomas 20S.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el sustrato contiene un grupo, cuya liberación puede determinarse fluorimétrica o colorimétricamente mediante una actividad enzimática del proteasoma 20S.

6. Procedimiento según la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque se usan proteasomas 20S, que se aislaron

a): rompiendo células eucariotas,

b): calentando la suspensión celular resultante hasta de 50ºC a 70ºC, hasta que hayan precipitado los componentes sensibles a la temperatura, y

c): obteniendo los proteasomas mediante la separación por centrifugación de los componentes insolubles.